DE10051806A1 - Verfahren zur Charakterisierung, Identifizierung und Kennzeichnung von mikrobiellen Mischungen - Google Patents

Verfahren zur Charakterisierung, Identifizierung und Kennzeichnung von mikrobiellen Mischungen

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Abstract

Zur schnellen Charakterisierung, Identifizierung und Kennzeichnung von mikrobiellen Mischungen werden Schwingungsspektren von Proben auf Basis der IR, FT-IR, Raman und FT-Raman Spektroskopie gemessen oder Gas-Chromatogramme aufgenommen. Die Messungen erfolgen in an sich bekannten experimentellen Anordnungen. Die Charakterisierung und Identifizierung von mikrobiellen Mischungen erfolgt über einen Vergleich der Infrarot-, Ramanspektren oder der Chromatogramme der Gas-Chromatographie oder Gas-Chromatographie/Massenspektroskopie der zu untersuchenden Probe mit einer Referenzdatenbank, bestehend aus IR, FT-IR, Raman oder FT-Ramanspektren oder GC-Chromatogrammen/GC-Massenspektren, die entsprechend der Zusammensetzung, der Eigenschaft oder des Zustandes der gemessenen Referenzprobe in zwei oder mehrere Klassen eingeteilt sind. Der Vergleich erfolgt bevorzugt mit Methoden der Mustererkennung wie künstlicher neutronaler Netze, multivariater statistischer Modelle, maschinelleres Lernen, fallbasiertes Klassifizieren und genetischen Algorithmen.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Charakterisierung, Identifizierung und Kennzeichnung von mikrobiellen Mischungen mittels IR (Infrarot)-, FT-IR (Fourier- Transform-Infrarot)-, Raman-, FT-Raman (Fourier-Transform Raman)- oder GC-Analysen (Gaschromtographie).
Mikrobielle Mischungen sind z. B. Bakterienmischungen, Mischungen von Hefen oder Pilzen. Solchen mikrobiellen Mischungen deren Zusammensetzung im einzelnen unbekannt ist, können bestimmte Eigenschaften zugeordnet werden. Es gibt mikrobielle Mischungen, die beispielsweise einen bestimmten Naturstoff synthetisieren. Eine Änderung der Zusammensetzung der mikrobiellen Mischung hat einen direkten Einfluß auf die Menge an synthetisiertem Naturstoff. Eine andere Anwendung von mikrobiellen Mischungen ist der Bereich der Verdrängung von unerwünschten Bakterienkulturen. Zum Beispiel verhindert eine charakteristische Bakterienmischung im Darm von Hühnern die Ansiedlung von Salmonellen im Darm der Hühner.
Bisher gibt es keine zuverlässige analytische Methode, um das Vorhandensein einer bestimmten Eigenschaft bei einer gegebenen mikrobiellen Mischung vorherzusagen oder auch nur die unterschiedliche Zusammensetzung von mikrobiellen Mischungen zu charakterisieren oder zu identifizieren. Die einzige Möglichkeit besteht in direkten Tests der Eigenschaft. Solche Tests sind langwierig und erfordern möglicherweise in vivo Test wie im oben beschrieben Fall der Hühner.
Für die Qualitätskontrolle während einer Produktion und der damit verbundenen Standardisierung des Herstellungsprozesses sind solche Tests ungeeignet.
Erste Ansätze für eine Anwendung der FT-IR-Spektroskopie zur Identifizierung von Mikroorganismen für biomedizinische, biotechnologische oder diagnostische Anwendungen wurden veröffentlicht für Actinomyceten (Haag H., Gremlich H.-U., Bergmann R. and Sanglier J.-J. (1996) Characterization and identification of actinomycetes by FT-IR spectroscopy. J. Microbiol. Meth. 27 (2-3), 157-163), Hefen in Nahrungsmitteln (Kümmerle M., Scherer S. and Seiler H. (1998) Rapid and reliable identification of food-borne yeasts by Fourier transform infrared spectroscopy. App. Env. Microbiol. 64 (6), 2207-2214), Pilz- und Algenpathogene von Tieren (Schmalreck A. F., Tränkle P., Vanca E. and Blaschke- Hellmessen R. (1998) Differentiation and characterization of Candida albicans, Exophiala dermatitidis and Prototheca spp. by Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR) in comparison with conventional methods. Mycoses. 41 (1), 71-77) und einige Spezies der Familien Lactobacillus (Curk M. C., Peladan F. and Hubert J. C. (1994) Fourier transform infrared (FT-IR) spectroscopy for identifying Lactobacillus species. FEMS Microbiol. Lett. 123, 241-248), Listeria (Holt C., Hirst D., Sutherland A. and MacDonald F. (1995) Discrimination of species in the genus Listeria by Fourier transform infrared spectroscopy and canonical variate analysis. Appl. Env. Microbiol. 61, 377-378), Streptococcus, Enterococcus (Goodacre R., Timmins E. M., Rooney P. J., Rowland J. J. and Kell D. B. (1996) Rapid identification of Streptococcus and Enterococcus species. FEMS Microbiol. Lett. 140 (2-3), 233-239), Clostridium (Franz M. (1994) Identifizierung von Clostridien mittels FT-IR Spektroskopie. Dtsch. Milchwirtsch. 3, 130-132), Bacillus, Pseudomonas und Taphylococcus, Candida (Schmitt J., T. Udelhoven (2000): Use of Artificial neural networks in biomedical applications. In: Gremlich H.-U., B. Yan: Infrared and Raman Spectroscopy of biologic materials. Marcel Dekker, New York. p. 379-420). Anwendungen in der klinischen Mikrobiologie und biomedizinische Anwendungen sind in Mantsch H., M. Jackson. Infrared Spectroscopy: A New Tool in Medicine. Washington D. C., 1998 und in Mahadevan-Jansen A., G. Puppels (2000): Biomedical Spectroscopy: vibrational spectroscopy and other novel techniques. Washington D. C., Bellingham, SPIE Vol. 3918 zusammengefasst.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum schnellen, zuverlässigen und ökonomischen Nachweis von Veränderungen in mikrobiellen Mischungen oder den Nachweis eines spezifischen Zustandes in mikrobiellen Mischungen zu entwickeln. Das erfindungsgemäße Verfahren soll auch unter den Bedingungen der Produktion im Routinebetrieb effektiv einsetzbar sein.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß die folgenden Verfahrensschritte nacheinander ausgeführt werden
  • a) die Spektren/Chromatogramme der mikrobiellen Mischung werden aufgenommen,
  • b) eine Referenzdatenbank, die in zwei oder mehrere vorgegebene Klassen klassifizierte Spektren/Chromatogramme von mikrobiellen Mischungen enthält, wird bereitgestellt,
  • c) die Spektren/Chromatogramme der mikrobiellen Mischung werden nach Vergleich mit den Spektren/Chromatogrammen der Referenzdatenbank einer von zwei oder mehreren vorgegebenen Klassen zugeordnet.
Die funktionellen Gruppen aller biochemischen Bestandteile einer mikrobiellen Mischung wie Peptide, Proteine, Polysacchiaride, Phospholipide und Nukleinsäuren von intakten Zellen tragen zu einem Spektrum dieser mikrobiellen Mischung bei. Die Spektren sind aufgrund der hohen Zahl von Beiträgen sehr komplex und beinhalten viele verschiedene Vibrationsmoden der Biomoleküle der Zellwand, der Membran, des Cytoplasma und der extrazellulären polymeren Substanzen. Die Spektren sind trotz ihrer Komplexität sehr spezifisch für eine Zusammensetzung, Eigenschaft oder einen Zustand einer mikrobiellen Mischung und können deshalb zur Identifizierung, Charakterisierung oder Kennzeichnung der mikrobiellen Mischung herangezogen werden.
Das Verfahren ist für die Klassifizierung von IR-, FT-IR-, Raman- und FT-Ramanspektren sowie für Gaschromatogramme und für aus Kopplungsverfahren wie GC-MS (Gaschromatographie und Massenspektroskopie) gewonnene Chromatogramme anwendbar.
Für die IR- oder Raman-Spektroskopie kann jede der an sich bekannten spektroskopischen Meßanordnungen eingesetzt werden wie Transmission/Absorption, abgeschwächte Totalreflexion, direkte oder diffuse Reflexion. Besonders vorteilhaft ist die Messung in Transmission/Absorption.
Die Aufnahme der IR-Spektren erfolgt typischerweise im Spektralbereich des sogenannten mittleren Infrarots zwischen 500-4000 cm-1. Prinzipiell kann auch das nahe Infrarot von 1000-4000 cm-1 dazu herangezogen werden.
Die Proben sind vorzugsweise fest oder flüssig. Bei der Messung ist der Einsatz von Multiküvetten für das Messen mehrerer Proben oder der Einsatz mikrospektrometrischer Techniken vorteilhaft. Dadurch kann eine Minimierung der Probenmenge erreicht werden und der Einsatz einer automatisierten Probenvorverarbeitung und -Messung erfolgen um so den Probendurchsatz zu erhöhen. Es können auch Probenträger wie sie für Mikrotiterplatten verwendet werden oder Durchflußküvetten, benutzt werden. Es ist auch der Einsatz von Infrarotlichtleitern für eine ortsunabhängigere Meßautomatisierung möglich.
Als Material für Küvetten und Probenträger der oben beschriebenen Präparationsvarianten können alle in der IR-Spektroskopie üblicherweise verwendeten wasserunlöslichen optischen Materialien eingesetzt werden wie Ge, ZnSe, CaF2, BaF2, wobei sich für ein Multiprobenelement ZnSe bewährt hat. Aber auch aufgeraute Metallplatten oder Mikrometallgitter sind als Probenhalter geeignet, besonders wenn sie im Maßstab der Mikrotiterplatten für eine Vielzahl von Proben und als Einwegmaterialien konzipiert sind.
Die Probenmenge für die Aufnahme von IR-Spektren kann sehr klein gehalten werden und nur wenige µl (2-5 µl) betragen. Je nach den vorgegebenenen Bedingungen mit oder ohne Strahlfokussierung können Substanzmengen von µg bis ng eingesetzt werden. Die Durchmesser der durchstrahlten Probenareale variieren zwischen 1-6 mm und 10-50 µm bei einer Mikrofukussierung.
Eine mögliche Klassifizierung kann darin bestehen, daß eine untersuchte mikrobielle Mischung für eine bestimmte Anwendung geeignet ("pass") oder ungeeignet ("fail") ist oder verschiedenen Zuständen (Zustand A, Zustand B oder Zustand C . . . usw.) entspricht.
Die Klassifizierung der Spektren/Chromatogramme erfolgt über einen Vergleich der Spektren/Chromatogramme der zu untersuchenden Probe mit entsprechend klassifizierten Referenzspektren/-chromatogrammen von Proben, deren Zusammensetzung, Eigenschaft oder Zustand bekannt ist, den Referenzspektren. Die Referenzspektren befinden sich in einer Referenzdatenbank. Diese Referenzdatenbank kann auch die Form eines künstlichen neuronalen Netzes besitzen, in dem die spektralen Informationen in Form neuronaler Gewichte gespeichert sind und für die Auswertung herangezogen werden können.
Die Erstellung der Referenzdatenbank ist für jede Charakterisierung, Identifizierung oder Kennzeichnung bezüglich einer Zusammensetzung, Eigenschaft oder eines Zustandes nur einmal erforderlich.
Für den Aufbau der Referenzdatenbank werden Spektren/Chromatogramme von Proben von mikrobiellen Mischungen gemessen und diese Proben durch weitere Tests bezüglich ihrer Zusammensetzung, ihrer Eigenschaft oder ihre Zustandes charakterisiert und dann beispielsweise den Klassen "passed" und "failed" oder einer von mehreren Klassen von Zuständen zugeordnet.
Die Probenpräparation und die Aufnahme der Spektren/Chromatogramme werden in gleicher Weise bei den Referenzproben und den unbekannten, zu klassifizierenden Proben durchgeführt. Entscheidend ist, daß alle Parameter für die Referenzprobenmesssung und die spätere eigentliche Probenmessung in engen Grenzen gleich gewählt werden.
Die physikalischen Meßparameter der Messungen auf Basis der IR, FT-IR Raman und FT- Raman, wie die spektrale Auflösung oder die Anzahl der gemittelten Spektren etc. können innerhalb der in der Schwingungs-Spektroskopie üblichen Bereiche variiert werden, ohne sich in der Praxis als kritisch für den Erfolg der Klassifizierung bzw. die Auswertung zu erweisen. Wichtig bei der Festlegung der Parameter der Spektrengewinnung sowie der Probenaufarbeitung und Probenpräparation ist lediglich, daß für alle Messungen in engen Grenzen gleiche Parameter gewählt werden.
Für die chromatographischen Methoden können die Messparameter wie Probenvorbereitung, Extraktion, Temperaturprogramm der Chromatographen, Wahl der Trennsäulen ebenfalls variiert werden. Wichtig bei der Festlegung der Parameter für die Chromatogrammgewinnung sowie der Probenaufarbeitung und Probenpräparation ist lediglich, daß für alle Messungen in engen Grenzen gleiche Parameter gewählt werden.
Der Vergleich von Spektren/Chromatogrammen unbekannter Proben mit der Referenzdatenbank erfolgt vorzugsweise mittels Methoden der computergestützten Mustererkennung, wie z. B. multivariate Statistik (Devijer P. A., and Kittler J., Pattern Recognition: A statistical approach, Prentice Hall; London 1982) wie z. B. der Diskriminanzanalyse, Clusteranalyse, Distanzmaße, multiple Regression (Otto M. Chemometrie, VCH Publisher, Weinheim, 1997), oder durch künstliche neuronale Netze (Zupan J., and Gasteiger J., Neural Networks for Chemists. VCH-Publisher, 1993), maschinelles Lernen, fallbasiertes Klassifizieren (Schank R. C., Dynamic Memory: A Theory of Reminding and Learning in Computers and People. Cambridge University Press 1982) und genetische Algorithmen (Holland J. H., Adaption in Natural and Artificial Systems, 2. Auflage MIT Press, Boston, 1992) oder evolutionäres Programmieren (Fogel L. J., Owens A. J., Walsh M. J.: Artificial Intelligence through Simulated Evolution, John Wiley 1966 and Fogel D. B., Evolving Artificial Intelligence, Ph.D. thesis, University of California at San Diego, 1992).
Die Beschreibung einer Klasse x basiert auf einem endlichen Set von Merkmalen x (wie z. B. Wellenlänge) und wird definiert als
Bevorzugt wird ein künstliches neuronales Netz für den Vergleich und die Zuordnung von Spektren/Chromatogrammen unbekannter Proben zu einer von mehreren vorgegebenen Klassen verwendet.
Ein solches künstliches neuronales Netz bestehend aus 3 Schichten ist schematisch in Fig. 3 gezeigt. Die Eingabeschicht (input layer) besteht aus Eingabe-Neuronen, welche ausgewählte Wellenlängen repräsentieren. Diese Informationen werden von der Eingabeschicht zu einer verdeckten Schicht (hidden layer) weitergeleitet, wo Berechnungen in den verdeckten Neuronen stattfinden. Der Informationsfluß wird durch die verdeckten Neuronen entweder vergrößert oder verringert und das Ergebnis der Berechnung wird zur Ausgabeschicht (output layer) weitergeleitet. Die Ausgabeschicht korrespondiert zu den vorgegebenen Klassen, die Zahl der Ausgabe-Neuronen zur Zahl der vorgegebenen Klassen. Die Aktivierung eines der Ausgabe-Neuronen ist das Ergebnis der Klassifizierungsprozedur.
Ein Neuron ist eine Informations-Zelle, die eine Ausgabe erzeugt, wenn der kumulierte Effekt aller Eingabeinformationen einen bestimmten Schwellenwert überschreitet. In Fig. 4 ist der Informationsfluß an einem Neuron illustriert.
Die Basiselemente des künstlichen neuronalen Netzes werden folgendermaßen definiert:
Eingabe-Neuronen werden durch ein Gewicht oder eine Stärke charakterisiert. Eine Eingabegröße xi wird multipliziert mit dem synaptischen Gewicht wij. Der erste Index weist dabei auf das entsprechende Neuron hin und der zweite Index auf das Eingabeende der Synapse zu der das Gewicht gehört. Die Gewichte modellieren die synaptischen neuronalen Verbindungen in ihrer Eigenschaft ein Eingangssignal entweder zu verstärken oder abzuschwächen. Die Gewichte sind reelle positive oder negative Zahlen.
Die Fortpflanzungsfunktion (netj) dient zum Aufsummieren aller Eingangssignale an einem Neuron, gewichtet durch die entsprechenden Synapsen des Neurons. Gegebenenfalls wird noch ein äußerer Bias θj addiert, der Summe der Eingangssignale verstärkt oder abschwächt, je nachdem ob θj positiv oder negativ ist.
Die Aktivierungsfunktion (f(netj)) dient zur Begrenzung der Amplitude der Ausgabe eines Neurons.
aj = (netj) Gleichung 2
Die am häufigsten genutzte Aktivierungsfunktion ist:
Ein Neuron wie in Fig. 4 gezeigt in der Ausgabeschicht kann die Zuordnung von Pattern von Stimulationswerten (z. B. Wellenlängen) zu zwei oder mehreren Klassen berechnen. Die Komponenten der Eingabevektoren x sind dabei die verschiedenen Stimulationswerte. Im Fall eines künstlichen neuronalen Netzes mit 3 Schichten korrespondiert der Ausgabevektor mit den versteckten Neuronen. In einem Beispiel mit zwei Klassen kann die Ausgabe mit den Klassen "fail" und "pass" eines Klassifikationssystems korrespondieren.
Die künstlichen neuronalen Netze lassen sich in zwei Arten unterteilen, die Vielschicht- Perceptronen (multilayer perceptrons (MLPs)) und die Netze mit radialen Basisfunktionen (RBFs). The Strukturen dieser zwei Arten von neuronalen Netzen (Bishop C. M. (1995). Neural networks for pattern recognition, Clarendon press, Oxford) sind unterschiedlich. Während MLPs die Zuordnung zu den verschiedenen Klassen durch die versteckten Neuronen vornehmen und sozusagen die Hyperebenen im Eingaberaum darstellen, repräsentieren die RBFs eine Klassenzuordnung durch lokale Kernel-Funktionen (Fig. 5).
Ein expliziter Ausdruck für ein vollständig verbundenes 3-Schicht MLP ist:
wobei:
ok() = Aktivierung des Ausgabeneurons k durch Eingabevektor x = x1, x2, . . ., xn
wji = Gewicht in der versteckten Schicht laufend, von Eingabe-Neuron i zu verstecktem Neuron j
wkj = Gewicht in der Ausgabe-Schicht, laufend von verstecktem Neuron j zu Ausgabe-Neuron k
wki = Gewicht in der Ausgabe-Schicht, laufend von Eingabe-Neuron i zu Ausgabe- Neuron k (shortcut-Verbindung)
θkj = Biases von Ausgabe-Schicht und versteckter Schicht
, ' = Aktivierungsfunktionen für Ausgabe-Schicht und versteckte Schicht
n, M, K = Zahl der Eingabe-, versteckten und Ausgabe-Neuronen.
Künstliche neuronale Netze mit radialen Basisfunktionen zeigen eine lokaleres Modellierungsverhalten als die MLPs und bewirken dadurch eine bessere Erfassung von Ausreißern. Ein vollständig verbundenes RBF-Netzwerk inklusive shortcut-Verbindungen zwischen Eingabe- und Ausgabe-Neuronen wird repräsentiert durch die folgende Näherung:
mit:
|-| = Euclidischer Distanz zwischen Eingabe-Vektor und den Zentren der RBFs
h = Basisfunktion.
Die radialen Basisfunktionen h werden werden auf die Distanz (meist euklidisch) zwischen dem Eingangs-Vektor und einem sogenannten Prototyp-Vektor (Gleichung 5) angewendet. Die Prototyp-Vektoren, die sogenannten Zentren, repräsentieren die verschiedenen Klassen im Trainingsset. Die häufigste Aktivierungsfunktion bei RBF-Anwendungen ist die Gauss- Funktion, mit gauss → 0 wenn |x|→∞. Der letzte Term in Gleichung 5 berücksichtigt die shortcut-Verbindungen.
Bevorzugt wird ein künstliches neuronales feed-forward Netz mit 3 Schichten und mit einer Gradientenabstiegsmethode wie resililient propagation, backpropagation, Quickprop und Varianten dieser Methoden als Lernalgorithmus verwendet.
Vorzugsweise wird vor der Klassifizierung eine Vorverarbeitung der Spektren durchgeführt. Diese Vorverarbeitung kann in einer Wellenlängenselektion im Falle der Schwingungsspektren oder einer heature-Selektion im Falle der Chromatogramme bestehen. Damit kann die Anzahl der Parameter für das Klassifikationsmodell reduziert werden und sich nur auf die optimalen spektralen Bereiche für die Klassifikation erstrecken. Redundante Informationen bzw. spektrale Bereiche oder Chromatogrammkomponenten ohne wesentliche Information können dadurch eliminiert werden, was die Qualität und Stabilität der Klassifikationsmodells verbessert.
Die Auswahl einer oder mehrerer Spektralbereiche kann durch die visuelle Inspektion der Spektren oder sinnvollerweise durch multivariate Verfahren zur Selektion spektraler Merkmale erfolgen. Als multivariate Verfahren werden insbesondere die Kovarianz-Analyse und die einfache univariate Varianzanalyse (Otto M., Chemometrie, VCH-Puplisher, Weinheim 1997) verwendet oder es werden genetische Algorithmen (Holland J. H., Adaption in Natural and Artificial Systems, 2. Auflage MIT Press, Boston, 1992) oder Diskriminanzverfahren (z. B. einem Distanzmaß, Diskriminanzanalyse) verwendet.
Bei der Wellenlängen- oder Feature-Selektion durch multivariate Verfahren sind drei verschiedene Elemente zu berücksichtigen, das Auswahlkriterium, die Suchstrategie und die Abbruchbedingung.
Als Auswahlkriterium können die Unterschiede zwischen den Klassen dienen. Mit statistischen Methoden wie Fehlerwahrscheinlichkeit, Distanz zwischen den Klassen (inter dass distance), probabilistische Distanz (probabilistic distance), probabilistische Abhängigkeit (probabilistic dependence) und Entropie können diese Unterschiede zwischen den Klassen analysiert werden. Es lassen sich daraus univariate und multivariate Auswahlkriterien ableiten. Ein univariates Auswahlkriterium ist der F-Wert, der das Verhältnis der Varianz zwischen und innerhalb der Klassen beschreibt. Die Suchstrategie besteht dann im Ranking der F-Werte. Als Abbruchbedingung kann die Ermittlung einer vorgegebenen Zahl von Wellenlängen mit den jeweils höchsten F-Werten dienen oder ein vorgegebener Schwellenwert für die F-Werte.
Um das Problem der Interkorrelation von univariaten Methoden zu umgehen und die Zahl der Wellenlängen (Features) weiter zu reduzieren ohne an Unterscheidungskraft einzubüßen kann auch ein multivariater Ansatz gewählt werden wie die multiple Kovarianzanalyse.
Das Prinzip bei der multiplen Kovarianzanalyse ist es iterativ alle nicht ausgewählten Wellenlängen (Features) mit bereits ausgewählten Wellenlängen (Features) zu verknüpfen und einen partiellen F-Wert zu berechnen. Die Wellenlänge mit der höchsten Einstufung wird in den Set der bereits ausgewählten Wellenlängen (Features) übernommen (die sogenannten Kontroll-Variablen) und entsprechend von dem Set der nicht ausgewählten Wellenlängen (Features) abgezogen. Diese Prozedur wird solange wiederholt, bis die gewünschte Zahl an ausgewählten Wellenlängen (Features) erreicht ist oder das Maximum der berechneten F- Werte unter einen vorbestimmten Schwellenwert fällt.
Die Vorverarbeitung der Spektren kann auch in einer Datenreduktion bestehen z. B. durch Methoden der multivariaten Statistik oder die Transformation der Daten mit Hilfe der Wavelet-Transformation wie die Hauptkomponenten-Zerlegung (z. B. Hauptkomponentenanalyse, Faktoranalyse).
Vor der Vorverarbeitung kann auch noch ein Schritt der Aufbereitung der Schwingungsspektren vorgenommen werden. In Frage kommende Methoden sind etwa Berechnung der ersten oder zweiten Ableitung, Spektren-Dekonvolution oder andere Verfahren zu Erhöhung des spektralen Kontrastes, die eine Bandenerkennung erleichtern und eine Minimierung etwaiger vorliegender Basislinienproblmen gestatten.
Insgesamt erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine Charakterisierung, Identifizierung oder Kennzeichnung der mikrobiellen Mischungen innerhalb weniger als einer Minute nach Erhalt der Probe.
Das Verfahren läßt sich sehr gut in einen Routineprozeß integrieren, da Spektrenaufnahme und Spektrenverarbeitung bzw. die Chromatographie und die nachfolgende Klassifizierung vollständig computergesteuert erfolgen und sich sehr leicht automatisieren lassen. Ein geringer Personalbedarf besteht infolge dessen lediglich für die an sich einfache Probenvorbereitung.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ohne Einbeziehung hochspezialisierter Fachleute durchgeführt werden, da die Klassifizierung der IR-Spektren/GC-Chromatogramme durch die für die Zwecke optimierte Verfahren der computergestützten Mustererkennung erfolgen. Die Bewertung anhand streng mathematischer Kriterien führt gleichzeitig zu einer hohen Sicherheit bei der Klassifizierung, und kommt ohne subjektives Erfahrungswissen aus.
Figuren und Beispiele
Es zeigen
Fig. 1 FT-IR Apsorptionsspektrurn von Aviguard®;
Fig. 2 1. Ableitung des Absoptionsspektrums von Aviguard®;
Fig. 3 schematische Darstellung einen künstlichen neuronalen Netzes mit 3 Schichten;
Fig. 4 schematische Darstellung eines Neurons z. B. aus der versteckten Schicht;
Fig. 5 Klassifizierung mittels RBF-Netzen mit lokalen Kernel-Funktionen (a.) und mit MLPs mit Hyperebenen (b.).
Beispiel 1 FT-IR Spektroskopie der Bakterienmischung Aviguard®
Beispielhaft wurde eine Charakterisierung des Produkts Aviguard® mit der erfindungsgemäßen Methode vorgenommen.
Aviguard® ist ein Produkt, das durch industrielle Fermentation hergestellt wird und aus einem breiten Spektrum von aeroben und anaeroben Bakterien besteht. Es wurde der Bakterienmischung im Darm von gesunden erwachsenen Hühnern nachgebildet. Basierend auf FT-IR Spektren von Aviguard® wurde ein Klassifizierungsschema erstellt, das der Klassifizierung als "pass" oder "fail" entsprechend dem in-vivo Qualitätstest einer Produkt- Charge aus dem Herstellungsprozess von Aviguard® entspricht. Dieser Qualitätstest mißt die Wirksamkeit von Aviguard® bei der Reduktion der Darmbesiedlung durch Salmonellen bei jungen Hühnern.
Die FT-IR Spektren von Aviguard®-Proben aus einem standardisierten Fermentations- Prozess wurden verglichen mit FT-IR Spektren von Proben, die denselben Fermentations- Prozess nicht erfolgreich durchlaufen hatten. Mit Mitteln der Chemometrie und Mustererkennung wurden die Unterschiede in den Spektren zwischen diesen beiden Gruppen extrahiert und für die Klassifizierung benutzt.
FT-IR Spektren von Aviguard® wurden mit einem Bruker IFS 28B Spektrometer mit einem ZnSe Probenhalter mit 15 Probenpositionen aufgenommen. Die Spektren wurden mit einem DTGS-Detektor und 64 Scans im Wellenlängenbereich von 4000-500 cm-1 aufgezeichnet. Die Fourier-Transformation wurde mit einer Blackman-Harris 3-Term apodization function, einem zero-filling Faktor von 4 zur Erreichung einer spektralen Auflösung von 6 cm-1 und einem encodingt interval von etwa 1 Punkt pro Wellenzahl durchgeführt.
Das Spektrometer wurde während der Aufnahmen mit 500-1000 l/h trockener Luft mit Hilfe eines Zander Lufttrockners geflutet, um so Artefakte durch Wasserdampflinien zu minimieren. Der Wasserdampfgehalt wurde während der Aufnahme der Spektren im Bereich von 1837 bis 1847 cm-1 gemessen und betrug nicht mehr als 0,0003 AU.
Das Signal-zu Rausch-Verhältnis betrug nicht mehr als 0,0003 von Peak zu Peak im Bereich von 2000 bis 2100 cm-1.
Ein Test zur Qualitätskontrolle der gemessenen FT-IR Spektren wurde auf die Spektren angewendet mit Schwellenwerten für minimale Absorption (0.3245 AU) und maximale Absorption (1.24 AU), um den Linearitätsbereich des Detektors zu bestimmen.
Vor jeder Messung an einer Probe wurde ein Hintergrundspektrum aufgenommen, um so den Hintergrund zu kompensieren.
Zu jeder Probe wurden 7 unabhängige Messungen durchgeführt, um Varianzen von Messung zu Messung für jede Probe mit aufzunehmen.
Ein Spektrum von Aviguard® ist beispielhaft in Fig. 1 dargestellt.
Die biochemischen Bestandteile von Aviguard® können 5 breiten IR-Absorptionsbändern zugeordnet werden: 1 - 3000-2800 cm-1 Fettsäurebereich, 2 - 1700-1500 cm-1 Proteinbereich, 3 - 1450-1200 cm-1 Mischbereich mit Carboxyl-Gruppen von Proteinen, freien Aminosäuren und Polysacchiariden (1450-140 cm-1) und RNA/DNA und Phospholopid-Gehalt (1250-­ 1200 cm-1), 4 - 1200-900 cm-1 Polysacchiaride, 5 - 900-700 cm-1 fingerprint-Bereich mit signifikantem Beitrag zur spezifischen Unterscheidung.
In einem ersten Verarbeitungsschritt wurde die erste Ableitung der aufgenommenen Spektren mit einem Savitzky-Golay Algorithmus mit 9-Punkten (A. Savitzky, M. J. Golay, Anal. Chem. 36: 1627-1638, 1964) berechnet und dann mit einer Vektor Transformation über den gesamten aufgenommenen spektralen Bereich normalisiert.
Fig. 2 zeigt die 1. Ableitung des Absorptionsspektrums aus Fig. 1 über den gesamten Wellenlängenbereich von 4000-500 cm-1.
Die Spektren der Proben von Aviguard® wurden jeweils einer von zwei Klassen zugeordnet, nämlich den Klassen "passed" und "failed". Basierend auf dieser Zuordnung wurde ein Vergleich zwischen den Spektren in den beiden Klassen vorgenommen, um die Varianzen der Spektren innerhalb der Klassen und zwischen den Klassen zu ermitteln (Wellenlängenselektion). Dabei wurden Prozeduren verwendet, die die Varianzen von Spektren innerhalb einer Klasse minimieren und zwischen den Klassen maximieren. Diese Prozedur wurde Datenpunkt für Datenpunkt über den gesamten gemessenen spektralen Bereich durchgeführt. Die sich ergebenden spektralen Features mit maximaler Unterscheidungskraft zwischen den Spektren der beiden Klassen wurden dann für die Klassifikation verwendet.
Die verwendete Methode bei dieser Wellenlängenselektion war die Kovarianzanalyse.
Als künstliches neuronales Netz zur Klassifikation wurde ein 3-Lagen MLP bestehend aus einer Eingabeschicht (input layer), einer verdeckten Schicht (hidden layer) und einer Ausgabeschicht (output layer), die untereinander vollständig verbunden waren, inklusive shortcut-Verbindungen, verwendet. Als Transferfunktionen wurden sigmoiden Transferfunktionen, sowohl in der verdeckten Schicht als auch auf den Ausgabeschicht verwendet.
Als Trainingsmethode für das künstliche neuronale Netz wurde eine Modifikation der Gradientenabstiegsmethode (Rumelhart D. und McClelland J. L., Parallel Distributed Processing: Exploration in the Microstructure of Cognition Vol. 1, 2, Cambridge, MA, MIT Press 1986), die als "Resilient Propagation" (Rprop) bezeichnet wurde (Riedmiller M. und Braun H. RPROP. a fast an robust backpropagation learning strategy. Proceedings of the IEEE International Conference on Neural Networks (ICNN) San Francisco 1993, p. 586-591) verwendet. Die Justierung der Gewichte erfolgte während des Trainings nicht nach dem Gradienten der Fehlerfunktion, sondern nach dem Vorzeichen dieses Gradienten. Dabei wurden die Steigungen der Fehlerfunktion des aktuellen und des vorherigen Zeitpunktes verwendet. Der Betrag der Gewichtsänderung hing also nicht vom Betrag der Steigung, sondern nur von ihrem Vorzeichen ab. Waren die Vorzeichen gleich, so konnte der Betrag erhöht werden, waren die Vorzeichen unterschiedlich, so wurde der Betrag verringert. Vorteil des Verfahrens bei RPROP ist, daß es anderen Verfahren in der Trainingszeit überlegen ist und gute Generalisierungseigenschaften aufweist.
Für die Beschreibung der Klassen wurde im Ausgabevektor des künstlichen neuronalen Netzes eine 1-aus-n-Kodierung benutzt, wobei jede Klasse durch eine Ausgabeeinheit repräsentiert wurde. Genau eine Position des Ausgabevektors war mit "1" kodiert (korrespondierend zu der Position der Klasse der das input pattern zugeordnet wurde), und alle anderen Positionen waren mit "0" kodiert.
Die Ergebnisse der Klassifizierung durch das trainierte neuronale Netz wurden dann mit einem Analyse-Werkzeug durch die Funktionen "winner takes all" (WTA) und "402040" evaluiert. Die WTA Funktion akzeptiert ein Ausgabepattern zu Klassifizierung, wenn ein Ausgabe-Neuron höher aktiviert ist, als die anderen. Die 402040-Regel verlangt, dass bei einem möglichen Ausgabe-Bereich von 0 bis 1 die Aktivierung eines Ausgabe-Neurons größer als 0,6 ist (die oberen 40% des Ausgabe-Bereichs), wobei die anderen Ausgabe- Neuronen weniger als 0,4 (die unteren 40% des Ausgabe-Bereichs) sind. Die output pattern bleiben in allen anderen Fällen unklassifiziert. Beide Methoden wurden zur Beschreibung des Ergebnisses herangezogen, wobei die 402040-Regel das strengere Kriterium der Ergebnisbewertung darstellt.
Der Datensatz bestand aus 10 Proben, die als "failed" gekennzeichnet wurden und 26 Aviguard® Proben, die als "passed" gekennzeichnet wurden. Jede Probe bestand aus 7 Wiederholungsmessungen, so daß sich entsprechend 70 FT-IR Spektren "failed" und 182 FT- IR Spektren "passed" ergeben. Die Validierung wurde anhand einer Kreuzvalidierung auf Basis der leave-one-out Methode (k = 1) vorgenommen, um Güte, Stabilität und Robustheit des erfindungsgemäßen Verfahrens zu prüfen.
Das Ergebnis der Klassifikation mit einer 3-Lagen MLP mit Kreuzvalidierung (k = 1) und 5 Eingangswellenlängen nach der Wellenlängenselektion ergab 86,82% richtig zugeordnete Spektren, keine falsch zugeordneten Spektren und 13,18% nicht zuordenbare Spektren. Der Fehler, als mittleres Fehlerquadrat (SSE) auf die Validierung bezogen, betrug 13,77 bei der "402040"-Validierungsmethode. Bei der "WTA"-Validierungsmethode ergaben sich 92,25% richtig zugeordnete Spektren, 7,75% falsch zugeordnete Spektren und keine nicht zuordenbare Spektren bei einem mittleren Fehlerquadrat (SSE) von 13,77.

Claims (17)

1. Verfahren zur Charakterisierung, Identifizierung oder Kennzeichnung von mikrobiellen Mischungen, dadurch gekennzeichnet, daß
  • a) Spektren/Chromatogramme der mikrobiellen Mischung aufgenommen werden,
  • b) eine Referenzdatenbank, die in zwei oder mehrere vorgegebene Klassen klassifizierte Spektren/Chromatogramme von mikrobiellen Mischungen enthält, bereitgestellt wird,
  • c) die Spektren/Chromatogramme der mikrobiellen Mischung nach Vergleich mit den Spektren/Chromatogrammen der Referenzdatenbank einer von zwei oder mehreren vorgegebenen Klassen zugeordnet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Spektren/Chromatogramme vor dem Schritt c. in einem Schritt b2. vorverarbeitet werden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorverarbeitung der Spektren/Chromatogramme in einer Datenreduktion besteht.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorverarbeitung der Spektren/Chromatogramme in einer Wellenlängenselektion im Falle der Spektren oder einer Feature-Selektion im Falle der Chromatogramme besteht.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorverarbeitung der Spektren/Chromatogramme in einer Datenreduktion und einer daran anschließenden Wellenlängenselektion im Falle der Spektren oder Feature-Selektion im Falle der Chromatogramme besteht.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Spektren/Chromatogramme vor dem Schritt c. oder gegebenenfalls vor dem Schritt b2. in einem Schritt b1. aufbereitet werden und diese Aufbereitung in der Bildung der ersten oder zweiten Ableitung, einer Spektren-Dekonvolution oder einem anderen Verfahren zu Erhöhung des spektralen Kontrastes liegt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzdatenbank in Form von Spektren/Chromatogrammen oder in Form von neuronalen Gewichten eines neuronalen Netzes vorliegt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Klassifizierung durch Mustererkennung, vorzugsweise mittels künstlicher neuronaler Netze, Methoden des maschinellen Lernens, Algorithmen der multivariaten Statistik, fallbasiertes Klassifizieren, genetische Algorithmen oder evolutionäres Programmieren erfolgt.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Algorithmen der multivariaten Statistik in einer Diskriminanzanalyse, Clusteranalyse, Distanzmaße oder Multiplen Regression oder Kombinationen hieraus bestehen.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß als künstliches neuronales Netz ein feed-forward-Netz mit 3-Lagen mit einer Gradientenabstiegsmethode als Lernalgorithmus oder ein künstliches neuronales Netz auf Basis radialer Basisfunktionen verwendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Lernalgorithmus resililient propagation (RProp), backpropagation, Quickprop und Varianten dieser Methoden verwendet werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlängenselektion im Falle der Spektren oder Feature-Selektion im Falle der Chromatogramme mit genetischen Algorithmen, der Kovarianzanalyse, der einfachen univariaten Varianzanalyse, einem statistischen Distanzmaß oder Diskriminanzverfahren erfolgt.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlängenselektion im Falle der Spektren oder Featureselektion im Falle der Chromatogramme visuell erfolgt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Datenreduktion durch Methoden der multivariaten Statistik oder die Transformation der Daten mit Hilfe der Wavelet-Transformation wie die Hauptkomponenten-Zerlegung (z. B. Hauptkomponentenanalyse, Faktoranalyse) erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den mikrobiellen Mischungen um Bakterienmischungen oder Mischungen von Hefen oder Pilzen oder allen drei Gruppen handelt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei den Spektren um IR, FT-IR, Raman- oder FT-Raman Spektren handelt und die Chromatogramme durch die Gaschromatographie (GC), oder durch Kopplung von GC mit der Massenspektroskopie (GC/MS) erstellt werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Spektrum ein in einer oder mehreren Regionen des mittleren Infrarotbereiches von 500 cm-1 bis 4000 cm-1 oder des nahen Infrarotbereiches von 1000 cm-1 bis 4000 cm-1 oder in beiden Regionen gemessen wird.
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