DE10050338A1

DE10050338A1 - Auf dem Nachweis von IGF-IRbeta und IRS-1 beruhendes Diagnose- bzw. Klassifizierungsverfahren für Carcinome

Info

Publication number: DE10050338A1
Application number: DE2000150338
Authority: DE
Inventors: Bernd Schnarr; Doris Mayer
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2000-10-11
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2002-04-25
Also published as: WO2002031500A3; WO2002031500A2

Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zur Diagnose und/oder Klassifizierung von Carcinomen, vorzugsweise Mammacarcinomen. Dieser Nachweis erfolgt vorzugsweise über einen anti-IGF-IRß- und/oder anti-IRS-1-Antikörper. Eine erniedrigte IRS-1- und/oder IGF-IRß-Expression stellt ein diagnostisches Anzeichen für ein niedrig differenziertes Carcinom (Stadium 3) dar, während eine hohe IRS-1- und/oder IGF-IRß-Expression ein diagnostisches Anzeichen für ein gut oder mäßig differenziertes Carcinom (Stdien 1 und 2) darstellt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose und/oder Klassifizierung von Carcinomen, vorzugsweise Mammacarcinomen. Dieser Nachweis erfolgt vorzugsweise über einen anti-IGF-IRβ- und/oder anti-IRS-1-Antikörper. Eine erniedrigte IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Expression stellt ein diagnostisches Anzeichen für ein niedrig differenziertes Carcinom (Stadium 3) dar, während eine hohe IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Expression ein diagnostisches Anzeichen für ein gut oder mäßig differenziertes Carcinom (Stadien 1 und 2) darstellt. Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen anti- IRS1- und/oder anti-IGF-IRβ-Antikörper enthaltenden Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Das Fortschreiten von Brustkrebs wird von einer Reihe von Verbindungen stimuliert, zu denen Steroidhormone und Peptid- Wachstumsfaktoren zählen. Während Östrogen bereits seit Jahrzehnten als ein Mitogen für epitheliale Zellen der Brust bekannt war, legen neuere Untersuchungen auch einen Zusammenhang zwischen hohen Plasmaspiegeln von Insulin (Insulinämie aufgrund von Fettsucht oder Diabetes des Typs II) und "insulin like growth factor-I" (IGF-I) und einem erhöhten Risiko für Brustkrebs für Frauen vor der Menopause nahe. Es konnte gezeigt werden, daß Östrogen und IGF-I synergistisch das Wachstum von Brustkrebszellen fördern, und es gibt aus in- vitro-Untersuchungen immer mehr Beweise für eine komplexe, wechselseitige Interaktion der Systeme der beiden Signalübertragungswege, die durch Östradiol und IGF-I ausgelöst werden. Östradiol erhöht durch Induktion der Expression von IGF-I und des IGF-I-Rezeptors (IGF-IR) und durch Stimulierung der Phosphorylierung und Aktivierung von IGF-IR und dessen stromabwärts liegenden Signalübertragungsmolekülen, wie z. B. dem Insulin-Rezeptor- Substrat 1 (IRS-1) die IGF-I-Signalübertragung. Umgekehrt führt die IGF-I-Signalübertragung zur Phosphorylierung und Aktivierung des Östrogen-Rezeptors. IGF-IR ist ein Heterodimer, das aus zwei Transmembran-β-Untereinheiten, die Tyrosinkinase-Aktivität zeigen, und zwei extrazellulären α-Ketten besteht, die die Ligandenbindungsdomäne umfassen. IGF-IR wird sowohl von IGF-I als auch Insulin aktiviert. Der Insulin-Rezeptor (IR) ist strukturell eng mit dem IGF-IR verwandt und wird hauptsächlich durch Insulin und - in geringerem Ausmaß - durch IGF-I aktiviert. Man weiß, daß sowohl die Insulin-Rezeptor- als auch die IGF-I-Rezeptor- Kinasen (IRS-1) phosphorylieren und aktivieren, welches das durch IGF-I und die Insulin-Signalübertragung aktivierte Schlüsselmolekül und ein zentrales "docking"-Protein darstellt, das an einer großen Anzahl weiterer Signalübertragungswege beteiligt ist.

Bisher wurde die Expression des Östrogen-Rezeptors hauptsächlich als prognostischer Marker bei Brustkrebs und als Ziel für die Therapie verwendet; allerdings zeigte sich, daß die mit diesem Marker ermittelten, diagnostischen Befunde oft unzuverlässig waren und auch eine Klassifizierung der Brusttumoren nicht erlaubten.

Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, Marker bereitzustellen, die eine verbesserte und spezifischere Diagnose oder Klassifizierung von Carcinomen, insbesondere Mammacarcinomen, erlauben, was u. U. die Auswahl der am besten geeigneten, therapeutischen Maßnahmen, z. B. chirurgische Maßnahmen, erleichtert.

Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß IRS-1 und IGF-IRβ hochspezifische Marker, vor allem in Gewebeschnitten, darstellen und neben der Diagnose vor allem eine Klassifizierung von Mammacarcinomen erlauben. In den zu der vorliegenden Erfindung führenden Studien wurde das Expressionsmuster des "insulin-like growth factor-I receptor-β" (IGF-IRβ), des Insulin-Rezeptors β (IRβ) und des Insulin-Rezeptorsubstrats 1 (IRS1) in 69 primären Brustkrebsproben unterschiedlicher Stadien und in 21 Kontrollgeweben durch Immunhistochemie untersucht. Parallel dazu wurden die Zellproliferation (Ki67-positive Zellkerne) und die Expression des Östrogen-Rezeptors (ER) bestimmt. Es zeigte sich, daß IGF-IRβ, IRS-1 und IRβ hauptsächlich in Epithelzellen exprimiert werden. Während die IRβ-Expression in allen untersuchten Geweben gering war, wurden IRS-1 und IGF- IRβ in Kontrollgeweben und in gut und mäßig differenzierten Carcinomen in hohen Spiegeln exprimiert, in niedrig differenzierten Brustkrebsen jedoch nur in geringen Spiegeln. Statistische Analysen (ROC-Analysen für das Tumorstadium) legen nahe, daß die Herunterregulation von IGF-IRβ und IRS-1 besser mit dem Fortschreiten des Tumors korreliert, als die Erniedrigung der ER-Expression oder die Steigerung der Zellproliferation, wobei IGF-IRβ die beste Korrelation zeigte, gefolgt von IRS-1 und, weniger signifikant, ER oder Ki67. Diese Befunde zeigen, daß IGF-IRβ und IRS-1 neue Markergene für die Klassifizierung von Tumoren darstellen. Außerdem scheint die Weiterentwicklung des Tumors nicht von einer hohen IGF-IRβ/IRS-1-Expression begleitet zu sein.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Diagnose und/oder zur Bestimmung des Differenzierungsstadiums eines Carcinoms, das dadurch gekennzeichnet ist, daß in einer Patientenprobe der IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Spiegel oder Spiegel der IRS-1- und/oder IGF- IRβ kodierenden mRNA bestimmt wird, wobei die Höhe des IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Spiegels oder Spiegels der IRS-1- und/oder IGF-IRβ kodierenden mRNA mit dem Differenzierungsstadium des Carcinoms korreliert ist. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich prinzipiell zur Diagnose/Klassifizierung jeder Tumorart, vorzugsweise von Mamma-, Leber- und Nierencarcinomen.

Geeignete Verfahren zur Gewinnung einer Patientenprobe sind dem Fachmann bekannt. Der Nachweis von IRS-1 bzw. IGF-IRβ kann über gängige Verfahren erfolgen, wobei von der bekannten Aminosäuresequenz der beiden Proteine oder der Nukleinsäuresequenz der entsprechenden Gene (vgl. EMBL- Datenbanken) ausgegangen wird. Dabei kann sich der Nachweis auf die Transkription (Nachweis der Konzentration der mRNA über gängige Verfahren, z. B. Northern-Blots, PCR, RT-PCR etc.) oder das IRS-1- bzw. IGF-IRβ-Protein selbst beziehen, wobei letzteres bevorzugt ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein erniedrigter IRS-1- und/oder IGF-IRβ- Spiegel ein diagnostisches Anzeichen für ein niedrig differenziertes Carcinom. Der Ausdruck "erniedrigter IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Spiegel" bezieht sich vorzugsweise auf den IRS-1- bzw. IGF-IRβ-Spiegel im Vergleich zu einer Kontrollprobe, die vorzugsweise von dem selben, allerdings gesunden Gewebe oder Organ stammt.

In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein hoher IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Spiegel ein diagnostisches Anzeichen für ein gut oder mäßig differenziertes Carcinom. Der Ausdruck "hoher IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Spiegel" bezieht sich vorzugsweise auf den IRS-1- bzw. IGF-IRβ-Spiegel im Vergleich zu einer Kontrollprobe, die vorzugsweise von dem selben, allerdings gesunden Gewebe oder Organ stammt. Dabei ist der Spiegel genauso hoch oder höher im Vergleich zu der Kontrollprobe.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Patientenprobe ein Gewebeschnitt, der nach allgemein üblichen Verfahren hergestellt werden kann, z. B. wie in dem nachstehenden Beispiel 1 angegeben.

In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der IRS-1- und/oder IGF-IRβ- Spiegel dadurch bestimmt, daß man die Patientenprobe mit einem anti-IRS1- und/oder anti-IGF-IRβ-Antikörper in Kontakt bringt und sodann bestimmt, in welchem Ausmaß der anti-IRS1- und/oder anti-IGF-IRβ-Antikörper an die Patientenprobe gebunden haben.

Dabei kann es sich bei den dafür geeigneten Antikörpern um monoklonale, polyklonale oder synthetische Antikörper oder Fragmente davon handeln. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des Antikörpers (z. B. Fab-, Fv- oder "single chain Fv"-Fragmente), welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um polyklonale oder monoklonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei vorzugsweise IRS-1 bzw. IGF-IRβ oder synthetische Fragmente davon als Immunogen dienen. Diese Polypeptide oder Peptide bzw. die Fragmente davon können z. B. durch Gewinnung des entsprechenden Gens, Klonierung und rekombinante Expression erzeugt werden. Verfahren zur Gewinnung polyklonaler oder monoklonaler Antikörper sind dem Fachmann bekannt. Für das erfindungsgemäße Diagnoseverfahren geeignete Antikörper sind auch im Handel erhältlich; siehe dazu die Angaben im nachstehenden Beispiel 1.

In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der IRS-1- und/oder IGF-IRβ- Spiegel über einen primären polyklonalen oder monoklonalen anti-IRS-1-Antikörper und/oder anti-IGF-IRβ-Antikörper und einen sekundären Antikörper und Alkalische-Phosphatase-anti- Alkalische-Phosphatase-Komplex (APAAP) bestimmt. Als Detektionssysteme sind ferner auch solche mit Peroxidase- oder Fluoreszenzfarbstoff-Markierungen zu nennen.

Der Nachweis der Bindung der (des) Antikörper(s) kann über übliche Verfahren erfolgen, z. B. immunhistochemische Verfahren, Western-Blot, ELISA, Radioimmunoassay (RIA) etc., wobei immunhistochemische Verfahren bevorzugt sind.

Die vorliegende Erfindung stellt auch Kits bereit, die für das erfindungsgemäße Diagnose- bzw. Klassifizierungsverfahren von Nutzen sind und vorzugsweise einen anti-IRS1- und/oder anti- IGF-IRβ-Antikörper enthalten und gegebenenfalls außerdem IRS-1 bzw. IGF-IRβ oder einen bindungsaktiven Teil davon zur Kontrolle. Der Ausdruck "bindungsaktiver Teil" bezeichnet ein Fragment, das mit dem Antikörper reagiert, mit dem auch das Gesamt-Molekül reagiert. Je nach Ausgestaltung des Kits kann der Antikörper an eine weitere Einheit konjugiert sein, beispielsweise eine Markierung, und/oder er kann auf einem festen Träger (Substrat) immobilisiert sein. Der Kit kann auch einen zweiten Antikörper zum Nachweis von anti-IRS-1- bzw. anti-IRβ-Antikörper-Komplexen enthalten. Der Antikörper oder das Fragment davon können frei vorliegen oder an einen festen Träger immobilisiert sein, beispielsweise eine Plastikschale, ein Teströhrchen, eine Mikrotiterplatte, ein Teststäbchen etc. Der Kit kann auch Anleitungen enthalten, die die Verwendung der Antikörper in dem Assay zur Klassifizierung des Tumors beschreiben. Der Kit kann weiterhin geeignete Reagenzien zum Nachweis von Markierungen oder zur Markierung positiver und negativer Kontrollen, Waschlösungen, Verdünnungspuffer etc. enthalten.

Kurze Beschreibung der Figuren Fig. 1 Expression des Insulin-Rezeptor-Substrats 1 (IRS-1) und des "insulin-like arowth factor-1 receptor-β (IGF-IRβ) in normalem Brustgewebe und bei Brustkrebs

A - C: Lobulus von normalem Brustgewebe. D - F: Teil eines gut differenzierten, ductalen Carcinoms (Pfeile), das von Bindegewebe umgeben ist. G - I: niedrig differenziertes, ductales Carcinom. A, D, G: Mit Hämatoxilin & Eosin (H & E) angefärbte Schnitte. Immunhistochemischer Nachweis von IRS-1 (B, E, H) und IGF-IRβ (C, F, I) in seriellen Schnitten zu A, D und G. A - C: Lobulus, der starke Expression von IRS-1 (B) und eine etwas weniger betonte Expression von IGF-IRβ (C) in allen epithelialen Zellen zeigt. D - F: Stadium-1-Carcinom (Pfeile) mit starker Expression von IRS-1 (E) und mäßiger bis starker Expression von IGF-IRβ (F). G - I: Stadium-3-Carcinom mit schwacher Expression von IRS-1 (H) und IGF-IRβ (I). K: In einigen Tumoren zeigte IRS-1 eine auffällige, perinucleäre Akkumulation (Pfeile). Die Spezifität des immunhistochemischen Assays wurde durch Ersatz des Antikörpers gegen Kaninchen-IgG (L) und Vorinkubation des Antikörpers gegen IRS-1 mit dem immunisierenden Peptid gezeigt (M, Adsorptionskontrolle). Die in L und M verwendeten Schnitte sind Serienschnitte zu K. Vergrößerungen:
A, B, C: × 150; D, E, F: × 240; G, H, I: × 120; K: × 510; L, M: × 200.

Fig. 2 A) Streuungsdiagramm von IRS-1 und IGF-IRβ

Die Datenpunkte sind zur besseren Sichtbarmachung der einzelnen Ergebnisse nach dem Zufallsprinzip gestreut. Tumorstadien sind als Stadium-3-Tumoren (geschlossene Kreise) und Stadium-1- oder Stadium-2-Tumoren (offene Kreise) gekennzeichnet.

B) Graphische Abschätzung der Klassifizierung von Stadium 3 vs. Stadium 1-2 (ROC-Analyse), die die Empfindlichkeit und Spezifität der Analyse als Funktion aller möglichen Schnittpunkte der Marker zeigt (siehe Beispiel 1)

Bewertung von IGF-IRβ: durchgehende Linie;
IRS-1: gestrichelte Linie;
Östrogen-Rezeptor (ER): gepunktete Linie.

Fig. 3 Expression von IRS-1 und IGF-IRβ in Lysaten von humanem Brustkrebsgewebe, nachgewiesen durch Western-Blots

Spuren 1-4: Carcinome des Stadiums 2;
Spuren 5-8: Carcinome des Stadiums 3 (20 µg Protein pro Spur).

Zu beachten ist die hohe Variation der Proteinexpression unter Tumoren desselben Stadiums.

Fig. 4 Muster der Tyrosinphosphorylierung in vier verschiedenen Brustkrebsproben des Stadiums 3

Die Proben entsprechen den in Fig. 3 gezeigten Proben. Jeweils 20 µg Protein wurden elektrophoretisch aufgetrennt, geblotted und mit für Phosphotyrosin spezifischen Antikörpern inkubiert. Zu beachten ist die hohe Variation in der Tyrosinphosphorylierung. Die bei etwa 170 kDa wandernde Bande wurde als IRS-1 identifiziert.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Allgemeine Verfahren A) Gewebepräparation

69 Brustkrebs-Proben (nachgewiesen durch histologische Diagnose) wurden mit Zustimmung der Ethikkommission der Universitätsklinik für Gynäkologie und Geburtshilfe aus Tumoren erhalten, die chirurgisch entfernt worden waren. Details sind in Tabelle 1 dargestellt. Normales Brustgewebe wurde von 15 Frauen erhalten, die keine Vorgeschichte bezüglich einer Brusterkrankung hatten und bei denen eine chirurgische Brustverkleinerung vorgenommen worden war, und von 6 Frauen mit einer gutartigen Brusterkrankung (Tabelle 1). Probenteile wurden in "Carnoy"-Fixiermittel (60% Ethanol, 30% Chloroform, 10% Eisessig) fixiert und in Paraffin eingebettet; andere Probenteile wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80°C aufbewahrt.

Tabelle 1

Patientenmerkmale und klinische Parameter von untersuchtem Brustgewebe und Brustkrebs

B) SDS-PAGE und Immun-Blotting

Schnitte von gefrorenen Proben wurden mit 0,1% Toluidinblau angefärbt und hinsichtlich der Anwesenheit von Tumorgewebe untersucht. Serielle Schnitte wurden gefriergetrocknet und in einem Puffer lysiert, der 50 mM Hepes (pH-Wert 7,1), 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl₂, 1% Nonidet P-40, 10% Glyzerin, 10 mM Na₄P₂O₇, 5 mM EDTA, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, 1 µg/ml Aprotinin, 1 µg/ml Antipain, 1 µg/ml Leupeptin, 1 µg/ml Pepstatin, 1 mM Na₃VO₄ und 1 mM NaF enthielt. Zelldebris wurden durch Zentrifugation (15.000 × g, 15 Min.) entfernt. Nach Zugabe von 2 × SDS-Puffer (100 mM Tris, pH-Wert 6,8, 4% SDS, 10% Glyzerin, 5% β-Mercaptoethanol und 0,2% Bromphenolblau) wurden die Proben 5 Min. bei 95°C inkubiert. Die Proteine (20 µg/Spur) wurden mittels 7,5% Polyacrylamidgelen getrennt und auf "Immobilon-P"-Membranen (Millipore, Eschwege, Deutschland) geblottet. Danach wurden die Membranen mit 3% BSA in TBST (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20) 1 Stunde behandelt, mit 1 µg/ml primären, polyklonalen Kaninchen-anti- IRS-1, -anti-IGF-IRβ, -anti-IRβ (Santa Cruz, Heidelberg, Deutschland) und -anti-Phosphotyrosin (Zymed Laboratories, San Francisco, CA, USA) 30 Min. bei Raumtemperatur und bei 4°C über Nacht inkubiert. Der sekundäre Antikörper war Meerrettich-Peroxidase(POD)-markierter Ziege-anti-Kaninchen- IgG (Dianova, Hamburg, Deutschland), und immunreaktive Banden wurden mit dem "ECLplus"-System von Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland) nachgewiesen. Die Proteinbeladung wurde durch Anfärbung der Membran mit Ponceau überprüft.

C) Immunhistochemie

Paraffinschnitte (3 µg dick) wurden mit Xylol entwachst und mit einer abgestuften Reihe von Ethanol-Inkubationen in wäßriges Millieu überführt. Die Objektträger wurden zur Zugänglichmachung des Antigens 10 bis 15 Min. in kochenden 0,01-M-Citrat-Puffer (pH-Wert 6,0) eingetaucht. Nach Blockierung mit "Dako® Protein Block Serum-Free" (DAKO, Diagnostika GmbH, Hamburg, Deutschland) wurden die Objektträger mit 5 µg/ml anti-IRS-1, 10 µg/ml anti-IRβ, 10 µg/ml anti-IGF-IRβ bzw. 7,5 µg/ml anti-Östrogen-Rezeptor (ER; Santa Cruz, Heidelberg, Deutschland)-Antikörper 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert, worauf sich eine weitere Inkubation (24 Stunden, 4°C) anschloß. Nach gründlichem Abspülen mit 50 mM Tris-Puffer (pH-Wert 7,4) wurden in zwei Zyklen 18 µg/ml Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Dianova, Hamburg, Deutschland) und danach ein 1 : 10 verdünnter Kaninchen-Alkalische-Phosphatase- anti-Alkalische-Phosphatase-Komplex (APAAP, Sigma, München, Deutschland) aufgebracht. Nach 5 Min. Waschen mit destilliertem Wasser wurden die Schnitte mit Naphthol-AS-BI- Phosphat (Sigma, München, Deutschland) als Substrat inkubiert und mit Neufuchsin als Chromogen gefärbt. Die Blockierung der endogenen Alkalischen Phosphatase wurde durch Zugabe von 1,73 mM Levasimol (Sigma, München, Deutschland) erreicht. Schließlich wurden die Schnitte mit Glyzerin-Gelatine präpariert. Serielle H & E-gefärbte Schnitte dienten zur Verifizierung der Diagnose der untersuchten Tumorproben.

Die Spezifität der Immunreaktion wurde durch Austausch des primären Antikörpers gegen 5 µg/ml affinitätsgereinigtes Kaninchen-IgG (Dianova, Hamburg, Deutschland) verifiziert. Außerdem wurde eine Flüssigadsorptions-Kontrolle durch Vorinkubation des anti-IRS-1-Antikörpers mit dem entsprechenden, zur Immunisierung verwendeten Peptid (Santa Cruz, Heidelberg, Deutschland) bei einem Mengenverhältnis von 1 : 20 mg/mg (3 Stunden, Raumtemperatur) durchgeführt. Die Festphasenadsorptions-Kontrolle wurde durch Bindung des immunisierenden Peptids an Nitrozellulose-Pulver und Inkubation des Antikörpers mit dem gebundenen Peptid durchgeführt. Nach Zentrifugation wurde der Überstand für die Immunhistochmie verwendet. Die Proliferation des Gewebes wurde durch den immunhistochemischen Nachweis der Ki67-Expression überprüft; der verwendete Antikörper war MIB-1 (Dianova, Hamburg, Deutschland). Zur Bestimmung des Prozentsatzes an Ki67-positiven Zellen wurden mindestens 1000 Zellkerne pro Schnitt einer Bewertung unterzogen.

D) Bewertung der Immunreaktivität

Objektträger wurden mittels Lichtmikroskop untersucht und von zwei Personen (unabhängig voneinander) bewertet. Die positiven Reaktionen von IGF-IRβ, IRβ und IRS-1 wurden entsprechend der Intensität der Anfärbung in die Stufen 0,25-0,5 (sehr schwach); 1 (schwach); 2 (mäßig), und 3 (stark) eingeordnet. Schnitte ohne sichtbare Reaktivität wurden als negativ (= 0) bewertet. Die Expression des Östrogen-Rezeptors (ER) wurde entsprechend des Anteils an positiven Zellen in 4 Kategorien eingeteilt (0, < 5% positive Zellen; 1,5-35% positive Zellen; 2, 36-70% positive Zellen; 3, 70-100% positive Zellen). Die Intensität der ER-Expression wurde mit negativ (0); schwach (1); mäßig (2), und stark (3) bewertet. Die Bewertung stellt die Summe der Intensität und des Prozentsatzes an positiven Zellen dar (Tabelle 2).

Tabelle 2

Expression des Insulinrezeptor-Substrats (IRS-1), Insulin-β-Rezeptors (IRβ), "insulin-like growth factor-I receptor-β" (IGF-IR-β) und des Östrogen-Rezeptors (ER) und Proliferationsrate (Ki67-positive Zellen) in Brusttumoren verschiedener Stadien im Vergleich zu Kontrollgewebe

E) Statistische Analysen

Für statistische Analysen wurden Brusttumoren anhand ihres Differenzierungsstatus (hoch oder mäßig differenziert versus schwach differenziert) in zwei Kategorien eingestuft. Zur Abschätzung der Nützlichkeit der IRS-1-, IGF-IRβ-, IRβ- und ER-Expression und Proliferation (unter Verwendung des Prozentsatzes an Ki67-positiven Zellkerne) als diagnostische Marker für die Tumorklassifizierung wurden die Bereiche unter den "Receiver Operating Characteristic"(ROC)-Kurven berechnet. Die ROC-Kurve stellte eine graphische Repräsentation der Paare falsch-positiver Testergebnisse (1-Spezifität) und wirklicher positiver Testergebnisse (Empfindlichkeit) für die Realisierung eines (semi-)quantitativen Diagnose-Tests dar. Vertrauensintervalle wurden unter Verwendung eines "bootstrap"-Vorgehens berechnet (Efron und Tibshirani: "An Introduction to the Bootstrap", New York, Chapman & Hall, 1993, 1 - 436). Der nicht-parametrische Vergleich der Bereiche unter den zwei ROC-Kurven erfolgte unter Verwendung des von DeLong et al. ("Biometrics", 44 (1988), 837-845) beschriebenen Verfahrens mittels der von Hellmich ("Receiver Operating Characteristic"(ROC)-Kurven und Flächen, darunter "Anwendungen in der Psychiatrie", Doktorarbeit, medizinische Fakultät der Universität Münster (1996), 1-110) beschriebenen S-Funktionen. Die Einberechnung fehlender Werte wurde für zwei fehlende Werte für den Prozentsatz an Ki67-positiven Nuclei gemäß Kuhfeld, "SAS technical report", R-108 (1990), 1 - 21, durchgeführt. Kombinationen möglicher, diagnostischer Marker wurden mittels einer logistischen Regressionsanalyse untersucht. In dem logistischen Regressionsmodell wurde das Alter als Covariable zusammen mit der IRS-1-, IGF-IRβ- und IRβ-Expression (Ordinalmaßstab), ER-Expression (dichotomisiert) und log10-transformierten Werten des Prozentsatzes an Ki67-positiven Nuclei als mögliche diagnostische Faktoren miteinbezogen. Zum Auffinden relevanter Kombinationen von Faktoren wurde ein Rückwärtsselektionsverfahren verwendet (Harrell, "Predicting outcomes, applied survival analysis and logistic regression", University of Virginia, 1998, 1 - 610). Die Modell-Validierung erfolgte mittels des "bootstrap-resampling" (Harrell, s. o.). Außerdem wurden Klassifizierungs- und Regressionsbäume (CART; Breiman et al., "Classification and Regression Trees", Belmont, CA. Wadsworth, Inc., 1984, 1 - 358) zum Auffinden von Kombinationen diagnostischer Marker für die Unterscheidung zwischen schwach differenzierten und hoch oder mäßig differenzierten Tumoren verwendet. CART erlaubt die Analyse der Interaktionseffekte zwischen den Markern. Die Bäume werden mittels rekursiver Partitionierung wachsen gelassen. Bei jedem Niveau, das einer maximal selektierten Teststatistik entspricht, die zu den Aufspaltungen aufgrund jeden Markers in Zusammenhang steht, wird ein Schnittpunkt für die Aufspaltung einer Gruppe in zwei Untergruppen ausgewählt. Die P-Wert- Anpassung erfolgte gemäß Lausen et al. ("Classification and regression-trees (CART) for the exploration of prognostic factors, measured on different scales", In: "Computational Statistics", Edited by Dirschedl, Ostermann, Heidelberg: Physica-Verlag, 1994, 4834 - 496).

Beispiel 2 Bestimmung der IGF-IRβ-, IRS-1- und IRβ-Expression und der Proliferationsrate in normalem Gewebe

56 von 69 untersuchten Mammacarcinomen waren ductalen, 7 lobulären und 6 gemischten, lobulären-ductalen Ursprungs oder zeigten tubulär-ductale Strukturen. 3 Carcinome zeigten Stadium 1 (hoch differenziert); 37 Stadium 2 (mäßig differenziert), und 29 Stadium 3 (schwach differenziert). Die 3 hoch und 37 mäßig differenzierten Carcinome wurden zusammen bewertet, da die Anzahl der Stadium-1-Tumore zur Bildung einer eigenen Gruppe zu klein war. 37 Patienten hatten einen positiven und 25 einen negativen Lymphknotenstatus. Die Tumorgröße betrug in 24 Fällen < 2 cm, in 36 Fällen 2-5 cm und in 9 Fällen < 5 cm. Kontrollgewebe wurde von 15 gesunden Frauen erhalten und von 6 Frauen mit einer gutartigen Brusterkrankung. Das mittlere Alter war 55 Jahre für Tumorpatienten und 28 Jahre für die Kontrollgruppe. Die klinischen Daten sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

In allen Kontrollgeweben wurde IGF-IRβ in luminalen und myoepithelialen Zellen der Drüsenläppchen und Milchgänge exprimiert; die Zellen zeigten eine mäßige bis starke Anfärbung der Membran und üblicherweise auch des Zytoplasmas. In einigen Fällen waren die Zellkerne der Drüsenepithel- Zellen positiv. Hier zeigten alle Zellen eines einzelnen Ductus oder Gruppen von Ductus ein Signal im Nucleus, während andere Ductus bezüglich der nucleären Anfärbung negativ waren, was Fixierungs- oder Anfärbungs-Artefakte ausschließt. IRS-1 wurde sowohl im Zytoplasma von Zellen des Drüsenepithels und Myoepithels der Gänge als auch von Acinus-Zellen stark bis mäßig exprimiert; manchmal wurden positive Nuclei beobachtet. IRS-1 und IGF-IRβ wurden auch in einzelnen Stroma-Zellen und in Blutgefäßen exprimiert. Typische Expressionsmuster von IRS- 1 und IGF-IRβ in einem Lobulus sind in den Fig. 1B und C gezeigt. IRβ wurde im Ductus und Lobulus von normalen Geweben nur schwach exprimiert. Die Expressionsmuster in Proben von einer gutartigen Brusterkrankung unterschieden sich nicht von denen in normaler Brust. Die Daten der Intensitätsbewertung sind in Tabelle 2 gezeigt. Das mittlere Alter der Kontrollen mit chirurgischer Brustverkleinerung betrug 28 Jahre (Bereich: 16-60 Jahre), das der Kontrollen mit einer gutartigen Brusterkrankung 41 (Bereich: 22-53 Jahre). Es bestand kein signifikanter Unterschied in der Intensität der IRS-1- und IGF-IRβ-Expression bei den beiden Gruppen und keine Alters abhängigen Änderungen. Der mit der IRS-1- und IGF-IRβ- Expression in Kontrollgewebe beobachtete, weite Bereich war jeweils durch einen Fall bedingt. Wenn diese Fälle nicht berücksichtigt werden, reicht die Intensität der IRS-1- Expression von 2,25 bis 3 und die der IGF-IRβ-Expression von 1,25 bis 2,75. Die Proliferationsrate (bestimmt durch Ki67- Markierung) war in normalem Gewebe gering (Tabelle 2).

Beispiel 3 Bestimmung der IGF-IRβ-, IRS-1- und IRβ-Expression in Carcinomen

Gewebe mit normalem Erscheinungsbild, das die Neoplasmen umgab, zeigte das gleiche IRS-1-, IGF-IRβ- und IRβ- Expressionsmuster wie das Gewebe von Kontrollen. Gut differenzierte (Stadium 1) und mäßig differenzierte (Stadium 2) ductale Carcinome waren durch eine mäßige, manchmal starke Expression von IRS-1 (Fig. 1E) und IGF-IRβ (Fig. 1F) gekennzeichnet. Die Immunreaktion für IRS-1 war auf das Zytoplasma beschränkt und zeigte manchmal eine auffallende intensive, perinucleäre Akkumulation (Fig. 1K). In einigen Tumorbereichen war die IRS-1-Expression in den Nuclei betont, während in anderen Bereichen des selben Tumors eine nucleäre Anfärbung fehlte. IGF-IRβ-Expression wurde in der Membran und im Zytoplasma der Tumorzellen beobachtet. Die Expression sowohl von IGF-IRβ als auch IRS-1 war in schwach differenzierten Carcinomen (Stadium 3) sowohl ductaler (Fig. 1H und I) als auch lobulärer Herkunft deutlich herunterreguliert. Einige der schwach differenzierten Tumoren waren sogar sowohl für IGF-IRβ (3/29) als auch IRS-1 (3/29) negativ. Andere Tumoren zeigten eine deutliche Mikroheterogenität der IRS-1-Expression, wobei einige Bereiche positiv, andere negativ waren. Diese wurden entsprechend dem am meisten vorherrschenden Muster klassifiziert, oder es wurden intermediäre Bewertungen zugeordnet, falls kohärente Tumormassen mit unterschiedlichen Intensitäten der Expression beobachtet wurden. Die Expression von IRβ war in allen untersuchten Tumoren schwach und änderte sich mit dem Fortschreiten der Erkrankung nicht signifikant. Einige Carcinome (6/69) waren vollständig negativ. Die Daten sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.

Beispiel 4 Bestimmung der Proliferationsrate und der Expression des Östrogen-Rezeptors in Carcinomen

Die Proliferationsrate der Carcinome (bestimmt durch Ki67- Markierung) zeigte eine starke Variabilität, jedoch eine signifikante Steigerung mit der Weiterentwicklung des Tumors. Östrogenrezeptoren wurden in 67% der gut und 73% der mäßig differenzierten Carcinome und in 41% der schwach differenzierten Carcinome exprimiert (Tabelle 2). Die Expressionsintensität und der Prozentsatz ER-positiver Zellen zeigten eine starke Variabilität.

Beispiel 5 Statistische Analysen

Statistische Analysen zeigten eine signifikante, negative Korrelation der Expression von IRS-1 (p = 0,001), IGF-IRβ (p < 0,001) und ER (p = 0,019) und eine positive Korrelation der Proliferationsrate (Ki67-Markierung; p = 0,008) mit dem Fortschreiten der Entdifferenzierung der Tumoren (Tabelle 3). Die Expression von IRβ konnte mit den Tumorstadien nicht korreliert werden. Tumoren mit geringem Differenzierungsgrad waren durch eine geringe Expression des Östrogenrezeptors und von IGF-IRβ/IRS-1 gekennzeichnet; es konnte jedoch in Tumoren des Stadiums 3 keine klare Korrelation zwischen der IRS-1- und IGF-IRβ-Expression mit der ER-Expression nachgewiesen werden.

Fig. 2A zeigt ein Streuungs-Diagramm von IRS-1, IGF-IRβ und der Klassifizierung aller untersuchter Tumoren. Das CART- Modell erlaubte einen "first level cut-off" von 1,00 (p_cor < 0,001) für IGF-IRβ und 1,25 (p_cor < 0,008) für IRS-1 für Stadium-1-/Stadium-2- bzw. Stadium-3-Tumoren. Die Figur zeigt deutlich, daß Tumoren des Stadiums 1 und des Stadiums 2 einer Gruppe zugeordnet werden können, während Stadium-3-Tumoren eine andere Gruppe bilden. Die Signifikanz der Korrelation der IRS-1-/IGF-IRβ-Expression und Klassifizierung wird durch die Hinzunahme der Daten hinsichtlich ER-Expression, Proliferationsrate oder Alter nicht weiter verbessert. Es ist beachtenswert, daß sich 3 der 8 Stadium-3-Tumoren, die unerwartet hohe Mengen an IRS-1 oder IGF-IRβ exprimierten (Bewertung < 1,5; Fig. 2A), als positiv für ER-Expression erwiesen. Fig. 2B zeigt eine graphische Abschätzung der Empfindlichkeit und Spezifität von IGF-IRβ, IRS-1 und ER als Marker für die Klassifizierung (ROC-Analyse). Es ist offensichtlich, daß die IGF-IRβ-Expression den besten Marker für die Tumorklassifizierung darstellt, gefolgt von IRS-1. Die ER-Expression ist weniger signifikant. Der Beitrag von Ki67 war mit dem von ER vergleichbar.

Tabelle 3

ROC-Analyse der Expression von IRS-1, IRβ und IGF-IR-β im Vergleich zur Proliferationsrate und ER-Expression in Brusttumoren in verschiedenen Stadien

Beispiel 6 Ergebnisse der Western-Blots

IGF-IRβ, IRS-1 und IRβ konnten in Kontrollgeweben und in Carcinomen verschiedener Stadien mittels Western-Blots von Lysaten gefrorener Gewebeproben eindeutig nachgewiesen werden. Fig. 3 zeigt die Expression von IRS-1 und IGF-IRβ in 4 Carcinomen des Stadiums 2 und 4 Tumoren des Stadiums 3, wobei derselbe Antikörper wie für die Immunhistochemie verwendet wurde. Die Intensität der Banden zeigte eine deutliche Variation und stimmte manchmal mit der Intensität der über Immunhistochemie beobachteten Proteinexpression nicht überein, was hauptsächlich durch unterschiedliche Mengen an stromalem Gewebe und Fett in den Proben bedingt war. Unterschiedliche Muster der Proteinphosphorylierung wurden durch anti- Phosphotyrosin-Immunblotanalyse nachgewiesen. Fig. 4 zeigt das Phosphotyrosin-Muster von 4 verschiedenen Tumoren des Stadiums 3. Die bei etwa 170 kDa wandernde Bande entspricht IRS-1 (nachgewiesen durch erneute Inkubation der Membran mit dem entsprechenden Antikörper). Die Intensität der Proteinbanden korrelierte nicht mit der Intensität der Tyrosin-Phosphorylierung.

Claims

1. Verfahren zur Diagnose und/oder zur Bestimmung des Differenzierungsstadiums eines Carcinoms, dadurch gekennzeichnet, daß in einer Patientenprobe der IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Spiegel oder Spiegel der IRS-1- und/oder IGF-IRβ kodierenden mRNA bestimmt wird, wobei die Höhe des IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Spiegels oder Spiegels der IRS-1- und/oder IGF-IRβ kodierenden mRNA mit dem Differenzierungsstadium des Carcinoms korreliert ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Carcinom ein Mammacarcinom ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein erniedrigter IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Spiegel ein diagnostisches Anzeichen für ein niedrig differenziertes Carcinom ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein hoher IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Spiegel ein diagnostisches Anzeichen für ein gut oder mäßig differenziertes Carcinom ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Patientenprobe ein Gewebeschnitt ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der IRS-1- und/oder IGF-IRβ-Spiegel dadurch bestimmt wird, daß man die Patientenprobe mit einem anti-IRS1- und/oder anti-IGF-IRβ-Antikörper in Kontakt bringt und sodann bestimmt, in welchem Ausmaß der anti-IRS1- und/oder anti- IGF-IRβ-Antikörper an die Patientenprobe gebunden haben.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der IRS-1- und/oder IGF- IRβ-Spiegel über einen primären, polyklonalen oder monoklonalen anti-IRS-1-Antikörper und/oder anti-IGF-IRβ- Antikörper und einen sekundären Antikörper und APAAP bestimmt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das ein immunhistochemisches Verfahren ist.

9. Diagnostischer Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 8, der einen anti-IRS1- und/oder anti-IGF-IRβ-Antikörper enthält.