DE10043504C2 - Verfahren zur Laser-Mikrodissektion und Verwendung einer Vorrichtung zur Laser-Mikrodissektion - Google Patents

Abstract

Es wird ein Verfahren und die Verwendung einer Vorrichtung zur Laser-Mikrodissektion interessierender Probenbereiche (23) einer Probe (4) angegeben. In einem ersten Schritt wird mittels eines Laserstrahls (7) eine Perforation mit Stegen (26, 27, 28) entlang einer den interessierenden Probenbereich (23) umschließenden Schnittlinie (25) erzeugt. Dabei weist die Perforation mindestens zwei, die Schnittlinie (25) unterbrechende Stege (26, 27, 28) auf, welche den interessierenden Probenbereich (23) mit der umgebenden Probe (4) verbinden. In einem zweiten Schritt werden die Stege (26, 27, 28) der Perforation mit einem einzigen, auf den interessierenden Probenbereich (23) gerichteten Laserimpuls abgerissen, wodurch der interessierende Probenbereich (23) von der Probe (4) getrennt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Laser-Mikrodissektion und die Verwendung einer Vorrichtung zur Laser-Mikrodissektion interessierender Probenbereiche einer Probe, die auf einem Probenhalter aufgebracht ist.

Mit Laser-Mikrodissektion wird im Bereich der Biologie und der Medizin ein Verfahren bezeichnet, mit dem aus einer im allgemeinen flachen Probe (bei­ spielsweise Zellen oder ein Gewebeschnitt) ein kleines Stück mit einem fei­ nen, fokussierten Laserstrahl ausgeschnitten wird. Das ausgeschnittene Stück steht damit für weitere biologische oder medizinische (z. B. histologische) Un­ tersuchungen zur Verfügung.

Die WO 97/11156 A2 beschreibt ein System zur Bereinigung von Zellkulturen. Es umfasst ein aufrechtes Mikroskop mit einem in das Mikroskop eingekoppelten Laserstrahl, vorzugsweise UV-Laserstrahl. Ungewünschte Zellkulturen eines Gewebedünnschnittes auf der Oberseite eines planaren Trägers werden mit dem fokussierten Laserstrahl weggebrannt. Die verbliebenen Zellen werden von dem Träger physikalisch abgelöst und zellbiologisch untersucht.

In einem Artikel in Cell. Mol. Biol. 44 (5) 1998, S. 735-746 ist offenbart, dass das interessierende biologische Präparat vollständig von dem umgebenden Präpa­ rat freipräpariert wird. Anschließend wird das interessierende biologische Prä­ parat mittels eines einzigen Lasserschusses in eine Auffänger katapultiert.

In einem Artikel in Onkologie 22, 1999, S. 296-301 ist offenbart, dass das inte­ ressierende biologische Präparat vollständig von dem umgebenden Präparat mittels eines geeigneten Lasers freipräpariert wird. Anschließend wird das interessierende biologische Präparat mittels einer Nadel aufgenommen und in ein PCR-Gefäß überführt.

Die WO 97/29355 A1 (bzw. die korrespondierende US 5,998,129) und die im we­ sentlichen wortgleiche WO 97/29354 A1 beschreiben ein solches Verfahren und eine Vorrichtung zur Laser-Mikrodissektion. Die Probe ist auf einem festen, planen Träger angeordnet, beispielsweise einer polymeren Trägerfolie, die über einen laborüblichen Objektträger aus Glas gespannt ist. Das beschriebe­ ne Verfahren arbeitet in zwei Schritten. In einem ersten Schrift wird mit einem Laserstrahl ein interessierender Probenbereich der Probe, auf dem sich z. B. ein selektierter Zellverband oder ein histologischer Schnitt befindet, mit einem Laserstrahl ausgeschnitten. Die Schnittlinie des Laserstrahls beschreibt dazu eine geschlossene Kurve um den interessierenden Probenbereich. Nach dem Schnitt liegt bzw. haftet der ausgeschnittene, interessierende Probenbereich dann noch auf seinem Untergrund. Daher wird in einem zweiten Schritt ein zusätzlicher Laserschuss auf den interessierenden Probenbereich gerichtet und dadurch der interessierende Probenbereich in Richtung des Laserstrahls in ein Auffanggefäß geschleudert.

Ein Nachteil dieses Verfahrens tritt beim ersten Verfahrensschritt auf. Kurz bevor die Schnittlinie geschlossen ist, ist der ausgeschnittene, interessierende Pro­ benbereich nur noch mit einem schmalen Steg mit der umgebenden Probe verbunden. Bedingt durch elektrische Aufladung oder durch mechanische Spannung im Steg, klappt in diesem Stadium des Schnitts der bisher ausge­ schnittene, interessierende Probenbereich häufig weg, d. h. aus der Fokus­ ebene des Laserstrahls heraus oder hinter die verbleibende Trägerfolie. Eine Fertigstellung des Schnitts des weggeklappten interessierenden Probenbe­ reichs ist nicht möglich, da der umgeklappte Teil des Probenbereichs in die Schnittlinie ragt und damit beim weiteren Schneiden beschädigt wird. Zugleich ist ein Weitertransport des ausgeschnittenen Probenbereichs mittels Laser­ schuss damit erschwert oder sogar unmöglich, da keine ausreichende An­ griffsfläche für den Laserschuss vorhanden ist.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Laser-Mikrodissektion anzugeben, welches eine gezielte Trennung eines interessierenden Proben­ bereichs aus einer Probe erlaubt und ein Wegklappen des interessierenden Probenbereichs verhindert.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Laser-Mikrodissektion inte­ ressierender Probenbereiche einer Probe, die auf einem Probenhalter aufge­ bracht ist, welches erfindungsgemäß folgende Schritte aufweist:

• - Erstellen einer Perforation mit Stegen entlang einer den interessieren­ den Probenbereich umschließenden Schnittlinie mittels eines Laser­ strahls, wobei die Perforation mindestens zwei, die Schnittlinie unter­ brechende Stege aufweist, welche den interessierenden Probenbe­ reich mit der umgebenden Probe verbinden, und
• - Abreißen der Stege der Perforation mit einem einzigen, auf den in­ teressierenden Probenbereich gerichteten Laserimpuls, wodurch der interessierende Probenbereich von der Probe getrennt wird.

Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, die Verwendung einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens zur Laser-Mikrodissektion anzugeben, welches eine gezielte Trennung eines interessierenden Probenbereichs aus einer Probe erlaubt und ein Wegklappen des interessierenden Probenbereichs verhindert.

Diese Aufgabe wird durch die Verwendung einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruchs 7 gelöst.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die zu untersuchenden Proben, aus denen interessierende Probenbereiche ausgeschnitten werden sollen, auf sehr dünne Kunststoff-Filme präpariert. Die Dicke dieser Kunststoff-Filme liegt in der Größenordnung zwischen 1 bis 2 µm. Es können beispielsweise PET- Filme verwendet werden. Die besten Schnittergebnisse wurden jedoch mit PEN-Filmen erzielt. Damit ist es möglich, schmale und zugleich stabile Stege zu erzeugen. Es hat sich als besonders günstig für das Verfahren erwiesen, wenn Stege mit einer Breite von ungefähr 1 µm stehen gelassen werden. Die Kunststoff-Filme sind in bekannter Weise über einen Probenhalter gespannt. Dies kann z. B. ein laborüblicher Objektträger aus Glas sein. Andere Probenhalter (Form, Material) sind jedoch denkbar. Der Probenhalter liegt auf einem xy-Tisch auf, der es erlaubt, unterschiedliche Probenbereiche zu betrachten und auszuwählen. Die Vorrichtung weist üblicherweise mindestens ein Be­ hältnis zum Auffangen eines ausgeschnittenen, interessierenden Probenbe­ reichs in der Nähe der Probe auf.

Eine Ausführungsform der verwendeten Vorrichtung weist einen fest­ stehenden Laserstrahl auf, und die Schnittlinien-Steuerungseinheit umfasst einen verfahrbaren xy-Tisch, welcher beim Erstellen einer Perforation die Pro­ be relativ zu dem feststehenden Laserstrahl bewegt. Dabei werden sehr hohe Anforderungen an die Positioniergenauigkeit des xy-Tisches gestellt, um eine exakte Schnittlinie zu erzeugen. Der xy-Tisch wird vorzugsweise motorisch verfahren.

In einer anderen Ausführungsform der verwendeten Vorrichtung um­ fasst die Schnittlinien-Steuerungseinheit eine Laser-Scan-Einrichtung, welche beim Erstellen einer Perforation den Laserstrahl relativ zu einer feststehenden Probe bewegt. Dazu wird beim Erstellen der Perforation der xy-Tisch mit dem aufliegenden Probenhalter und der Probe nicht verfahren. Die Schnittlinie der Perforation entsteht ausschließlich durch Ablenken des Laserstrahls über die Probe.

Besonders vorteilhaft ist eine Ausführungsform der verwendeten Vorrichtung, in welcher die Mittel zum Erstellen einer Perforation eine Laser-Steuerungseinheit umfassen, welche die Betriebsparameter des Lasers steuert. Diese Betriebsparameter sind beispielsweise die Laser-Leistung, die Laser-Pulsdauer oder die Laser- Schnittbreite. Zusätzlich können die Mittel zum Erstellen einer Perforation eine Autofokusvorrichtung für den Laser umfassen. Dadurch ist eine Automatisie­ rung des Perforationsvorgangs möglich.

Weiterhin können die Mittel zum Abreißen der Stege der Perforation eine Per­ foration-Steuerungseinheit zur Steuerung der Schnittlinien-Steuerungseinheit und der Laser-Steuerungseinheit umfassen. Dazu erweist es sich als günstig, wenn die Perforation-Steuerungseinheit zusätzlich Mittel zum Defokussieren des Lasers umfasst. Dann braucht ein Benutzer der Vorrichtung zum Abreißen der Stege den Laser nicht mehr manuell defokussieren. Dieses Defokussieren stellt einen wesentlichen Teil des Verfahrens dar, weil dadurch der Laserstrahl aufgeweitet und seine Energie auf eine größere Fläche verteilt wird. Dadurch wird in dem interessierenden Probenbereich kein Schnitt mehr erzeugt, son­ dern der Laserimpuls zum Abreißen der Stege genutzt.

Anschließend kann mittels der Autofokusvorrichtung für die Laser- Mikrodissektion eines anderen interessierenden Probenbereichs sehr schnell und zuverlässig eine Fokussierung des Lasers vorgenommen werden. Da­ durch ist eine Automatisierung des gesamten Verfahrens möglich.

In anderen Ausführungsformen der verwendeten Vorrichtung sind Mittel zur Auswahl der Schnittlinie oder Mittel zur Auswahl der Schnittlinie und der Lage der Stege durch einen Benutzer vorgesehen. Zusätzlich können Mittel zur Auswahl der Breite der Stege und zur Auswahl der Lage der Stege durch einen Benutzer vorgesehen sein. Durch diese Auswahlmöglichkeit kann der Benutzer vor dem Erstellen der Perforation den richtigen interessierenden Probenbereich gezielt auswählen und zugleich wichtige Stellen der Probe vor Beschädigungen schützen. So entstehen beispielsweise im Bereich der Stege Riss-Strukturen zwischen dem interessierenden Probenbereich und der umgebenden Probe. Indem der Benutzer beispielsweise die Stege auf unkritische Zellstrukturen der Probe legen kann, werden kritische, interessierende Zellstrukturen inner­ halb des interessierenden Probenbereichs vor solchen Riss-Strukturen ge­ schützt.

Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt den Vorteil, dass ein Wegklappen des interessierenden Probenbereichs beim Schneiden ausgeschlossen ist. Dadurch ist ein problemloses Schneiden der Probe möglich. Außerdem ist eine zuverlässige Entnahme des ausgeschnittenen, interessierenden Proben­ bereichs möglich. Eine Automatisierung des Verfahrens und der Vorrichtung ermöglicht einen Einsatz im routinemäßigen Laborbetrieb.

Das Verfahren und die zur Durchführung des Verfahrens verwendete Vorrichtung werden nachfolgend anhand der schematischen Zeichnung genau­ er beschrieben. Es zeigen:

Fig. 1: eine Vorrichtung zum Laserschneiden mit einem feststehenden Laserstrahl;

Fig. 2: eine Probe mit einer Perforation um einen interessierenden Proben­ bereich;

Fig. 3: eine Vorrichtung zum Laserschneiden mit einem beweglichen Laser­ strahl.

In den Figuren sind gleiche Vorrichtungselemente mit denselben Bezugszif­ fern bezeichnet.

In Fig. 1 ist eine Vorrichtung zum Laserschneiden dargestellt, welche mit ei­ nem feststehenden Laserstrahl und einer relativ dazu bewegten Probe arbei­ tet. Sie weist ein Mikroskop 1 mit einem motorisch verfahrbaren xy-Tisch 2 auf. Der xy-Tisch 2 dient zur Aufnahme eines Probenhalters 3, auf dem eine zu untersuchende bzw. zu schneidende Probe 4 ist aufgebracht ist. Ferner ist ein Beleuchtungssystem 5 sowie ein Laser 6 vorgesehen, der einen Laser­ strahl 7 erzeugt, der zum Schneiden der Probe 4 auf diese fokussiert wird. Der xy-Tisch 2 dient als Schnittlinien-Steuerungseinheit und erzeugt während des Schneidvorgangs eine Relativbewegung zwischen dem Laserstrahl 7 und der Probe 4.

Bei dem dargestellten Mikroskop 1 handelt es sich um ein Durchlicht- Mikroskop, bei dem das Beleuchtungssystem 5 an einem Mikroskopstativ 8 unterhalb des xy-Tisches 2 und der Probe 4 angeordnet ist. Mindestens ein Objektiv 9 des Mikroskops 1 äst oberhalb des xy-Tisches 2 und der Probe 4 angeordnet. Das Objektiv 9 definiert eine optische Achse 10, die mit der opti­ schen Achse des Beleuchtungssystems 5 fluchtet.

In dieser beschriebenen Anordnung wird die Probe 4 mit einer Durchlicht- Beleuchtung betrachtet. Das Laserschneiden könnte ebenso auch mit einem inversen Mikroskop ausgeführt werden, bei dem das Beleuchtungssystem 5 oberhalb des xy-Tisches 2 und das mindestens eine Objektiv 9 unterhalb des xy-Tisches 2 angeordnet ist.

Das von dem Beleuchtungssystem 5 ausgestrahlte Licht wird durch einen Kondensor 11 von unten auf den auf dem xy-Tisch 2 angeordneten Proben­ halter 3 mit der Probe 4 gerichtet. Das die Probe 4 durchdringende Licht ge­ langt zum Objektiv 9 des Mikroskops 1. Innerhalb des Mikroskops 1 wird das Licht über nicht dargestellte Linsen und Spiegel mindestens einem Okular 12 des Mikroskops 1 zugeleitet, durch welches ein Bediener die auf dem xy-Tisch 2 angeordnete Probe 4 betrachten kann.

Im Mikroskopstativ 8 des Mikroskops 1 ist ein optisches System 13 in der opti­ schen Achse 10 des Objektivs 9 vorgesehen. Das optische System 13 kann z. B. ein dichromatischer Teiler sein. Ferner ist es denkbar, dass das optische System 13 aus mehreren optischen Bauteilen besteht. Dies ist dann der Fall, wenn der Laserstrahl 7 mehrfach umgelenkt werden muss. Ferner ist im La­ serstrahl 7 eine Blende 14 vorgesehen, mit welcher der Durchmesser des La­ serstrahls 7 in entsprechender Weise beschränkt werden kann. Die Blende 14 kann z. B. als eine Festblende ausgebildet sein. In einer vorteilhaften Ausfüh­ rungsform können mehrere Festblenden 14 auf einer Revolverscheibe oder einem Linearschieber angeordnet sein, um eine dieser Festblenden als die jeweils erforderliche Blende 14 in den Strahlengang einzubringen. Das Ein­ bringen in den Laserstrahl 7 kann manuell durch den Benutzer oder motorisch durchgeführt werden.

In der hier dargestellten Ausführungsform ist die Blende 14 als eine Vario­ blende, beispielsweise als eine Irisblende, ausgebildet, deren Durchmesser über einen Blenden-Motor 15 gesteuert wird. Der Blenden-Motor 15 erhält von einem Rechner 16 die nötigen Steuersignale zum Einstellen des erforderli­ chen Blendendurchmessers.

Das Mikroskop 1 ist ferner mit einer Kamera 17 versehen, die ein Bild von der zu schneidenden Probe 4 aufnimmt. Dieses Bild ist auf einem Monitor 18 dar­ stellbar, der mit dem Rechner 16 verbunden ist. Das System aus Rechner 16, Kamera 17 und Monitor 18 stellen in dieser Ausführungsform Mittel zum Erstellen einer Perforation dar. Sie können dazu verwendet werden, um den mit dem Laser 4 durchgeführten Schneidevorgang zu beobachten und zu überwachen. So kann der Rechner an den Laser Triggersignale zur Auslösung von Laserimpulsen und zur Steuerung der Laserleistung abgeben, den Blen­ den-Motor 15 ansteuern und eine (nicht dargestellte) Autofokuseinrichtung für den Laser 6 ansteuern.

Ferner kann auf dem Monitor 18 der auszuschneidende, interessierende Pro­ benbereich der Probe 12 mittels eines Mauszeigers umfahren werden. Die Lage der Stege kann durch eine Software im Rechner 16 automatisch be­ stimmt werden. Es erweist sich jedoch als vorteilhaft, wenn ein Benutzer auch die Lage der Stege mittels Mausclick vorbestimmen kann. So können die Ste­ ge in Bereiche gelegt werden, in denen beim nachfolgenden Abreißen Risse auftreten dürfen, ohne die Information über den interessierenden Probenbe­ reich zu beeinträchtigen. Entlang der so gekennzeichneten Schnittlinie wird dann der Schneidevorgang mittels des Laser 4 ausgeführt und die gewünsch­ te Perforation erstellt.

Als Mittel zum Abreißen der Stege ist in dieser Ausführungsform eine in den Rechner 16 integrierte Steuerung zum automatischen De-Fokussieren des Lasers 6 vorgesehen. Zusätzlich kann durch eine Software im Rechner 16 aus der vorgewählten Schnittlinie die Mitte des interessierenden Probenbereichs bestimmt werden. Dann kann der xy-Tisch 2 so verfahren werden, dass der feststehende, defokussierte Laserstrahl 7 beim Abreißen der Stege auf diesen berechneten Mittelpunkt gerichtet ist.

Unterhalb der Probe 4 ist mindestens ein Auffangbehältnis 19 zum Auffangen des ausgeschnittenen, interessierenden Probenbereichs angeordnet.

Anhand Fig. 2 wird nachfolgend das erfindungsgemäße Verfahren beschrie­ ben.

Dargestellt ist ein Kamerabild einer Probe 4 mit einer Vielzahl von Zellen 22. Ungefähr in der Mitte der Probe 4 liegt eine interessierender Probenbereich 23, in dem eine abweichende Zellstruktur 24, z. B. eine mutmaßliche Krebszel­ le, liegt. Dieser interessierende Probenbereich 23 soll für weitere Untersu­ chungen aus der Probe 4 entnommen werden.

Dazu wird von einem Benutzer unter Benutzung einer entsprechenden Soft­ ware mittels einer Computermaus im Kamerabild eine gewünschte Soll- Schnittlinie für die zu erzeugenden Perforation markiert. Außerdem wird die Anzahl und gewünschte Lage der Stege der Perforation markiert.

Entsprechend der aktuellen eingestellten Schnittbreite des Laserstrahls 7 wird mit dem Rechner 16 zu der definierten Soll-Schnittlinie eine Anzahl von Soll­ positionen des Laserstrahls auf der Probe 4 berechnet, wobei die aneinander gereihten Sollpositionen des Laserstrahls 7 die gewünschte Soll-Schnittlinie ergeben.

Zum Erzeugen der Perforation wird dann der Tisch schrittweise so verfahren, dass der Laserstrahl 7 nacheinander an den berechneten Sollposition auf die Probe 4 auftrifft. In jeder Sollposition wird von dem Rechner 16 jeweils ein Triggersignal erzeugt, an den Laser 6 gesendet und von diesem entsprechend ein Laserimpuls abgestrahlt. Auf diese Weise wird mit dem Laser 6 um den interessierenden Probenbereich 23 die dargestellte Perforation erzeugt. Die Perforation besteht aus der durch Stege 26, 27, 28 unterbrochenen Schnittli­ nie 25. Der interessierende Probenbereich ist dann nur noch durch die drei Stege 26, 27, 28 mit der umgebenden Probe 4 verbunden.

Im letzten Verfahrensschritt werden diese Stege 26, 27, 28 mit einem auf die Mitte des interessierenden Probenbereichs 23 gerichteten Laserimpuls abge­ rissen. Der auf diese Weise dissektierte, interessierende Probenbereich 23 fällt in ein darunter angeordnetes Auffanggefäß (nicht dargestellt) herab. Der Laserimpuls zum Abreißen der Stege 26, 27, 28 wird vorzugsweise mit einem deutlich defokussiertem Laserstrahl 7 durchgeführt, um in dem interessieren­ den Probenbereich möglichst biologische Veränderungen zu vermeiden. Ins­ besondere wird durch den aufgeweiteten Laserstrahl eine Perforation in dem interessierenden Probenbereich ausgeschlossen.

Fig. 3 zeigt ein Laser-Mikro-Dissektionsgerät zur Durch­ führung des erfindungsgemäßen Verfahrens, welches beim Schneiden einen Laserstrahl über eine festgehaltene Probe bewegt.

Das Laser-Mikro-Dissektionsgerät umfasst ein Mikroskop 1 mit einem verfahr­ baren xy-Tisch 2, auf dem ein Probenhalter 3 angeordnet ist. An der Untersei­ te des Probenhalters 3 befindet sich eine zu schneidende Probe 4. Unter dem xy-Tisch 2 sind ein Beleuchtungssystem 5 und ein Kondensor 11 angeordnet, der die Probe 4 beleuchtet. Der xy-Tisch 2 wird während des Schneidvor­ gangs horizontal, also in x-Richtung und in y-Richtung, nicht verfahren. Unter­ halb der Probe 4 ist mindestens ein Auffangbehältnis 19 zum Auffangen des ausgeschnittenen, interessierenden Probenbereichs angeordnet.

Von einem Laser 6, in diesem Beispiel ein UV-Laser, geht ein Laserstrahl 7 aus, der in einen Beleuchtungsstrahlengang 20 eingekoppelt wird. In dem Be­ leuchtungsstrahlengang 20 ist eine Laser-Scan-Einrichtung 31 angeordnet. Der Laserstrahl 7 durchläuft die Laser-Scan-Einrichtung 31 und gelangt über ein optisches System 13 zu einem Objektiv 9, das den Laserstrahl 7 auf die Probe 4 fokussiert. Das optische System 13 ist mit Vorteil als dichromatischer Teiler ausgeführt, durch den ein von der Probe 4 durch das Objektiv 9 ausge­ hender Abbildungsstrahlengang 21 zu mindestens einem Okular 12 gelangt.

Die Einstellung der Laser-Scan-Einrichtung 31 und damit die Verstellung des Laserstrahls 7 auf der Probe 4 erfolgt in dieser Ausführungsform mit Mitteln zum Erstellen einer Perforation, die einen der Laser-Scan-Einrichtung 31 zu­ geordneten Motor 32, eine Steuerungseinheit 33 und einen Rechner 16 um­ fassen. Der Motor 32 ist mit der Steuerungseinheit 33 verbundenen, welche die Steuersignale zur Ansteuerung des Motors 32 liefert. Die Steuerungsein­ heit 33 ist mit dem Rechner 16 verbunden, an den ein Monitor 18 angeschlos­ sen ist.

Die Laser-Scan-Einrichtung 31 selbst dient als Schnittlinien- Steuerungseinheit, die während des Schneidvorgangs eine Relativbewegung zwischen dem Laserstrahl 7 und der Probe 4 erzeugt. Die Fokussierung des Laserstrahls 7 kann durch manuelles Verfahren des xy-Tisches 2 in der Höhe bei gleichzeitiger visueller Kontrolle des Kamerabildes durch einen Benutzer erfolgen. Bedienungsfreundlicher ist jedoch eine Ausführungsform der Vorrichtung, die eine Autofokus-Vorrichtung (nicht dargestellt) für den Laserstrahl 7 umfasst.

Durch Ansteuerung der Laser-Scan-Einrichtung 31 erscheint der Laserstrahl 7 am Ausgang der Laser-Scan-Einrichtung 31 unter verschiedenen Ablenkwin­ keln. Dabei kann der Laserstrahl 7 durch Variation des Ablenkwinkels auf be­ liebige Positionen auf der Probe 4 geführt werden, die innerhalb des Sehfel­ des des Objektivs 10 liegen. Durch geeignete Ansteuerung der Laser-Scan- Einrichtung 31 wird auf der Probe 4 eine Schnittlinie erzeugt. Der ausgeschnit­ tene Teil der Probe 4 fällt in ein Auffanggefäß 17, das unterhalb der Probe 4 auf dem xy-Tisch 2 angeordnet ist.

Auf dem Monitor 18 wird das von einer Kamera 17 aufgenommene Bild der Probe 4 dargestellt. Als Vorbereitung zum Heraustrennen eines interessieren­ den Probenbereichs kann auf dem Monitor 18 mittels einer Rechner-Maus (nicht dargestellt) oder einer anderen beliebigen Cursorsteuerungseinrichtung eine Schnittlinie definiert werden. Der Rechner 16 ist außerdem mit der Laser­ lichtquelle 6 verbunden und liefert nur dann diesem Triggersignale zum Auslö­ sen von Laserpulsen, wenn ein Schnitt durchgeführt wird.

Die Schnittbreite eines Lasers in einer Probe hängt ab von den Laserparame­ tern, wie z. B. Laserleistung und Apertur des Laserstrahls 7. Diese Schnittbrei­ te wird vorher bestimmt oder ist in Abhängigkeit von den Laserparametern in einer Tabelle im Rechner 16 abgelegt. Entsprechend der aktuellen eingestell­ ten Schnittbreite wird zu der definierten Soll-Schnittlinie eine Anzahl von Soll­ positionen des Laserstrahls auf der Probe 4 berechnet, wobei die aneinander gereihten Sollpositionen des Laserstrahls 7 die gewünschte Soll-Schnittlinie ergeben.

Dann werden auf der Probe 4 nacheinander die Sollpositionen mit der Laser- Scan-Einrichtung 31 angefahren. Jedesmal, wenn die Sollposition des Laser­ strahls 7 auf der Probe 4 mittels der Laser-Scan-Einrichtung 31 vorbereitet bzw. eingestellt wurde, liefert der Rechner 16 Triggersignale zum Auslösen von Laserpulsen an die Laserlichtquelle 6. Auf diese Weise wird schrittweise die Schnittlinie erzeugt.

In einem zweiten Verfahrensschritt werden die Stege mit einem einzigen La­ serimpuls abgerissen. Als Mittei zum Abreißen der Stege ist in dieser Ausfüh­ rungsform eine in den Rechner integrierte Steuerung zum automatischen De- Fokussieren des Lasers 6 vorgesehen. Zusätzlich kann durch eine Software im Rechner 16 aus der vorgewählten Schnittlinie der Schwerpunkt des inte­ ressierenden Probenbereichs bestimmt werden. Dann kann der xy-Tisch 2 so verfahren werden, dass der feststehende, defokussierte Laserstrahl 7 beim Abreißen der Stege auf diesen berechneten Schwerpunkt gerichtet ist.

Claims (16)

1. Verfahren zur Laser-Mikrodissektion interessierender Probenbereiche (23) einer Probe (4), die auf einem Probenhalter (3) aufgebracht ist, gekennzeichnet durch folgende Schritte:

• - Erstellen einer Perforation mit Stegen (26, 27, 28) entlang einer den interessierenden Probenbereich (23) umschließenden, durch Stege (26, 27, 28) unterbrochenen Schnittlinie (25) mittels eines Laserstrahls (7), wobei die Perforation mindestens zwei, die Schnittlinie (25) unter­ brechende Stege (26, 27, 28) aufweist, welche den interessierenden Probenbereich (23) mit der umgebenden Probe (4) verbinden, und
• - Abreißen der Stege (26, 27, 28) der Perforation mit einem einzi­ gen, auf den interessierenden Probenbereich (23) gerichteten Laser­ impuls, wodurch der interessierende Probenbereich (23) von der Probe (4) getrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass der Durchmesser des Laserstrahls (7) während der Erstellung der Perforation konstant ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass das Abreißen der Stege (26, 27, 28) mit einem Laserimpuls mit defo­ kussiertem Laserstrahl (7) erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Erstellen der Perforation die Schnittlinie (25) durch einen Benutzer definiert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass vor dem Erstellen der Perforation die Lage der Stege (26, 27, 28) durch einen Benutzer definiert wird.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass vor dem Erstellen der Perforation die Breite der Stege (26, 27, 28) durch einen Benutzer definiert wird.

7. Verwendung einer Vorrichtung zum Laserschneiden mikroskopischer Pro­ ben (4) bei dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Vor­ richtung ein Mikroskop (1) mit mindestens einem eine optische Achse (10) definierenden Objektiv (9) zur Betrachtung einer Probe (4) mit einem inte­ ressierenden Probenbereich (23), einen Laser (6), der einen Laserstrahl (7) erzeugt, und mindestens ein optisches System (13), das den Laser­ strahl (7) in das Objektiv (9) einkoppelt, umfasst, wobei

• - dem Mikroskop (1) eine Schnittlinien-Steuerungseinheit (2; 31) zur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen dem Laserstrahl (7) und der Probe (4) zugeordnet ist, wobei
• - Mittel zum Erstellen einer Perforation (16, 17, 18; 16, 17, 18, 31, 32) mit Stegen (26, 27, 28) entlang einer den interessierenden Probenbe­ reich (23) umschließenden, von den Stegen (26, 27, 28) unterbroche­ nen Schnittlinie mittels eines Laserstrahls (7) vorhanden sind, wobei die Perforation mindestens zwei Stege (26, 27, 28) aufweist, welche den interessie­ renden Probenbereich (23) mit der umgebenden Probe (4) verbinden, und wobei
• - Mittel zum Abreißen der Stege der Perforation vorhanden sind, mit welchen der interessierende Probenbereich (23) mit einem einzigen, auf den interessierenden Probenbereich (23) gerichteten La­ serimpuls von der Probe (4) getrennt wird.

8. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei der Laserstrahl (7) feststehend ist und die Schnittlinien-Steuerungseinheit einen verfahrbaren xy-Tisch (2) umfasst, welcher beim Erstellen einer Per­ foration die Probe (4) relativ zu dem feststehenden Laserstrahl (7) bewegt.

9. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Schnittlinien-Steuerungseinheit eine Laser-Scan-Einrichtung (31) umfasst, welche beim Erstellen einer Perforation den Laserstrahl (7) relativ zu einer feststehenden Probe (4) bewegt.

10. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Mittel zum Erstellen einer Perforation eine Laser- Steuerungseinheit umfassen, welche die Betriebsparameter des Lasers (6) steuert.

11. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Mittel zum Erstellen einer Perforation eine Autofokusvorrichtung für den Laser (6) umfassen.

12. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Mittel zum Abreißen der Stege (26, 27, 28) der Perforation eine Perforation-Steuerungseinheit zur Steuerung der Schnittlinien- Steuerungseinheit (2; 31) und der Laser-Steuerungseinheit umfassen.

13. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 7, wobei die Perforation-Steuerungseinheit Mittel zum Defokussieren des La­ sers (6) umfasst.

14. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei Mittel zur Auswahl der Schnittlinie (25) durch einen Benutzer vorhanden sind.

15. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei Mittel zur Auswahl der Breite der Stege (26, 27, 28) durch einen Be­ nutzer vorhanden sind.

16. Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 9, wobei Mittel zur Auswahl der Lage der Stege (26, 27, 28) durch einen Be­ nutzer vorhanden sind.