DE10037859A1

DE10037859A1 - Ion-Gate-Scan bei Reflektor-Flugzeit-Massenspektrometern mit schrittweisem Scannen der Delayzeiten zur Neutralverlust- und Vorläufer-Ionen-Analyse

Info

Publication number: DE10037859A1
Application number: DE10037859A
Authority: DE
Inventors: Ralf Hoffmann; Marco Wehofsky; Sabine Metzger
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-08-01
Filing date: 2000-08-01
Publication date: 2002-03-07

Abstract

Die vorliegende Erfindung beschreibt ein neues, scannendes massenspektrometrisches Verfahren bei der MS/MS-Analyse in Reflektor-Flugzeit-Massenspektrometern. Dabei wird mit dem ersten Massenanalysator nicht mehr wie üblich ein einzelnes Ion selektiert und nachfolgend analysiert, sondern ein ausgewähltes Intervall wird kontinuierlich über den gesamten zu analysierenden Massenbereich verschoben (Scan). Die Einzelspektren werden hinterher über eine Software ausgewertet, kalibriert und zusammengesetzt. Diese Erfindung wird exemplarisch zur Analyse von Peptidgemischen in einem Matrix-unterstützten Laser Desorption/Ionisation (MALDI) Massenspektrometer (MS) mit einem Reflektor beschrieben, kann jedoch auf beliebige Analyten, insbesondere Oligomere und Polymere (einschließlich Biooligomeren und Biopolymeren) angewandet werden. Neben einer Steigung der Empfindlichkeit und des Signal-Rausch-Verhältnisses, sowie der Aufhebung von Analyt-Diskriminierungen in komplexen Gemischen, erlaubt dieses scannen des Ion-Gates erstmals eine Vorläufer-Ionen- und eine Neutralverlust-Analyse in Reflektor-Flugzeit-Massenspektrometern.

Description

Stand der Technik Prinzipien von MS/MS-Analysen

Man unterscheidet bei Massenspektrometern drei Arten der MS/MS-Analysen, die am Beispiel eines Triple-Quadrupol-Massenspektrometers kurz erläutert werden (analog auch bei Sektorfeld-Massenspektrometern):

Bei der Produkt-Ionen-Analyse wird im ersten Quadrupol (Q₁) nur ein Ion einer bestimmten Masse transferiert und im zweiten Quadrupol (Q₂) fragmentiert. Die bei der Fragmentierung gebildeten Tochter-Ionen werden im dritten Quadrupol (Q₃) nach ihrer Masse getrennt und analysiert. Die Produkt-Ionen-Analyse ist die häufigste MS/MS-Methode.

Bei der Vorläufer-Ionen-Analyse werden in Q₁ alle Ionen des gesamten Massenbereiches sequentiell transferiert, d. h. der gesamte Massenbereich wird langsam gescannt. Nach Fragmentierung in Q₂ wird in Q₃ nur eine fest eingestellte Masse durchgelassen und detektiert. Somit kann man feststellen, welches Vorläufer-Ion ein bestimmtes Fragment enthält.

Die Neutralverlust-Analyse weist die Abspaltung eines Neutralteilchens nach. Dazu wird, wie bei der Vorläufer-Ionen-Analyse Q₁ über den gesamten Massenbereich gescannt und die sequentiell transferierten Ionen werden in Q₂ fragmentiert. In Q₃ wird analog zur Produkt- Ionen-Analyse wiederum der gesamte Massenbereich synchron zu Q₁ mit einer verschobenen Masse gescannt. Dadurch werden in Q₃ nur Ionen transferiert, die einen definierten Massenverlust zum Vorläufer-Ion zeigen.

Beschreibung

Bei Flugzeit-Massenspektrometern wurde bisher nur die Produkt-Ionen-Analyse verwirklicht. Die MS/MS-Analyse im MALDI-Flugzeit-Massenspektrometer beruht auf dem Zerfall der Ionen nach der Quelle (post-source decay PSD) und der Trennung der Fragment-Ionen- Massen im Reflektor.

Die Selektionierung des Vorläufer-Ions erfolgt durch ein gepulstes elektrisches Ablenkfeld (ion gate). Ein Ion-Gate besteht prinzipiell aus zwei Elektroden, zwischen denen orthogonal zur Flugbahn der Ionen ein elektrisches Feld anliegt (Abb. 1). Auf diese Weise erfahren alle Ionen eine Ablenkung ihrer Flugbahn, so daß sie nicht den Detektor erreichen. Wird nun das Ablenkfeld für eine kurze Zeit (~80-100 ns) ausgeschaltet, werden alle Ionen, die in dieser Zeitspanne in das Ion-Gate eindringen und es wieder verlassen haben, ungehindert den Detektor erreichen, während alle Ionen die früher oder später ankommen abgelenkt werden.

Diese Methode wird zur Sequenzanalyse von Oligomeren und Polymeren eingesetzt. Die beiden anderen MS/MS-Verfahren (Neutralverlust- und Vorläufer-Ionen-Analyse) wurden bisher bei Flugzeit-Massenspektrometern noch nicht etabliert.

Wir haben einen neuen Messmodus (Scannen des Ion-Gate) entwickelt, der sowohl eine Vorläufer-Ionen- als auch eine Neutralverlust-Analyse in Reflektor-Flugzeit-Massenspektro metern ermöglicht, und hier exemplarisch für ein MALDI-Massenspektrometer beschrieben wird. Darüber hinaus wird die Sensitivität normaler MS-Messungen, d. h. Massenanalyse, erhöht. Das Signal/Rausch-Verhältnis verbessert sich durch die Diskriminierung der Interferenzen zwischen PSD-Fragment-Ionen und stabilen Ionen im Reflektor.

Nach dieser Sichtweise ist das Ion-Gate bei einem MALDI-Reflektor-Flugzeit-Massen spektrometer der erste Massenanalysator, und der Reflektor mit der Trennung der Fragment- Ionen stellt den zweiten Analysator dar. Für die Bestimmung der Fragment-Ionen-Massen reicht es bei dieser Anordnung nicht aus, nur die Detektionszeit des Fragment-Ions zu kennen, sondern es muß auch die Masse des Mutter-Ions aus der Massen-Kalibrierung des Ion-Gate berücksichtigt werden. Die Massen-Kalibrierung des Ion-Gate wird über die Flugzeit der stabilen Ionen bis zum Detektor bestimmt.

Datenaufnahme

Durch das schrittweise Scannen der Delayzeit T_D des Ion-Gate (typischerweise 20-40 ns) wird der gesamte interessierende Massenbereich durch die Aufnahme von Einzelspektren abgedeckt (Abb. 2), wobei darauf geachtet wird, dass sich die Einzelfenster überlappen. Die Öffnungszeit des Fensters beträgt 80 bis 100 ns. Mit dieser Art der Ionen-Selektionierung wird der chemische Untergrund reduziert und die Intensität der Signale vorhandener Ionen verstärkt (siehe Beispiele). Einzelne Peaks können erst durch die Selektion des umgebenden Massenintervalls vom Untergrund unterschieden werden (Abb. 3):
Nach der Aufnahme der Einzelspektren werden diese mit einer neu entwickelten Software bearbeitet. In den Rohdaten sind folgende Informationen enthalten, die durch verschiedene Auswertungsmodi zur Kombination der Einzelspektren erhalten werden:

- Scan der stabilen Ionen.
- Unterscheidung von Fragment-Ionen und stabilen Ionen, sowie die Identifikation des zugehörigen Vorläufer-Ions.
- Identifizierung von Abspaltungen beliebiger Massen (Neutralverlust-Analyse).
- Identifikation des Vorläufer-Ions zu einem Fragment-Ion bestimmter Masse (Vorläufer- Ionen-Analyse)

Scan der stabilen Ionen

Fragment-Ionen werden in Reflektor-Flugzeit-Massenspektrometern zeitlich vor dem korrespondierenden Vorläufer-Ion detektiert. Dadurch können sie gleichzeitig mit einem leichteren stabilen Ion nachgewiesen werden. Durch das Scannen des Ion-Gates über den gesamten Massenbereich können diese Masseninterferenzen ausgeschlossen werden.

Die Einzelspektren werden nicht durch aneinanderreihen zu einem Gesamtspektrum zusammengesetzt. Um Interferenzen der verschiedenen Isotopensignale zu unterbinden, werden die Einzelspektren zu monoisotopischen Spektren entfaltet. Alle als Peak identifizierten Signale werden in einer Peakliste (Masse/Intensität) zusammengefasst (Abb. 4). In mehreren Einzelspektren vorkommende Signale werden zu einem Signal zusammengefasst. Die Peakliste wird in Form eines Linienspektrums dargestellt, das nur noch aus stabilen monoisotopischen Massen besteht.

Neutralverlust-Analyse

Alle Signale, die außerhalb des geöffneten Zeitfensters detektiert werden, sind Fragment- Ionen (Abb. 5). Diese Fragment-Ionen können einem stabilen Ion innerhalb des geöffneten Zeitfensters zugeordnet werden. Um Fehlinterpretationen bei dieser Korrelation auszu schließen, muß sie in mehreren Zeitfenstern beobachtet werden. Die exakte Masse des Fragment-Ions ergibt sich aus der Masse des korrelierten stabilen Ions als Vorläufer-Ion in der PSD-Kalibrierung.

Im Gegensatz zur herkömmlichen Neutralverlust-Analyse braucht hier die Massendifferenz nicht im Voraus bekannt zu sein. Alle Fragment-Ionen in einen Bereich von etwa 25% der Vorläufer-Ionen Masse können zugeordnet werden.

Vorläufer-Ionen-Analyse

Wird zusätzlich zum Scan der stabilen Ionen ein zweiter Scan der Delayzeit über den gesamten Massenbereich mit variierenden Reflektorspannungen durchgeführt, ist es möglich die Vorläufer-Ionen zu einer festgehaltenen Fragment-Ionen Masse zu finden. Die Reflektor spannungen müssen den Massen der nachgewiesenen stabilen Ionen in jedem Einzelspektrum angepasst werden. Bei einem zweistufigen Reflektor muß das Verhältnis aus U₁/U₂ konstant sein, wobei für U₁ und U₂ die folgenden Bedingungen gelten:

(mit U₁ = erste Reflektorspannung, U₂ = zweite Reflektorspannung, U_Probe = Beschleunigungsspannung, m_F = Fragment-Ionen Masse, m_PU = kleinste Masse des selektierten stabilen Massenbereichs, m_PO = größte Masse des selektierten stabilen Massenbereichs).

Die Spannungen werden derart geschaltet, dass in jedem Einzelspektrum die gleiche Fragment-Ionen-Masse fokussiert wird. Für jedes Einzelspektrum wird mit jedem im stabilen Ionen Scan nachgewiesenen Vorläufer-Ion eine PSD-Kalibrierung durchgeführt. Es wird geprüft, ob ein Signal zu der für die angegebene Fragment-Ionen Masse berechneten Flugzeit auftritt.

Im folgenden sind vier Beispiele wichtiger Anwendungen bei der Peptid- und Proteinanalytik ("Proteomics") beschrieben, um die Vorteile der scannenden Flugzeit-Massenspektrometrie gegenüber der konventionellen Datenaufnahme der Gesamtspektren zu demonstrieren.

Beispiel 1

Abb. 6 zeigt die Auswirkung des Scans des Ion-Gate auf das Signal/Rausch-Verhältnis am Beispiel eines komplexen Peptid-Gemisches. Verglichen wird hier das MALDI- Übersichts-Spektrum mit dem monoisotopischen Linienspektrum des Scans der stabilen Ionen. Für den Scan wurden 150 Einzelspektren mit je 30 Laserpulsen aufgenommen, wobei die Delayzeit von 3800 ns bis 6740 ns mit einer Schrittweite von 20 ns, bei einem offenen Zeitfenster von 100 ns, verändert wurde. Dadurch wurde der Massenbereich von 600 bis 2000 u abgedeckt. Im Linienspektrum können eindeutig mehr Peptidsignale als im Übersichts-Spektrum identifiziert werden.

Beispiel 2

In Abb. 7 wird die Möglichkeit der Unterscheidung von stabilen Ionen und Fragment- Ionen belegt. Gezeigt wird wieder ein Vergleich des MALDI-Übersichts-Spektrums mit dem monoisotopischen Linienspektrum des Scans der stabilen Ionen. Einige intensive Signale (z. B. 1011,7 u und 1029,2 u) treten im Scan der stabilen Ionen nicht mehr auf. Dies zeigt eindeutig, dass es sich bei diesen Signalen nicht um stabile Ionen, sondern um PSD- Fragment-Ionen handelt.

Beispiel 3

Abb. 8 zeigt ein MALDI-Übersichts-Spektrum (a), den Scan der stabilen Ionen (b) und die Neutralverlust-Analyse einer C-terminalen Prolin-Abspaltung (c) einer Mischung aus acht synthetischen Peptiden (Tabelle 1).

Tabelle 1

Sequenzen und Molekulargewichte der in der Mischung enthaltenen Peptide

Im Vergleich des Übersichts-Spektrums mit dem Scan der stabilen Ionen ist wieder eine Unterscheidung zwischen stabilen Ionen und PSD-Fragment-Ionen möglich. Mit Hilfe der Korrelations-Analyse läßt sich einem identifizierten Fragment-Ion durch den Scan der Delayzeit des Ion-Gate ein Vorläufer-Ion zuordnen. Mit einer anschließenden PSD- Fragment-Ionen Massen-Kalibrierung kann die zugehörige Massendifferenz und somit der Typ der Abspaltung identifiziert werden.

Die PSD-Kalibrierung für das stabile Ion bei 1157,7 u ergibt ein Fragment-Ion bei 1042,6 u, was dem b₉-Ion des Peptids IIQGTLWKCP-NH₂ mit einer C-terminalen Prolin-Abspaltung entspricht. Analog konnte dem stabilen Ion mit der Masse 1295,5 u eine C-terminale Prolin- Abspaltung zugeordnet werden. Die Intensität aller Vorläufer-Ionen mit einem Fragment-Ion eines definierten Neutral-Verlustes (hier 114 u) wird in einem Korrelations-Spektrum dargestellt (Abb. 8c). Mit dieser Methode können Neutral-Verlust-Analysen mit beliebigen Massendifferenzen mit einem einzigen Scan des Ion Gate durchgeführt werden.

Eine wichtige praktische Anwendung dieser Korrelationsanalyse ist die Analyse eines enzymatischer Verdaus unbekannter Proteine ("Proteomics"), da die Masse stabiler Ionen (Peptide) mit einer partiellen terminalen Sequenz (aus den detektierten PSD-Fragment-Ionen im Massenbereich unterhalb der Einzelspektren) kombiniert werden kann. Dadurch wird die Eindeutigkeit der Daten deutlich erhöht und deren Interpretation erleichtert.

Beispiel 4

Der Scan des Ion-Gate ermöglicht auch eine schnelle und eindeutige Identifizierung modifi zierter Peptide und Proteine. Dies wird am Beispiel der O-Phosphorylierung des Tyrosin restes in der Sequenz RRLIEDAEYAARG-NH₂ gezeigt. Phosphopeptide können eine HPO₃- oder H₃PO₄-Gruppe, entsprechend einem Massenverlust von 80 bzw. 98 u, abspalten. In Abb. 9 sind für eine Mischung des phosphorylierten ([M + H]⁺ = 1598,8 u) und unphosphorylierten ([M + H]⁺ = 1518,8 u) Peptids der oben genannten Sequenz das entfaltete MALDI-Übersichts- Spektrum (a), der Scan der stabilen Ionen (b) und in (c-e) die verschiedenen Abspaltungen der Phosphat-Gruppe (Neutralverlust-Analyse) dargestellt.

Der Scan des Ion-Gate wurde mit einer Schrittweite von 40 ns und einer Intervall-Breite von 100 ns durchgeführt. Während im Spektrum des Scans der stabilen Ionen (b) nur die erwarteten Massen der beiden zugesetzten Peptide auftreten, sind im entfalteten Übersichtsspektrum (a) neben den stabilen Ionen zusätzlich die Signale der Fragment-Ionen enthalten.

Die Signale, die bei den stabilen Massen 1486 u, 1502 u und 1520 u nachgewiesen werden, können mit dem Signal bei 1598,8 u korreliert werden. Die PSD-Kalibrierung mit der Masse 1598,8 u als Vorläufer-Ion belegt dass es sich hierbei um ein Phosphopeptid handelt, das H₃PO₄- und HPO₃-Gruppen mit der Masse 98 u und 80 u, sowie eine Amid-Gruppe mit der Masse 17 u, abspaltet.

Ein Vorteil eines derartigen Scans des Ion-Gate besteht darin, daß mit einem einzigen Scan, der über einen großen Massenbereich möglich ist, Rohdaten erzeugt werden in denen die Informationen sowohl für eine Neutralverlust-Analyse, als auch für eine Vorläufer-Ionen- Analyse sowie die Unterscheidung zwischen stabilen Ionen und Fragment-Ionen enthalten sind. Wobei die Neutralverlust-Analyse für Abspaltungen beliebiger Massendifferenz möglich ist.

Claims

1. Scannen des Ion-Gate über einen Massenbereich in Reflektor-Flugzeit-Massenspektro metern (insbesondere MALDI-Massenspektrometern). Die erzeugten Einzelspektren werden über eine Software ausgewertet, kalibriert und zu einem Gesamtspektrum zusammengesetzt.

2. Neutralverlust-Analyse durch Korrelation der Massen der stabilen Ionen eines aufge nommenen Massenbereiches im Einzelspektrum (Anspruch 1) mit den unterhalb des offenen Massenfensters detektierten Fragment-Ionen. Über eine PSD-Kalibrierung der Fragment-Ionen kann der Neutralverlust zum stabilen Ion bestimmt werden.

3. Vorläufer-Ionen-Analyse durch Korrelation zweier Scans des Ion Gate (Anspruch 1), bei dem im zweiten Scan die Reflektorspannungen parallel zu den Delayzeiten geschaltet werden. Die Spannungen werden derart geschaltet, dass in jedem Einzelspektrum die gleiche Fragment-Ionen-Masse fokussiert wird. Für jedes Einzelspektrum wird mit jedem im Scan der stabilen Ionen nachgewiesenen Vorläufer-Ion eine PSD-Kalibrierung durchgeführt. Es wird geprüft, ob ein Signal zu der für die angegebene Fragment-Ionen Masse berechneten Flugzeit auftritt.

4. Identifizierung bisher unbekannter Abspaltungen oder Modifikationen in den "Rohdaten" der Spektren, da sowohl bei der Vorläufer-Ionen- als auch bei der Neutralverlust-Analyse (Ansprüche 1-3) die Datenaufnahme nicht auf eine bestimmte Masse eingeschränkt werden muß. Für die Messung müssen keine weiteren Informationen über mögliche Modifikation vorliegen.

5. Analyse komplexer Probengemische (Ansprüche 1-4) um die gegenseitige Diskriminier ung von Analytmolekülen aufzuheben.

6. Kombination der Masseninformation stabiler Ionen mit Massen-, Fragmentierungs- und/oder Sequenzinformationen der Fragment-Ionen (Ansprüche 1-4) um Biomoleküle, Oligomere und/oder Polymere zu identifizieren oder zu charakterisieren.

7. Identifizierung posttranslationaler, cotranslationaler oder anderer Modifikationen in Bio oligomeren, Biopolymeren und/oder synthetischen Molekülen nach Ansprüchen 1-6.

8. Alle auf den Ansprüchen 1-7 aufbauenden Analyseverfahren für Proben synthetischen oder natürlichen Ursprungs.

9. Alle auf Ansprüche 1-8 aufbauenden diagnostischen Methoden zur Analyse von Biomolekülen, insbesondere Biopolymeren wie Proteinen, DNA, RNA und Zucker.