DE10034628A1 - Pyridinhaltige Oxazolidinone als Cytokin-Inhibitoren - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pyridinhaltige Oxazolidinone, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln, insbesondere zur Behandlung von durch den Tumor Necrosis Faktor (TNF) ausgelösten Wirkungen wie z. B. Arteriosklerose.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Pyridinhaltige Oxazolidinone, Verfahren zu ihrer Herstellung und deren Verwendung zur Herstellung von Arzneimitteln insbe­ sondere zur Behandlung von durch den Tumor Necrosis Faktor (TNF) ausgelösten Wirkungen wie z. B. Arteriosklerose.

Tumor necrosis factor α (TNFα) ist ein proinflammatorisches Zytokin mit athero­ gener Wirkung. Proinflammatorische Zytokine sind Proteine, die als entzündungs­ fördernde Botenstoffe nach einem Stimulus in bestimmten Gewebszellen gebildet werden.

TNFα ist ein Zytokin, das auch bei vielen krankhaften Entzündungsreaktionen in besonderem Maße eine Progression der Entzündung fördert. Im Extremfall, wenn TNFα vermehrt in die Blutzirkulation ausgeschüttet wird, trägt TNFα zur Ausprä­ gung lebensbedrohender Zustände, wie beispielsweise dem septischen Schock, der disseminierten intravasalen Koagulation oder der Kachexie, bei. Bei lokal begrenzter Ausschüttung von TNFα fördert es Entzündungsprozesse, die auf das Gewebe, in dem es gebildet wird, beschränkt bleiben.

In jüngster Zeit wurde berichtet, dass TNFα eine besondere Bedeutung bei der Pro­ gression entzündlicher Prozesse in der arteriellen Gefäßwand hat. In diesem Zusam­ menhang ist die die Arteriosklerose fördernde (atherogene) Wirkung von TNFα in mehreren Untersuchungen belegt worden. Es konnte nachgewiesen werden, dass TNFα in arteriosklerotischem Gewebe vermehrt gebildet wird

(T. J. DeGraba, Neurology 49 Suppl 4, S 15-S 19, 1997; M. Kaartinen et al. Circula­ tion 94, 2787-2792, 1996, X. Lei et al., Atherosclerosis 125 (1996), 81-89) und die Wirkung von TNFα auf Zellen der Gefäßwand (Endothelzellen, Glattmuskelzellen), und insbesondere die Wirkung von TNFα auf Zellen der arteriosklerotischen Gefäßwand, die zusätzlich noch Monozyten, naive Makrophagen, Schaumzellen und Lymphozyten enthält, ist mannigfach untersucht und beschrieben worden:

TNFα löst die Bildung von Zelladhäsionsmolekülen insbesondere auf Endothelzellen aus, wie z. B. vascular cell adhesion molecule (VCAM), intercellular adhesion mole­ cule (ICAM-1) oder P-selectin, die ihrerseits ein weiteres Einwandern von Monozy­ ten, Makrophagen und Lymphozyten zur Progression der Gefäßwandentzündung fördern (T. J. DeGraba, Neurology 49 Suppl 4, S 15-S 19, 1997; J. L. Barks et al. J. Immunology 159, 4532-4538, 1997, M. F. Iademarco et al., J. Clin. Invest. 95 (1995), 264-271). TNFα löst die Bildung von weiteren Zytokinen in Endothelzellen, Monozyten, Schaumzellen und Glattmuskelzellen aus. Namentlich Interleukin 1 (IL- 1) und autokrin gebildetes TNFα sind hier zu nennen.

TNFα löst die Bildung von Chemokinen wie monocyte chemoattractant protein (MCP-1) und Interleukin 8 (IL-8) in den genannten Gefäßzellen aus zur weiteren Rekrutierung von Monozyten und Lymphozyten in die arteriosklerotisch veränderte Gefäßwand.

TNFα löst die Bildung von Wachstumsfaktoren (z. B. platelet derived growth factor) und Matrixmetalloproteasen aus, die ihrerseits Entzündungsprozesse in der Gefäß­ wand fördern (H. Funayama, Cardiovasc. Res. 37, 216-224 (1998); T. B. Rajavashisth, Circulation 99, 3103-3109 (1999).

TNFα ist neben der Bedeutung für die Progression der arteriosklerotischen Gefäß­ entzündung (P. T. Kovanen et al., Circulation 94, 2787-2792, 1996) auch von entscheidender Bedeutung in der pathophysiologischen Progression anderer Entzündungskrankheiten, für die eine Syntheseinhibition des proinflammatorischen Zytokins TNFα ebenfalls ein therapeutisch nützlicher Eingriff zur Abschwächung der Krankheit darstellt. Entzündungserkrankungen und Autoimmunerkrankungen die durch TNFα Syntheseinhibition behandelt werden können, weil TNFα ursächlich zum Krankheitsbild beiträgt sind Arthritis, rheumatoide Arthritis, Osteoporose, Crohns Krankheit, chronisch-entzündliche Lungenkrankheiten wie Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), Transplantat-Abstoßung, Reperfusionsgewebeschäden nach Schlaganfall, Herzinfarkt oder peripheren Gefäßverschlüssen, chronisch-ent­ zündliche fibrotische Organveränderungen wie Leberfibrose, oder die generalisierte Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes oder andere Formen des Lupus erythematodes sowie dermale Entzündungskrankheiten wie Psoriasis.

Aus den Publikationen EP-A-0 693 491, EP-A-789 026 und EP-A-789 025 sind Oxazolidinone mit antibakterieller Wirkung bekannt.

Die vorliegende Erfindung betrifft Pyridinhaltige Oxazolidinone der allgemeinen Formel (I)

worin
a und b gleich oder verschieden sind und stehen können für Wasserstoff, oder einen Kohlenwasserstoffrest ausgewählt aus Alkyl, Aryl, Heteroaryl, oder worin
a und b gemeinsam stehen können für einen benzokondensierten Rest der
seinerseits mit aromatischen Heterocylen substituiert sein kann,
d stehen kann für Hydroxy, Halogen oder einen Rest der Formel (d₁)

worin
g stehen kann für Sauerstoff oder Schwefel und R^d1,1 und R^d1,2 gleich oder ver­ schieden sein können und stehen können für Wasserstoff, einen Kohlen­ wasserstoffrest wie Alkyl oder Aralkyl, die ihrerseits mit cyclischen Kohlen­ wasserstoffresten, oder der Gruppe (d₁) substituiert sein können,
und deren Salze und S-Oxide;

Die erfindungsgemäßen Stoffe der allgemeinen Formel (I) können auch als Salze vorliegen. Im Rahmen der Erfindung sind physiologisch unbedenkliche Salze bevor­ zugt.

Physiologisch unbedenkliche Salze können Salze der erfindungsgemäßen Verbin­ dungen mit anorganischen oder organischen Säuren sein. Bevorzugt werden Salze mit anorganischen Säuren wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Bromwasser­ stoffsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure, oder Salze mit organischen Carbon- oder Sulfonsäuren wie beispielsweise Essigsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfel­ säure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Benzoesäure, oder Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure oder Naphthalindisulfon­ säure.

Physiologisch unbedenkliche Salze können ebenso Metall- oder Ammoniumsalze der erfindungsgemäßen Verbindungen sein. Besonders bevorzugt sind Alkalimetallsalze (z. B. Natrium- oder Kaliumsalze), Erdalkalisalze (z. B. Magnesium- oder Calcium­ salze), sowie Ammoniumsalze, die abgeleitet sind von Ammoniak oder organischen Aminen, wie beispielsweise Ethylamin, Di- bzw. Triethylamin, Di- bzw. Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol, Arginin, Lysin, Ethylendiamin oder 2-Phenylethylamin.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können in verschiedenen stereoisomeren Formen auftreten, die sich entweder wie Bild und Spiegelbild (Enantiomere), oder die sich nicht wie Bild und Spiegelbild (Diastereomere) verhalten. Die Erfindung betrifft sowohl die Enantiomeren als auch die Diastereomeren sowie deren jeweilige Mischungen. Die Racemformen lassen sich ebenso wie die Diastereomeren in bekannter Weise in die stereoisomer einheitlichen Bestandteile trennen.

Weiterhin können bestimmte Verbindungen in tautomeren Formen vorliegen. Dies ist dem Fachmann bekannt, und derartige Verbindungen sind ebenfalls vom Umfang der Erfindung umfaßt.

Im Rahmen der Erfindung können Kohlenwasserstoffreste gesättigt oder ungesättigt, linear, verzweigt oder cyclisch sein und 1 bis 24 C-Atome besitzen.

C₁-C₁₂-Alkyl umfaßt Methyl, Ethyl, n- und i-Propyl, n-, i-, sek.- und tert.-Butyl, n- Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, 2-Ethylhexyl, n-Octyl Decyl, Dodecyl,
C₁-C₆-Alkyl umfasst Methyl, Ethyl, n- und i-Propyl, n-, i-, sek.- und tert.-Butyl, n- Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl.

C₁-C₄-Alkyl umfasst Methyl, Ethyl, n- und i-Propyl, n-, i-, sek.- und tert.-Butyl.

Cyclische Kohlenwasserstoffreste können mono- oder polycyclisch, gesättigt oder ungesättigt, nicht-aromatisch oder aromatisch sein und bis zu 14 C-Atome besitzen.

Gesättigte Kohlenwasserstoffreste können linear, verzweigt oder cyclisch sein und bis zu 24 C-Atome besitzen.

Ein im Rahmen der Erfindung bevorzugter gesättigter Kohlenwasserstoffrest ist Cycloalkyl.

Cycloalkyl umfasst polycyclische gesättigte Kohlenwasserstoffreste mit bis zu 14 C- Atomen, nämlich monocyclisches C₃-C₁₂-, vorzugsweise C₃-C₈-Alkyl, wie z. B. Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl, Cylcooctyl, Cyclo­ nonyl, und polycyclisches Alkyl, d. h. vorzugsweise bicyclisches und tricyclisches, gegebenenfalls spirocyclisches C₇-C₁₄-Alkyl, wie z. B. Bicyclo[2.2.1]-hept-1-yl, Bicyclo[2.2.1]-hept-2-yl, Bicyclo[2.2.1]-hept-7-yl, Bicyclo[2.2.2]-oct-2-yl, Bicyclo- [3.2.1]-oct-2-yl, Bicyclo[3.2.2]-non-2-yl und Adamantyl.

Im Rahmen der Erfindung bevorzugt ist Cyclohexyl.

Hydroxyschutzgruppe im Rahmen der Erfindung steht im allgemeinen für eine Schutzgruppe aus der Reihe: Trimethylsilyl, Triisopropylsilyl, tert-Butyldimethyl­ silyl, Benzyl, Benzyloxycarbonyl, 2-Nitrobenzyl, 4-Nitrobenzyl, tert.-Butyloxy­ carbonyl, Allyloxycarbonyl, 4-Methoxybenzyl, 4-Methoxybenzyioxycarbonyl, Tetra­ hydropyranyl, Formyl, Acetyl, Trichloracetyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, Meth­ oxyethoxymethyl, [2-(Trimethylsilyl)ethoxy]methyl, Benzoyl, 4-Methylbenzoyl, 4- Nitrobenzoyl, 4-Fluorbenzoyl, 4-Chlorbenzoyl oder 4-Methoxybenzoyl. Bevorzugt sind Acetyl, tert.-Butyldimethylsilyl oder Tetrahydropyranyl.

Bevorzugt sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin
a und b gleich oder verschieden sind und stehen können für Wasserstoff, einen Koh­ lenwasserstoffrest wie (C₁-C₁₂)-Alkyl, oder 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl das seinerseits mit Heteroaryl-Gruppen, vorzugsweise Pyridyl substituiert sein kann, oder worin
a und b gemeinsam für einen Rest der Formel (e) stehen können,

worin
f für 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, beispielsweise Pyridyl stehen kann,
d stehen kann für Hydroxy, Halogen wie beispielsweise Chlor, einen Rest der Formel (d₁)

worin
g stehen kann für Sauerstoff oder Schwefel und R^d1,1 und R^d1,2 gleich oder ver­ schieden sein können und stehen können für Wasserstoff, einen Kohlenwas­ serstoffrest wie (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkyl, das seinerseits substituiert sein kann mit einem cyclischen Kohlenwasserstoffrest oder die Gruppe (d₁);
und deren Salze und S-Oxide;
Besonders bevorzugt im Rahmen der Erfindung sind Verbindungen der allgemeinen Formel (I),

worin
a und b gleich oder verschieden sind und stehen können für Wasserstoff, einen Koh­ lenwasserstoffrest wie (C₁-C₄)-Alkyl, 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl wie bei­ spielsweise Pyridyl oder Pyridyl, das seinerseits substituiert ist mit Hetero­ aryl, vorzugsweise Pyridyl, worin
a und b gemeinsam stehen können für einen Rest der Formel (e)

f für 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, beispielsweise Pyridyl stehen kann,
d stehen kann für Hydroxy, Halogen wie beispielsweise Chlor, einen Rest der Formel (d₁)

worin
g stehen kann für Sauerstoff oder Schwefel und R^d1,1 und R^d1,2 gleich oder ver­ schieden sein können und stehen können für Wasserstoff, einen Kohlenwas­ serstoffrest wie (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkyl, das seinerseits substituiert sein kann mit einem cyclischen Kohlenwasserstoffrest, vorzugsweise Cycloalkyl, beispielsweise Cyclohexyl, oder die Gruppe (d₁)
und deren Salze und S-Oxide.

Außerdem wurden Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen gefunden, dadurch gekennzeichnet, dass

• A) Verbindungen der allgemeinen Formel (AI)
  worin
  R^AI,1 für eine Hydroxyschutzgruppe, oder, bevorzugt, für Wasserstoff steht, und
  R^AI,2 für eine Abgangsgruppe, beispielsweise für ein Halogenatom, bei­ spielsweise Brom steht,
  in DMF oder einem gleichwirkenden Lösungsmittel mit Trialkylstannylpyri­ dinen, bevorzugt 4-Trimethylstannyl-pyridin in Gegenwart von Reduktions­ mitteln wie beispielsweise Palladium-II-komplexen, bevorzugt Bis-(triphe­ nylphosphin)-palladium-(II)-chlorid, und einer Base, beispielsweise Triethyl­ amin, zu Verbindungen mit der allgemeinen Formel (AII)
  umgesetzt werden und aus diesen gegebenenfalls die Hydroxy-Schutzgruppe R^AI,1 abgespalten wird, so dass Verbindungen der allgemeinen Formel (AII), in denen R^AI,1 für Wasserstoff steht, erhalten werden;
• B) Verbindungen der allgemeinen Formel (AII), in denen R^AI,1 für Wasserstoff steht, in polaren Lösungsmitteln, beispielsweise DMF oder einem gleichwir­ kenden Lösungsmittel, mit Isocyanaten, beispielsweise Ethylisocyanat, in Gegenwart eines Deprotonierungsmittels, beispielsweise Phosphazen-Base P₁-tBu, zu Verbindungen mit der allgemeinen Formel (BI)
  worin
  R^BI,1 für einen Kohlenwasserstoffrest wie (C₁-C₆)-Alkyl, und in einer für (BI) bevorzugten Ausführungsform für die Ethyl-Gruppe steht,
  umgesetzt werden.

Die Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen werden aus dem nachfolgenden Formelschema ersichtlich.

Als Lösemittel eignen sich in Abhängigkeit von den einzelnen Verfahrensschritten die üblichen Lösemittel, die sich unter den Reaktionsbedingungen nicht verändern. Hierzu gehören unpolare Lösemittel, polaraprotische Lösemittel und protische Löse­ mittel.

Als unpolare Lösemittel seien beispielsweise genannt: aliphatische und aromatische Kohlenwasserstoffe wie Benzol, Toluol, Xylol, Hexan, Cyclohexan oder Erdölfrak­ tionen; aliphatische und aromatische Halogenkohlenwasserstoffe wie Dichlormethan, Trichlormethan, Tetrachlormethan, Trichlorethan, Tetrachlorethan, 1,2-Dichlorethan oder Trichlorethylen, Dichlorbenzol; Ether wie Diethylether, tert.-Butyldimethyl­ ether, Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), Glykoldimethylether (1,2-Dimethoxyethan, "glyme" oder "DME") oder Diethylenglykoldimethylether ("diglyme").

Als polaraprotische Lösungsmittel seien beispielsweise genannt: Ketone wie Aceton oder Butanon, Essigsäureester wie Ethylacetat oder Butylacetat, Amide wie Dimethylformamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid, N-Methylpyrrolidon ("NMP"), Nitrile wie Acetonitril, Nitroverbindungen wie Nitromethan, Dimethylsulf­ oxid (DMSO), basische Lösemittel wie Pyridin, Picolin, N-Methylpiperidin.

Als protische Lösemittel seien beispielsweise genannt: Wasser oder Alkohole wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, iso-Propanol, n-Butanol oder tert.-Butanol.

Die Lösemittel können auch in Form von Gemischen eingesetzt werden.

Alle Umsetzungen werden im allgemeinen bei normalem, erhöhtem oder bei ernie­ drigtem Druck durchgeführt (z. B. 0,5 bis 5 bar). Im allgemeinen arbeitet man bei Normaldruck. Wenn nicht anders angegeben, werden die Reaktionen bei Raumtem­ peratur durchgeführt.

Die vorstehend beschriebenen Verbindungen können zur Herstellung von Arznei­ mitteln zur Behandlung von Erkrankungen an Mensch und Tier verwendet werden.

Die vorstehend beschriebenen Verbindungen sind Inhibitoren der TNFα Biosyn­ these. Sie können eingesetzt werden bei der Vorbeugung und Behandlung von Herz-Kreislauf Erkrankungen, wie z. B. der Atherosklerose sowie Arthritis, rheuma­ toide Arthritis, Osteoporose, Crohns Krankheit, chronisch-entzündliche Lungen­ krankheiten wie Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), Transplantat-Abstoßung, Reperfusionsgewebeschäden nach Schlaganfall, Herzinfarkt oder peripheren Gefäßverschlüssen, chronisch-entzündliche fibrotische Organveränderungen wie Leberfibrose, oder die generalisierte Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes oder andere Formen des Lupus erythematodes sowie dermale Entzün­ dungskrankheiten wie Psoriasis.

Die Hemmung der der TNFα Biosynthese durch vorstehend beschriebene Verbin­ dungen kann in biologischen Tests in vitro und in vivo nachgewiesen werden.

Der Wirkstoff kann zur Erzielung einer systemischen Wirkung oral oder parenteral, für eine äußere Wirkung lokal appliziert werden.

Für die parenterale Applikation eignen sich insbesondere Applikationsformen auf die Schleimhäute (buccal/lingual/sublingual, rectal, nasal, pulmonal, conjunctival oder intravaginal) oder in das Körperinnere. Dies kann unter Umgehung der Resorption geschehen (intrakardial, intraarteriell, intravenös, intraspinal oder intralumbal) oder unter Einschaltung einer Resorption geschehen (intracutan, subcutan, percutan, intramuskulär oder intraperitoneal).

Hierbei können die Wirkstoffe allein oder in Form von Applikationsformen verab­ reicht werden.

Für die orale Applikation eignen sich als Applikationsformen u. a. normale und magensaftresistente Tabletten, Kapseln, Dragees, Pillen, Granulate, Pellets, Pulver, feste und flüssige Aerosole, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen.

Für die parenterale Applikation eignen sich als Applikationsformen Injektions- und Infusionslösungen.

Für die lokale Applikation mit systemischer Verteilung eignen sich Suppositorien und Aerosole, ist keine systemische Verteilung erwünscht so eignen sich Vaginalkapseln, Nasen-, Ohren- Augentropfen, wässrige Suspensionen (Lotionen, Schüttel­ mixturen), lipophile Suspensionen, Salben, Cremes, Milch, Pasten, Streupuder oder Sprays.

In den Applikationsformen kann der Wirkstoff in einer Konzentration von 0-100 Gew.-% vorliegen; bevorzugterweise soll die Konzentration des Wirkstoffs 0.5-90 Gew.-% betragen, d. h. in Mengen, die ausreichend sind, den angegebenen Dosie­ rungsspielraum zu erreichen.

Die Wirkstoffe können in an sich bekannter Weise in die angeführten Applikations­ formen überführt werden. Dies geschieht unter Verwendung inerter nichttoxischer, pharmazeutisch geeigneter Hilfsstoffe, z. B. Trägerstoffe, Lösungsmittel, Vehikel, Emulgatoren und/oder Dispergiermittel.

Als Hilfsstoffe seien beispielsweise aufgeführt: Wasser, feste Trägerstoffe wie natür­ liche oder synthetische Gesteinsmehle (z. B. Talkum oder Silikate), Zucker (z. B. Milchzucker), nichttoxische organische Lösungsmittel wie Paraffine, pflanzliche Öle (z. B. Sesamöl), Alkohole (z. B. Ethanol, Glycerin), Glykole (z. B. Polyethylenglykol), Emulgiermittel, Dispergiermittel (z. B. Polyvinylpyrrolidon) und Gleitmittel (z. B. Magnesiumsulfat).

Im Falle der oralen Applikation können Tabletten selbstverständlich auch Zusätze wie Natriumcitrat zusammen mit Zuschlagstoffen wie Stärke, Gelatine und derglei­ chen enthalten. Wässriger Zubereitungen für die orale Applikation können weiterhin mit Geschmacksaufbesserern oder Farbstoffen versetzt werden.

Im allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, bei parenteraler Applikation Mengen von etwa 0,001 bis 25 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,001 bis 10 mg/kg Kör­ pergewicht zur Erzielung wirksamer Ergebnisse zu verabreichen. Bei oraler Applika­ tion beträgt die Menge etwa 0,001 bis 50 mg/kg, vorzugsweise etwa 0,01 bis 20 mg/kg Körpergewicht.

Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen ab­ zuweichen, und zwar in Abhängigkeit von Körpergewicht, Applikationsweg, indivi­ duellem Verhalten gegenüber dem Wirkstoff, Art der Zubereitung und Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchem die Applikation erfolgt.

Nachweis der TNFα Biosyntheseinhibition in humanen Blutmonozyten

Periphere Blutmonozyten werden wie folgt aus 150 ml Blut von gesunden Probanden isoliert:

Das Blut wird in Vacutainer-Röhrchen (Fa. Becton-Dickinson GmbH, Heidelberg, Best. Nr. 362753) 20 Minuten bei 1500 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Monozyten werden gemäß der Vorschrift des Herstellers aus einer Zone über dem Trenngel abgesaugt und in einem 50 ml Falcon Zentrifugenröhrchen in 50 ml phos­ phat-gepufferter Saline suspendiert und erneut 20 Minuten bei 300 g zentrifugiert.

Das Zell-Pellet wird in 10 ml Versene-Lösung (Fa. Life-Technologies GmbH, Karls­ ruhe, Best.-Nr. 15040-033) suspendiert und erneut 5 Minuten bei 300 g zentrifugiert. Anschließend werden die Zellen in Kulturmedium RPMI 1640 (Fa. Life-Technolo­ gies GmbH, Karlsruhe, Best.-Nr. 21875-059) aufgenommen. Für das Kulturmedium werden als Zusätze jeweils 1% (vol/vol) der folgenden Lösungen verwendet: 200 mM L-Glutamin; 5000 E/ml Penicillin G und 5 mg/ml Steptomycin-Sulfat; 1,0 M HEPES Pufferlösung; 100 mM Natriumpyruvat; Lösung nichtessentieller Aminosäu­ ren (Fa. Life-Technologies GmbH, Karlsruhe, Best.-Nr. 11140-035) Weiterhin wird dem Kulturmedium noch 10% (vol/vol) fötales Kälberserum zugesetzt.

Die Monozyten werden in 100 µl in diesem Kulturmedium mit einer Zelldichte von 2,5 × 10⁵ Zellen/vertiefung in einer 96-Loch Mikrotiterplatte (Fa. Falcon/Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ 07035, Microtest III, Tissue Culture Plate) ausgesät. Nach 1 bis 2 Stunden haften die Monozyten an der Oberfläche an. Das Medium wird abgesaugt und die Monozyten werden mit 100 µl Kulturmedium gewaschen. Anschließend werden in die Vertiefungen 100 µl Kulturmedium, die Testsubstanz, gelöst in 50 µl Kulturmedium und 50 µl Lipopolysaccharid-(LPS-) Lösung (0,5 µg/ml LPS gelöst in Kulturmedium: Escherichia coli Serotype 0111:B4 von Fa. Sigma, St. Louis, MO 63178, USA, Best. Nr. L-3012) zugegeben und 18 Stunden im Zellkul­ turinkubator bei 37°C und 5% CO2 Atmosphäre inkubiert.

Die gebildete Menge TNFα wird in je 100 µl Überstand der Testansätze mit einem kommerziell verfügbaren enzymgekoppelten Immunosorbent-Test (ELISA), z. B. von der Fa. R Systems GmbH, 65205 Wiesbaden, Best.-Nr. DTASO, gemäß den Angaben des Herstellers quantitativ bestimmt. Die TNFα Syntheseinhibition lässt sich auf diese Weise konzentrationsabhängig von der eingesetzten Testsubstanz bestimmen. Die Konzentration der Testsubstanz, die eine halbmaximale TNFα Syntheseinhibition (EC50) bewirkt, wird aus der entsprechenden Dosis-Wirkungs­ kurve ermittelt.

Tabelle 1

TNF-ELISA: Wirkdaten

Nachweis der Hemmung der TNF-Freisetzung in vivo

Für die Bestimmung der TNF-Freisetzung in vivo wurden weibliche Balb/c oder OF- 1-Mäuse (Iffa-Credo) eingesetzt. Diese wurden 4 Stunden vor Versuchsbeginn nüchtern gesetzt.

Die zu testenden Substanzen wurden per os, intraperitoneal oder intravenös verab­ reicht. Bei peroraler und intraperitonealer Gabe betrug das Applikationsvolumen 10 ml/kg, während bei intravenöser Gabe nur 5 ml/kg appliziert wurden.

Die TNF-Freisetzung in den Mäusen wurde durch die Applikation von LPS aus S. minnesota (4 mg/kg) induziert, das intraperitoneal in einem Volumen von 25 ml/kg in 0.9% NaCl verabreicht wurde. Die LPS-Gabe fand routinemäßig 30 Minuten nach der peroralen Substanzgabe statt. Zur Analyse von kinetischen Fragestellungen oder nach intravenöser Gabe wurde LPS 15 bis 120 Minuten nach Substanzgabe injiziert.

Bei allen Studien wurde den Mäusen 1.5 Stunden nach LPS-Gabe durch retro-orbi­ tale Punktion Blut entnommen und der weiteren Analyse zugeführt. Das entnom­ mene Blut wurde 10 Minuten bei 1400 U/min zentrifugiert um Serum zu gewinnen. Unter Einsatz eines TNF-ELISA der Firma R wurde in den Serumproben der Gehalt an TNF bestimmt.

Nachweis der anti-atherosklerotischen Wirkungen der vorstehend beschriebenen Verbindungen und TNF-Syntheseinhibitoren im Modell der ApoE knockout Maus.

Zur Feststellung der anti-atherosklerotischen Wirkung der Verbindungen wurde das Modell der ApoE-defizienten Maus verwendet. Bei diesem Modell handelt es sich um Mäuse, die aufgrund eines Gendefektes im Apolipoprotein E einen gestörten Lipidstoffwechsel aufweisen und innerhalb von 3 Monaten im Herzklappenbereich eine Form der Atherosklerose entwickeln, die der fortgeschrittenen Atherosklerose des Menschen sehr ähnlich ist. Dieses Modell hat sich in den letzten Jahren zu einem Standardmodell der Atheroskleroseforschung entwickelt.

Zur Quantifizierung der Atherosklerose wird der interessierende Bereich der Herz­ klappe entnommen und in Paraffin fixiert. Anschließend wird in histologischen Schnitten die Querschnittsfläche der atherosklerotischen Ablagerungen mit Hilfe eines Computergestützten Morphometriesystem bestimmt

Abkürzungen

abs.: absolut
Ac: Acetyl
aq.: wässrig
Boc: tert.-Butoxycarbonyl
Bu: Butyl
CDI: N,N'-Carbonyldiimidazol
DC: Dünnschichtchromatographie
DCC: N,N'-Dicyclohexylcarbodümid
DEAD: Azodicarbonsäurediethylester
dest.: destilliert
DIBAH: Diisobutylaluminiumhydrid
DMAP: 4-N,N-Dimethylaminopyridin
DME: 1,2-Dimethoxyethan
DMF: N,N-Dimethylformamid
DMPU: N,N'-Dimethylpropylenharnstoff
DMSO: Dimethylsulfoxid
DPPA: Diphenylphosphorylazid
EDC: N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid × HCl
eq: Äquivalent(e)
Et: Ethyl
fl.: flüssig
Fp.: Schmelzpunkt
Fr.: Fraktion
GC: Gaschromatographie
ges.: gesättigt
HMPT: Hexamethylphosphorsäuretriamid
HOBt: 1-Hydroxy-1H-benzotriazol × H₂

O
HOSu: N-Hydroxysuccinimid
HPLC: Hochdruck-, Hochleistungsflüssigchromatographie
konz.: konzentriert
Kp.: Siedepunkt
krist.: kristallin/kristallisiert
LAH: Lithiumaluminiumhydrid
LDA: Lithium-N,N-diisopropylamid
LiHMDS: Lithium-N,N-bistrimethylsilylamid
Lit.: Literatur(stelle)
Lsg.: Lösung
MCPBA: meta-Chlorperbenzoesäure
Me: Methyl
MEK: Methylethylketon
MPLC: Mitteldruckflüssigchromatographie
MS: Massenspektroskopie
MTBE: Methyl-tert.butylether
Nd.: Niederschlag
NBS: N-Brom-Succinimid
NMM: N-Methylmorpholin
NMR: Kernresonanzspektroskopie
p. A.: pro analysi
Ph: Phenyl
Pr: Propyl
RF: Rückfluss
R_F

: Retentionsindex (bei DC)
RT: Raumtemperatur
subl.: sublimiert
TBAF: Tetrabutylammoniumfluorid
TBDMS: tert.-Butyldimethylsilyl
TEA: Triethylamin
techn.: technisch
TFA: Trifluoressigsäure
TFAA: Trifluoracetanhydrid
THF: Tetrahydrofuran
titr.: titriert
TMS: Trimethylsilyl
TPP: Triphenylphosphin
TPPO: Triphenylphosphinoxid
verd.: verdünnt
Vol.: Volumen
wässr.: wässrig
Z: Benzyloxycarbonyl
Zers.: Zersetzung

Die für die Dünnschichtchromatografie benutzten Laufmittel sind:
A = Dichlormethan/Methanol = 96/4
B = Dichlormethan/Methanol = 98/2
C = Toluol/Ethanol = 10/1
D = Dichlormethan/Methanol = 9/1

Ausgangsverbindungen Beispiel I

(5R)-5-(Hydroxymethyl)-3-[6-(4-pyridinyl)-1-benzothien-2-yl]-1,3-oxazolidin-2-on

2.35 g (7.16 mmol) (5R)-3-(6-Brom-1-benzothien-2-yl)-5-(hydroxymethyl)-1,3-oxa­ zolidin-2-on (Synthese des Ausgangsmaterials erfolgte nach: B. Riedl, D. Häbich, A. Stolle, H. Wild, R. Endermann, K.-D. Bremm, H.-P. Kroll, H. Labischinski, K. Schaller und H.-O. Werling, EP 693 491) werden unter Argon in 40 mL wasserfreiem DMF mit 2.08 g (8.59 mmol) frisch hergestelltem 4-Trimethylstannyl-pyridin (Synthese: J. E. Phillips, R. H. Herber, J. Organomet. Chem. 268, 39 (1984).), 0.35 g (0.50 mmol) Bis- (triphenylphosphin)-palladium(II)-chlorid und 1.77 g (17.5 mmol) Triethylamin versetzt und 48 Stunden bei 60°C gerührt. Darauf wird das DMF im Hochvakuum bei maximal 40°C abgedampft und der Rückstand aus Dichlormethan umkristallisiert.
Ausbeute: 2.0 g (86%)
R_f = 0.09 (A)
Fp.: 210°C
MS (FAB): 327 [M + H]⁺

Beispiel II

(5R)-5-(Hydroxymethyl)-3-[5-(4-pyridinyl)-1-benzothien-2-yl]-1,3-oxazolidin-2-on

Die Synthese der Verbindung erfolgte analog zu Beispiel I. Die Synthese des ent­ sprechenden Ausgangsmaterials (5R)-3-(5-Bromo-1-benzothien-2-yl)-5-(hydroxy­ methyl)-1,3-oxazolidin-2-one erfolgt nach: B. Riedl, D. Häbich, A. Stolle, H. Wild, R. Endermann, K.-D. Bremm, H.-P. Kroll, H. Labischinski, K. Schaller und H.-O. Werling, EP 693 491.
Rf = 0.07 (A)
Fp.: 242°C

Beispiel III

(5R)-5-(Hydroxymethyl)-3-[6-(3-pyridinyl)-1-benzothien-2-yl]-1,3-oxazolidin-2-on

Die Synthese des entsprechenden Ausgangsmaterials (5R)-3-(6-Brom-1-benzothien- 2-yl)-5-(hydroxymethyl)-1,3-oxazolidin-2-on erfolgt nach: B. Riedl, D. Häbich, A. Stolle, H. Wild, R. Endermann, K.-D. Bremm, H.-P. Kroll, H. Labischinski, K. Schaller und H.-O. Werling, EP 693 491 über eine Suzuki-Kupplung mit Diethyl-(3- pyridyl)-boran
Rf = 0.04 (A)
Fp.: 248°C

Herstellungsbeispiele Beispiel 1

{(5R)-2-Oxo-3-[6-(4-pyridinyl)-1-benzothien-2-yl)-1,3-oxazolidin-5-yl}methyl methylcarbamat (FIX 1770, 39-7555)

0.10 g (0.31 mmol) der Verbindung des Beispiels (I) werden in 2 mL DMF gelöst, mit 0.02 g (0.38 mmol) Methylisocyanat und einem Tropfen N'''-tert-Butyl- N,N,N',N',N",N"-hexamethylphosphorimidsäuretriamid (Phosphazen-Base P₁-tBu, verdünnt mit 1 ml DMF) versetzt und über Nacht bei 23°C gerührt. Die Reaktions­ mischung wird in Wasser und Dichlormethan gegossen und die wäßrige Phase mit Dichlormethan nachextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das so erhaltene Material wird chroma­ tographisch gereinigt (Kieselgel 60, Merck, Dichlormethan : Methanol = 96 : 4).
Ausbeute: 0.067 g (57%)
Rf = 0.18 (A)
Fp.: 202

Analog zur Vorschrift des Beispiels 1 werden die Verbindungen der Tabelle 1 herge­ stellt.

Tabelle 1

Beispiel 7

{(5R)-2-Oxo-3-[6-(4-pyridinyl)-1-benzothien-2-yl]-1,3-oxazolidin-5-yl} methyl methylcarbamat Hydrochlorid

0.02 g (0.052 mmol) {(5R)-2-Oxo-3-[6-(4-pyridinyl)-1-benzothien-2-yl]-1,3-oxazo­ lidin-5-yl}methyl methylcarbamat (Beispiel 1) werden in 2 ml Dichlor­ methan/Methanol (1 : 1) gelöst und mit 0.5 ml 1 N Salzsäure versetzt. Anschließend wird das Lösungsmittel abdestilliert und der Rückstand im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 0.015 g (68%)
Fp.: < 250°C
MS (ESI negativ): 418 (100%, [M - H]⁺)

Analog zur Vorschrift des Beispiels 7 werden die Verbindungen der Tabelle 2 herge­ stellt.

Tabelle 2

Claims (7)

1. Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
worin
a und b gleich oder verschieden sind und stehen können für Wasserstoff, oder einen Kohlenwasserstoffrest ausgewählt aus Alkyl, Aryl, Heteroaryl, oder worin
a und b gemeinsam stehen können für einen benzokondensierten Rest der seinerseits mit aromatischen Heterocylen substituiert sein kann,
d stehen kann für Hydroxy, Halogen oder einen Rest der Formel (d₁)
worin
g stehen kann für Sauerstoff oder Schwefel und R^d1,1 und R^d1,2 gleich oder verschieden sein können und stehen können für Wasserstoff, einen Kohlenwasserstoffrest wie Alkyl oder Aralkyl, die ihrerseits mit cyclischen Kohlenwasserstoffresten, oder der Gruppe (d₁) substituiert sein können,
und deren Salze und S-Oxide;

2. Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
worin
a und b gleich oder verschieden sind und stehen können für Wasserstoff, einen Kohlenwasserstoffrest wie (C₁-C₁₂)-Alkyl, oder 5- bis 10- gliedriges Heteroaryl das seinerseits mit Heteroaryl-Gruppen, vor­ zugsweise Pyridyl substituiert sein kann, oder worin
a und b gemeinsam für einen Rest der Formel (e) stehen können,
worin
f für 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, beispielsweise Pyridyl stehen kann,
d stehen kann für Hydroxy, Halogen wie beispielsweise Chlor, einen Rest der Formel (d₁)
worin
g stehen kann für Sauerstoff oder Schwefel und R^d1,1 und R^d1,2 gleich oder verschieden sein können und stehen können für Wasserstoff, einen Kohlenwasserstoffrest wie (C₁-C₆)-Alkyl, (C₁-C₆)-Alkyl, das seinerseits substituiert sein kann mit einem cyclischen Kohlenwasser­ stoffrest oder die Gruppe (d₁);
und deren Salze und S-Oxide;

3. Verbindungen der allgemeinen Formel (I),
worin
a und b gleich oder verschieden sind und stehen können für Wasserstoff, einen Kohlenwasserstoffrest wie (C₁-C₄)-Alkyl, 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl wie beispielsweise Pyridyl oder Pyridyl, das seinerseits substituiert ist mit Heteroaryl, vorzugsweise Pyridyl, worin
a und b gemeinsam stehen können für einen Rest der Formel (e)
f für 5- bis 10-gliedriges Heteroaryl, beispielsweise Pyridyl stehen kann,
d stehen kann für Hydroxy, Halogen wie beispielsweise Chlor, einen Rest der Formel (d₁)
worin
g stehen kann für Sauerstoff oder Schwefel und R^d1,1 und R^d1,2 gleich oder verschieden sein können und stehen können für Wasserstoff, einen Kohlenwasserstoffrest wie (C₁-C₄)-Alkyl, (C₁-C₄)-Alkyl, das seiner­ seits substituiert sein kann mit einem cyclischen Kohlenwasserstoff­ rest, vorzugsweise Cycloalkyl, beispielsweise Cyclohexyl, oder die Gruppe (d₁)
und deren Salze und S-Oxide.

4. Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.

5. Verwendung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Her­ stellung von Arzneimitteln.

6. Verwendung von Verbindungen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Her­ stellung von Arzneimitteln die vorbeugend, lindernd, oder heilend wirken bei durch TNFα vermittelten Krankheitsbildern wie Arthritis, rheumatoide Arthritis, Osteoporose, Crohns Krankheit, chronisch-entzündliche Lungen­ krankheiten wie Adult Respiratory Distress Syndrome (ARDS), Transplantat- Abstoßung, Reperfusionsgewebeschäden nach Schlaganfall, Herzinfarkt oder peripheren Gefäßverschlüssen, chronisch-entzündliche fibrotische Organver­ änderungen wie Leberfibrose, oder die generalisierte Autoimmunerkrankung systemischer Lupus erythematodes oder andere Formen des Lupus erythematodes sowie dermale Entzündungskrankheiten wie Psoriasis.

7. Arzneimittel enthaltend eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 sowie einen pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff.