DE10028725A1 - Primärstruktur des HNA-2a (ehemals NB1)-Antigens - Google Patents

Abstract

Das auf neutrophilen Granulozyten exprimierte HNA-2a(ehemals NB1)-Antigen kann Anlaß zur Antikörperbildung sein, die Immungranulozytopenien und pulmonale Transfusionsreaktionen zur Folge hat. Für die Antigen- und Antikörperdiagnostik mußten bisher Granulozyten arbeits- und zeitaufwendig aus dem Blut typisierter Spender isoliert werden. Voraussetzung für die Entwicklung einfacher diagnostischer Verfahren war die Kenntnis der Primärstruktur des HNA-2a(NB1)-Antigens. Diese wurde von uns aufgeklärt. Hierzu wurde zunächst das Antigen immunaffinitätschromatographisch aufgereinigt, und die HNA-2a(NB1)-Identität mittels Immunoblot unter Verwendung von Referenzantikörpern bestätigt. Anschließend wurde die N-terminale Aminosäuresequenz durch Edman-Abbau bestimmt und nach Primerkonstruktion die cDNA-Sequenz mittels RACE-PCR ermittelt. Die cDNA-Sequenz wurde in Säugerzellen rekombinant zur Expression gebracht und die Identität des rekombinant exprimierten Glykoproteins mit dem nativen HNA-2a-Antigen durch Bindung von monoklonalen und humanen Antikörpern an das rekombinante Glykoprotein in Antikörperbindungstests (Durchflußzytometrie, Immunoblot, Immunpräzipitation) nachgewiesen. DOLLAR A Die ermittelte cDNA-Sequenz wird die Entwicklung von DNA-basierten Antigenbestimmungsmethoden sowie von Antikörpernachweisverfahren unter Verwendung rekombinant hergestellter HNA-2a(NB1)-Antigene in Form von fertig konfektionierten Testkits ermöglichen und damit die Antigen- und Antikörperdiagnostik ...

Description

Es ist bekannt, daß das HNA-2a (NB1)-Merkmal zur Bildung von Allo- und Autoantikörpern führen kann. Diese Antikörper können zu Erkrankungen wie der neonatalen Immunneutropenie, die transfusionsassoziierten akuten Lungeninsuffizienz, der Immunneutropenie nach Knochenmarktransplantation, der Medikament-induzierten Immunneutropenie sowie der Autoimmunneutropenie führen. Man weiß, daß es sich bei dem HNA-2a (NB1)-Antigen um ein auf einer Subpopulation der Granulozyten exprimiertes Glykoprotein handelt. Die dem Glykoprotein zugrundeliegende Nukleotid- und Aminosäuresequenz ist bisher nicht bekannt gewesen, weshalb die fragilen und nicht lagerbaren Granulozyten für die Antigen- und Antikörper-Diagnostik benutzt werden müssen. Hierzu sind die Granulozyten zunächst arbeits- und zeitaufwendig aus dem Blut von Patienten (Antigennachweis) bzw. ausgesuchter, gesunder Spender (Antikörpernachweis) zu isolieren. Erst dann können die notwendigen Untersuchungen für die Diagnostik der oben angeführten Erkrankungen durchgeführt werden. Dies hatte zur Folge, daß diese Untersuchungen nur von wenigen Speziallaboratorien durchgeführt werden, was wiederum Postversand notwendig macht, bzw. der Patient wegen der Instabilität der Granulozyten zur. Blutentnahme zum Speziallabor reisen muß.

Das Problem der Erfindung lag daher in der Aufklärung der kodierenden Nukleotidsequenz und der hieraus ableitbaren Aminosäuresequenz, um auf die Verwendung von humanen, Granulozyten verzichten zu können.

Zur Lösung dieses Problems wurden zunächst Granulozyten aus dem Blut HNA-2a (NB1) tragender Individuen separiert und anschließend lysiert. Mittels Immunaffinitätschromatographie wurde das Antigen aus dem Granulozytenlysat isoliert. Nach Auftrennung in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektropherese wurde das isolierte Antigen mittels Immunoblot unter Verwendung von mehreren Referenzantikörpern als HNA-2a (NB1)-Antigen bestätigt. Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde durch Edman-Abbau ermittelt und Primer zur Aufklärung der cDNA-Sequenz konstruiert. Nach Isolierung von m- RNA aus Granulozyten HNA-2a (NB1)-positiver Individuen wurde die cDNA-Sequenz mittels RACE-PCR ("rapid amplification of cDNA ends polymerase chain reaction) ermittelt. Die aus der cDNA-Sequenz abgeleitete Aminosäuresequenz enthielt Aminosäuresequenzen von 3 Trypsinspaltprodukten des immunchromatographisch isolierten Antigens. Die gefundene Nukleinsäuresequenz wurde in COS- und CHO-Säugerzellen zur Expression gebracht. Das exprimierte Glykoprotein (Antigen) wurde von monoklonalen und humanen Antikörpern sowohl in der Durchflußzytometrie als auch in immunchemischen Methoden wie dem Immunoblot und der Immunpräzipitation erkannt. Somit ist nach derzeit gültigen wissenschaftlichen Maßstäben nachgewiesen, daß die von uns aufgeklärte Nukleinsäuresequenz für das bekannte HNA-2a- (NB1)-Antigen codiert. Nukleinsäuresequenz-Datenbanksuchen zeigten, daß der Anfangsteil der Nukleotidsequenz bereits im Rahmen des Human Genome Projekts sequenziert worden waren, ohne jedoch die Bedeutung der Nukleotidsequenz als kodierende Sequenz für das HNA-2a (NB1)-Antigen zu erkennen, was sich auch in den Protein-Datenbanksuchen bestätigte. Bei dem HNA-2a (NB 1)-Antigen handelte es sich somit um ein Glykoprotein der Granulozytenmembran mit bislang unbekannter Primärstruktur.

Mit Hilfe der gewonnenen Nukleotidsequenz lassen sich einfache und sichere molekularbiologische Methoden, z. B. Polymerase-Ketten-Reaktionen, zur Antigenbestimmung entwickeln, die nur geringe Mengen lagerbare DNA und nicht fragile Granulozyten als Ausgangsmaterial erfordern. Die DNA-basierten Techniken erlauben im Gegensatz zu intakten Granulozyten auch einen Versand der Patientenblutproben. Weiterhin kann mit Hilfe der Rekombinationstechnologie das HNA-2a (NB1)-Antigen in großer Menge und ohne Verunreinigungen durch andere humane Glykoproteine hergestellt und in Antikörpernachweisverfahen, z. B. ELISA, eingesetzt werden.

Sowohl die DNA-basierten Antigentests als auch die Antikörpernachweisverfahren unter Verwendung rekombinanter Antigene lassen sich in Form von fertig konfektionierten Testkits als einfache diagnostische Verfahren für Laboratorien vermarkten. Die Aufklärung der HNA- 2a (NB 1)-Primärstruktur führt somit zu einer entscheidenden Vereinfachung seiner Antigen- und Antikörper-Diagnostik.

Die Ausführung der Testkits kann zum Beispiel analog zu den bereits im Handel befindlichen PCR-SSP-Testkits für die molekulare HLA-Antigenbestimmung erfolgen, wobei die Nukleotidsequenzen für die HLA-Primer durch HNA-2a (NB1)-Antigen-spezifische Primersequenzen zu ersetzen wären.

Der Antikörpernachweistest könnte entsprechend einem ebenfalls bereits auf dem Markt befindlichen Testkit zum Nachweis antinukleärer Antikörper unter Verwendung rekombinat hergestellter Antigene konfiguriert werden. Hierzu könnte die rekombinate Herstellung des HNA-2a (NB1)-Antigens in größerem Stile ebenfalls im Baculovirus-Insektenzellen- Expressionssystem erfolgen.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (2)

1. Die Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Immunhämatologie und betrifft die von uns aufgeklärte Primärstruktur des HNA-2a (ehemals NB1)-Antigens. Dieses Antigen wird auf neutrophilen Granulozyten exprimiert und wurde von seinem Erstbeschreiber "NB1" genannt. Nach der Revision der Nomenklatur für Granulozytenantigene wird es "HNA-2a" (human neutrophil antigen 2a) bezeichnet.

2. Für die von uns aufgeklärte Nukleotidsequenz, die davon abgeleitete Aminosäuresequenz und die sich hieraus ergebenden Nutzungsmöglichkeiten für das HNA-2a (NB1)-Antigen wird patentrechtlicher Schutz beantragt. Nutzungsmöglichkeiten stellen RNA- oder DNA-basierte- Verfahren zum Antigennachweis wie z. B. die Polymerase-Kettenreaktion mit, sequenzspezifischen Primern (PCR-SSP), die Hybridisierungsreaktionen mit sequenzspezifischen Oligonileotiden oder DNA-Sequenzierungsverfahren dar. Weitere Nutzungsmöglichkeiten ergeben sich aus der rekombinanten Herstellung des HNA-2a- Antigens zum Nachweis von HNA-2a-spezifischen Alloantikörpern.