DE10028639A1 - Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen sowie deren Ester - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen sowie deren EsterInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von C¶9¶-Aldehyden, C¶9¶-Alkoholen sowie deren Ester, das auf der Umsetzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit rekombinanter 9-Lipoxygenase (9-LOX) und 13 Hydroperoxid-Lyase (13-HPL) basiert.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen sowie
deren Ester, das auf der Umsetzung von mehrfach ungesättigten Fettsäuren mit rekombinanter
9-Lipoxygenase (9-LOX) und 13-Hydroperoxid-Lyase (13-HPL) basiert.
Der Abbau von mehrfach ungesättigten Fettsäuren beginnt mit der Oxygenierung des
(1Z,4Z)-Pentadiensystems von mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Diese Reaktion wird durch
das Enzym Lipoxygenase (EC 1.13.11.12) katalysiert, das in Pflanzen, Tieren und
Mikroorganismen vorkommt. Die oxygenierten Produkte, als Fettsäurehydroperoxide
bezeichnet, sind Vorstufen für viele wichtige Hormone, beispielsweise Jasmonsäure,
Traumatinsäure sowie Geschmacks- und Duftmoleküle in Pflanzen, beispielsweise Hexenale,
(3Z)-Hexenol und Nonenale.
Verbindungen wie Jasmonsäure werden aus Hydroperoxiden, wie 13-
Hydroperoxylinolensäure, über einen Allenoxidsynthase- und eine Allenoxidcyclase
abhängigen Weg erzeugt. Jasmonsäure ist an Streß- und Krankheitsresistenz-Signalantworten
über den Octadecanoid-Weg beteiligt. Alternativ kann 13-Hydroperoxylinolensäure durch
Hydroperoxid-Lyase unter Bildung von flüchtigen Aldehyden und Traumatinsäure gespalten
werden.
Fettsäurehydroperoxid-Lyase (HPL) katalysiert die Spaltung von Kohlenstoff-Kohlenstoff-
Bindungen in mehrfach ungesättigten Fettsäurehydroperoxiden unter Erzeugung von
kurzkettigen C9- bzw. C9-Aldehyden und ω-Oxosäuren der Kettenlänge C12 bzw. C9 (Vick et
al. (1976) Plant Physiol. 57: 780-788). Die kurzkettigen flüchtigen C6-Aldehyde liefern einen
Beitrag zu den sogenannten "grünen Duftnoten" in einer Vielzahl von Pflanzenblättern,
Gemüsen und Früchten. Diese Duftnoten werden häufig auch als "frisches Gras" bezeichnet.
Andere kurzkettige flüchtige Aldehyde, wie beispielsweise (3Z,6Z)-Nonadienal, der gemäß
dem Stand der Technik durch Spaltung von (9Z,15Z,12Z,10E)-9-Hydroperoxy-15,12,10-
Cctadecatriensäure durch eine 9-Hydroperoxid-Lyase (9-HPL) erzeugt wird, liefern ein
Melonen- oder Gurken-artiges Aroma und/oder einen entsprechenden Geschmacksbeitrag in
Früchten und Gemüse. Derartige Merkmale sind für Duft- und Aromastoffe, insbesondere für
die Lebensmittelindustrie, aber auch für die Kosmetik, pharmazeutische und chemische
Industrie, von großer Bedeutung.
Ferner wird angenommen, daß kurzkettige Aldehyde ebenfalls eine Rolle bei der
Pathogenresistenz spielen. Beispielsweise haben kürzlich Croft et al. (1993) Plant Physiol.
101: 13-24, berichtet, daß der Gehalt an (3Z)-Hexenol und (2E)-Hexenal während einer
hypersensitiven Antwort (HR) der Ackerbohne anstieg. Ferner wurde gezeigt, daß (2E)-
Hexenal ein wirksames antibakterielles Mittel ist.
Die Charakterisierung von Hydroperoxid-Lyasen ist für die weitere Untersuchung des
Pflanzenfettsäuremetabolismus und für die Entwicklung von transgenen Pflanzen mit
erhöhten sensorischen Eigenschaften einschließlich des Aromas und des Geschmacks von
großer Bedeutung. Die Untersuchungen der Pflanzenmechanismen können weitere Mittel
bereitstellen, um die sensorischen Merkmale von Pflanzen, die für die Lebensmittelindustrie
von Bedeutung sind, zu verstärken, zu steuern, zu modifizieren oder auf andere Art und
Weise zu verändern. Ferner ist die Aufklärung der physiologischen Rollen von HPL und ihrer
Produkte von Interesse für die weitere Untersuchung von Krankheitsresistenzen.
Die Biosynthese von C6- und C9-Aldehyden und den dazu gehörenden C12- und C9-ω-Keto-
Fettsäuren aus Linol- oder Linolensäure ist eine weitverbreitete Reaktion im Pflanzenreich
(z. B. K. Matsui, Belgian J. Bot. 1998, 131, 50-62). Beide Substanzgruppen können in der
Pflanze weiteren Umsetzungen unterliegen. So werden die Aldehyde durch Dehydrogenasen
zu den entsprechenden Alkoholen und die Fettsäuren zu ω-Hydroxy-Fettsäuren reduziert.
Die so erzeugten C9-Alkohole können ferner mit Säuren, insbesondere Essigsäure, zu den
entsprechenden Estern, insbesondere Essigsäurestern umgesetzt werden, die ebenfalls von
großer industrieller Bedeutung als Duft- und Aromastoffe sind.
Die Synthese der C9-Aldehyde (3Z)-Nonenal bzw. (3Z,6Z)-Nonadienal beginnt mit der
Umsetzung von Linol- bzw. α-Linolensäure mit 9-Lipoxygenase zu (9S)-Hydroperoxy-
Derivaten. Diese können anschließend durch eine 9-Hydroperoxid-Lyase (9-HPL) in die C9-
ω-Keto-Fettsäure und (3Z)-Nonenal bzw. (3Z,6Z)-Nonadienal gespalten werden. Die
entstandenen Aldehyde können dann enzymatisch bzw. chemisch zu den C9-Alkoholen (3Z)-
Nonenol bzw. (3Z,6Z)-Nonadienol reduziert werden.
N. J. Bate et al., Plant Physiology 117: 1393-1400 (1998), beschreiben die molekulare
Charakterisierung eines für eine 13-Hydroperoxid-Lyase kodierenden Gens aus Arabidopsis.
Dabei wurde eine deutliche HPL-Aktivität beobachtet, wenn (13S,9Z,11E,15Z)-13-
Hydroperoxy-9,11,15-Octadecatriensäure als Substrat verwendet wurde, während die
Aktivität mit (13S,9Z,11E)-13-Hydroperoxy-9,11-Octadecadiensäure etwa um eine
Größenordnung niedriger war. In A. Geerts et al. Plant Physiology 105: 269-277 (1994), ist
die Expression von 9-Lipoxygenase in verwundeten Knollen der Kartoffel beschrieben.
Die internationale Patentanmeldung WO 00/00627 offenbart Nukleinsäuresequenzen, die für
9-Hydroperoxid-Lyasen und 13-Hydroperoxid-Lyasen kodieren. Gemäß dieser
Patentanmeldung katalysiert 13-Hydroperoxid-Lyase ausschließlich die Bildung von C6-
Aldehyden und C12-Oxosäuren aus 13-Hydroperoxid-C18-Fettsäurederivaten, während 9-
Hydroperoxid-Lyase ausschließlich die Bildung von C9-Aldehyden und C9-Oxosäuren aus 9-
Hydroperoxid-C18-Fettsäurederivaten katalysiert.
Die internationale Patentanmeldung WO 00/22145 beschreibt ein Hydroperoxid-Lyase-Gen
aus Mais. Ferner sind dort Verfahren zur Verbesserung von Krankheitsresistenzen und zur
Änderung des Gehaltes von Aromamolekülen in Pflanzen offenbart. Diese Verfahren
umfassen die Expression von Hydroperoxid-Lyase-Genen in Pflanzen, Pflanzenzellen und
Pflanzengeweben. Eine Spezifität der dort beschriebenen Hydroperoxid-Lyase aus Mais für
bestimmte Hydroperoxidfettsäuren ist dort nicht beschrieben.
In der internationale Patentanmeldung WO 99/58648 ist das 13-Hydroperoxidfettsäure-
Lyaseprotein aus Guave sowie das Gen offenbart, das dieses Protein kodiert. Ferner
beschreibt diese Patentanmeldung die durch die vorstehend genannten 13-HPL katalysierte
Spaltung eines 13-Hydroperoxidderivats von Linolensäure in n-Hexanal und weitere C6-
Aldehyde sowie in eine C12-Oxocarbonsäure.
Die im Stand der Technik beschriebenen Verfahren beschreiben somit die Spaltung von 13-
Hydroperoxidfettsäuren durch 13-Hydroperoxid-Lyase bzw. 9-Hydroperoxidfettsäuren durch
9-Hydroperoxid-Lyase. D. h., die Herstellung eines C9-Aldehyds bzw. -Alkohols aus einer
C18-Fettsäure über das entsprechende Hydroperoxid-Fettsäurederivat erfordert gemäß dem
Stand der Technik die Spaltung eines 9-Hydroperoxid-Fettsäurederivats mit einer 9-HPL.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es nun, ein neues, einfaches Verfahren zur
Herstellung von C9-Aldehyden, C9-Alkoholen sowie Estern der C9-Alkohole bereitzustellen,
bei dem die Aktivität einer 9-Hydroperoxid-Lyase nicht benötigt wird. Weitere Aufgaben der
Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
Diese Aufgaben werden durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen definiert.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß 13-Hydroperoxid-Lyasen (9S)-Hydroperoxid-
Fettsäurederivate umsetzen, die in Position Δ6 eine weitere Doppelbindung enthalten.
Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden bzw. C9-
Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren bereitgestellt,
wobei die mehrfach ungesättigten Fettsäuren zumindest an den Positionen Δ6 und Δ9
Doppelbindungen aufweisen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die folgenden
Schritte:
- a) die Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein pflanzliches oder mikrobielles Protein mit der biologischen Aktivität von 9-Lipoxygenase kodiert;
- b) die Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls, welches ein pflanzliches oder mikrobielles Protein mit der biologischen Aktivität von 13-Hydroperoxid-Lyase kodiert;
- c) die Übertragung der Nukleinsäuremoleküle aus a) und b) auf eukaryontische oder prokaryontische Zellen, wobei die kodierende Sequenz unter Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen steht,
- d) die Expression der rekombinanten 9-Lipoxygenase bzw. 13-Hydroperoxid-Lyase in den Zellen;
- e) gegebenenfalls die Reduktion der erzeugten C9-Aldehyde zu C9-Alkoholen;
- f) gegebenenfalls die Umsetzung der C9-Alkohole aus Schritt e) mit einer Säure, insbesondere Essigsäure, zu einem entsprechenden Ester;
- g) gegebenenfalls die Gewinnung der hergestellten C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole aus den Zellen.
Falls in den eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen bereits eine 9-LOX- bzw. 13-HPL-
Aktivität in angemessener Höhe vorhanden ist, kann gegebenenfalls auf die Übertragung der
Nukleinsäuremoleküle aus Schritt a) oder b) des erfindungsgemäßen Verfahrens verzichtet
werden.
Vorzugsweise werden bei der vorliegenden Erfindung als mehrfach ungesättigte Fettsäuren
C18-Fettsäuren eingesetzt. Beispiele für C18-Fettsäuren, die in Position Δ6 eine
Doppelbindung aufweisen, und vorteilhaft bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet
werden können, sind γ-Linolensäure oder Stearidonsäure (6Z,9Z,12Z,15Z-Octadecatetraen
säure).
Für den Fall, daß die vorstehend genannten mehrfach ungesättigten Fettsäuren, insbesondere
γ-Linolensäure oder Stearidonsäure, in der Pflanzenzelle nicht in ausreichenden Konzen
trationen vorliegen, umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren sowie das nachfolgend
beschriebene Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einem
veränderten, insbesondere erhöhten Gehalt an C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. deren
Estern in einer bevorzugten Ausführungsform zusätzlich die Bereitstellung zusätzlicher
Ausgangssubstrate in der Pflanzenzelle, z. B. durch Expression einer Acyllipid-Δ6-Desaturase
in der Pflanzenzelle. Geeignete DNA-Sequenzen, die für Proteine mit der enzymatischen
Aktivität einer Acyllipid-Δ6-Desaturase kodieren, sind dem Fachmann bekannt und können
dem Stand der Technik entnommen werden. Bevorzugt handelt es sich bei der DNA-Sequenz,
die zwecks Bereitstellung von γ-Linolensäure in Pflanzen auf Pflanzenzellen übertragen und
in diesen exprimiert wird, um eine für eine Acyllipid-Δ6-Desaturase kodierende DNA-
Sequenz aus Boragio officinalis.
Vorzugsweise werden im Anschluß an die Übertragung der Nukleinsäuremoleküle auf
pflanzliche Zellen aus den transgenen Zellen vollständige Pflanzen regeneriert, die als
Produktionsstätte für C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole dienen.
Bei einer alternativen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei den
transformierten Zellen um Bakterienzellen, Hefezellen oder Algenzellen. In diesem Fall
erfolgt die Kultivierung der Zellen und die Herstellung der C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole
bzw. Ester der C9-Alkohole in einem Reaktor. Selbstverständlich muß dabei eine
ausreichende Konzentration der Substrate sichergestellt werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform werden transgene Pflanzenzellen kultiviert (z. B. in Form
von Suspensions- oder Kalluskulturen) und als Produktionsstätte für C9-Aldehyde bzw. C9-
Alkohole bzw. Estern der C9-Alkohole genutzt.
Vorzugsweise kodiert das Nukleinsäuremolekül aus Schritt a) ein Protein mit der
biologischen Aktivität von 9-Lipoxygenase aus der Kartoffel.
Ferner kodiert das Nukleinsäuremolekül aus Schritt b) vorzugsweise eine 13-Hydroperoxy-
Lyase aus Arabidopsis oder alternativ aus Tomate, Alfalfa oder Guave.
Je nach Wunsch kann der entstandene Aldehyd in Schritt e) des erfindungsgemäßen
Verfahrens enzymatisch, vorzugsweise mit Alkoholdehydrogenase, oder chemisch,
vorzugsweise mit Natriumborhydrid, zu einem C9-Alkohol reduziert werden.
Alternativ zu der vorstehend beschriebenen Expression der rekombinanten 9-Lipoxygenase
bzw. 13-Hydroperoxid-Lyase in Zellen können die C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester
der C9-Alkohole auch in vitro in einem Reaktionsgemisch hergestellt werden, das als
Komponenten eine mehrfach ungesättigte Fettsäure mit Doppelbindungen zumindest an den
Positionen Δ6 und Δ9, insbesondere eine C18-Fettsäure, besonderes bevorzugt γ-Linolensäure
oder Stearidonsäure; 9-Lipoxygenase und 13-Hydroperoxid-Lyase (als Rohextrakt oder in
reiner Form); sowie, falls die Herstellung eines Alkohols erwünscht ist, ein Reduktionsmittel;
sowie, falls die Herstellung eines Esters erwünscht ist, eine Säure, insbesondere Essigsäure;
umfaßt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Verfahren zur Veränderung des
Gehalts an C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole in einer
Wirtszelle. Im allgemeinen umfassen die Verfahren entweder das Erhöhen oder das
Vermindern des Gehalts an C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole
in einer Wirtszelle. Das Verfahren umfaßt die Verwendung von Expressionskonstrukten zur
Durchführung der Expression von DNA-Sequenzen, die ein Protein mit der biologischen
Aktivität einer 13-Hydroperoxid-Lyase kodieren, in einer Wirtszelle. Insbesondere bevorzugt
ist die Verwendung von Expressionskonstrukten zur Veränderung des Gehaltes an C9-
Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole in einer Pflanzenzelle bzw.
Pflanze. Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Veränderung des Gehaltes
an C9-Aldehyden, C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole in Pflanzenteilen einschließlich
Blätter, Wurzeln, Stämme, Blüten, Früchte, Samen und Saatölen, die aus Pflanzensamen
erhalten werden, verwendet.
Besonders bevorzugt werden die 13-Hydroperoxid-Lyase kodierenden DNA-Sequenzen zur
Erzeugung von transgenen Pflanzen verwendet, die eine erhöhte Produktion an C9-Aldehyden
bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole in Pflanzenfrüchten und -geweben
aufweisen. Derartige Aldehyde sind wichtige Bestandteile charakteristischer Aromata von
Früchten, Gemüse und grünen Blättern. Somit kann eine 13-Hydroperoxid-Lyase
erfindungsgemäß auch zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserten
Aromamerkmalen verwendet werden.
Um die Lipidperoxidation in einem Pflanzengewebe zu erhöhen, schließt die vorliegende
Erfindung auch die Coexpression einer pflanzlichen oder anderen 13-Hydroperoxid-Lyase in
einem Pflanzengewebe mit einem zweiten Gen ein, das bei der Lipidperoxidation eine Rolle
spielt. Beispielsweise kann die Coexpression einer 13-Hydroperoxid-Lyase in einem
Pflanzengewebe mit einer DNA-Sequenz, die für eine Lipoxygenase, insbesondere eine 9-
Lipoxygenase kodiert, die Lipidperoxidation erhöhen und somit den Gehalt an C9-Aldehyden,
die in dem Pflanzengewebe erzeugt werden, steigern. Eine derartige Erhöhung an C9-
Aldehyden kann das "Melonen"- bzw. "Gurken"-Aroma in einer Pflanze erhöhen.
Ferner können die Pflanzenzellen, die eine DNA-Sequenz enthalten, die für eine 13-
Hydroperoxid-Lyase kodiert, ebenfalls als Quelle für C9-Aldehyde in Reaktionen für die
Erzeugung von C9-Alkoholen für die Verwendung in Aromastoffen verwendet werden.
Derartige Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und sind beispielsweise in der US-
Patentschrift 5,695,973 und in der internationalen Patentanmeldung WO 95/26413
beschrieben. Im allgemeinen wird eine Mischung aus Aldehyden und Alkoholen durch
derartige Verfahren erhalten. Die Verfahren werden üblicherweise in einem
Reaktionsgemisch durchgeführt, das mindestens eine mehrfach ungesättigte Fettsäure, ein
Pflanzenmaterial mit einem relativ hohen Gehalt an Enzymaktivität von Lipoxygenase und
Hydroperoxid-Lyase und eine Alkoholdehydrogenase enthält.
Die mehrfach ungesättigte Fettsäure kann variieren und umfaßt eine einzelne ungesättigte
Fettsäureart sowie Mischungen von verschiedenen ungesättigten Fettsäuren. Die Fettsäuren
sind im allgemeinen C18-Fettsäuren, aber nicht beschränkt auf diese. Bevorzugte Beispiele
schließen γ-Linolensäure und Stearidonsäure ein. Voraussetzung der Spezifität der 13-
Hydroperoxid-Lyase für eine 9-Hydroperoxidfettsäure ist eine Doppelbindung an Position Δ6.
Quellen für eine für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Alkoholdehydrogenase
sind vorzugsweise Hefen. Die Alkoholdehydrogenase katalysiert die Umwandlung eines
Aldehyds in einen Alkohol. Hefe stellt ferner eine Quelle für Nicotinadenindinucleotid
(NADH) als Reduktionsmittel bereit.
Die DNA-Sequenz, die ein Protein mit der biologischen Aktivität einer 9-LOX bzw. einer 13-
HPL kodiert, kann aus natürlichen Quellen isoliert oder nach herkömmlichen Verfahren
synthetisiert werden. Mittels gängiger molekularbiologischer Techniken (siehe beispielsweise
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) ist es möglich, gewünschte
Konstrukte für die Transformation von Pflanzenzellen vorzubereiten bzw. herzustellen. Die
für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen üblicherweise eingesetzten
Klonierungs-, Mutagenisierungs-, Sequenzanalyse-, Restriktionsanalyse- und weitere bio
chemisch-molekularbiologischen Methoden sind dem Durchschnittsfachmann wohl bekannt.
So können nicht nur geeignete chimäre Genkonstrukte mit der gewünschten Fusion von
Promotor und 9-LOX- bzw. 13-HPL-DNA-Sequenz und ggf. weiteren Regulations- und/oder
Signalsequenzen hergestellt werden, vielmehr kann der Fachmann, falls erwünscht, zusätzlich
mittels Routmetechniken, verschiedenartige Mutationen in die die 9-LOX- bzw. 13-HPL
kodierende DNA-Sequenz einführen, wodurch es zur Synthese von Proteinen mit eventuell
veränderten biologischen Eigenschaften kommt. Hierbei ist zum einen die Erzeugung von
Deletionsmutanten möglich, bei denen durch fortschreitende Deletion vom 5'- oder vom 3'-
Ende der kodierenden DNA-Sequenz die Synthese entsprechend verkürzter Proteine erreicht
werden kann. Ferner ist es möglich, gezielt Enzyme herzustellen, die durch Addition
entsprechender Signalsequenzen in bestimmten Kompartimenten der Pflanzenzelle lokalisiert
sind. Derartige Sequenzen sind in der Literatur beschrieben und dem Durchschnittsfachmann
wohl bekannt (siehe z. B. Braun et al. (1992) EMBO J. 11: 3219-3227; Wolter F. et al. (1988)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 846-850; Sonnewald U. et al. (1991) Plant J. 1: 95-106).
Weiterhin ist auch die Einführung von Punktmutationen an Positionen denkbar, bei denen
eine Veränderung der Aminosäuresequenz einen Einfluss beispielsweise auf die Enzymakti
vität oder die Regulierung des Enzyms hat. Auf diese Weise können z. B. Mutanten hergestellt
werden, die nicht mehr den normalerweise in der Zelle herrschenden Regulationsmechanis
men über allosterische Regulation oder kovalente Modifizierung unterliegen. Des weiteren
können Mutanten hergestellt werden, die eine veränderte Substrat- oder Produktspezifität
aufweisen (Hornung et al. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 4192-4197). Weiterhin
können Mutanten hergestellt werden, die ein verändertes Aktivitäts-, Temperatur- und/oder
pH-Profil aufweisen.
Für die gentechnische Manipulation in prokaryontischen Zellen können die erfindungs
gemäßen rekombinanten Nukleinsäuremoleküle oder Teile davon in Plasmide eingebracht
werden, die eine Mutagenese oder eine Sequenzveränderung durch Rekombination von DNA-
Sequenzen erlauben. Mit Hilfe von Standardverfahren (siehe z. B. Sambrook et al. (1989),
vide supra) können Basenaustausche vorgenommen oder natürliche oder synthetische
Sequenzen hinzugefügt werden. Für die Verbindung der DNA-Fragmente untereinander
können an die Fragmente, wo erforderlich, Adapter oder Linker angefügt werden. Ferner
können mittels enzymatischer und anderer Manipulationen passende Restriktionsschnittstellen
zur Verfügung gestellt oder überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernt werden.
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen in Frage kommen, können in vitro-
Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Als Analyse
methoden werden im allgemeinen Sequenzanalyse, Restriktionsanalyse und weitere
biochemisch-molekularbiologische Methoden durchgeführt.
Für die Expression der in den rekombinanten Nukleinsäuremolekülen enthaltenen DNA-
Sequenzen in pflanzlichen Zellen kommt grundsätzlich jeder in pflanzlichen Zellen aktive
Promotor in Frage. So können die 9-LOX- bzw. 13-HPL-DNA-Sequenzen beispielsweise
unter Kontrolle konstitutiver, aber auch induzierbarer oder gewebe- bzw. entwicklungs
spezifischer Regulationselemente, insbesondere Promotoren, in Pflanzenzellen exprimiert
werden. Während beispielsweise die Verwendung eines induzierbaren Promotors die gezielt
ausgelöste Expression der 9-LOX- bzw. 13-HPL-DNA-Sequenzen in Pflanzenzellen
ermöglicht, bietet beispielsweise der Einsatz von gewebespezifischen, beispielsweise blatt-
oder samenspezifischen, Promotoren die Möglichkeit, den Gehalt an C9-Aldehyden bzw. C9-
Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole in bestimmtem Gewebe, z. B. in Blatt-. bzw.
Samengewebe, zu verändern. Andere geeignete Promotoren vermitteln z. B. Lichtinduzierte
Genexpression in transgenen Pflanzen. In Bezug auf die zu transformierende Pflanzen kann
der Promotor homolog oder heterolog sein.
Geeignete Promotoren sind z. B. der 35S RNA-Promotor des Cauliflower Mosaic Virus und
der Ubiquitin-Promotor aus Mais für eine konstitutive Expression. Als samenspezifische
Promotoren bieten sich bspw. der USP- (Bäumlein et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 225: 459-
467) oder dem Hordein-Promotor (Brandt et al. (1985), Carlsberg Res. Commun. 50: 333-
345).
Konstitutive, keimungsspezifische und samenspezifische Promotoren werden im Rahmen
dieser Erfindung bevorzugt, da sie sich besonders für die gezielte Erhöhung des Gehalts an
C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole in transgenen Samen eignen,
u. a. auch im Zusammenhang mit der Antisense- oder Cosuppressions-Technik.
In jedem Fall kann der Fachmann geeignete Promotoren der Literatur entnehmen oder mittels
Routineverfahren selbst aus beliebigen Pflanzen isolieren.
Ferner sind Transkriptions- bzw. Terminationssequenz vorhanden, die der korrekten Beendi
gung der Transkription dient, sowie der Addition eines polyA-Schwanzes an das Transkript
dienen kann, dem eine Funktion bei der Stabilisierung der Transkripte beigemessen wird.
Derartige Elemente sind in der Literatur beschrieben (z. B. Gielen (1989) EMBO J. 8: 23-29)
und beliebig austauschbar, z. B. der Terminator des Octopinsynthasegens aus Agrobacterium
tumefaciens.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die in den Vektoren enthaltenen Nukleinsäure
moleküle mit regulatorischen Elementen verknüpft, die die Transkription und ggf. Translation
in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen gewährleisten.
Gegegebenfalls können die Nukleinsäuresequenzen durch Enhancer-Sequenzen oder andere
regulatorische Sequenzen ergänzt sein. Diese regulatorischen Sequenzen beinhalten
beispielsweise auch Signalsequenzen, die für den Transport des Genprodukts zu einem
bestimmten Kompartiment sorgen.
Es ist ebenso eine Aufgabe der Erfindung, neue transgene Pflanzen, Pflanzenzellen, Pflanzen
teile, transgenes Vermehrungsmaterial und transgene Ernteprodukte bereitzustellen, die sich
durch eine gegenüber Wildtyppflanzen bzw. -zellen veränderten Gehalt an C9-Aldehyden
bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole auszeichnen.
Diese Aufgabe wird durch die Übertragung der Nukleinsäuremoleküle, welche für ein
pflanzliches oder mikrobielles Protein mit der biologischen Aktivität einer 13-HPL kodieren,
und ihre Expression in Pflanzen gelöst. Durch die Übertragung der vorstehend genannten
Nukleinsäuremoleküle besteht nun die Möglichkeit, pflanzliche Zellen mittels gentechnischer
Methoden dahingehend zu verändern, daß sie im Vergleich zu Wildtypzellen eine neue oder
veränderte 13-HPL-Aktivität aufweisen und es als Folge davon zu einer Veränderung des
Gehalts an C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole in der Pflanze
kommt.
So betrifft die Erfindung in einer Ausführungsform Pflanzen bzw. deren Zellen und Teile, in
denen der Gehalt an C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole aufgrund
der Gegenwart und Expression der vorstehend genannten Nukleinsäuremoleküle gegenüber
Wildtyppflanzen erhöht ist.
Die Erfindung betrifft aber auch solche Pflanzen, in denen die Übertragung der vorstehend
genannten Nukleinsäuremoleküle zu einer Verringerung des Gehalts an C9-Aldehyden bzw.
C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole führt. Eine derartige Reduktion kann
beispielsweise durch den Transfer von Antisense-Konstrukten oder durch andere
Suppressionsmechanismen, wie beispielsweise Cosuppressionen, erreicht werden.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin transgene Pflanzenzellen bzw. solche
Pflanzenzellen umfassende Pflanzen und deren Teile und Produkte, in denen die vorstehend
genannten, für 13-HPL kodierenden Nukleinsäuremoleküle integriert in das pflanzliche
Genom vorliegen. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung sind Pflanzen, in deren Zellen das
vorstehend genannte Nukleinsäuremolekül in selbstreplizierender Form vorliegt, d. h. die
Pflanzenzelle enthält die fremde DNA auf einem eigenständigen Nukleinsäuremolekül
(transiente Expression).
Bei den Pflanzen, die mit den vorstehend genannten Nukleinsäuremolekülen transformiert
sind und in denen aufgrund der Einführung eines solchen Moleküls eine veränderte Menge an
C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole synthetisiert wird, kann es
sich im Prinzip um jede beliebige Pflanze handeln. Vorzugsweise ist es eine monokotyle oder
dikotyle Nutzpflanze.
Beispiele für monokotyle Pflanzen sind die Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer),
Triticum (Weizen), Secale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum,
Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) gehören. Bei den dikotylen Nutzpflanzen sind u. a. zu
nennen Leguminosen, wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps, Tomate,
Zuckerrübe, Kartoffel, Zierpflanzen oder Bäume. Weitere Nutzpflanzen können
beispielsweise Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und
Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal, Baumwolle, Lein,
Sonnenblume sowie Heilpflanzen und Weidegräser sowie Futterpflanzen sein. Besonders
bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse,
Futtergetreide, Zuckerrübe, Raps, Soja, Sonnenblume, Lein, Tomate, Kartoffel, Süßgräser,
Futtergräser und Klee. Es ergibt sich von selbst, daß die Erfindung insbesondere übliche
Nahrungs- bzw. Futterpflanzen betrifft. Hier sind neben den bereits erwähnten Pflanzen
zusätzlich Erdnuß, Linse, Ackerbohne, Runkelrübe, Buchweizen, Möhre, Sonnenblume,
Topinambur, Rübsen, Weißer Senf, Kohlrübe und Stoppelrübe zu nennen.
Besonders bevorzugt werden Ölsaaten.
Gegenstand der Erfindung sind ferner Vermehrungsmaterial und Ernteprodukte von
erfindungsgemäßen Pflanzen, beispielsweise Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen,
Wurzelstöcke usw., sowie Teile dieser Pflanzen, wie Protoplasten, Pflanzenzellen und Kalli.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung Wirtszellen, insbesondere
prokaryontische und eukaryontische Zellen, die mit einem oben beschriebenen
Nukleinsäuremolekül oder einem Vektor transformiert bzw. infiziert wurden, sowie Zellen,
die von derartigen Wirtszellen abstammen und die beschriebenen Nukleinsäuremoleküle oder
Vektoren enthalten. Die Wirtszellen können Bakterien, Viren, Algen, Hefe- und Pilzzellen
sowie pflanzliche oder tierische Zellen sein.
Gegenstand der Erfindung sind auch solche Wirtszellen, die neben den erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremolekülen ein oder mehrere, auf gentechnologischem oder natürlichem Weg
übertragene Nukleinsäuremoleküle enthalten, die die genetische Information für am LOX
abhängigen Katabolismus von mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Pflanzen beteiligte
Enzyme tragen.
Der vorliegenden Erfindung liegt außerdem die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung
von Pflanzenzellen und Pflanzen, die sich durch einen veränderten Gehalt an C9-Aldehyden
bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole auszeichnen, bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch Verfahren gelöst, mit deren Hilfe die Erzeugung neuer
Pflanzenzellen und Pflanzen, die aufgrund der Übertragung der vorstehend genannten, für 13-
HPL kodierenden Nukleinsäuremolekülen einen veränderten Gehalt an C9-Aldehyden bzw.
C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole aufweisen, möglich ist. Zur Erzeugung solcher
neuer Pflanzenzellen und Pflanzen bieten sich verschiedene Methoden an. Zum einen können
Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer
Transformationsmethoden derart verändert werden, daß die neuen Nukleinsäuremoleküle in
das pflanzliche Genom integriert werden, d. h., es werden stabile Transformanten erzeugt.
Zum anderen kann ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, dessen Anwesenheit und
ggf. Expression in der Pflanzenzelle eine veränderte Biosyntheseleistung bewirkt, in der
Pflanzenzelle bzw. der Pflanze als selbstreplizierendes System enthalten sein. So können die
erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle beispielsweise in einem Virus enthalten sein, mit
dem die Pflanze bzw. Pflanzenzelle in Kontakt kommt.
Erfindungsgemäß werden Pflanzenzellen und Pflanzen, die aufgrund der Expression einer
erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz einen veränderten, insbesondere erhöhten Gehalt an
C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole aufweisen, durch ein
Verfahren hergestellt, das folgende Schritte umfaßt:
- a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, umfassend die folgenden
Bestandteilen in 5' → 3'-Orientierung:
- - regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors,
- - operativ daran gebunden eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer 13-HPL kodiert, und
- - ggf. operativ daran gebunden Sequenzen, die als Transkriptions-, Termination- und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
- b) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen.
Alternativ können eine oder mehrere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen als
selbstreplizierendes System in die Pflanzenzelle bzw. die Pflanze eingebracht werden.
Als weitere Alternative kann Schritt a) des obigen Verfahrens dahingehend abgewandelt
werden, daß die Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer
13-HPL kodiert, in Antisense-Orientierung an das 3'-Ende des Promotors gekoppelt ist.
Bei einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere zusätzliche
Nukleinsäuremoleküle eingeführt werden, die für Proteine kodieren, die die Oxygenierung
von Fettsäuren zu 9-Hydroperoxid-Fettsäuren katalysieren (Lipoxygenasen).
Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen
eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikationssignal für E.
coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für
derartige Vektoren sind pBR322, pUC-Serien, M13mp-Serien, pACYC184 usw. Die gewün
schte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt
werden. Das erhaltene Plasmid wird dann für die Transformation von E. coli-Zellen verwen
det. Transformierte E. coli-Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend
geerntet und lysiert, und das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysen
methode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid-DNA werden im allgemeinen
Restriktionsanalysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch-molekularbiologische
Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und
gewonnene DNA-Fragmente mit anderen DNA-Sequenzen verknüpft werden.
Voraussetzung für die Einführung der rekombinanten Nukleinsäuremoleküle und Vektoren in
Pflanzenzellen ist die Verfügbarkeit geeigneter Transformationssysteme. Hier wurde während
der letzten zwei Jahrzehnte ein breites Spektrum an Transformationsmethoden entwickelt und
etabliert. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter
Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes als
Transformationsmittel, Diffusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA
in Protoplasten, die Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen, die
Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methoden sowie weitere Möglichkeiten,
wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode problemlos ermitteln kann. Sämtliche
Transformationsverfahren sind seit vielen Jahren gut etabliert und gehören zweifelsohne zum
Standardrepertoire des Fachmanns in der pflanzlichen Molekularbiologie,
Pflanzenbiotechnologie und Zell- und Gewebekultur.
Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine spe
ziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten
Gentransfer. Es können einfache Plasmide, wie z. B. pUC-Derivate, verwendet werden. Sollen
aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesen
heit eines selektierbaren Markergens empfehlenswert. Dem Fachmann sind die gängigen
Selektionsmarker bekannt, und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker
auszuwählen.
Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA-
Sequenzen erforderlich sein. Werden z. B. für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti-
oder Ri-Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die
rechte und linke Begrenzung der im Ti- bzw. Ri-Plasmid enthaltenen T-DNA als Flanken
bereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden. Werden für die Transformation
Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert wer
den, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die interme
diären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA
sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri-Plasmid der Agrobakterien integriert
werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir-Region.
Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplas
mids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Kon
jugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren.
Sie enthalten ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker, welche von der
rechten und linken T-DNA-Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agro
bakterien transformiert werden. Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid,
das eine vir-Region trägt, enthalten. Die vir-Region ist für den Transfer der T-DNA in die
Pflanzenzelle notwendig. Zusätzliche T-DNA kann vorhanden sein. Das derartig transfor
mierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet. Die Verwen
dung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzellen ist intensiv untersucht und
ausreichend in allseits bekannten Übersichtsartikeln und Handbüchern zur Pflanzentrans
formation beschrieben worden.
Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen-Explantate zweckmäßiger
weise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus
dem infizierten Pflanzenmaterial (z. B. Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch
Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeigneten
Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten
kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden.
Ist die eingeführte DNA einmal im Genom der Pflanzenzelle integriert, so ist sie dort in der
Regel stabil und bleibt auch in den Nachkommen der ursprünglich transformierten Zelle
erhalten. Sie enthält normalerweise einen Selektionsmarker, der den transformierten Pflanzen
zellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G 418,
Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonylharnstoff, Genta
mycin oder Phosphinotricin u. a. vermittelt. Der individuell gewählte Marker sollte daher die
Selektion transformierter Zellen gegenüber Zellen, denen die eingeführte DNA fehlt, gestat
ten. Hierzu sind auch alternative Marker geeignet, wie nutritive Marker, Screeningmarker
(wie GFP, green fluorescent protein). Selbstverständlich kann auch vollkommen auf Selek
tionsmarker verzichtet werden, was allerdings mit einem ziemlich hohen Screeningbedarf
einhergeht. Falls der eingesetzte Selektionsmarker nach erfolgter Transformation und
Identifizierung erfolgreich transformierter Zellen bzw. Pflanzen wieder entfernt werden soll,
stehen dem Fachmann hierfür verschiedene Strategien zur Verfügung. So können z. B.
sequenzspezifische Rekombinasen verwendet werden, z. B. in Form der Retransformation
einer Rekombinase-exprimierenden Ausgangslinie und Auskreuzung der Rekombinase nach
erfolgter Entfernung des Selektionsmarkers (siehe z. B. Reiss et al. (1996) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 93: 3094-3098; Bayley et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 353-361; Lloyd et al.
(1994) Mol. Gen. Genet. 242: 653-657; Mäser et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176;
Onouchi et al. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 6373-6378). Der Selektionsmarker kann auch
durch Cotransformation mit anschließender Auskreuzung entfernt werden.
Die Regeneration der transgenen Pflanzen aus transgenen Pflanzenzellen erfolgt nach übli
chen Regenerationsmethoden unter Verwendung üblicher Nährmedien und Phytohormone.
Die so erhaltenen Pflanzen können dann, falls erwünscht, mittels üblicher Verfahren,
einschließlich molekularbiologischer Methoden, wie PCR, Blot-Analysen, oder biochemischer
Verfahren auf Anwesenheit der eingeführten DNA, die ein Protein mit der
enzymatischen Aktivität einer 13-HPL kodiert, bzw. auf Anwesenheit von 13-HPL-
Enzymaktivität untersucht werden.
Unabhängig von den verwendeten regulatorischen Sequenzen, unter deren Kontrolle die
Expression der 9-LOX- bzw. 13-HPL-Sequenzen steht, steht dem Fachmann ein breites
Spektrum an molekularbiologischen und/oder biochemischen Verfahren für die Analyse der
transformierten Pflanzenzellen, transgenen Pflanzen, Pflanzenteile, Ernteprodukte und
Vermehrungsmaterial zur Verfügung, z. B. PCR, Northern Blot-Analyse zum Nachweis von
für 9-LOX- bzw. 13-HPL spezifischer RNA bzw. zur Bestimmung der Höhe der
Akkumulation von 9-LOX- bzw. 13-HPL-spezifischer RNA, Southern Blot-Analyse zur
Identifizierung von 9-LOX- bzw. 13-HPL-kodierenden DNA-Sequenzen oder Western Blot-
Analyse zum Nachweis des durch die Nukleinsäuremoleküle kodierten 9-LOX- bzw. 13-HPL.
Selbstverständlich kann der Nachweis der enzymatischen Aktivität der 9-LOX- bzw. 13-HPL
auch vom Fachmann mittels in der Literatur erhältlicher Protokolle bestimmt werden. Weiter
kann man z. B. den durch Kreuzungen erhaltenen Samen auf Medium auslegen, das das zu
dem zusammen mit der 9-LOX- bzw. 13-HPL-DNA-Sequenz übertragenen Selektionsmarker
passende Selektionsmittel enthält, und anhand der Keimfähigkeit und des Wachstums der
Tochtergeneration(en) und des Segregationsmusters Rückschlüsse auf den Genotyp der
jeweiligen Pflanze schließen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verwendungen der 13-HPL aufzuzeigen.
Diese Aufgabe wird durch die erfindungsgemäßen Verwendungen der 13-HPL zur Erzeugung
von Pflanzenzellen und Pflanzen, die sich durch einen im Vergleich zu Wildtypzellen bzw.
Wildtyppflanzen veränderten Gehalt an C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der
C9-Alkohole auszeichnen, gelöst.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner jede mögliche Form des Einsatzes des für 13-HPL
kodierenden Nukleinsäuremoleküls, dessen Gegenwart und ggf. Expression in Pflanzen eine
Veränderung des Gehalts an C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole
bewirkt.
Die für 13-HPL kodierenden Nukleinsäuremoleküle können somit erfindungsgemäß
verwendet werden, um transgene Pflanzen zu erzeugen, in denen der Gehalt an 13-HPL höher
oder geringer ist als natürlicherweise, oder in Zelltypen oder Entwicklungsstufen vorliegt, bei
denen die 13-HPL normalerweise nicht gefunden werden. Dies bewirkt eine Änderung des
Gehalts an C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole in diesen Zellen.
Die Akkumulierung von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole kann
ein vorteilhafter Phenotyp in Pflanzen sein, die für Lebensmittel verwendet werden.
Für manche Anwendungen kann es nützlich sein, die 13-HPL in unterschiedliche zelluläre
Kompartimente einzuführen oder deren Sekretion aus der Zelle zu erleichtern. Es ist somit
möglich, daß die für 13-HPL kodierenden Nukleinsäuremoleküle derart modifiziert sind, daß
sie mit geeigneten intrazellulären Target-Sequenzen, wie Transit-Sequenzen (K. Keegstra
(1989) Cell 56: 247-253), Signal-Sequenzen und dergleichen ergänzt werden.
Für manche Anwendungen kann es auch erwünscht sein, die Expression von Nukleinsäure
molekülen zu vermindern oder zu eliminieren, die für 13-HPL kodieren. Um dies zu
erreichen, kann ein für die Cosupression der 13-HPL entwickeltes Nukleinsäuremolekül
durch Verknüpfen eines Gens oder Genfragments, das eine 13-HPL kodiert, mit Pflanzen
promotersequenzen, erzeugt werden. Alternativ kann ein Nukleinsäuremolekül, das für die
Expression von Antisense-RNA für das gesamte oder einen Teil des vorstehend genannten
Nukleinsäuremoleküls entwickelt ist, durch Verbinden des Gens oder Genfragments in
reverser Orientierung zu Pflanzenpromotersequenzen erzeugt werden. Sowohl die Gene für
die Cosuppression als auch die Antisense-Gene können mittels Transformation in die
Pflanzen eingeführt werden, wodurch die Expression der entsprechenden endogenen Gene
vermindert oder eliminiert ist.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Beschreibung der vorliegenden Erfindung, ohne
diese in irgendeiner Weise einzuschränken.
Amplifizierte PCR-Fragmente von cDNA-Sequenzen, die JUr eine 9-Lipoxygenase aus
Solanum tuberosoum sowie eine 13-Hydroperoxid-Lyase aus Arabidopsis thaliana kodieren,
wurden in den Expressionsvektor QIAexpress pQE 30 (Qiagen, Hilden, Deutschland)
hineinligiert und mit Transformation in XL1-Blue-Zellen unter Nutzung des p GEMR-T Easy
Vector System II Kits (Promega, Madison, USA) vorkloniert. Anschließend erfolgte die
Umklonierung in den Expressionsstamm E. coli SG13009[pREP4].
Für die Expression der pflanzlichen Lipoxygenase bzw. Hydroperoxid-Lyase wurde der
E. coli-Stamm in LB-Medium bei 37°C bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,6
angezogen. Dann wurde die Kultur auf Eis abgekühlt und die Expression durch Zugabe von
1 mM IPTG induziert. Die Expression erfolgte bei 10°C für 18 Stunden. Schließlich wurden
die Bakterien bei 4000 x g abzentrifugiert.
Die Reinigung der rekombinanten Hydroperoxid-Lyase von Arabidopsis thaliana erfolgte
nach dem folgenden Protokoll:
- - Waschen des Bakterienpellets aus Beispiel 1 mit 50 mM Na-Phosphat-Puffer bei pH 8
- - Resuspendieren des Bakterienpellets in 5 Volumina 50 mM Na-Phosphat-Puffer
- - Aufschließen der Bakterien in 50 mM Na-Phoshat-Puffer durch Ultraschallbehandlung
- - Zentrifugieren bei 5.000 x g und Verwerfen des Sedimentes
- - Zentrifugieren des Überstandes bei 100.000 x g und Verwerfen des entstehenden Überstandes
- - Zugabe von 0,1% Triton X-100 zu dem Sediment und Inkubation für 1 Stunde bei 4°C
- - Zentrifugation bei 100.000 x g und Verwerfen des Sedimentes
- - Inkubation des Zentrifugationsüberstandes mit Talon-Affinity Resin (Clontech, Palo Alto, USA) für 18 Stunden bei 4°C
- - Waschen des Talon-Protein-Konjugates mit:
20 Säulenvolumina 50 mM Na-Phosphat pH 8/0,5 M NaCl
10 Säulenvolumina 50 mM Na-Phosphat pH 7/0,5 M NaCl
10 Säulenvolumina 50 mM Na-Phosphat pH 6/0,5 M NaCl - - Elution der HPL mit 3 Säulenvolumina 50 mM Na-Phosphat pH 4, 5/0,5 M NaCl
Die Herstellung von 9-Hydroperoxiden aus γ-Linolensäure erfolgte nach dem folgenden
Protokoll:
- - Resuspendieren des Bakterienpellets von 21 Kultur in 30 ml Lysispuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10% (v/v) Glycerin, 0,1% Tween 20, 0,5 M NaCl)
- - Aufschließen der Bakterien durch Ultraschallbehandlung
- - Zentrifugation bei 14.000 x g und Verwerfen des Sedimentes
- - Rühren von 10 ml geklärtem Bakterien-Homogenat mit 20 mg Fettsäure für 30 Minuten bei 4°C
- - Extraktion mit Diethylether
- - Trocknen des Extraktes unter Stickstoff und Aufnehmen in Diethylether : Hexan 93 : 7
- - Aufgeben auf eine Kieselgelsäule und Waschen mit Diethylether : Hexan 93 : 7
- - Elution der LOX-Produkte mit Diethylether : Hexan 80 : 20
- - Berechnung der Ausbeute aus der optischen Dichte bei 234 nm (eine Extinktion von 1 entspricht 12,4 µg Hydroperoxid bei 1 ml Meßvolumen und einer Schichtdicke von 10 mm)
Die Umsetzung des 9-Hydroperoxids von γ-Linolensäure mit rekombinanter HPL von
Arabidopsis thaliana erfolgte nach dem folgenden Protokoll:
- - Endvolumen des Reaktionsansatzes von 0,5 ml:
0,1 M Na-Phosphat
1 µg gereinigte HPL
5 µg des Hydroperoxids - - Reaktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter Argon
- - Zugabe von 2 ml 1 M HCl
- - Zugabe von 0,5 ml 2,4-Dinitrophenylhydrazin (DNPH, 1 mg/ml in 1 M HCl)
- - Schütteln für 1 Stunde bei Raumtemperatur unter Argon
- - Extraktion mit Hexan
Der Nachweis der derivatisierten Aldehyde aus Beispiel 4 erfolgte durch Trennung mittels
HPLC auf einer Säule Phenomenex RP18 Jupiter 1 × 250 mm (Laufmittel Acetonitril : H2O,
Gradient von 60 : 40 nach 80 : 20, Flußrate 0,05 ml/min) und Detektion der Aldehyd-Derivate
bei λ = 365 nm. Die Zuordnung der Peaks zu den einzelnen Produkten erfolgte mittels
mitgeführter Reinsubstanzen.
Claims (19)
1. Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der
C9-Alkohole aus mehrfach ungesättigten Fettsäuren, die zumindest Doppelbindungen an den
Positionen Δ6 und Δ9 aufweisen, insbesondere C18-Fettsäuren, besonders bevorzugt
γ-Linolensäure oder Stearidonsäure, umfassend die folgenden Schritte:
- a) die Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls, welches für ein pflanzliches oder mikrobielles Protein mit der biologischen Aktivität von 9-Lipoxygenase kodiert;
- b) die Bereitstellung eines Nukleinsäuremoleküls, welches für ein pflanzliches oder mikrobielles Protein mit der biologischen Aktivität von 13-Hydroperoxid-Lyase kodiert;
- c) die Übertragung der Nukleinsäuremoleküle aus a) und b) auf eukaryontische oder prokaryontische Zellen, wobei die kodierende Sequenz unter Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen steht,
- d) die Expression der rekombinanten 9-Lipoxygenase bzw. 13-Hydroperoxid-Lyase in den Zellen;
- e) gegebenenfalls die Reduktion der entstandenen C9-Aldehyde zu C9-Alkoholen;
- f) gegebenenfalls die Umsetzung der C9-Alkohole aus Schritt e) mit einer Säure, insbesondere Essigsäure, zu einem entsprechenden Ester;
- g) gegebenenfalls die Gewinnung der hergestellten C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole aus den Zellen.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß im Anschluß an die Übertragung der Nukleinsäuresequenz auf
pflanzliche Zellen aus den transgenen Zellen vollständige Pflanzen regeneriert werden, die als
Produktionsstätte für C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole dienen.
3. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß die transformierten Zellen Bakterienzellen, Hefezellen und
Algenzellen umfassen und die Kultivierung der Zellen und die Herstellung der C9-Aldehyde
bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole in einem Reaktor erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet, daß transgene Pflanzenzellen kultiviert und als Produktionsstätte
für C9-Aldehyde bzw. C9-Alkohole bzw. Ester der C9-Alkohole genutzt werden.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz für ein Protein mit der biologischen
Aktivität von 9-Lipoxygenase aus der Kartoffel kodiert.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz für ein Protein mit der biologischen
von 13-Hydroperoxid-Lyase aus Arabidopsis kodiert.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuresequenz für ein Protein mit der biologischen
Aktivität einer 13-Hydroperoxid-Lyase aus Tomate, Alfalfa oder Guave kodiert.
8. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion in Schritt e) von Anspruch 1 enzymatisch,
vorzugsweise mit Alkoholdehydrogenase erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion in Schritt e) von Anspruch 1 chemisch,
vorzugsweise mit Natriumborhydrid erfolgt.
10. Verfahren zur Herstellung von C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der
C9-Alkohole in einem Reaktionsgemisch, umfassend die Komponenten mindestens eine
mehrfach ungesättigte Fettsäure, die zumindest Doppelbindungen an den Positionen Δ6 und
Δ9 aufweist, insbesondere C18-Fettsäuren, besonders bevorzugt γ-Linolensäure oder
Stearidonsäure; gegebenenfalls 9-Lipoxygenase; 13-Hydroperoxid-Lyase; sowie, falls
erwünscht ein Reduktionsmittel; sowie, falls erwünscht, eine Säure, insbesondere Essigsäure.
11. Verfahren nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante 9-Lipoxygenase aus der Kartoffel
verwendet wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11,
dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante 13-Hydroperoxid-Lyase aus Arabidopsis
verwendet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11,
dadurch gekennzeichnet, daß eine rekombinante 13-Hydroperoxid-Lyase aus der Tomate,
Alfalfa oder Guave verwendet wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, daß ein enzymatisches Reduktionsmittel, vorzugsweise eine
Alkoholdehydrogenase verwendet wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, daß ein chemisches Reduktionsmittel, vorzugsweise
Natriumborhydrid verwendet wird.
16. Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit einem
veränderten, insbesondere erhöhten Gehalt an C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern
der C9-Alkohole, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Herstellung eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls, umfassend die folgenden Bestandteilen in 5' → 3'-Orientierung:
- - regulatorische Sequenzen eines in Pflanzenzellen aktiven Promotors,
- - operativ daran gebunden eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer 13-HPL kodiert, und
- - ggf. operativ daran gebunden Sequenzen, die als Transkriptions-, Termination-
und/oder Polyadenylierungssignale in Pflanzenzellen dienen können.
- a) Übertragung des Nukleinsäuremoleküls aus a) auf pflanzliche Zellen.
17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei Ausgangssubstrate in Form von mehrfach
ungesättigten Fettsäuren, die zumindest Doppelbindungen an den Positionen Δ6 und Δ5
aufweisen, insbesondere C18-Fettsäuren, besonders bevorzugt γ-Linolensäure oder
Stearidonsäure; in der Pflanzenzelle durch Expression einer Acyllipid-Δ6-Desaturase in der
Pflanzenzelle bereitgestellt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Acyllipid-Δ6-Desaturase aus Boragio
officinalis stammt.
19. Verwendung von 13-Hydroperoxid-Lyase zur Erzeugung von Pflanzenzellen
bzw. Pflanzen, die einen im Vergleich zu Wildtypzellen bzw. Wildtypflanzen veränderten
Gehalt an C9-Aldehyden bzw. C9-Alkoholen bzw. Estern der C9-Alkohole aufweisen.
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