DE10002566A1 - Verfahren und Einrichtung zur Bestimmung des Schmelzpunktes und/oder der Bindungskonstante von Substanzen, wie z. B. DNA-Sequenzen, in einer Probe - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Bestimmung des Schmelzpunktes und/oder der Bindungskonstante von Substanzen, wie z. B. DNA-Sequenzen, und/oder der Konzentration derselben in einer Probe, wobei die Substanzen mit Meßpunkten auf einem planaren Lichtwellenleiter eines Reaktionsträgers, wie z. B. eines Biochips, gebildet durch mit den Substanzen reagierenden Komplementär-Agenzien, wie z. B. komplementären DNA-Einzelsträngen, in Kontakt gebracht werden und die Anregung von an die Substanzen und/oder Komplementär-Agenzien gebundenen, fluoreszierenden Farbstoffen im Bereich der Oberfläche des planaren Lichtwellenleiters zur Emission von Fluoreszenzlicht durch das evaneszente Feld von in den planaren Lichtwellenleiter eingekoppeltem Anregungslicht und die Detektion des emittierten Fluoreszenzlichtes in der Umgebung des Lichtwellenleiters oder durch Anregungslicht aus der Umgebung des planaren Lichtwellenleiters erfolgt, wobei ein Strang der Substanz bzw. eines Hybrides, wie z. B. eine Nukleinsäure, an einer Festphase gekoppelt ist und die Anbindung der Probe in der Lösung als Funktion der Zeit und/oder der Temperatur bestimmt wird.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Einrichtung zur Bestimmung des Schmelzpunktes und/oder der Bindungskonstante von Substanzen, wie z. B. DNA- Sequenzen, sowie der Konzentration derselben in einer Probe, wobei die Substanzen mit Meßpunkten, die durch mit den Substanzen reagierenden Komplementär- Agenzien, wie z. B. komplementären DNA-Einzelsträngen, gebildet werden, in Kontakt gebracht werden und unter Einstrahlung von Anregungslicht, insbesondere Laserlicht, ein Fluoreszenzlicht erzeugt wird, das über eine Erfassungseinrichtung ausgewertet wird.

Zur Bestimmung von Substanzen in Proben, insbesondere zur Feststellung bestimm­ ter DNA-Sequenzen in einer Probe, ist die Verwendung von Biochips bekannt. Diese bilden planare Substanzträger, auf deren Oberfläche eine Vielzahl von Meßpunkten, z. B. gebildet durch Nukleinsären (komplementäre DNA-Einzelstränge) immobilisert sind, wobei diese Chipoberfläche mit einer die DNA-Sequenzen als zu analysierende Substanzen enthaltenden Probe in Kontakt gebracht werden und die Probe die zu analysierenden Nukleinsäuren enthält. Da jeder Einzelstrang eines Nukleinsäure- Moleküls mit seinem komplementären Strang eine Bindung eingeht, die als Hybridisie­ rung bezeichnet wird, erhält man nach Prüfung der einzelnen Meßpunkte hinsichtlich der Anbindung von Probenmolekülen eine Aussage über die in der Probe vorhande­ nen DNA-Sequenzen. Einer der Vorteile der Biochip-Analytik besteht darin, daß bis zu einigen tausend Hybridisierungsereignissen parallel auf einem Biochip durchgeführt und detektiert werden können.

Entsprechend der Parallelität der Hybridisierungsereignisse ist ein Analysator zur Auswertung des Biochips erforderlich, der bei hoher Ortsauflösung eine ebenfalls ho­ he Nachweisempfindlichkeit erreicht. Da ein möglichst geringer Aufwand bei der Pro­ benvorbehandlung getrieben werden soll, muß außerdem auch eine geringe Anzahl von hybridisierten Molekülen an den einzelnen Meßpunkten noch zuverlässig erkannt werden.

Heute kommerziell erhältliche Biochip-Reader arbeiten nach dem Scanning-Prinzip. Das Licht zur Anregung der Fluoreszenz tastet die Oberfläche seriell ab. Entweder wird bei feststehendem Lichtstrahl der Biochip schnell bewegt, oder es wird, zumin­ dest für eine Bewegungsrichtung, ein Galvano-Scanner eingesetzt, mit dem der Lichtstrahl abgelenkt wird. Das von den Fluorochromen emittierte Licht wird dann mit einem empfindlichen Fotodetektor (z. B. einem Foto-Multiplier) nachgewiesen. Die Ge­ räte sind als Labormeßsysteme für Anwendungen in der molekularbiologischen For­ schung ausgelegt. Das Detektionslimit liegt im Bereich von wenigen Molekülen pro µm² bis ca. 100 µm². Die Scannzeiten liegen bei ca. 2 bis 4 Minuten. Die Kosten für derartige Geräte bewegen sich von ca. 50.000 US-$ für ein preisgünstiges Gerät bis zu ca. 350.000 US-$ für hochwertigere Geräte.

Beispielhaft werden hier die beiden Geräte genauer diskutiert, die heute vermutlich die größte Verbreitung haben. Es handelt sich hierbei um den GeneArray Scanner von Hewlett-Packard, der von der amerikanischen Firma Affymetrix vertrieben wird, und um den ScanArray 3000 von GSI Lumonics. Der GeneArray Scanner tastet die Chip­ oberfläche optisch ab, indem in einer Raumrichtung eine Schnellablenkung des Licht­ strahles erfolgt. In der anderen Richtung wird der Chip schrittweise bewegt. Die Ab­ messungen des Gerätes betragen 66 cm × 78 cm × 42 cm. Die Lichtquelle ist ein Ar­ gon-Ionenlaser (Wellenlänge 488 nm). Detektiert wird mit einem Foto-Multiplier bei 550 bis 600 nm. Der ScanArray 3000 hat eine feststehende Optik. Der Scann-Vor­ gang wird durch eine schnelle Bewegung des Chips in einer Raumrichtung und eine schrittweise Verschiebung in der anderen Richtung realisiert. Es werden bis zu drei verschiedene Anregungswellenlängen zur Anregung verschiedener Fluorochrome an­ geboten. Die Detektion erfolgt auch hier mit einem Foto-Multiplier. Alle Meßgeräte werten den Biochip nach abgeschlossener Hybridisierung aus.

All diesen Geräten ist aber gemein, daß sie Probleme bei der parallelen Messung des Schmelzpunktes eines Nukleinsäurehybrides, von dem ein Strang an einer Festphase immobilisiert ist, durchzuführen. Der Schmelzpunkt teilweise komplementärer Nukleinsäuren läßt sich mathematisch nur sehr ungenau errechnen, insbesondere, wenn festphasengebundene Reaktionspartner die Freiheitsgrade der Reaktion einschrän­ ken.

Eine weitere, diesen Geräten innewohnende Problematik besteht in der Bestimmung der Hybridisierungsgenetik komplexer Proben zur Analyse und Konzentrationsbe­ stimmung mehrerer Nukleinsäuren in einem Analysat. Der Nachweis multipler Nu­ kleinsäuren durch Hybridisierung wird durch die Schmelzpunktproblematik der Hybride limitiert. Liegen die wirklichen, von den errechneten Schmelzpunkten oft abweichen­ den Schmelzpunkte der Hybride nicht in einem engen Temperaturbereich, so kann ei­ ne Messung dadurch sowohl qualitativ, also falsch-negativ, bzw. falsch- positiv sein, als auch im quantitativen Bereich gestört werden.

Für eine Reihe von Anwendungen ist es aber auch interessant, den zeitlichen Verlauf der Hybridisierung direkt zu beobachten. Dieses ist mit den beschriebenen Geräten nicht möglich, da in allen Fällen die an der Oberfläche gebundenen Fluorochrome von der Chipoberseite beleuchtet werden. Die Realtime-Messung erfordert eine Detektion in Anwesenheit der Probe. Die Probe kann sich z. B. in einer Flußzelle auf der Ober­ seite des Chips befinden. Eine Einstrahlung des Anregungslichtes durch die Zelle hin­ durch oder von der Unterseite des Chips würde wegen der Anregung von Fluoro­ chromen in der Probe eine sehr hohe Untergrundintensität erzeugen. Dadurch wird die Auswertung der Reaktion auf der Oberseite des Biochips, die mit hoher Ortsauflö­ sung erfolgen muß, beträchtlich erschwert oder gar unmöglich gemacht.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren und eine Einrichtung der eingangs genannten Art zu verbessern derart, daß in einfacher Weise und ohne hohe Anforderungen an die Probenvorbehandlung eine präzise Bestimmung des Schmelzpunktes und/oder der Bindungskonstante von Substanzen ermöglicht wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Bestimmung des Schmelzpunktes und/oder der Bindungskonstante von Substanzen, wie z. B. DNA- Sequenzen, und/oder der Konzentration derselben in einer Probe, wobei die Sub­ stanzen mit Meßpunkten auf einem planaren Lichtwellenleiter eines Reaktionsträgers, wie z. B. eines Biochips, gebildet durch mit den Substanzen reagierenden Komplemen­ tär-Agenzien, wie z. B. komplementären DNA-Einzelsträngen, in Kontakt gebracht werden und die Anregung von an die Substazen und/oder Komplementär-Agenzien gebundenen, fluoreszierenden Farbstoffen im Bereich der Oberfläche des planaren Lichtwellenleiters zur Emission von Fluoreszenzlicht durch das evaneszente Feld von in den planaren Lichtwellenleiter eingekoppelten Anregungslicht und die Detektion des emittierten Fluoreszenzlichtes in der Umgebung des Lichtwellenleiters oder durch An­ regungslicht aus der Umgebung des planaren Lichtwellenleiters erfolgt, wobei ein Strang der Substanz bzw. eines Hybrides, wie z. B. eine Nukleinsäure, an einer Fest­ phase gekoppelt ist und die Anbindung der Probe in der Lösung als Funktion der Zeit und/oder der Temperatur bestimmt wird.

Durch die exakte Kenntnis derartiger Schmelzpunkte ist es möglich, die Mutationsana­ lyse auf Biochips wesentlich zu verbessern. Somit können Meßdaten für ein rationales Sondendesign zur Nukleinsäureanalytik entwickelt werden. Insbesondere ist es da­ durch möglich, Sonden zur parallelen isothermischen Analyse zu verwenden.

Dabei ist es von Vorteil, wenn das Anregungslicht in den Lichtwellenleitern mittels ei­ ner optischen Einrichtung, wie z. B. einem Prisma, eingekoppelt wird.

Ferner kann das Anregungslicht durch Totalreflexion (ATR) oder Totale Interne Re­ flexions Fluoreszenz (TIRF) der Lichtstrahlen an einer Grenzfläche zwischen zwei op­ tisch unterschiedlich dichten Medien im optisch dünneren Medium ein elektromagneti­ sches Feld erzeugen, wobei das optisch dichtere Medium eine Festphase, und das optisch dünnere Medium eine Flüssigphase ist, zur Messung des zeitlichen Verlaufs der Reaktion.

Ein solches Verfahren ermöglicht eine sehr einfache Auslegung des Reaktionsträgers, insbesondere Biochips, durch Beschichten eines transparenten Körpers mit einer hochbrechenden planaren Wellenleiterschicht und gestattet eine einfache Analysevor­ richtung, bei der z. B. eine die Probe enthaltende Flußzelle (oder einer Küvette oder sonstiger stationärer Probenkörper) in abdichtenden Oberflächenkontakt mit dem Re­ aktionsträger, insbesondere Biochip, gebracht wird, dessen Oberfläche zumindest im wesentlichen als planarer Wellenleiter ausgebildet ist und das Anregungslicht, das an einem Ende des planaren Wellenleiters in diesen eingekoppelt wird, führt, wobei das vom evaneszenten Feld des Anregungslichtes angeregte Fluoreszenzlicht durch den transparenten Trägerkörper hindurch an der dem planaren Wellenleiter und der Fluß­ zelle gegenüberliegenden Seite des Reaktionsträgers bzw. Biochips durch eine, vor­ zugsweise einen Filter enthaltende Abbildungsoptik erfaßt und einem zugehörigen ortsauflösenden Detektor, z. B. einem Foto-Multiplier oder einer CCD-Kamera zum Auslesen des Reaktionsträgers, insbesondere Biochips, zugeführt wird.

Hierbei werden sämtliche Meßpunkte auf der Oberseite des planaren Wellenleiters des Reaktionsträgers bzw. Biochips gleichzeitig durch das evaneszente Feld des in den planaren Lichtwellenleiter eingekoppelten Anregungslichtes zur Fluoreszenzlicht­ emission in Verbindung mit einer Reaktion zwischen den immobilisierten Agenzien auf der Chip-Oberfläche, wie z. B. DNA-Einzelsträngen und den nachzuweisenden Sub­ stanzen in der Probe, wie z. B. der DNA-Sequenzen, angeregt.

Die vorgenannte Aufgabe wird ferner erfindungsgemäß gelöst durch eine Einrichtung zur Analyse des Schmelzpunktes und/oder der Bindungskonstante von Substanzen und/oder der Konzentration derselben in der Probe, mit einem Reaktionsträger, insbe­ sondere Biochip, dessen Oberfläche mit den Substanzen reagierende Komplementär- Agenzien aufweist, die Meßpunkte auf einem planaren Lichtwellenleiter des Reakti­ onsträgers bilden, mit einer Lichtquelle zur Einkopplung von Anregungslicht in den planaren Lichtwellenleiter zur Anregung der Emission von Fluoreszenzlicht in Abhän­ gigkeit von der Reaktion der Substanzen der Probe mit den Komplementär-Agenzien des Reaktionsträgers und mit einem Detektor zum Erfassen des emittierten Fluores­ zenzlichtes zur Bestimmung der Ankopplung eines Stranges der Substanzen bzw. ei­ nes Hybrides, wie z. B. eine Nucleinsäure, an einer Festphase sowie zur Bestimmung der Anbindung der Probe in der Lösung als Funktion der Zeit und/oder der Tempera­ tur.

Eine derartige Einrichtung kann neben der exakten Bestimmung der obengenannten Schmelzpunkte auch noch die Dissoziations-Assoziationsgenetik von Nukleinsäuren über einen Temperaturgradienten messen, und kann durch die errechenbaren Gleichgewichtskonstanten nun eine klare Auskunft über die Reaktionsenthalpie geben und somit eine Konzentrationsbestimmung der Analysate ermöglichen. Selbst komplexere Hybridisierungskurven, z. B. mehrere Hybridisierungspartner an einer Sonde, das ist eine an die Festphase gebundene Nukleinsäure, sind durch mathematische Analyse der Hybridisierungskurve auswertbar, so daß Parameter, die bisher nicht chiptauglich waren, mit dieser Analysemethode nun erfaßt werden können.

Das Wesen der Erfindung besteht in der Bestimmung des Schmelzpunktes und der Bindungskonstante von Nukleinsäure-Hybriden und der Konzentration von Nuklein­ säuren in einer Probe, wobei ein Strang des Hybrides, also die Sonde, an einer Fest­ phase gekoppelt ist, und die Anbindung der Probe in der Lösung als Funktion der Zeit oder der Temperatur bestimmt wird.

Weitere, bevorzugte Ausgestaltungen des Erfindungsgegenstandes sind in den übri­ gen Unteransprüchen dargelegt.

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen und zugehörigen Zeichnungen näher erläutert. In diesen zeigen:

Fig. 1a einen Biochip in schematisch perspektivischer Darstellung;

Fig. 1b einen Ausschnitt eines Biochips nach Fig. 1a für einen Meßpunkt einer Oberfläche mit immobilisierten DNA-Einzelsträngen;

Fig. 1c eine schematische Darstellung der Zugabe der Probe mit den zu analy­ sierenden DNA-Sequenzen zu dem Meßpunkt nach Fig. 1a, und eine Darstellung der komplementären Interaktion zwischen den immobilisier­ ten DNA-Einzelsträngen nach Fig. 1b und den in der Probe enthaltenen DNA-Sequenzen (Hybridisierung);

Fig. 2 eine Darstellung der Trennung von gebundener und gelöster Phase nach dem ATR-Prinzip;

Fig. 3 eine erfindungsgemäße Anordnung zum Auslesen eines ATR-Prismas durch Einfachreflexion;

Fig. 4 eine erfindungsgemäße Anordnung zum Auslesen eines ATR-Prismas durch Vielfachreflexion; und

Fig. 5 Graphen zur Darstellung der Fluoreszenzverteilung sowie deren Ablich­ tung nach der Zeit.

Als Ausführungsbeispiel des Verfahrens und der Einrichtung, die den Gegenstand der vorliegenden Patentanmeldung bilden, wird die Gestaltung und das Auslesen eines Biochips gewählt, wie er für die Analyse von DNA-Sequenzen, die sich in einer Probe befinden, und zur Analyse der Nukleinsäure mit einer Oberfläche eines Biochips in Kontakt gebracht werden, verwendet.

Selbstverständlich ist dies nur ein Ausführungsbeispiel, und es können hier auch an­ dere molekularbiologische, biologische und/oder chemische Substanzen, wie z. B. Ge­ ne und Antikörper, detektiert werden.

In Fig. 1a ist in schematischer Darstellung ein solcher Biochip 1 gezeigt, der ein klei­ nes Plättchen bildet, auf dessen Oberfläche eine Vielzahl von Nukleinsäuren 11 in einzelnen Meßpunkten 10 immobilisiert sind. An jedem einzelnen Meßpunkt 10 befin­ det sich ein Oligonukleotid mit einer definierten Basensequenz. Dies ist in Fig. 1b dar­ gestellt. In Fig. 1c sind die zu analysierenden Nukleinsäuren der zu untersuchenden Probe mit 12 bezeichnet und durch einen Pfeil ist angedeutet, daß diese in Kontakt gebracht werden mit den komplementären Nukleinsäuren 11, die sich im Meßpunkt 10 befinden. Da jeder Einzelstrang eines Nukleinsäuremoleküls 11 mit seinem komple­ mentären Strang 12 (s. Fig. 1b) eine Bindung eingeht (Hybridisierung), erhält man nach Prüfung der einzelnen Meßpunkte 10 hinsichtlich der Anbindung von Probenmo­ lekülen 12 eine Aussage über die in der Probe vorhandenen DNA-Sequenzen 12. Die hybridisierten DNA-Sequenzen sind in Fig. 1c mit 13 bezeichnet.

Die folgenden Ausführungsbeispiele verwenden entweder die abgeschwächte Totalre­ flexion (ATR) oder die Totale Interne Reflexions Fluoreszenz (TIRF). Durch die Total­ reflexion eines Lichtstrahles an der Grenzfläche zwischen zwei optisch unterschiedlich dichten Medien wird im optisch dünneren Medium ein elektromagnetisches Feld er­ zeugt. Das optisch dichtere Medium sei hier eine Festphase und das optisch dünnere Medium eine Flüssigphase. Dieses sogenannte Evaneszentfeld dringt nur einige hun­ dert µm von der Grenzfläche in das flüssige Umgebungsmedium ein. Dadurch werden fast ausschließlich die an der Oberfläche angebundenen Fluoreszenzfarbstoffe nach­ gewiesen. Die im Umgebungsmedium gelösten Farbstoffe tragen nur geringfügig zum Meßsignal bei, wie es in Fig. 2 dargestellt ist. Das ermöglicht die Messung des zeitli­ chen Verlaufs von Reaktionen.

In Fig. 2 ist deutlich dargestellt, daß die Intensitätsprofile der Evaneszentfelder sehr stark abfallen.

Dabei bringt eine beheizbare Durchflußzelle die Flüssigphase mit der Festphase in Kontakt und ermöglicht die Temperierung der Reaktionspartner. Eine Flußzelle 6 ist gekoppelt mit einem Fluidik-System zur Handhabung der Flüssigphase. Durch den permantenten Kontakt der Sonde, also der an die Festphase gebundenen Nukleinsäu­ re, mit der flüssigen Phase, ist die Regenerierbarkeit des Biochips gegeben. Als Meß­ chip wird ein transparentes Prisma 5 verwandt.

Bei der Anordnung nach Fig. 3 wird die Kante des Prismas 5 flächig ausgeleuchtet. Eine einfache Totalreflexion an der Grundseite des Prismas genügt, um eine ausrei­ chend große Meßfläche zu erhalten.

Fig. 3 zeigt des weiteren in schematischer Darstellung eine Einrichtung zum Auslesen des Biochips 1, der eine Konfiguration aufweist, wie er bereits oben beschrieben wor­ den ist. Der Biochip 1 besteht wiederum aus einem transparenten Substrat und der auf das Substrat aufgebrachten hochbrechenden Beschichtung als planarer Lichtwel­ lenleiter. Der Lichtwellenleiter trägt ein Feld von Meßpunkten 10, und ein Anregungs­ licht 4 wird über das Prisma 5 in den Lichtwellenleiter eingekoppelt und in diesem ge­ führt. Die Meßsonde ist so ausgebildet, wie dies anhand der Fig. 1b erläutert wurde.

Zur Analyse von den DNA-Nukleinsäuren in einer Probe wird diese Probe hier in der Flußzelle 6 und durch diese hindurchgeführt, wie dies durch die Strömungspfeile 6a und 6b angedeutet ist. Die Flußzelle 6 wird abgedichtet auf den Lichtwellenleiter auf­ gesetzt und umgibt das Meßfeld mit den Meßpunkten 10 rahmenartig und fluiddicht, so daß die Probe mit allen Meßpunkten 10 zur möglichen Hybridisierung in Wechsel­ wirkung treten kann. Die Detektion der durch das Evaneszentfeld des Anregungslich­ tes 4 angeregten Fluoreszenzstrahlung 7 erfolgt z. B. mittels einer Abbildungsoptik 8 in Verbindung mit einem hier nicht gezeigten Filter und einem ortsauflösenden Detektor 9, wie z. B. einer DDC-Kamera oder einem Foto-Multiplier.

Auf diese Weise ist eine Erfassung der Hybridisierung und eine parallele Auslesung des Biochips 1 mit allen Meßpunkten 10 gleichzeitig möglich. Zugleich erfolgt eine selektive Anregung der gebundenen Fluorochrome in den Meßpunkten 10. Durch die­ ses Meßprinzip ist daher ohne besondere Probenvorbereitung eine mit großer Genau­ igkeit hinsichtlich der Ortsauflösung und auch hinsichtlich der Präsenz von hybridisier­ ten Nukleinsäuren eine sehr schnelle Auswertung und Detektion des Biochips 1 mög­ lich.

Bei der Anordnung gemäß Fig. 4 wird eine Kante eines wesentlich dünneren Prismas 5a, mit einer Stärke von ungefähr 1 mm mit einer Linienoptik ausgeleuchtet. Dabei sind mehrere Prismen 5a nebeneinander angeordnet. Durch Vielfachreflexion an den Ober- und Unterseiten der Prismen 5a wird eine flächige Ausleuchtung des Meßfeldes erzeugt. Die Detektion der emittierten Fluoreszenzstrahlung erfolgt mit einem ortsauf­ lösenden Detektor 9. In diesem Fall dient als Lichtquelle eine Laserdiode 3.

Die Onlinemessung der Hybridisierung mittels eines ATR-Analysators mit beheizbarer Fluidik geschieht wie folgt.

Zunächst wird die Schmelzpunktbestimmung einer DNA beschrieben. Dabei können Sonden mit synthetischen, d. h. Oligonukleotide, oder natürlichen Proben, d. h. cDNAs, hybridisiert werden. Die Aufnahme der Signalintensität bei verschiedenen Temperatu­ ren erlaubt es, den Schmelzpunkt Tm der DNA zu bestimmen. Dies ist die Temperatur, bei der 50% der maximalen Signalstärke erreicht werden. Dieser Versuch kann mit einer Vielzahl von Sonden durchgeführt werden.

Als nächstes wird die Bestimmung der Bildungskonstante beschrieben. Bei einer be­ kannten Konzentration von Analysatmolekülen kann nach Massen-Wirkungs-Gesetz die Geschwindigkeitskonstante einer Reaktion gemessen werden. Dies kann auf dem Chip mit einer Vielzahl von Analysepunkten geschehen.

Sind der Schmelzpunkt und die Bildungskonstante bekannt, so kann die Konzentration eines oder mehrerer Analyte in einer komplexen Probe über die Aufnahme der Hybri­ disierungskurve bestimmt werden.

Unter Bezugnahme auf die Fig. 5 wird nunmehr ein Anwendungsbeispiel beschrieben.

Durch Veränderung der Temperatur können die Schmelzpunkte von immobilisierten Oligonukleotiden ermittelt werden, da man ein Ablösen bzw. Binden der Probe bei Er­ höhen bzw. Verringern der Temperatur beobachten und aus der daraus erstellbaren Schmelzkurve rechnerisch den Schmelzpunkt ermitteln kann. Die Schmelzpunktbe­ stimmung kann in einem auf dem Chip parallelisierten Ansatz für viele Oligonukleotide gleichzeitig erfolgen.

Zur Schmelzkurvenbestimmung wurden z. B. Oligonukleotide eingesetzt, deren Se­ quenz einem Abschnitt des Hämochromatosegens entsprechen. Dabei wurden sowohl Oligonukleotide verschiedener Längen als auch verschiedene Basensubstitutionen an unterschiedlichen Stellen getestet. Die synthetisch hergestellten Oligonukleotide wa­ ren dabei am 5'-Ende je mit einem Spacer aus 10 Tymin-Basen und einem C6-Amino­ linker versehen. Über die Aminogruppe am Linker wurden die Oligonukleotide an sila­ nisierte Glasobjektträger kovalent gekoppelt. Zur Detektion wurde entweder mit kom­ plementären fluoreszenzmarkiertem (Cy5) Oligonukleotid oder PCR-Produkt aus Hä­ mochromatosepatienten hybridisiert und im ATR-Reader bei Temperaturerhöhung die Dissoziationskinetik gemessen. Dabei ergab sich z. B. für Oligonuekleotide einer Län­ ge von 17 Basen, die in einer Konzentration von 2 µM auf einem Glas-Chip immobili­ siert worden waren und an zentraler Position entweder die dem Wildtyp entsprechende Base G (5' ATATACGTGCCAGGTGG), die der Kurve 1 von Fig. 5 entspricht, bzw. die der Mutanten entsprechende Base A (5' ATATACGTACCAGGTGG), die der Kur­ ve 2 von Fig. 5 entspricht, enthielten, bei Hybridisierung mit einem komplementären äquimolaren Oligonukleotid der Länge von 31 Basen bei Raumtemperatur und nach­ folgender Temperaturerhöhung folgende Schmelzpunkte: Von den Oligonukleotiden, die eine Missense-Base enthielten, löste sich das komplementäre Oligonukleotid frü­ her ab (Tm 43°C) als von dem dem Wildtyp entsprechenden Oligonukleotid (Tm 46°C).

Die Fluoreszenz nimmt durch das Ablösen des fluoreszenzmarkierenden komplemen­ tären Oligonukleotids von der Oligonukleotidsonde bei Temperaturerhöhung bei der Hybridisierung des komplementären Oligonukleotids ab.

Dies ist in dem oberen Graph von Fig. 5 für den immobilisierten Wildtyp-Oligonuk­ leotids mit der Kurve 1 dargestellt, während die Kurve 2 den immobilisierten Oligonu­ kleotid, das die Missens-Base enthält und den Mutanten entspricht, gezeigt.

Die Kurve 3 dient der Kontrollmessung und zeigt die Hybridisierung ohne Oligonukleo­ tid.

Der untere Graph der Fig. 5 zeigt die Ableitung der Fluoreszenz nach der Zeit. Dabei ist aus Übersichtlichkeitsgründen die Ableitung nach Vorzeichenumkehr aufgetragen.

Claims (18)

1. Verfahren zur Bestimmung des Schmelzpunktes und/oder der Bindungskon­ stante von Substanzen (12), wie z. B. DNA-Sequenzen, und/oder der Konzentration derselben in einer Probe, wobei die Substanzen (12) mit Meßpunkten (10) auf einem planaren Lichtwellenleiter eines Reaktionsträgers (1), wie z. B. eines Biochips, gebildet durch mit den Substanzen (12) reagierenden Komplementär-Agenzien (11), wie z. B. komplementären DNA-Einzelsträngen, in Kontakt gebracht werden und die Anregung von an die Substazen (12) und/oder Komplementär-Agenzien (11) gebundenen, fluo­ reszierenden Farbstoffen im Bereich der Oberfläche des planaren Lichtwellenleiters zur Emission von Fluoreszenzlicht (7) durch das evaneszente Feld von in den plana­ ren Lichtwellenleiter eingekoppelten Anregungslicht (4) und die Detektion des emittier­ ten Fluoreszenzlichtes in der Umgebung des Lichtwellenleiters oder durch Anregungs­ licht aus der Umgebung des planaren Lichtwellenleiters erfolgt, wobei ein Strang der Substanz (12) bzw. eines Hybrides, wie z. B. eine Nukleinsäure, an einer Festphase gekoppelt ist und die Anbindung der Probe in der Lösung als Funktion der Zeit und/oder der Temperatur bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Anregungs­ licht (4) in den Lichtwellenleiter mittels einer optischen Einrichtung, wie z. B. einem oder mehreren Prismen (5; 5a) eingekoppelt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Anre­ gungslicht (4) durch Totalreflexion (ATR) oder Totale Interne Reflexions Fluoreszenz (TIRF) der Lichtstrahlen an einer Grenzfläche zwischen zwei optisch unterschiedlich dichten Medien im optisch dünneren Medium ein elektromagnetisches Feld erzeugt wird, wobei das optisch dichtere Medium eine Festphase und das optisch dünnere Medium eine Flüssigphase ist zur Messung des zeitlichen Verlaufs der Reaktion.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß Prismen (5a) vorgesehen sind, die durch Vielfachreflexion an der Ober- und Unterseite der Prismen (5a) mittels einer Linienoptik eine flächige Ausleuchtung des Meßfeldes er­ zeugen.

5. Verfahren nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche 1 bis 4, da­ durch gekennzeichnet, daß mit Hilfe des in den planaren Lichtwellenleiter eingekop­ pelten Anregungslichtes (4) eine gleichzeitige Anregung aller Meßpunkte (10) erfolgt.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenz­ licht (7) der zu den DNA-Sequenzen (12) in der Probe komplementären DNA-Einzel­ stränge (11) vorzugsweise mittels einer einen Filter (8a) enthaltenden Abbildungsoptik einem ortsauflösenden Detektor (9) oberhalb der unterhalb des Biochips (1) oder auf der Seite zum Auslesen des Biochips (1) zugeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigphase entgast wird.

8. Einrichtung zur Analyse des Schmelzpunktes und/oder der Bindungskonstante von Substanzen (12) und/oder der Konzentration derselben in einer Probe mit einem Reaktionsträger (1), insbesondere Biochip, dessen Oberfläche mit den Substanzen (12) reagierende Komplementär-Agenzien (11) aufweist, die Meßpunkte (10) auf ei­ nem planaren Lichtwellenleiter des Reaktionsträgers bilden, mit einer Lichtquelle (3) zur Einkopplung von Anregungslicht (4) in den planaren Lichtwellenleiter zur Anregung der Emission von Fluoreszenzlicht (7) in Abhängigkeit von der Reaktion der Substan­ zen (12) der Probe mit den Komplementär-Agenzien (11) des Reaktionsträgers (1) und mit einem Detektor (9) zum Erfassen des emittierten Fluoreszenzlichtes (7) zur Bestimmung der Ankopplung eines Stranges der Substanzen (12) bzw. eines Hybri­ des, wie z. B. eine Nucleinsäure, an einer Festphase sowie zur Bestimmung der An­ bindung der Probe in der Lösung als Funktion der Zeit und/oder der Temperatur.

9. Einrichtung nach Anspruch 8, gekennzeichnet durch optische Einrichtungen, wie z. B. ein oder mehrere Prismen (5; 5a), zum Einkoppeln des Anregungslichts (4) in den Lichtwellenleiter.

10. Einrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Prisma bzw. die Prismen (5; 5a) dazu ausgelegt sind, das Licht einfach oder vielfach zu reflektie­ ren.

11. Einrichtung nach Anspruch 8 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Festphase aus Glas oder transparentem Kunststoff besteht.

12. Einrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 11, gekennzeichnet durch eine in der Einrichtung integrierte Entgasungseinheit zur Ent­ gasung der Flüssigphase.

13. Einrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe durch eine Flußzelle (6) geführt oder sta­ tionär in einer Küvette oder einem Probenbehälter in abdichtender Verbindung im Be­ reich der Meßpunkte auf der Oberfläche des planaren Lichwellenleiters (1b) des Re­ aktionsträgers (1) vorgesehen ist.

14. Einrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsträger ein Biochip (1) mit einem plana­ ren Lichtwellenleiter auf seiner Oberseite ist, der die Meßpunkte (10) trägt.

15. Einrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsträger (1) eine Glasplatte ist, die selbst den planaren Lichtwellenleiter bildet.

16. Einrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Anregungslicht (4) von einer Seite des Reaktion­ strägers (1), insbesondere Biochips, her auf diesen fällt, und daß von den an der Oberfläche des planaren Lichtwellenleiters gebundenen Fluorochromen emittierte Fluoreszenzlicht (7) im Bereich des evaneszenten Feldes des Anregungslichtes (4) in den planaren Lichtwellenleitern eingekoppelt und in diesem geführt und durch die Er­ fassungseinrichtung (8, 9), die an zumindest einer Endfläche des planaren Lichtwel­ lenleiters (1) angeordnet ist, erfaßbar ist.

17. Einrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfas­ sungseinrichtung vorzugsweise eine Abbildungsoptik (8) mit einem Filter (8b) sowie einen Detektor (9), z. B. Foto-Multiplier oder CCD-Kamera, aufweist.

18. Einrichtung nach zumindest einem der vorhergehenden Ansprüche 8 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine Scanneinrichtung zum Auslesen des Reaktion­ strägers (1), insbesondere Biochips, vorgesehen und der Reaktionsträger (1) und/oder das Anregungslicht aus der Umgebung des Reaktionsträgers (1) relativ zu diesem in zumindest einer Ebene bewegbar ist.