DD299291A5 - Geschuetzte aminosaeuren und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Abstract

Beschrieben sind Verfahren zur Herstellung von N-Trityl-Carbamoylgruppen enthaltenden Aminosaeurederivaten der Formel * worin n fuer 1 oder 2 steht, R1 Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe, R2 Wasserstoff oder eine Carboxylschutzgruppe und R3 Triphenylmethyl, 4-Monomethoxy-trityl oder 4,4-Dimethoxy-trityl bedeuten, und von reaktionsfaehigen Carbonsaeurederivaten von solchen Verbindungen der Formel I, worin R1 fuer eine Aminoschutzgruppe und R2 fuer Wasserstoff stehen. Diese Verbindungen koennen als Ausgangsstoffe zur Herstellung von Peptiden, z. B. durch Festphasensynthese, verwendet werden. Sie sind hierzu besser geeignet als analoge Verbindungen der Formel I, worin R3 Wasserstoff oder eine der bisher gebraeuchlichen Carbamoylschutzgruppen bedeutet. Formel (I){Herstellungsverfahren; Aminosaeurederivate; Carbamoylschutzgruppen; N-Trityl-Carbamoylgruppen; Triphenylmethyl; * Ausgangsstoffe; Peptidherstellung; Festphasensynthese}

Description

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Anwendungsgebiet dor Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung N-Trityl-Carbamoylgruppen enthaltender .Aminosäurederivate, welche in der Peptidsynthese verwendet werden können.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Amidgruppen der Aminosäuren Asparagin und Glutamin führen bei der Peptidsynthese häufig zu unerwünschten Nebenreaktionen, z.B. Dehydratisierung zum Nitril, intramolekulare Cyclisierung zum Imid und, im Falle von Glutamin, zur Pyrrolidonbildung. Außerdem beobachtet man bei der Festphasensynthese mit Glutamin oft, daß die Peptidharze wegen intermolekularer Ausbildung von Wasserstoffbrücken nicht mehr quellen, was schlechte Kupplungsausbeuten zur Folge hat. Diese Nachteile können durch Schutz der Carbamoylgruppen von Asparagin und Glutamin vermieden werden. Gebräuchlicherweise verwendet man 4,4'-Dimethoxy-diphenyl-methyl iui-[4-methoxy-phenyll-methyl, 4,4'-Dimethoxybenzhydryl, abjekürzt Mbh) oder 2,4,6-Trimethoxy-benzyl (abgekürzt: Tmob) als Schutzgruppe.

Ziel der Erfindung

Nun wurde jedoch von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gefunden, daß die bisher bekannten Carbamoyl-Schutzgruppen bei ihrer Abspaltung in bestimmten Fällen selbst unerwünschte Nebenroaktionen verursachen. Die bei der acidolytischen Abspaltung gebildeten Carbokationen reagieren nämlich sehr leicht und in irreversibler Weise mit Tryptophan. Ausgehend von diesem Befund, det als ihr Ausgangspunkt gewissermaßen Teil der vorliegenden Erfindung ist, bestand die Aufgabe der vorliegenden Erfindung nun darin, eine Carbamoyl-Schutzgruppe zu finden, bei der die genannten Nebenreaktionen nicht auftreten, und entsprechend geschützte Aminosäurederivate herzustellen.

Darlegung der Erfindung

Die Erfindung betrifft zur Herstellung von Verbindungen der Formel I,

Il

R₁-NH-HC-C-O-R₂

I (I)

(CH₂)_n

O=C-NH-R₃

worin η für 1 oder 2 steht, R) Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe, R₂ Wasserstoff oder eine Carboxylschutzgruppe und R3 Triphenylmethyl,4-Monomethoxy-trityl oder 4,4'-Dimethoxy-trityl bedeuten, von Salzen von solchen Verbindungen mit einer salzbildenden Gruppe und reaktionsfähigen Carbonsäurederivaten von solchen Verbindungen der Formel I, worin R] für eine Aminoschutzgruppe und R₂ für Wasserstoff stehen. Die Konfiguration am asymmetrischen HC-Atom ist (D, L), (D) oder vorzugsweise (L).

Die Verbindungen der Formel I sind bei der Peptidsynthese ohne alkylierende Wirkung auf die Indolseitenkette von Tryptophan. Sie sind außerdem leichter zugänglich, besser löslich in organischen Lösungsmitteln und ihre Amidschutzgruppe kann leichter

mit Trifluoressigsäure abgespalten werden als in analogen Verbindungen, worin R₃ für 2,4,6-Trimethoxy-benzyl (Tmob) oder Di-(4-methoxy-phenyl)-methyl (Mbh) steht. Zum Beispiel betragen die Halbwertszeiten von Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gln(Tmob)-OH und Fmoc-Gln(Mbh)-OH bei dor Spaltung in Trifluoressigsäure-1,2-Dichlorethan (1:1) bei 22⁰C 2, 9 beziehungsweise 27 Minuten.

Die reaktionsfähigen Carbonsäurederivate der Verbindungen der Formel I sind unter Kupplungsbedingungen, das heißt in Gegenwart von Kupplungskatalysatoren, wie 1-Hydroxy-IH-benztriazol (HOBt), und in Gegenwart von Lösungsmitteln, die üblicherweise für Kupplungsreaktionen bei der Peptidsynthese verwendet werden, z. B. Dimethylacetamid (DMA) und i,2-Dichlor-ethan (DIEA), deutlich stabiler als analoge Verbindungen, worin R₉ Wasserstoff bedeutet. Zum Beispiel betragen die Zerfall-Halbwertszeiten von Fmoc-Asn-O-Tcp und Fmoc-Asn-O-Pfp (Fmoc = 9-Fluorenyl-methoxy-carbonyl, Pfp = Pentafluorphenyl, Tcp = 2,4,5-Trichlor-phenyl) in DMA + 1 Äquivalent HOBt + 1,7 Äquivalente DIEA nur 2 Minuten beziehungsweise sogar weniger als 1 Minute, während die analogen Verbindungen, worin R₃ einen Tritylrest bedeutet, unter den gleichen Bedingungen vollkommen stabil sind.

Überraschenderweise verlangsamen die raumfüllenden Tritylschutzgruppen die Kupplungsreaktionen nicht, sondern haben praktisch keinen Einfluß auf die Kupplungsgeschwindigkeit.

Schutzgruppen, ihre Einführung und Abspaltung sind beispielsweise beschrieben in „Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London, New York 1973, und in „Methoden der organischen Chemie", Houben-Weyl, 4. Auflage, Bd. 15/1, Georg-Thieme-Vorlag, Stuttgart 1974 sowie in Theodora W. Greene, „Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York ' 981. Charakteristisch für Schutzgruppen ist, daß sie leicht, d. h. ohne r!aß unerwünschte Nobenreaktionen stattfinden, z.B. solvolyrisch, reduktiv, photolytisch oder auch unter physiologischen Bedingungen abspaltbar sind. Eine geschützte Aminogruppe Ri-NH kann z. B. in Form einer leicht spaltbaren Acylamino-, Arylmethylamino-, verätherten Mercaptoamino-, 2-Acyl-niederalk-1 -enyl-amino- oder Silyl-aminogruppe vorliegen.

In einer entsprechenden Acylaminogruppe ist Acyl beispielsweise der Acylrest einer organischen Carbonsäure mit z. B. bis zu 18 Kohlenstoffatomen, insbesondere einer gegebenenfalls, z. B. durch Halogen oder Aryl, substituierten Alkancarbonsäure oder gegebenenfalls, z. B. durch Halogen, Niederalkoxy oder Nitro, substituierten Benzoesäure, oder eines Kohlensäurehalbesters. Solche Acylgruppen sind beispielsweise Niederalkanoyl, wie Formyl, Acetyl oder Propionyl, Halogenniederalkanoyl, wie 2-Halogenacetyl, insbesondere 2-Chlor-, 2-Brom-, 2-lod-, 2,2,2-Trifluor- oder 2,2,2-Trichloracetyl, gegebenenfalls, z.B. durch Halogen, Niederalkoxy oder Nitro substituiertes Benzoyl, z. B. Benzoy1,4-Chlorbenzoyl, 4-Methoxybenzoyl oder 4-Nitrobenzoyl, oder in 1-Stellung des Niederalkylrestes verzweigtes oder in 1- odor 2-Stellung geeignet substituiertes Niederalkoxycarbonyl, insbesondere tert.-Niederalkoxycarbonyl, z. B. tert.-Butyloxycar'jonyl, Arylmethoxycarbonyl mit einem oder zwei Arylresten, die vorzugsweise gegebenenfalls, z. B. durch Niederalkyl, insbesondere tert.-Niederalkyl, wie tert.-Butyl, Niederalkoxy, wie Methoxy, Hydroxy, Halogen, z.B. Chlor, und/oder Nitro, mono- oder polysubstituiertes Phenyl darstellen, wie gegebenenfalls substituiertes Benzyloxycarbonyl, z. B. 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, oder substituiertes Diphenylmethoxycarbonyl, z. B. Benzhydryloxycarbonyl oder Di-(4-methoxyphenyl)-methoxycarbonyl, Aroylmethoxycarbonyl, worin die Aroylgruppe vorzugsweise gegebenenfalls, z. B. durch Halogen, wie Brom, substituiertes Benzoyl darstellt, z. B. Phonacyloxycarbonyl, 2-Halogen-niederalkoxycarbonyl, z.B. 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, 2-Bromethoxycarbonyl oder 2-lodethoxycarbonyl, oder 2-(trisubstituiertes SilyD-ethoxycarbonyl, worin die Substituenten unabhängig voneinander je einen gegebenenfalls substituierten, z. B. durch Niederalkyl, Niederalkoxy, Aryl, Halogen oder Nitro substituierten, aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffrest mit bis zu 15 C-Atomen, wie entsprechendes, gegebenenfalls substituiertes Niederalkyl, Phenylniederalkyl, Cycloalkyl oder Phenyl, bedeuten, z. B. 2-Triniederalkylsilylethoxycarbunyl, wie 2-Trimethylsilylethoxycarbonyl oder 2-(Di-n-butyl-methyl-silyl)-ethoxycarbonyl, oder 2-Triaryisilylethoxycarbonyl, wie 2-Triphenylsilylethoxycarbonyl.

Weitere, als Aminoschutzgruppen R₁ in Frage kommende Acylreste sind auch entsprechende Reste organischer Phosphor-, Phosphon- oder Phosphinsäuren, wie Diniederalkylkphosphoryl, z. B. Dimethylphosphoryl, Diethylphosphoryl, Di-npropylphosphoryl oder Diisopropylphosphoryl, Dicycloalkylphosphoryl, z.B. Dicyclohexylphosphoryl, gegebenenfalls substituiertes Diphenylphosphoryl, z.B. Diphenylphosphoryl, gegebenenfalls, z.B. durch Nitro substituiertes Di-(phenylniederalkyl)-phosphoryl, z.B. Dibenzylphosphoryl oder Di-(4-nitrobenzyl)-phosphoryl, gegebenenfalls substituiertes Phenyloxyphenyl-phosphonyl, z. B. Phenyloxyphenyl-phosphonyl, Diniederalkylphosphinyl, z. B. Diethylphosphinyl, oder gegebenenfalls substituiertes Diphenylphosphinyl, z. B. Diphenylphosphinyl.

In einer Arylmethylaminogruppe, die eine Mono-, Di- oder insbesondere Triarylmethylaminogruppe darstellt, sind die Arylreste insbesondere gegebenenfalls substituierte Phenylreste. Solche Gruppen sind beispielsweise Benzyl-, Diphenylmethyl- und insbesondere Tritylamino.

Eine verätherte Mercaptogruppe in einer mit einem solchen Rest geschützten Aminogruppe ist in erster Linie Arylthio oder Arylniederalkylthio, worin Aryl insbesondere gegebenenfalls, z. B. durch Niederalkyl, wie Methyl oder tert.-Butyl, Niederalkoxy, wie Methoxy, Halogen, wie Chlor, und/oder Nitro substituiertes Phenyl ist. Eine entsprechende Aminoschutzgruppe ist z.B. 2-Nitrophenylthio.

In einem als Aminoschutzgruppe verwendbaren 2-Acyl-niederalk-1-en-1-yl-rest ist AcyI z.B. der entsprechende Rest einer Niederalkancarbonsäure, einer gegebenenfalls, z. B. durch Niederalkyl, wie Methyl oder tert.-Butyl, Niederalkoxy, wie Methoxy, Halogen, wie Chlor, und/oder Nitro substituierten Benzoesäure, oder insbesondere eines Kohlensäurehalbesters, wie eines Kohlensäure-niederalkylhalbesters. Entsprechende Schutzgruppen sind in erster Linie 1-Niederalkanoyl-prop-1-en-2-yl, z.B. 1 -Acetyl-prop-1 -en-2-yl, oder 1 -Niederalkoxycarbonyl-prop-1 -en-2-yl, z. B. 1 -Ethoxycarbonyl-prop-1 -en-2-yl. Bevorzugte Aminoschutzgruppen sind Acylreste von Kohlensäurehalbestern, insbesondere tert.-Butyloxycarbonyl, gegebenenfalls, z. B. wie angegeben, substituiertes Benzyloxycarbonyl, z. B. 4-Nitro-benzyloxycarbonyl, oder Diphenylmethoxycarbonyl, oder 2-Halogen· niederalkoxycarbonyl, wie 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl, oder Ally loxycarbonyl und diesem verwandte Schutzgruppen, oder vor allem 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl.

Carboxylschutzgruppen R₂ sind üblicherweise veresternde Gruppen, in erster Linie in 1-Stellung verzweigte oder in 1- oder 2-Stellung geeignet substituierte Niederalkylgruppen. Bevorzugte, in veresterter Form vorliegende Carboxylgruppen sind u.a. tert.-Niederalkoxycarbonyl, z. B. tert.-Butyloxycarbonyl, Arylmethoxycarbonyl mit einem oder zwei Arylresten, wobei diese gegebenenfalls z. B. durch Niederalkyl, wie tert.-Niederalkyl, z. B. tert.-Butyl, Niederalkoxy, wie Methoxy, Hydroxy, Halogen, z.B.

Chlor, und/oder Nitro, mono- oder polysubstituierte Phonylreste darstellen, wie gegobenonfalls, ζ. B. wie oben erwähnt, substituiertes Benzyloxycarbonyl, z. B. 4-Methoxybenzyloxycarbonyl oder 4-Nitrobenzyloxycarbonyl, oder gegebenenfalls, z. B. wie oben erwähnt, substituiertes Diphenylmethoxycarbonyl, z. B. Diphenylmothoxycarbonyl oder Di-(4-methoxyphenyl)-methoxycarbonyl, i-Niederalkoxyniederalkoxycarbonyl.wieMethoxymethoxycarbonyl, 1-Methoxyethoxycarbonyloder 1-Ethoxymethoxycarbonyl, I-Niederalkylthioniederalkoxycarbonyl, wie 1-Methylthiomethoxycarbonyloder 1 -Ethylthioethoxycarboiiyl, Aroylmethoxycarbonyl, worin die Aroylgruppe gegebenenfalls, z. B. durch Halogen, wie Brom, substituiertes Benzoyl darstellt, ?.B. Phenacyloxycarbonyl, 2-Halogenniederalkoxycarbonyl, z.B. 2,2,2-Trichlorethoxyca· bonyl, 2-Bromethoxycarbonyl oder 2-lodethoxycarbonyl, den 2-(trisubstituiertes oilyD-ethoxycarbonyl, worin dij Substituenten. unabhängig voneinander je einen gegebenenfalls substituierten, z.B. durch Niederalkyl, Niederalkoxy, Aryl, Halogen, und/oder Nitro substituierten, aliphatischen, araliphatischen, cycloaliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoffrest, wie entsprechendes, gegebenenfalls substituiertes Niederalkyl, Phenylniederalkyl, Cycloalkyl oder Phenyl, bedeuten, z. B. 2-Triniederalkylsilylethoxycarbonyl, 2-Trimethylsilylethoxycarbonyl oder 2-(Di-n-butyl-methylsilyl)-ethoxycarbonyl, oder 2-Triarylsilylethoxycarbonyl, wie2-Triphenylsilylethoxycarbonyl.

Bworzugte geschützte Carboxylgruppen cind tert.-Niederalkoxycarbonyl, wie tert.-Butoxycarbonvl, und in erster Linie gegebenenfalls, z.B. wie oben erwähnt, substituiertes Benzyloxycarbonyl, wie 4-Nitrobenzyloxycdrbonyl, oder Diphenylmethoxycarbonyl, und vor allem 2-(Trimethylsilyl)-ethoxycarbonyl.

Eine salzbildende Gruppe in einer Verbindung der Formel I ist z.B. eine freie Aminogruppe (Rj = H) oder eine freie Carboxylgruppe (R₂ = H). Die Verbindungen der Formel I, worin Ri Wasserstoff bedeutet, können Säureadditionssalze bilden, z.B. mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder mit geeigneten organischen Carbonoder Sulfonsäuren, z. B. Trifluoressigsäure. Die Verbindungen der Formel I, worin R₂ Wasserstoff bedeutet, können Metall- oder Ammoniumsalze bilden, z.B. Alkalimetall- oder Erdalkalimetallsalze, z.B. Natrium-, Kalium-, Magnesium- oder Calciumsalze, oder Saize mit Ammoniak oder geeigneten organischen Aminen, wobei in erster Linie aliphatische, cycloaliphatische, cycloaliphatjsch-aliphatische oder araliphatische primäre, sekundäre oder tertiäre Mono-, Di- oder Polyamine, sowie heterocyclische Basen für die Salzbildung in Frage kommen, wie Niederalkylamine, z. B. Triethylamin, Hydroxyniederalkylamine, z. B. 2-Hydroxyethylamin, Bis-(2-hydroxyethyl)-amin, 2-Hydroxy-ethyl-diethyl-amin oder Tri-(2-hydroxyethyl)-amin, basische aliphatische Ester von Carbonsäuren, z. B. 4-Amino-benzoesäure-2-diethylaminoethylester, Niederalkylenamine, z. B. 1-Ethylpiperidin, Cycloalkylamine, z. B. Dieyclohexylamin, oder Benzylamine, z. B. Ν,Ν'-Dibenzylethylendiamin, ferner Basen vom Pyridintyp, z. B. Pyridin, Collidin oder Chinolin.

Verbindungen der Formel I, worin Ri und R₂ Wasserstoff bedeuten, können innere Salze bilden.

Diese Salze können unter anderem zur Isolierung oder Reinigung der Verbindungen der Formel I verwendet werden, worin Ri und/oder R₂ Wasserstoff bedeuten.

Reaktionsfähige Carbonsäurederivate einer Verbindung der Formel I, worin R_t für eine Aminoschutzgruppe und R₂ für Wasserstoff stehen, sind in erster Linie reaktionsfähige aktivierte Ester oder reaktionsfähige Anhydride, ferner reaktionsfähige cyclische Amide.

Aktivierte Ester von Sauren sind insbesondere am Verknüpfungskohlenstoffatom des veresternden Restes ungesättigte Ester, z. B. vom Vinylester-Typ, wie eigentliche Vinylester (die man z. B. durch Umesterung eines entsprechenden Esters mit Vinylacetat erhalten kann; Methode des aktivierten Vinylesters), Carbamoylvinylester (die man z. B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit einem Isoxazoliumreagens erhalten kann; 1,2-Oxazolium- oder Woodward-Methode), oder 1-Niederalkoxyvinylester (die man z. B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit einem Niederalkoxyacetylen erhalten kann; Ethoxyacetylen-Methode), oder Ester vom Amidinotyp, wie Ν,Ν'-disubstituierte Amidinoester (die man z. B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit einem geeigneten Ν,Ν'-disubstituierten Carbodiimid, z.B. N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid, erhalten kann; Carbodiimid-Methode), oder Ν,Ν-disubstituierte Amidinoester (die man z. B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit einem Ν,Ν-disubstituierten Cyanamid erhalten kann; Cyanamid-Methode), geeignete Arylester, insbesondere durch elektronenanziehende Substituenten geeignet substituierte Phenylester (die man z. B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit einem geeignet substituierten Phenol, z. B. 4-Nitrophenol, 4-Methylsulfonyl-phenol, 2,4,5-Trichlorphenol, 2,3,4,5,6-Pentachlorphenol, 2,3,4,5,6-Pentafluorphenol oder 4-Phenyldiazophenol, in Gegenwart eines Kondensationsmittels, wie N,N'-Dicyclohexyl-carbodiimid, erhalten kann; Methode der aktivierten Arylester), Cyanmethylester (die man z. B. ddrch Behandeln der entsprechenden Säure mit Chloracetonitril in Gegenwart einer Base erhalten ^ann; Cyanmethylester-Methode), Thioester, insbesondere gegebenenfalls, z. B. durch Nitro, substituierte Phenyl-thioester (die man z.B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit gegebenenfalls, z.B. durch Nitro, substituierten Thiophenolen, u.a. mit Hilfe der Anhydrid- oder Carbodiimid-Methode, erhalten kann; Methode der aktivierten Thiolestor), Amino- oder Amidoester (die man z. B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit einer N-Hydroxy-amino- bzw. N-Hydroxy-amido-Verbindung, z. B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, N-Hydroxy-piperidin, N-Hydroxy-phthalimid, 1-Hydroxy-benztriazol oder 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin, z. B. nach der Anhydrid- oder Carbodiimid-Methode, erhalten kann; Methode der aktivierten N-Hydroxyester) oder Silylester (die man z.B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit einem Silylierungsmittel, z. B. Hexamethyldisilazan, erhalten kann und die leicht mit Hydroxy-, nicht aber mit Aminogruppen reagieren). Anhydride von Säuren können symmetrische oder vorzugsweise gemischte Anhydride dieser Säuren sein, so z. B. Anhydride mit anorganischen Säuren, wie Säurehalogenide, insbesondere Säurechloride (die man z. B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit Thionylchlorid, Phosphorpentachlorid oder Oxalylchlorid erhalten kann; Säurechloridmethode), A2ide (die man z. B. aus einem entsprechenden Säureester über das entsprechende Hydrazid und dessen Behandlung mit salpetriger Säure erhalten kann, Azidmethode), Anhydride mit Kohlensäurehalbderivaten, wie mit entsprechenden Estern, z. B. Kohlensäureniederalkylhalbestern (die man z.B. durch Behandeln der entsprechend· Säure m^;t Halogen-, wie Chlorameisensäure-niederalkylestern oder mit einem i-Niederalkoxycarbonyl^-niederalkoxy-i^-dihydro-chinolin, z. B. 1-Niederalkoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydrochinolin, erhalten kann; Methode der gemischten O-Alkyl-kohlensäureanhydride), oder Anhydride mit dihalogenierter, insbesondere dichlorierter Phosphorsäure (die man z.B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit Phosphoroxyohlorid erhalten kann; Phosphoroxychloridmethode), oder Anhydride mit organischen Säuren, wie gemischte Anhydride mit organischen Carbonsäuren (die man z.B. durch Behandeln der entsprechenden Säure mit einem gegebenenfalls substituierten Niedcralkan- oder Phenylalkancarbonsäurehalogenid, z. B. Phenylessigsäure-, Pivalinsäure- oder Trifluoressigsäurechlorid erhalten kann; Methode der gemischten Carbonsäureanhydride) oder mit

organischen Sulfonsäuren (die man z. B. durch Behandeln eines Salzes, wie eines Alkalimetallsalzes, der entsprechenden Säure, mit einem geeigneten organischen Sulfonsäurehalogenirf, wie Niederalkan- oder Aryl-, z.B. Methan- oder p-Toluolsulfonsäurechlorid, erhalten kann; Methode der gemischten Sulfonsäureanhydride), sowie symmetrische Anhydride (die man z.B. durch Kondensation der entsprechenden Säure in Gegenwart eines Carbodiimids oder von 1-Diethylaminopropin erhalten kann; Methode der symmetrischen Anhydride).

Geeignete cyclische Amide sind insbesondere Amide mit fünfgliedrigen Diazacyclen aromatischen Charakters, wie Amide mit Imidazolen.z.B. Imidazol (die man z.B. durch Behandeln der entsprechenden Saure mit Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol erhalten kann; Imidazolid-Methode), oder Pyrazolen, z.B. 3,5-Dimothyl-pyrazGl (die man z.B. über das Sa'urehydraiid durch Behandeln mit Ace(ylaceton erhalten kann; Pyrazolid-Methode).

Die in diesem Text verwendeten Abkürzungen für die Aminosäuren sind die allgemein üblichen. So bedeuten Asp Asparaginsäure, Asn Asparagin, GIn Glutamin, Ser Serin, Leu Leucin, GIy, Glycin, l.ys Lysin, His Histidin, Pro Prolin Tyr Tyrosin, Trp Tryptophan, Arg Arginin, VaI Valin und Me isoloucin.

in Übereinstimmung mit den international anerkannten Nomenklaturregeln bezeichnen in diesem Text üie Abkürzungen für die Aminosäuren, z. B. die obengenannten Abkürzungen, die freie Säure und, wenn nicht anders angegeben, die L-Konfiguration. Die a-Aminogruppe ist an der linken Seite der Abkürzung, die Carboxygruppe an der rechten Seite zu denken. Das Fehlen eines Η-Atoms in der a-Amino-Gruppe wird durch einen links an der Abkürzung für die Aminosäure stehenden Bindestrich, das Fehlen von zwei Η-Atomen durch zwei links stehende Bindestriche gekennzeichnet. Das Fehlen einer HO-Gruppe in der Carboxygruppe wird durch einen rechts stehenden Bindestrich ausgedrückt. Substituienten in der Seitenkette von Aminosäuren werden unmittelbar hinter das Aminosäuresymbol in Klammern gesetzt. Somit steht z.B. Z-Asn(Trt)-OH für die Verbindung der Formel la.

O O

Il (L) II

C₆H₅-CH₂-O-C-NH-HC-C-OH

I (la)

CH₂ O=C-NH-C(C₆Hs)₃

Die durch Verwendung der Verbindungen der Formel I bei der Peptidsynthese erzielten Vorteile sind im Beispielteil illustriert. So wird z. B. H-Gln-Gln-Gln-Gln-Gln-Ser-Leu-Gly-OH als Rohprodukt in einer Reinheit von 92% erhalten, wenn die Carbamoylgruppe der Gin-Reste bei der Herstellung durch Trityl geschützt wird. Ohne diesen Schutz bei der Merrifield-Synthese enthält das Rohprodukt nicht 92%, wie oben, sondern nur 30% des gewünschten Pioriukts.

Die erhaltenen Rohprodukte aus den Synthesen von Fmoc-Lys-Gln-His-Asn-Pro-Lys-Tyr-Gln-Trp-Asn-OH mit Trityl-Schutz der Carbamuylgruppen von Asn und GIn (Rohprodukt A) einerseits und mit 2,4,6-Trimethoxy-benzyl-Schutz (Rohprodukt B) andererseits weisen etwa 95% des gewünschten Produkts in Rohprodukt A und nur etwa 8% des gewünschten Produkts in Rohprodukt B auf.

Die Verbindungen der Formel I können als Bausteine bei der Synthese von beliebigen Peptiden, die Glutamin- und/oder Asparaginreste enthalten, oder als Zwischenprodukte zur Herstellung dieser Bausteine verwendet werden. Zur Peptidsynthese nach Merrififild verwendet man diejenigen Verbindungen der Formel I, worin R₁ eine Aminoschutzgruppe, wie insbesondere 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl oder tert.-Hutyloxycaibonyl, R₂ Wasserstoff und R₃ Triphenylmethyl, 4-Monomethoxy-trityl oder 4,4'-Dimethoxy-trityl bedeuten, und reaktionsfähige Carbonsäurederivate davon.

Bevorzugt sind Verbindungen der Formel I, worin R, Benzyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbonyl, R₂ Wasserstoff und R₃ Triphenylmethyl bedeuten.

Besonders bevorzugt sind die in den Beispielen beschriebenen Verbindungen der Formel I.

Von den ohen näher beschriebenen reaktionsfähigen Carbonsäurederivaten sind besonders die 2 1,5-Trichlor-dhenylester, die Pentafluor-phenylester, die Ester mit 1-Hydroxybenztriazol, mit 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin oder mit N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, die Säurechloride und die symmetrischen Anhydride zu erwähnen, insbesondere solche reaktionsfähigen Carbonsäurederivate der vorstehend als bevorzugt herausgestellten Verbindungen der Formel I.

Überraschenderweise ist die erfindungsgemäße Amidschutzgruppe R₃ stabil bei der katalytischen Hydrierung unter Bedingungen, unter denen Benzyloxycarbonyl oder R₃ als Aminoschutzgruppen oder Benzyl als Carboxylschutzgruppe bereits abgespalten werden. Die Schutzgruppe R₃ kann z.B. mit Trifluoressigsäure-Wasser-1,2-Ethandithiol (90:5:5) im Temperaturbereich zwischen Raurr 'emperatur und +5O⁰C, z. B. bei +3O⁰C, abgespalten werden.

Die Verbindungen der Formel I werden in an sich bekannter Weise hergestellt. Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Verbindung der Formelll,

Il

R₄-NH-HC-C-OR₂

(CH₂J_n O=C-NH₂

worin R₄ für Wasserstoff oder eine unter den Reaktionsbedingungen stabile Aminoschutzgruppe steht und η und R₂ die obengenannten Bedeutungen haben, mit einer Verbindung der Formel III,

R₃-OH (III)

worin Ra die obengenannte Bedeutung hat, umsetzt und aus dem erhaltenen Produkt diejenigen Schutzgruppen abspaltet, die nicht Bestandteil des gewünschten Endprodukts der Formel I sind, oder

b) zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin Ri für eine Aminoschutzgruppe steht, in eine Verbindung der Formel IV,

Il

H₂N-CH-C-OR₂

I (IV)

(CH₂)_n

O=C-NiI-R₃

worin π, R₂ und R₃ die obengenannten Bedeutungen haben, eine Aminoschutzgruppe einführt, oder

c) eine Verbindung der Formel V,

Il

R₅-NH-HC-C-OR₆

I (V)

(CH₂)_n

O=COH

worin η die obengenannte Bedeutung hat, Rs eine unter den Reaktionsbedingungen stabile Aminoschutzgruppe bedeutet und Re für eine unter den Reaktionsbedingungen stabile Carboxylschutzgruppe steht, mit einer Verbindung der Formel Vl,

R₃-NH₂ (Vl)

worin R₃ die obengenannte Bedeutung hat, umsetzt und aus dem erhaltenen Produkt diejenigen Schutzgruppen abspaltet, die nicht Bestandteil des gewünschten Endprodukts der Formel I sind, und, wenn erwünscht, nach Durchführung eines der Verfahren a), b) oder c) eine erhaltene Verbindung der Formol I mit einer salzbildenden Gruppe in ihr Salz überführt oder ein erhaltenes Salz in die freie Verbindung überführt oder eine erhaltene Verbindung der Formel I, worin R) eine Aminoschutzgruppe und R₂ Wasserstoff bedeuten, in ein reaktionsfähiges Carbonsäurederivat überführt. Die obengenannten Verfahrensvarianten werden im folgenden näher erläutert: Verfahren a):

Verfahren a) wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie z.B. Essigsäure, in Gegenwart katalytischer Mengen einer wasserfreien starken Lewis-Säure, wie z. B. Bortrifluorid, Trifluormethansulfonsäure oder vorzugsweise Schwefelsäure, sowie in Gegenwart eines wasserentziehenden Mittels, wie z. B. Acetanhydrid, im Temperaturbereich zwischen etwa O⁰C und + 10O⁰C, vorzugsweise zwischen Raumtemperatur (etwa 2O⁰C) und +70^cC, z.B. bei +5O⁰C durchgeführt. Wenn R₄ Wasserstoff bedeutet, verwendet man zweckmäßigerweise mehr wasserfreie Schwefelsäure als im Fall, wo R₄ eine Aminoschutzgruppe bedeutet, z. 8.1,1 Äquivalente, und führt die Reaktion vorzugsweise bei etwa +6O⁰C durch, besonders, wenn man von Verbindungen der Formel Il ausgeht, worin R₄ für Wasserstoff und η für 1 stehjn.

Eine Aminoschutzgruppe R₄ ist eine unter sauren Bedingungen stabile Aminoschutzgruppe, wie z. B. Aüyloxycarbonyl, Trifluoracetyl oder vorzugsweise Benzyloxycarbcnyl oder 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl.

Wenn im gewünschten Endprodukt der Formel IR, und/oder R₂ für Wasserstoff stehen, müssen die Schutzgruppen R₄ und/oder R₂ abgespalten werden.

Die meisten Carboxylschutzgruppen R₂ werden bereits unter den Reaktionsbedingungen abgespalten. Stabil sind lediglich Carboxy Ischutzgruppen R₂ wie Methyl, Ethyl oder Ally I, die ζ. Β. durch basenkatalysierte Hydrolyse abgespalten werden können. Trifluoracetyl als Aminoschutzgruppe R₄ wird durch milde alkalische Hydrolyse, z. B. mit wäßriger Ammoniaklösung, Natriumoder Bariumhydroxid oder mit basischen lorienaustauscherharzen abgespalten.

Benzyloxycarbonyl als Aminoschutzgruppe R₄ wird durch Hydrierung in Gegenwart eines Palladium-auf-Kohle-Katalysators in wasserhaltiger, methanolischer, salzsaurer Lösung bei Raumtemperatur und Normaldruck abgespalten. 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl als Aminoschutzgruppe R₄ wird mittels Piperidin-Dimethylacetamid (1:4) bei Raumtemperatur abgespalten.

Die Ausbeuten bei Verfahren a) betragen etwa 60-95% der Theorie

Verfahren b):

Verfahren b) wird in einem geeigneten, gegebenenfalls wasserhaltigen organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch im Temperaturbereich zwischen etwa O⁰C und +8O⁰C, vorzugsweise bei Raumtemperatur bis +5O⁰C, durchgeführt, wobei auch in Suspension gearbeitet werden kann. So kann man z. B. 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl als Aminoschutzgruppe R_t einführen, indem man eine Ausgangsverbindung der Formel IV in einem organischen Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran oder Dioxan, in Gegenwart von Wasser und einer anorganischen Base, wie Natriumhydrogencarbonat oder Natriumhydroxid, sowie erforderlichenfalls von einem tertiären organischen Amin, wie Triethylamin, mit 9-Fluorenylmethyl-N-succinimidyl-carbonat umsetzt. Tert.-Butyloxycarbonyl als Aminoschutzgruppe R₁ kann man z. B. in 90%igem wäßrigen Tetrahydrofuran in Gegenwart von Triethylamin bei Raumtemperatur mit äquimolaren Mengen Di-tert.-butyl-dicarbonat einführen. Die Ausbeuten bei Verfahren b) betraget, etwa 90-99% der Theorie.

Im Unterschied zu Verfahren a) gestattet Verfahren b) die Einführung beliebiger Aminoschutzgruppen R₁.

Verfahrene):

Verfahren c) wird in einem geeigneten organischen Lösungsmittel, wie 1,2-Dichlor-ethan, im Temperaturbereich zwischen -2O⁰C und +7O⁰C, z. B. bei O⁰C, und vorzugsweise unter Schutzgas, 2.8. unter Argonatmosphäre, durchgeführt. Hierzu ist eine in situ Aktivierung der freien Carboxylgruppe im Ausgangsmaterial der Formel V, 1. B. mit Hilfe von 1 -Chlor-N,N,2-trimethyl-prop-1 enylamin, erforderlich. Die Ausbeuten bei Verfahren c) betragen etwa 40-70% der Theorie.

tine unter den Reaktionsbedingungen stabile Aminoschutzgruppe R₆ ist z. B. 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl. Eine unter den Reaktionsbedingungen stabile Carboxylschutzgruppe R₈ ist z. B. Benzyl.

Die Abspaltung der Carboxyl- und/oder Aminoschutzgruppen, die nicht Bestandteil des gewünschten Endprodukts der Formel I sind, erfolgt in an sich bekannter Weise, z. B. mittels Solvolyso, insbesondere Hydrolyse, Alkoholyse oder Acidolyse, oder mittels Reduktion, insbesondere Hydrogenolyse oder chemische Reduktion, gegebenenfalls stufenweise oder gleichzeitig, wobei auch enzymatische Methoden verwendet werden können.

Insbesondere kann eine Benzylgruppe R6 durch Hydrierung in Gegenwart eines Palladium-auf-Kohle-Katalysators bei Raumtemperatur abgespalten werden, wobei 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl R₅ und die Schutzgruppe R3 erhalten bleiben. Die Abspaltung von 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl H₅ kann wie bei Verfahren a) beschrieben ausgeführt werden. Die Ausbeuten bei der Abspaltung der Schutzgruppen betragen etwa SO-99% der Theorie.

Vorzugsweise stellt man die Verbindungen der Formel I nach den Verfahren b) und vor allem a) her.

Zusatzoperationen: Salze von Verbindungen der Formel I mit salzbildenden Gruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden. So kann man Salze von Verbindungen der Formel I mit sauren Gruppen durch Umsetzung mit einer geeigneten Base, z. B. durch Behandeln mit geeigneten Metallverbindungen, wie Alkalimetallsalzen von geeigneten organischen Carbonsäuren, z.B. dem Natriumsalz der a-Ethyl-capronsäure, oder mit geeigneten anorganischen Alkali- oder Erdalkalimetallsalze^ insbesondere solchen, die sich von einer schwachen und vorzugsweise flüchtigen Säure ableiten, z.B.

Natriumhydrogencarbonat, oder mit Ammoniak oder einem geeigneten organischen Amin bilden, wobei man vorzugsweise stöchiometrische Mengen oder nur einen kleinen Überschuß des salzbildenden Mittels verwendet. Säureadditionssalze von Verbindungen der Formel I erhält man in üblicherweise, z.B. durch Behandeln mit einer Säure oder einem geeigneten Anionennustauschreagens. Innere Salze von Verbindungen der Formel I, welche z. B. eine freie Carboxylgruppe und eine freie Aminogruppe enthalten, können z. B. durch Neutralisieren von Salzen, wie Säureadditionssalzen, auf den isoelektrischen Punkt,

z. B. mit schwachen Basen, oder durch Behandeln mit flüssigen Ionenaustauschern gebildet werden. Die Salzbildung verläuft praktisch quantitativ.

Salze können in üblicher Weise praktisch quantitativ in die freien Verbindungen überführt werden, Metall- und Ammoniumsalze, z.B. durch Behandeln mit geeigneten Säuren, und Säureadditionssalze, z.B. durch Bahandeln mit einem geeigneten basischen Mittel.

Die Herstellung der reaktionsfähigen Carbonsäurederivate einer Verbindung der Formel I, worin Ri eine Aminoschutzgruppe und R₂ Wasserstoff bedeuten, erfolgt, wie bereits oben, bei der näheren Charakterisierung der reaktionsfähigen Carbonsäurederivate, beschrieben ist. Hierzu kann man z. B. von einer Verbindung der Formel I, worin Ri eine geeignete Aminoschutzgruppe und R₂ Wasserstoff bedeuten, ausgehen. Die Ausbeuten an reaktionsfähigem Carbonsäurederivat betragen etwa 85-98% der Theorie.

Die oben beschriebenen Verfahren, inklusive die Verfahren zur Abspaltung von Schutzgruppen und die zusätzlichen Verfahrensmaßnahmen, werden, wenn nicht anders angegeben, in an sich bekannter Weise, z. B. in An- oder Abwesenheit von vorzugsweise inerten Lösungs- und Verdünnungsmitteln, wenn notwendig, in Anwesenheit von Kondensationsmitteln oder Katalysatoren, bei erniedrigter oder erhöhter Temperatur, z. B. in einom Temperaturbereich von etwa -2O⁰C bis etwa 15O⁰C, insbesondere von etwa O⁰C bis etwa +70⁰C, vorzugsweise von etwa +10⁰C bis etwa +5O⁰C, hauptsächlich bei Raumtemperatur, in einem geeigneten Gefäß und erforderlichenfalls in einer Inertgas-, z. B. Stickstoffatmosphäre, durchgeführt.

Dabei sind unter Berücksichtigung aller im Molekül befindlichen Substituen'en, wenn erforderlich, z. B. bei Anwesenheit leicht hydrolysierbar,er Reste, besonders schonende Reaktionsbedingungen, wie kurzo Reaktionszeiten, Verwendung von milden sauren oder basischen Mitteln in niedriger Konzentration, stöchiometrische Mengenverhältnisse, Wahl geeigneter Katalysatoren, Lösungsmittel, Temperatur- und/oder Druckbedingungen, anzuwendun.

Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens, bei denen man von einer auf irgendeiner Stufe des Verfahrens als Zwischenprodukt erhältlichen Verbindung ausgeht und die fehlenden Verfahrensschritte durchführt oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht oder einen Ausgangsstoff unter den Reaktionsbedingungen bildet oder in Form eines reaktionsfähigen Derivats oder Salzes verwendet. Dabei geht man vorzugsweise von solchen Ausgangsstoffen aus, die verfahrensgemäß zu den oben als besonders wertvoll beschriebenen Verbindungen führen.

Die Verbindungen der Formel I, insbesondere die Verbindungen der Formel I, worin R| eine Aminoschutzgruppe, wie Benzyloxycarbonyl, Allyloxycarbcnyl, tert.-Butyloxycarbonyl oder insbesondere 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl, R₂ Wasserstoff und R₃ 4-Monomethoxytrityl, 4,4'-Dimethoxytrityl oder insbesondere Triphenylmethyl (Trityl) bedeuten, sowie die reaktionsfähigen Carbonsäurederivate dieser Verbindungen können z. B. zur Synthese von Peptiden, insbesondere an fester Phase, wie z.B. zur Merrifield-Synthese, sowie zor Synthese von Substanzen, die mindestens einen bivalenten Rest der Formel VII,

-NH-HC-C-O-

I (VII)

(CH₂)_n O=C-NII-R₃

worin η für 1 oder 2 steht und R₃ Triphenylmethyl, 4-Monomethoxy-trityl oder 4,4'-Dimethoxy-trityl bedeutet, enthalten,

verwendet werden. Bei diesen Substanzen handelt es sich in erster Linie um Peptidderivate, wie sie zum Beispiel bei der Peptidsynthese als Zwischenprodukte anfallen. Dementsprechend können diese Peptidderivate auch an ein Syntheseharz gebunden sein.

Die nachfolgenden Beispiele il'ustrieren die Erfindung, ohne sie einzuschränken. Die Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.

Abkürzungen	tert.-Butyl
Bu.	tert.-Butoxycarbony!
Boc	Benzyl
BzI	beziehungsweise
bzw. =	3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazinyl
Dhbt	Fast atom bombardment Massespektrum
FAB-MS =	9-Fluorenyl-methoxycarbonyl
Fmoc =	Hochdruckflüssigkeitschromatographie
HPLC =	konzentriert
konz. =	Pentafluor-phenyl
Pfp	c^.S^.e-Pentamethyl-chroman-e-sulfonyl
Pm c	Schmelzpunkt
?mp.	2,4,5-Trichlor-phenyl
Tcp	Tetrahydrofuran
THF	2,4,6-Trimethoxy-benzyl
Tmob =	Trityl (Triphenyl-methyl)
Trt	Benzyloxycarbonyl
Z

Beispiel 1: Z-Asn(Trt)-OH

Ein Gemisch von 13,3g Z-Asn-OH (5OmMoI), 26g Triphenylmethanol (10OmMoI), 150ml Essigsäure und 9,5ml (10OmMoI) Acetanhydrid wird bei 50°C 15 Minuten gerührt. Nach Zugabe von 0,25 konz. Schwefelsäure entsteht nach 5 Minuten eine klare, gelbe Lösung. Nach 1V2 Stunden wird abgekühlt und in 1,5 Liter Eiswasser ausgegossen. Der Niederschlag wird abfiltriert, gut mit Wasser gewaschen und in etwa 500ml Essigsäureethylester gelöst. Die organische Phase wird mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 250g eingeengt. Das Z-Asn(Trt)-OH wird durch Zugabe von 125 ml Hexan zum Kristallisieren gebracht, Smp. 195-196°C.

Beispiel 2: H-Asn(Trt*-OH

Eid«» Suspension von 10,2 gZ-Asn(Trt)-OH (2OmMoI) in 120 ml Methanol und 20 ml einnormaler wäßriger Chlorwasserstoffsäure wird in Gegenwart von 0,5g eines 10%igen Palladium-auf-Kohle-Katalysators bei Raumtemperatur und Normaldruck hydriert. Nach beendeter Wasserstoffaufnahme wird der Katalysator abfiltriert, mit Methanol ausgewaschen und das Filtrat unter vermindertem Druck auf ein Gewicht von 100g geeignet. Nach Zusatz von 2,8 ml Triethylamin (2OmMoI) wird weiter auf ein Gewicht von 50g eingeengt, der kristalline Niederschlag wird abfiltriert und mit einem 1:1-Gemisch von Mothanol und Wasser, dann mit Wasser chloridfrei gewaschen. Das H-Asn(Trt)-OH enthalt 0,5MoI Wasser und zersetzt sich langsam ab 220⁰C.

Beispiel 3: Fmoc-Asn(Trt)-OH

Eine Lösung von 3,8g H-Asn(Trt)-OH 0,5H₂O (1OmMoI) in 20ml Tetrahydrofuran, 10ml Wasser und 1,4ml Triethylamin (1OmMoI) wird unter kräftigem Rühren mit 3/g g-Fluorenylmethyl-N-succinimidyl-carbonat (1OmMoI) versetzt und gleichzeitig 1,4ml Triethylamin so zugetropft, daß der pH-Wert 8,3-8,7 beträgt. Nach 20 Minuten wird im Eisbad gekühlt, mit Essigsäureethylester und 25ml einer einmolaren wäßrigen Kaliumhydrogensulfatlösung versetzt. Die organische Phase wird mit Wasser sulfatfrei gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf etwa 50g eingeengt. Durch langsam^-.-! Zugeben von Diisopropylether kann das Fmoc-Asn(Trt)-OH kristallisiert werden, Smp. 210-211⁰C (unter Zersetzung;.

Beispiel 4: Fmoc-Asn(Trt)-OH

Eine Suspension von 3,54g Fmoc-Asn-OH (1OmMoI) und 5,2g Triphenylmethanol (2OmMoI) in 30ml Essigsäure und 1,9ml Acetanhydrid (2OmMoI) wird 15 Minuten bei 5O⁰C gerührt, dann mit einer Lösung von 0,05ml konz. Schwefelsäure in 5ml Essigsäure versetzt. Nach etwa einer Stunde bei 5O⁰C bildet sich eine Lösung, und nach 1V2 Stunden beginnt sich ein Niederschlag zu bilden. Nach 3 Stunden wird die Suspension unter Eiskühlung langsam mit 200ml eiskaltem Wasser versetzt, kurz gerührt, der Niederschlag abfiltriert und gut mit Wasser gewaschen. Das feuchte Material wird in Essigsäureethylester gelöst, die organische Phase mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck einijRongt. Bevor das Produkt auszukristallisieren beginnt wird mit 1,2-Dichlorethan verdünnt, wieder eingeengt und durch 50g Kieselgel filtriert. Das überschüssige Triphenylmethanol wird mit 200ml 1,2-Dichlorethan eluiert, dann wird mit je 500ml eines 98:2- und eines 96:4-Gemisches von 1,2-Dichlorethan und Methanol Frnoc-Asn(Trt)-OH eluiert. Nach Eindampfen zur Trockne wird der Rückstand in 10ml Tetrahydrofuran gelöst, mit 30ml Essigsäureethylester versetzt, auf 20g eingeengt und durch Zusatz von Diisopropylether kristallisiert; das so erhältliche Fmoc-Asn(Trt)-OH schmilzt bei 210-211 °C (unter Zersetzung).

Beispiel 5: Fmoc-Asn(Trt)-OH

Eine Lösung von 0,69 g Fmoc-Asn(Trt)-OBzl in 10ml 9:1-Gemisches von Methanol und Wasser wird in Gegenwart von 0,07 g eines 10%igen Palladium-auf-Kohle-Katalysators bei Raumtemperatur und Normaldruck hydriert, bis im Dünnschichtchromatogramm (Lösungsmittel: 1:1-Gemisch von Toluol und Aceton) kein Ausgangsmaterial mehr sichtbar ist.

Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat eingedampft, der Rückstand in einem 96:4-Gemisch von 1,2-Dichlorethan und Methanol gelöst und durch wenig Silikagel filtriert. Nach Eindampfen des Filtrats erhält man das Fmoc-Asn(Trt)-OH, Smp. 210-211⁰C (unter Zersetzung).

Das Ausgangsmaterial kann wie folgt erhalten werden: Stufe 5.1:1,12g H-Asp-OBzl (5mMol)und 1,05g Natriumhydrogoncarbonat werden in 25 ml eines 9:1 -Gemisches aus Dioxan und Wasser suspendiert, 1,85g ü-Fluorenylmethyl-N-succinimidyl-carbonatfostzugegeben und das Gemisch 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Einengender Lösung wird mit Essigsäureethylester verdünnt, die organische Phase mit 0,5molarer wäßriger Kaliumhydrogensulfatlösung und Wasser gewaschen, dann über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Nach Zusatz von Petrolether kristallisiert Fmoc-Asp-OBzI aus.

Stufe 5.2: Eine Lösung von 2,09g Fmoc-Asp-OBzl in 20ml 1,2-Dichlorethan wird unter Rühren bei O⁰C und unter einer Argonatmosphäre mit 0,8 ml 1-Chlor-N,N,2-trimethylprop-1-enylamin (A. Devos et al., J. Chem. Soc, Commun., Bd. 1979, S. 1180) versetzt. Nach 10 Minuten wird eine Lösung von 1,2gTritylamin in 4ml 1,2-Dichlorethan zugegeben, dann 2 Stunden gerührt, mit Essigsäureethylester verdünnt und mit Wasser gowaschen. Die organische Phase wird getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen und an 250g Silikagel chromatographiert. Die den Fmoc-Asn(Trt)-OBzl enthaltenden Fraktionen worden vereinigt und eingedampft; das Produkt wird als amorpher Schaum erhalten.

Beispiel 6: Z-GIn(TrI)-OH

ein Gemisch von 2,8g Z-GIn-OH (1OmMoI), 5,2g Triphenylmethanol (2OmMoI) in 30ml Essigsäure wird mit 1,1 ml Essigsäureanhydrid (12mMol) versetzt und 15 Minuten bei 5O⁰C gerührt. Dann werden 0,05ml konz. Schwefelsäure (etwa ImMoI) zugegeben, wobei in wenigen Minuten eine klare, gelbe Lösung entsteht. Nach 2 Stunden wird die Lösung unter Rühren und Eiskühlung in 500ml Wasser eingetropft, der Niederschlag abfiltriert und gut mit Wasser gewaschen. Das feuchte Material wird in Essigsäureethylester gelöst, die wäßrige Phase abgetrennt, die organische Phase einmal mit einer gesättigten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 20g eingeengt. Durch portionsweise Zugabe von Hexan wird das Z-GIn(TYt)-OH kristallisiert, Smp. 161-162°C.

Beispiel 7: H-GIn(TrI)-OH

Eine Suspension von 10,4g Z-GIn(TrI)-OH (2OmMoI) in 180ml eines 9:1-Gemisches von Methanol und Wasser und 20ml einnormaler wäßriger Chlorwasserstoffsäure wird bei Raumtemperatur und Normaldruck in Gegenwart von 0,5g eines 10%igen Palladium-auf-Kohle-Katalysators hydriert; nach beendeter WasseiStoffaufnahme ist das Ausgangsmaterial gelöst. Der Katalysator wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen; das Filtrat wird auf 200g eingeengt und bei 60°C mit 2,8 ml Triethylamin (2OmMoI) versetzt, wobei das Produkt sofort zu kristallisieren beginnt. Man engt auf 100g ein, läßt einige Zeit bei etwa 4⁰C stehen, filtriert die Kristalle ab und wäscht mit einem Gemisch aus Methanol und Wasser chlorfrei. Das so erhältliche H-GIn(Tr^)-OH enthält 0,5 Mol Wasser und schmilzt bei 233°C (unter Zersetzung).

Beispiel 8: Fmoc-Gln(Trt)-OH

Eine Lösung von 4g des Halbhydrates von H-GIn(TrI)-OH (1OmMoI) in 20ml Tetrahydrofuran und 10ml einnormaler wäßriger Natriumhydroxidlösung wird unter gutem Rühren mit 3,4g g-Fluorenylmethyl-N-succinimidyl-carbonat (1OmMoI) versetzt und gleichzeitig 1,4ml Triethylamin so zugetropft, daß der pH-Wert etwa 8,5 beträgt. Nach 20 Minuten wird im Eisbad gekühlt, mit Essigsäureethylester überschichtet und mit 25ml einmolarer wäßriger Kaliumhydrogensulfatlösung bis zu einem pH-Wert von 2-2,ΰ angesäuert. Die organis he Phase wird mit Wasser neutral gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf 30g eingeengt. Das Produkt wird durch portionenweise Zugabe von 35ml Diisopropylether zum Kristallisieren gebracht. Nach längerem Stehen in der Kälte wird das kristalline Material abfiltriert und einmal in einem 1:4-Gemisch von Essigsäureethylester und Diisopropylether und dreimal mit Diisopropylether gewaschen. Das Fmoc-Gln(Trt)-OH enthält auch nach längerem Trocknen im Hochvakuum bei 6O⁰C noch 0,5 Mol Diisopropylether, Smp. ab 125⁰C (langsames Schmelzen unter Abgabe von Diisopropylether).

Beisiel 9: Fmoc-Gln(Trt)-OH

Ein Gemisch von 7,4 g Fmoc-Gln-OH (2OmMoI) und 10,4g Triphenylmethanol (4OmMoI) in 300ml Essigsäure wird 10 Minuten bei 100°C gerührt. Nach Zugabe von 0,1 ml konz. Schwefelsäure wird noch weitere 15 Minuten bei 100°C gerührt, wobei eine klare, gelbe Lösung entsteht. Diese wird unter vermindertem Druck bei 60°C eingedampft, und der Rückstand noch 10 Minuten unter vermindertem Druck getrocknet. Der feste Rückstand wird in 60ml Essigsäure bei 6O⁰C gelöst, während 20 Minuten bei 60°C belassen, dann mit 2ml Essigsäureanhydrid (2OmMoI) versetzt und nach 1 Stunde bei 60°C unter vermindertem Druck eingedampft. Der ölige Rückstand wird während 10 Minuten bei 60°C getrocknet, dann in 100ml Essigsäure gelöst und in 500ml eiskaltes Wasser eingetropft. Der Niederschlag wird abfiltriert, gut mit Wasser gewaschen und in Essigsäureethylester gelöst; die wäßrige Phase wird abgetrennt, und die organische Phase mit einer gesäugten wäßrigen Natriumchloridlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die organische Lösung zur Trockne eingedampft, der Rückstand wird in 50 ml 1,2-Dichlorethan gelöst und auf 100g Silikagrl gegeben; eluiert wird mit 1,2-Dichlorethan und 1,2-Dichlorethan enthaltend 2%, dann 4% Methanol. Die das Fmoc-Gln(Trt)-OH enthaltenden Fraktionen werden unter vermindertem Druck eingedampft, und das Produkt wird aus einem Gemisch von Essigsäureethylester und Diisopropylether kristallisiert, Smp. ab 125⁰C.

Beispiel 10: H-Gln-Gln-Gln-Gln-Gln-Ser-Leu-Gly-OH

Das Peptid wird zweimal mittels der Merrifield-Festphasensynthese hergestellt, wobei bei der einen Synthese Fmoc-Gln-OH und bei der anderen Fmoc-Gln(Trt)-OH verwendet wird.

Ausgehend von 1 g sogenannten Fmoc-Gly-p-Benzyloxybenzylester-polystyrolharz (1 % vernetzt) der Firma Novabiochem (Läufelfingen, Schweiz), worin die Carboxylgruppe des Glycins, dessen Aminogruppe durch 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl (Fmoc) geschützt ist, mit 4-Methoxy-benzylalkohol verestert ist, wobei das Kohlenstoffatom der Methoxygruppe mit einem aromatischen Ring des zu 1 % mit Divinylbenzol vernetzten Polystyrolharzes, das gleichzeitig als Trägermaterial dient, verbunden

ist, wird der Aufbau des Peptidmoleküls nach der Merrifield-Synthese durchgeführt. Dabei wird eine automatische Peptidsyntheseapparatur verwendet, die sich zur alternierenden Abspaltung der Aminoschutzgruppen, im vorliegenden Fall der Fmoc-Gruppe, und zur Ankupplung der N-Fmoc-geschützton Aminosäureverbindungen eignet. Im ersten Schritt wird dabei die Fmoc-Schutzgruppe im Fmoc-Gly-p-Benzyloxybenzylester-Polyslyrolharz entfernt und Fmoc-Leu-OH mit dem so erhaltenen H-Gly-p-Benzyloxybenzylester-Polystyrolharz gekuppelt, und dann die weiteren N-Fmoc-Aminosäuren stufenweise in der Reihenfolge Fmoc-Ser(But>-OH, dann entweder Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Gln-OH und Fmoc-Gln-OH, oder FmOC-GIn(Td)-OH, Fmoc-Gln(Trt>-OH, Fmoc-Gln(T:t)-O!i, Fmoc-Gln(Trt)-OH und Fmoc-Gln(Trt)-OH an das jeweils erhaltene Peptid/Harz-Zwischenprodukt gekuppelt. Die einzelnen Stufen werden nach folgendem Schema durchgeführt, wobei jeweils etwa 1OmI der Waschflüssigkeit verwendet und die einzelnen Operationen, falls nicht anders angegeben, bei Raumtemperatur durchgeführt werden und wobei das Reaktionsgomisch jeweils regelmäßig geschüttelt wird: Ausgehend von 1 g des oben beschriebenen Fmcc-Gly/Harz-Ausgangsmaterials (Beladung: 0,47mMol/g) werden die folgenden, sich für jede Stufe jeweils repetierenden Verfahrensschritte durchgeführt:

1. einmaliges Waschen während 0,8 Minuten mit Isopropanol;

2. dreimaliges Waschen während je 0,5 Minuten mit unter vermindertem Druck entgastem Dimethylacetamid (Dimethylaminfrei);

3. fünfmaliges Behandeln während je 1,7 Minuten mit einem 1 ^-Gemisch von Piperidin und Dimethylacetamid (Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe);

4. einmaliges Waschen während 0,8 Minuten mit Isopropanol;

5. dreimaliges Waschen während je 0,5 Minuten mit unter vermindertem Druck entgastem Dimethylacetamid (Dimethylaminfrei);

6. einmaliges Waschen während 0,8 Minuten mit Isopropanol;

7. dreimaliges Behandeln während je 1,7 Minuten mit einem 1:4-Gemisch von Piperidin und Dimethylacetamid (zur vollständigen Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppe);

8. zweimaliges Waschen während je 0,5 Minuten mit unter vermindertem Druck entgastem Dimethylacetamid (Dimethylaminfrei);

9. einmaliges Waschen während 0,8 Minuten mit Isopropanol;

10. sechsmaliges Waschen während je 0,5 Minuten mit unter vermindertem Druck entgastem Dimethylacetamid (Dimethylamin-frei);

11. Zugabe des zwischenzeitlich bereitgestellten Kupplungsreagens (das wie folgt erhalten wird: Ein Gemisch von 1,^mMoI der jeweiligen Fmoc-L-Aminosäure, 1,4 mMol 1-Hydroxy-1H-benztriazol und 1,55mMol Diisopropylcarbodiimid in 4ml Dimethylacetamid (Dimethylamin-frei) wird während etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen und dann verwendet). Die Kupplungsreaktion selber dauert 60 Minuten bei Raumtemperatur;

12. einmalige Acetylierung während 5 Minuten mit einem 1:1:8-Gemisch von Acetanhydrid, Pyridin und Dimethylacetamid (Dimethylamin-frei);

13. dreimaliges WaschenwährendsjeO,5 Minuten mituntervermindertem Druck entgastem Dimethylacetamid (Dimethylaminfrei);

14. einmaliges Waschen während 0,8 Minuten mit Isopropanol und

15. zweimaliges Waschen während 0,5 Minuten mit unter vermindertem Druck entgastem Dimethylacetamid (Dimethylaminfrei).

Nach Ankupplung der letzten Aminosäure werden nochmals die obigen Behandlungsschritte 1-10 zwecks Abspaltung der Fmoc-Gruppe ausgeführt.

Die Ausbeuten für jeden der letzten fünf Kupplungsschritte mit Fmoc-Gln-OH bzw. Fmoc-Gln(Trt)-OH werden anhand des mit der jeweiligen Abspaltung der Fmoc-Gruppe als Nebenprodukt gebildeten 1-(9-Fluorenylmethyl)-piperidins bestimmt. Hierzu werden jeweils die vereinigten Filtrate der Schritte 3-10 auf ein bestimmtes Volumen verdünnt und photometrisch im UV (λ,™ = 299,8nm,e = 7800) ausgewertet. Die Ausbeuten betragen für die Serie mit Fmoc-Gln-OH 99%,97%, 98%, 49%und 72%, für diejenige mit Fmoc-Gln(Trt)-OH 100%, 100%, 99%, 99% und 100%.

Das Peptid wird durch Behandeln mit etwa 10ml eines (90:5:5)-Gemisches von Trifluoressigsäure, Wasser und 1,2-Ethandithiol wahrende Minuten von Harz abgespalten; das Reaktionsgemisch wird filtriert, das Filtrat unter vermindertem Druck eingeengt und das Peptid mit einem 1:1-Gemisch von Diisopropylether und Hexan ausgefällt und getrocknet. Durch die obengenannte Behandlung mit Trifluoressigsäure-Wasser-1,2-Ethandithiol werden teilweise bereits auch die Tritylgruppen (sofern vorhanden) und die tert.-Butylgruppe abgespalten. Diese Abspaltung wird durch 30minütiges Erwärmen der Peptidfällung auf 3O⁰C in Trifluoressigsäuro-Wasser-1,2-Pthandithiol (90:5:5) vervollständigt. Die erhaltenen Rohprodukte aus den Synthesen mit und ohne Trityl-Schutzgruppen werden im HPLC untersucht (Säule: Nucleosil 5C18, 250 χ 4,6mm; Laufmittel: A = 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser, B = 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril. Gradient: 0 bis 40% B in 30 Minuten; Fluß: 1 ml/Minute. Detektion: 215nm).

Das gewünschte Titelprodukt weist eine Retentionszeit von 17,98 Minuten auf. Das HPLC-Profil des Rohprodukts aus der Synthese mit Trityl-Schutz der Glutaminreste weist neben dem Titelprodukt (92%) ein Signal (8%) bei einer Retentionszeit von 18,65 Minuten auf. Das HPLC-Profil des Rohprodukts aus der Synthese ohne Trityl-Schutz der Glutaminreste weist neben dem Titelprodukt (nur 30%) ein Signal (70%) mit einer Reteniionszeit von 18,38 Minuten auf.

Beispiel 11: H-Arg-Arg-Ser-Asn-Gln-Va^Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-lle-Val-Gln-Asn-lle-Gln-Gly-Arg-Arg-OH Das Titelpeptid wird zweimal nach dem im Beispiel 10 beschriebenen Syntheseschema hergestellt, erstens mit ungeschützten Fmoc-Asn-OH bzw. Fmoc-Gln-OH und zweitens mit Fmoc-Asn(Trt)-OH bzw. Fmoc-Gln(Tr1)-OH. Ausgehend von Fmoc-Arg(Pmc)-Harz (Novabiochem) werden nacheinander folgende Aminosäuren ankondensiert:

Fmoc-Arg(Pmc), Fmoc-Gly, Fmoc-Gln bzw. Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Ile, Fmoc-Asn bzw. Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Gln bzw. Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Val, Fmoc-Ile, Fmoc-Pro, Fmoc-Tyr(But), Fmoc-Asn bzw. Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Gln bzw. Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Ser(But), Fmoc-Val, Fmoc-Gln bzw. Fmoc-Gln(Trt), Fmoc-Asn bzw. Fmoc-Asn(Trt), Fmoc-Ser(But), Fmoc-Arg(Pmc) und Fmoc-Arg(Pmc).

Das Peptid wird nach Abspaltunrj der N-terminalen Fmoc-Gruppe während 8 Minuten mit Trifluoressigsäure-H₂O-1,2-Ethandithio! (90:5:5) vom Harz abgespalten und anschließend mit Triiluoressigsäure-H₂O-1,2-Ethandithiol-4-Methylmercaptophenol (90:5:3:2) während 90 Minuten bei 3O⁰C von den restlichen Schutzgruppen befreit. Das Rohprodukt aus der Synthese a (mit Trityl-Schutz) liefert im FAB-MS ein (M + ΗΓ-Signal bei 2414,1 (berechnetes Molekulargewicht: 2413,7). Dio HPLC-Profile (Säule: Nucleosil 7C18,125 x 4,6mm; Laufmittel: A = 0,1 %Trifluoressigsäure in W >sser; B = 0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril. Gradient: 0 bis 90% B in 30 Minuten, 1,5 ml/Minute. Detektion: Ül5nm) der Rohprodukte von beiden Synthesen (a: mit Trityl-Schutz bei Asn und GIn; b: ohne Trityl-Schutz bei Asn und GIn) sind in Figur 1 abgebildet. Darin gibt die Abszirsenskala die Retentionszeit in Minuten an.

Beispiel 12: Fmoc-Lys-Gln-Hls-Asn-Pro-Lys-Tyr-Gln-Trp-Asn-OH

Zu einer Suspension von 10g sogenannten 4-Benzyloxybenzylalkoholpolystyrol (0,78mMol OH/g; 1 % mit Divinylbenzol quervernetzt; die Phenylgruppon des Polystyrols sind in 4-Stellung durch 4-Hydroxymethylphenyloxymethyl substituiert; Novabiochem), 9,3g (15,GmMoI) Fmoc-Asn(Trt)-OH und 3,1 ml (38,5mMol) Pyridin in 60ml Dimethylacetamid werden 3,35ml (23,4mMol)2,6-Dichlor-benzoylchlorid(Fluka)in4 Portionen innerhalb von 5 Stunden zugegeben und 24 Stunden gerührt. Das Harz wild abfiltriert und sehr gut mit Methanol und 1,2-Dichlor-ethan ausgewaschen. Das Harz weist eine Beladung von 0,48mMol/g auf (photometrische Fmoc-Bestimmung). Die restlichen OH-Gruppen werden vor Beginn der Peptidsynthese 2 Stunden lang mit Acetanhydnd-Pyridin-Dimethylacetamid 1:1:8 acetyliert. In analoger Weise (Ersatz von Fmoc-Asn(Trt)-OH durch Fmoc-Asn(Tmob)-OH) stellt man ein Fmoc-Asn(Tmob)-Harzher. Dieses weist eine Beladung von 0,44 mMol/g auf. 0,5g Fmoc-Asn(Trt)-Harz (0,24mMol Asn) bzw. 0,5g Fmoc-Asn(Tmob)-Harz (0,22mMol Asn) werden nach dem im Beispiel 10 beschriebenen Syntheseschema nacheinander mit folgenden Aminosäuren gekuppelt: Fmoc -Trp, Fmoc-Gln(Trt) bzw. Fmoc-Gln(Tmob), Fmoc-Tyr(But), Fmoc-Lys(Boc), Fmoc-Pro, Fmoc-Asn(Trt) bzw. Fmoc-Asn(Tmob), Fmoc-His(Trt), Fmoc-Gln(Trt) bzw. Fmoc-Gln(Tmob), und l-moc-Lys(Boc).

Die erhaltenen Peotid-Harze werden 15 Minuten mit Trifluoressigsäure-Dimethylsulfid- 1,2-Ethandithiul (77:20:3) geschüttelt, um das Peptid vom Harz abzuspalten. Die restlichen Fchutzgruppen werden dann mit Trifluuressigssure-Wasser-1,2-Ethandithiol (90:5:5) während 40 Minuten bei Raumtemperatur abgespalten.

Die erhaltenen Rohprodukte aus den Synthesen mit Trityl-Schutz an Asn und GIn (= Rohprodukt A¹ einerseits und mit Tmob-Srhutz an Asn und GIn (= Rohprodukt B) andererseits werden im HPLC untersucht (Sä jle: Nucleosil 5C18,250 x 4,6mm; Laufmittel: A = 0,1 %Trifluoressigsä'jre in Wasser, B = 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril Gradient: 0 bis 90% B in 30 Minute. 1 ml/Minute. Detektion: 215nm). Das gewünschte Titelprodukt weist eine Retenlionszeit von 29,8 Minuten auf. Das HPLC-Profil des Rohprodukts aus der Synthese mit Trityl-Schutz (Rohprodukt A) weist neben dem Titelprodukt (95%, (M + ΗΓ im FAB-MS = 1 565,4; berechnetes Molekulargewicht: 1 564,7) ßin Signal (5%) bei einer Retentionszeit von 30,9 Minuten für

Fmoc-Lys-Gln-His-Asn-Pro-Lys-Tyr-Gln-TipiCfy -/ VOH)-Asn-OH auf.

Das HPLC-Profil von Rohprodukt B (mit Tmob-Schutz) weist neben dem Signal für das Titelprodukt (nur etwa 8%) und dem obengenannten Signal (ca. 3%) mit der Retentionszeit von 309,9 Minuten ein Signal (89%) mit einer Retentionszeit von 33,7 Minuten für

OCH-,

Fmoc-Lys-Gln-His-Asn-Pro-Lys-Tyr-Gln-TrpC CH₂ -^ ^x)- OCH₃ )-Asn-OH

OCH₃

[(M + H)" im FA-MS = 1 745,6; berechnetes Molekulargewicht: 1 744,9) und weitere, sehr kleine Signale auf.

Beispiel 13: Fmoc-Asn(Trt)-OTcp

Eine Lösung von 1,5 g (2,51 mMol) Fmoc-Asn(Trt)-OH und 0,54g (2,75 mMol) 2,4,5-Trichlor-phenol in 10 ml Tetrahydrofuran wird auf O⁰C gekühlt. Man gibt 0,57g (2,75mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid in fester Form zu und rührt während 30 Minuten bei O⁰C, 2 Stunden bei Raumtemperatur, nochmals 30 Minuten bei O⁰C und filtriert dann den gebildeten Dicyclohexylharnstoff ab. Aus dem Filtrat wird Fmoc-Asn(Trt)-OTcp durch Zugabe von POmI Hexan auskristallisiert; Smp. 133-135⁰C, (a)£° = +51,1° (THF).

Beispiel 14: Fmoc-Gln(Trt)-OTcp

10g (15,1 mMol) Fmoc-Gln(Trt)-OH x 0,5 Diisopropylether und 3,26g (16,6mMol) 2,4,5-Trichlor-phenol werden in 100ml Tetrahydrofuran gelöst und auf 0°C abgekühlt. Nach Zugabe von J,41 g (16,6mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form wird 1 Stunde bei 0⁰C, 2 Stunden bei Raumtemperatur und nochmals 30 Minuten bei 0⁰C gerührt. Der auskristallisierte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und aus dem Filtrat Fmoc-Gln(Trt)-OTcp durch Zugabe von 750 ml Petrolether als Gallerte ausgefällt, abfiltriert, getrocknet und aus Methylenchlorid-Hexan kristallisiert; Smp. = 166°C, (α)έ° = 16,1° (THF).

Beispiel 15: Fmoc-Asn(Trt)-OPfp

1,5g (2,51 mMol) Fmoc-Aan(Trt)-OH werden in 15ml Tetrahydrofuran gelöst. Man gibt 0,51g (2,76mMol) Pentafluor-phenolzu, kühlt die Lösung auf O⁰C und fügt dann noch 0,57g (2,76mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid in fester Form zu. Es wird während 30 Minuten bei 0⁰C, 2 Stunden bei Raumtemperatur und nochmal 30 Minuten bei 0°C gerührt. Der auskristallisierte Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingeengt und mit 40ml Diisopropylether verrieben. Der pulvrige Rückstand wird abfiltriert, getrocknet und aus Methylenchlorid-Petrolether umkristallisiert. Man erhält Fmoc-Asn(Trt)-OPfp; Smp. 154-156°C,[a]g° = -7,8° (THF).

Beispiel 16: Fmoc-Gln(Trt) -OPfp

1,5g (2,27mMol) Fmoc-Gin(Trt)-OH x 0,5 Oiisopropylether und 0,46g (2,BmMoI) Pentafluor-phenol werden in 35ml Essigsäureethylester gelöst, auf O⁰C gekühlt und unter Rühren mit 0,52g (2,5mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Man rührt während 1 Stunde bei O⁰C und 3 Stunden bei Raumtemperatur, filtriert das unlösliche Material ab und wäscht mit Tetrahydrofuran. Das Filtrat wird zur Trockne eingeengt und der Rückstand in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst. Durch langsame Zugabe von Petrolether unter Rühren wird Fmoc-Gln(Trt)-OPfp kristallisiert; Smp. 185-187°C, [α)έ° = -16,4° (THF).

Beispiel 17: Fmoc-Asn\Trt)-ODhbt

1,5g (2,51 mMol) Fmoc-Asn(Trt)-OH werden in 10ml Tetrahydrofuran gelöst und mit einer Lösung von 0,45g (2,76 mMol) 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin in 5ml Dimethylformamid vermischt. Man kühlt auf 0⁰C, gibt 0,57g (2,76 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid in fester Form zu und rührt während 1 Stunde bei O⁰C, 3 Stunden bei Raumtemperatur und dann nochmals 1 Stunde bei O⁰C. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, das Filtrat zur Trockne eingeengt, der Rückstand mit 30ml Diisopropylether verrieben, abfiltriert und getrocknet. Das Rohprodukt wird durch Umfallen aus Methylenchlorid-Hexan gereinigt. Man erhält Fmoc-Asn(Trt)-ODhbt als amorphes Pulver; Smp. ca. 14O⁰C, Ia)I⁰ = -40,8° (THF).

Beispiel 18: Fmoc-Gln(Trt)-ODhbt

1g (1,51 mMol)Fmoc-Uln(Trt)-OH x 0,5 Diisopropylether werden in 10ml Essigsäureethylester gelöst. Man gibt 0,27g (1,66mMol) 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin in fein pulverisierter Form zu, und versetzt die Suspension nach Abkühlen auf O⁰C noch mit 0,34g (1,66mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid in fester Form. Nach einstündigem Rühren bei O⁰C gibt man nochmals 10ml Essigsäureethylester zu, rührt während 3 Stunden bei Raumtemperatur, filtriert den Dicyclohexylharnstoff ab und wäscht mit Essigsäureethylester. Das Filtrat wird auf ca. 10ml konzentriert und daraus Fmoc-Gln(Trt)-ODhbt durch Zugabe von 50ml Petrolether auskristallisiert; Smp. 130-133°C, [a]g° = -53,7° (THF).

Beispiel 19: H-Asn(Trt)-OH · 0,5H₂O

20g (0,1515 Mol) H-Asn-OH und 78,8g (0,303 Mol) Trt-OH werden in 455ml Eisessig suspendiert. Man gibt 9,28ml (0,174 Mol) konzentrierte H₂SO₄ zu, gefolgt von 28,6ml (0,303 Mol) Acetanhydrid und rührt während 75 Minuten bei 60⁰C. Nach ca. 40-50 Minuten ist alles gelöst. Das Reaktionsprodukt wird durch langsames Eintragen in 910ml eisgekühltes H₂O ausgefällt. Anschließend wird der pH-Wert mit ca. 850 ml 10N NaOH auf ca. 6 gestellt. Nach ca. 1 Stunde Rühren bei O⁰C wird abfiltriert, mehrmals mit H₂O und dann mit Toluol gewaschen, bis kein Trt-OH mehr im Filtrat enthalten ist. Das erhaltene Titelprodukt zersetzt sich langsam ab 22O⁰C.

Beispiel 20: Βο

3,83g (1OmMoI) H-Asn(Trt)-OH · 0,5H₂O und 1,37ml (1OmMoI) Triethylamin werden in 38ml 90%igem Tetrahydrofuran gelöst. Man gibt 2,2 ml (10 mMol) Di-tert.-butyl-dicarbonat zu, gefolgt von weiteren 1,37 ml Triethylamin. Man läßt während 2'Λ Stunden bei Raumtemperatur reagieren und extrahiert dann mit 250ml Essigsäureethylester und 125 ml wäßriger einmolarer KHSO₄-Lösung. Die organische Phase wird neutral gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird aus Methanol-Essigsäureethylester-Hexan kristallisiert; Smp. des erhaltenen Titelprodukts: 201-203°C, [a)g° = -17,7° (THF).

Beispiel 21: Boc-Gln(Trt)-OH

3,98g (1OmMoI) H-GIn(Tn)-OH · 0,5H₂O und 1,38ml (1OmMoI) Triethylamin werden in 60ml 90%igem Tetrahydrofuran suspendiert, dann mit 2,28ml (10,2 mMol) (Boc)₂O und weiteren 1,38ml Triethylamin versetzt und während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach ca. 30 Minuten ist alles klar in Lösung gegangen. Man verfährt weiter analog Beispiel 20, mit dem Unterschied, daß der Rückstand aus Methanol-CH₂CI₂-Petrolether kristallisiert wird; Smp. des erhaltenen Titelprodukts: ca. 112⁰C, la\l⁰ = -2± 1° (THF).

Claims (41)

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I,

il

R₁-NH-HC-C-O-R₂

I (I)

(CH₂)_n

O=C-NH-R₃

worin η für 1 oder 2 steht, R₁ Wasserstoff oder eine Arninoschutzgruppe, R₂ Wasserstoff oder eine Carboxylschutzgruppe und R₃ Triphenylmethyl, 4-Monomethoxy-trityl oder 4,4'-Dimethoxy-trityl bedeuten, eines Salzes einer solchen Verbindung mit einer salzbildenden Gruppe oder eines reaktionsfähigen Carbonsäurederivats einer solchen Verbindung, worin R₁ für eine Aminoschutzgruppe und R₂ für Wasserstoff stehen, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Verbindung der Formel II,

Il

R₄-NH-HC-C-OR₂

I (in

(CH₂X,
O=C-NH₂

worin R₄ für Wasserstoff oder eine unter den Reaktionsbedingungen stabile Aminoschutzgruppe steht und η und R₂ die obengenannten Bedeutungen haben, mit einer Verbindung der Formel III,

R₃-OH (III)

worin R₃ die obengenannte Bedeutung hat, umsetzt und aus dem erhaltenen Produkt diejenigen Schutzgruppen abspaltet, die nicht Bestandteil des gewünschten Endprodukts der Formel I sind, oder

b) zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin R₁ für eine Aminoschutzgruppe steht, in eine Verbindung der Formel IV,

Il

H₂N-CH-C-OR₂

I ' (IV)

(CH₂)_n

O=C-NH-R₃

worin n, R₂ und R₃ die obengenannten Bedeutungen haben, eine Aminoschutzgruppe einführt, oder

c) eine Verbindung der Formel V,

Il

R₅-NH-HC-C-OR_{6 (v)}

(CH₂),,

O=C-OH

worin η die obengenannte Bedeutung hat, R₅ eine unter den Reaktionsbedingungei stabile Aminoschutzgruppe bedeutet und R₆ für eine unter den Reaktionsbedingungen stabile Carboxylschutzgruppe steht, mit einer Verbindung der Formel Vl,

R₇-NH₂ (Vl)

worin R₃ die obengenannte Bedeutung hat, umsetzt und aus dem erhaltenen Produkt diejenigen Schutzgruppen abspaltet, die nicht Bestandteil der gewünschten Endprodukts der Formel I sind, und, wenn erwünscht, nach Durchführung eines der Verfahren a), b) oder c) eine erhaltene Verbindung der Formel I mit einer salzbildenden Gruppe in ihr Salz überführt oder ein erhaltenes Salz in die freie Verbindung überführt oder eine erhaltene Verbindung der Formel I, worin R₁ eine Aminoschutzgruppe und R₂ Wasserstoff bedeuten, in ein reaktionsfähiges Carbonsäurederiva* überführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel II, worin R₄ für Benzyloxycarbonyl oder 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl steht, in einem geeigneten organischen Lösungsmittel in Gegenwart katalytischer Mengen einer wasserfreien starken Lewis-Säure und in Gegenwart eines wasserentziehenden Mittels zwischen +2O⁰C und +7O⁰C umsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin R₁ eine Aminoschutzgruppe, R₂ Wasserstoff und R₃Triphenylmethyl,4-Monomethoxy-trityl oder 4,4'-Dimethoxy-trityl bedeuten, oder eines Metall- oder Ammonium'salzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin R₁ Benzyloxycarbonyl, 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbonyl, R₂ Wasserstoff und R₃ Triphenylmethyl bedeuten, oder eines Metall- oder Ammoniumsalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin R₁ 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl bedeutet, oder eines Metall- oder Ammoniumsalzes einer solchen Verbindung, worin R₂ für Wasserstoff steht, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von Benzyloxycarbonyl-Asn(triphenylmethyl)-OH oder eines Metall-oder Ammoniumsalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl-Asn(triphenylmethyl)-OH oder eines Metall- oder Ainmoniumsalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

8. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von H-Asn(triphenylmethy!)-OH oder eines Salzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmateriaiien verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von Tert.-butyloxycarbonyl-Asn(triphenylmethyl)-OH oder eines Salzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von Benzyloxycarbonyl-Glnltriphdnylmethyl)-OH oder eines Metall-oder Ammoniumsalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

ι.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von 9-Fluorenyl-methoxy-carbonyl-Gln(triphenylmethyl)-Oh oder eines Metall- oder Ammoniumsalzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von H-Gln(triphenylmethyl)-OH oder eines Salzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von Tert.-butyloxycarbonyl-Gln-(triphenylmethyl)-OH oder eines Salzes davon, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines reaktionsfähigen Carbonsäurederivates einer Verbindung der Formel I, dadurch gekennzeichnet, daß man eine erhaltene Verbindung der Formel I, worin R₁ eine Aminoschutzgrupoe und R₂ Wasserstoff bedeuten, in ein reaktionsfähiges Carbonsäurederivat überführt.

15. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines reaktionsfähigen Carbonsäurederivates einer Verbindung der Formel I in Form eines 2,4,5-Trichlor-phenylesters, Pentafluor-phenylesters, eines Säurechlorids, eines symmetrischen Anhydrids, eines Esters mit 1-Hydroxybenztriazol oder

eines Esters mit 3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazin oder eines Esters mit N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid, dadurch gekonnzeichnet, daß man eine erhaltene Verbindung der Formel I, worin R₁ eine Aminoschutzgruppe und R₂ Wasserstoff bedeuten, in ein entsprechendes reaktionsfähiges Carbonsäurederivat überführt.

16. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl-Asn(triphenylmethyl)-O-2,4,5-trichlorphenyl, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von 9-Fluorenyl-methoxy-carbonyl-Gln(triphenylmethyl)-O-2,4,5-trichlorphenyl, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von 9-Fluorenyl-methoxy-carbonyl-Asn(triphenylmethyl)-O-pentafluor-phenyl, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

19. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von 9-Fluorenyl mothoxy-carbonyl-Gln(triphenylmethyl)-0-pentafluorphenyl, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von 9-Fluorenyl-methoxy-carbonyl-Asn(triphenylmethyl)-0-3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazinyl, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

21. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von 9-Fluorenyl-methoxy-carbonyl-G ln(triphenylmethyl)-0-3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazinyl, dadurch gekennzeichnet, daß man entsprechend substituierte Ausgangsmaterialien verwendet.

22. Eine Verbindung der Formel I,

Il

R₁-NH-HC-C-O-R₂

I (I)

(CH₂)_n

O=C-NH-R₃

worin η für 1 oder 2 steht, R₁ Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe, R₂ Wasserstoff oder eine Carboxylschutzgruppe und R₃Triphenylmethyl, 4-Monomethoxy-trityl oder4,4'-Dimethoxy-trityl bedeuten, ein Salz einer solchen Verbindung mit einer salzbildenden Gruppe oder ein reaktionsfähiges Carbonsäurederivat einer solchen Verbindung der Formel I, worin R₁ für eine Aminoschutzgruppe und R₂ für Wasserstoff stehen.

23. Eine Verbindung nach Anspruch 22 der Formel I, worin R₁ eine Aminoschutzgruppe, R₂ Wasserstoff und R₃Triphenylmethyl, 4-Monomethoxy-trityl oder4,4'-Dimethoxytrityl bedeuten, oder ein Metall- oder Ammoniumsalz davon.

24. Eine Verbindung nach Anspruch 22 der Formel I, worin R₁ Benzyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl oder tert.-Butyloxycarbonyl, R₂ Wasserstoff und R₃ Triphenylmethyl bedeuten, oder ein Metall- oder Ammoniumsalz davon.

25. Eine Verbindung nach einem der Ansprüche 22-24 der Formel I, worin R₁ 9-Fluorenylmethoxycarbonyl bedeutet, oder ein Metall- oder Ammoniumsalz einer solchen Verbindung, worin R₂ für Wasserstoff steht.

26. Benzyloxycarbonyl-Asn(triphenylmethyl)-OH oder ein Metall- oder Ammoniumsalz davon nach Anspruch 22.

27. 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl-Asn(triphenylmethyl)-OH oder ein Metall- oder Ammoniumsalz davon nach Anspruch 22.

28. H-Asn(triphenylmethyl)-OH oder ein SiIz davon nach Anspruch 22.

29. Tert.-butyloxycarbonyl-Asn(triphenylmethyl)-OH oder ein Salz davon nach Anspruch

30. Benzyloxycarbonyl-Gln(triphenylmethyl)-OH odereii, Metall-oder Ammoniumsalz davon nach Anspruch 22.

31. 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl-Gln(triphenylmethyl)-0H oder ein Metall- oder Ammoniumsalz davon nach Anspruch 22.

32. H-Gln(triphenylmethyl)-OH oder ein Salz davon nach Anspruch 22.

33. Tert.-butyloxycarbonyl-Gln(triphenylmethyl)-OH oder ein Salz davon nach Anspruch

34. Ein reaktionsfähiges Carbonsäurederivat nach Anspruch 22 einer der in den Ansprüchen 23-33 beanspruchten Verbindungen.

35. Ein reaktionsfähiges Carbonsäurederivat nach Anspruch 34 in Form eines 2,4,5-Trichlorphenylesters, Pentafluor-phenylesters, eines Säurechlorids, eine > symmetrischen Anhydrids, eines Esters mit 1-Hydroxybenztriazol oder eines Esters mit S^-Dihydro-S-hydroxy^-oxo-I^.S-benzotriazin oder eines Esters mit N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid.

36. g-Fluorenyl-methoxycarbonyl-AsnUriphenylmethyll-O^AB-trichlorphenyl nach Anspruch 22.

37. g-Fluorenyl-methoxycarbonyl-GlnUriphenylmethylJ-O^AS-trichlorphenyl nach Anspruch 22.

38. g-Fluorenyl-methoxycarbonyl-AsndriphenylmethyD-O-pentafluor-phenyl nach Anspruch 22.

39. Q-Fluorenyl-methoxycarbonyl-GlnltriphenylmethyD-O-pentafluor-phenyl nach Anspruch 22.

40. g-Fluorenyl-methoxycarbonyl-AsnltriphenylmethyD-O-S^-dihydro-S-hydroxy^-oxo-I^.S-benzotriazinyl nach Anspruch 22.

41. S-Fluorenyl-methoxycarbonyl-GlndriphenylmethyD-O-S^-dihydro-S-hydroxy^-oxo-i^^- benzotriazinyl nach Anspruch 22.