DD299089A5 - Verfahren zur bestimmung von anti-oxydierenden eigenschaften eines lebenden organismus oder eines potentiell aggresiven mittels durch freie radikale - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung oder Bewertung von oxydationshemmenden Aktivitaeten eines lebenden Organismus oder eines potentiell aggressiven Agens unter Verwendung von freien Radikalen als Mittel zur Induktion der Zellaufloesung. Erfindungsgemaesz wird in einem geeigneten fluessigen, biologischen Medium ein Erzeuger freier Radikale und ein Zellmaterial zusammengebracht. Das Zellmaterial wird ausgewaehlt aus menschlichen, tierischen und pflanzlichen Zellen, aus Fragmenten dieser Zellen oder aus synthetischen Zellwaenden und deren Liposome enthaltenden Fragmenten, wobei das Zellmaterial vorher durch ein potentiell aggressives Agens kontaminiert wurde. Die Freisetzung der freien Radikale wird, ausgehend von dem Erzeuger freier Radikale, induziert. Die Aufloesung des Zellmaterials durch die freien Radikale wird bewertet in bezug auf eine das nicht kontaminierte Zellmaterial enthaltende Kontrollprobe.{lebender Organismus; oxydationshemmende Eigenschaften; potentiell aggressives Agens; freie Radikale; Induktion; Zellaufloesung}

Description

Hierzu 4 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Diese Erfindung bezieht sich auf ein neues Verfahren zur Bestimmung der oxydationshemmenden Eigenschaften eines lebenden Organismus oder eines potentiell aggressiven Agens mit Hilfe freier Radikale.

Sie betritt insbesondere das Verfahren zur Bewertung des oxydationshemmenden Zustande von Zellen eines lebenden Organismus einerseits und der oxydationsfördernden bzw. oxydationshemmenden Aktiväten eines Agens chemischer oder physikalischer Natur andererseits, welches aggressiv sein kann, d, h., das die durch die freien Radikale eingeleitete Zellauflösung entweder erhöhen bzw. beschleunigen, oder hemmen bzw. verzögern kann.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, daß die freien Radikale im allgemeinem eine ungünstige Wirkung auf den Organismus und insbesondere auf die Zellen dieses Organismus ausüben. Die freien Radikale greifen mehr oder weniger schnell die Zellwand je nach

Widerstandsfähigkeit der Zellen an, den ihnen das enzymatische oder molekulare Material (bzw. Ausstattung) der genannten Zellen verleiht. Wenn die Zellwand von freien Radikalen beschädigt, durchlöchert oder geöffnet wurde, breitet sich dor Zeliinhalt außerhalb der Wand aus. Siehe insbesondere die folgenden Dokumente: Chemical Abstracts 107,213235v, Chemical Abstracts 0107,232454g, Chemical Abstracts 100,99345J, Biological Abstracts 72 (Nr.9), Seite 5914, Zusammenfassung Nr. 57169, (1981) und Biological Abstracts 73 (Nr. 12), Seite 8817, Zusammenfassung Nr.84420, (1982).

Die Zusammenfassung CA 107,21323Ev, die sich auf einen Artikel von M. MIKI und Mitarbeitern, Arch. Biochem. Biophys., 258 (Nr.2), Seite 373-380 (1987) bezieht, beschreibt, daß das Alpha-Tocopherol die roten Blutkörperchen von Ratten gegenüber der von dun freien Radikalen eingeleiteten Auflösung schützt.

Nach der vorher erwähnten Zusammenfassung CA 100,99345J, die sich auf einen Artikel von E. B. SPEKTOR und Mitarbeitern, Lab. DeIo (Nr. 1), Seite 26-28 (1984) bezieht, wird die Bewertung der gesamten oxydationshemmenden Aktivität einer Probe (Blutplasma oder Rückenmarksflüssigkeit) durch eine Absorption bei 532nm nach Induktion freier Radikale in einem Zellmateriul (im speziellen Fall: Membrane von Erythrozyten) mit Hilfe einer UV-Lampe ermittelt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens zur Bestimmung der oxydationshemmenden Eigenschaften eines lebenden Organismus oder eines potentiell aggressiven Agens.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, dem Zellmaterial geeignete freie Radikale in neuartiger Weise zuzusetzen. Erfindungsgemäß wird eine neue technische Lösung empfohlen, nach der (i) die freien Radikale nicht im genannten Zellmaterial erzeugt werden, so.idei,, von einem Initiator von freien Radikalen stammen, der dem gerannten Zellmaterial zugesetzt wird, und (ii) nach der das Zellmatei ial vorher mit einem potentiell aggressiven Agens kontaminiert wurde.

Erfindungsgemäß wird ein neues Verfahren zur Bestimmung oder Bewertung der oxydationshemmenden Aktivitäten eines lebenden Organismus oder eines potentiell aggressiven Agens vorgeschlagen, wobei das genannte Verfahren, welches die Verwendung freier Radikale als Mittel zur Einleitung der Zellauflösung beinhaltet, dadurch gekennzeichnet, daß

1. in geeignetem flüssigem, biologischem Medium ein Erzeuger von freien Radikalen und ein Zellmaterial (I) zusammengebracht werden, welches ausgewählt wurde aus dem Komplex aus

a) menschlichen, tierischen und pflanzlichen Zellen,

b) Fragmenten der genannten Zellen, und

c) synthetischen Wänden und ihren Liposome enthaltenden Fragmenten,

wobei das genannte Zellmaterial vorher durch ein potentiell aggressives Agens (II) kontaminiert wurde;

2. das Freisetzen der freien Radikale ausgehend vom genannten Erzeuger freier Radikale eingeleitet wird, und

3. die Auflösung des Zellmaterials durch die freien Radikale in bezug auf eine Kontrollprobe, die das genannte nicht kontaminierte Zellniaterial enthält, bewertet wird.

Nach diesem Verfahren wird der oxydative Zustand des Zellmateria!? I oder der Einfluß des Agens Il auf das genannte Material I bestimmt.

Die Bewertung der Auflösung des Zellmaterials kann insbesondere auf „kinetische" Art und Weise (durch regelmäßige Messung an Probeentnahmen [mit konstantem Volumen) von flüssigem Versuchsmedium, das den Erzeuger freier Radikale, das Zellmaterial und möglicherweise das zu prüfende Agens Il enthält) bzw. auf „nicht-kinetische" Art und Weise erfolgen (durch Messung vom Dosis-Wirkungstyp an Proben aus dem flüssigen Versuchsmedium, welches das Zellmaterial, gegebenenfalls in Verbindung mit dem zu testenden Agens II, sowie wachsende aliquote Mengen des Erzeugers von freien Radikalen enthält). Im Rahmen der kinetischen Bewertung wird die Resistenz des Zellmaterials I gegenüber freien Radikalen durch die einer 50%igen Auflösung des genannten Zellmaterials entsprechende Zeit ausgedrückt.

Irn Rahmen der Dos's-Wirkungs-Bewertung wird die Widerstandsfähigkeit des Zellmaterials gegen freie Radikale durch die Konzentration des Erzeugers freier Radikale ausgedrückt, die eine 50%ige Auflösung des genannten Zellmaterials einleiten. Unter den erfindungsgemäß geeigneten Erzeugern von freien Radikalen können insbesondere die Produkte genannt werden, die die freien Radikale freisetzen und die häufig auf dem Gebiet der Polymerisation zum Erhalt von Makromolekülen verwendet werden. Unter diesen Produkten können insbesondere die Erzeuger von oxydierenden freien Radikalen aufgeführt werden, wie z. B. das Benzoylperoxid, die Alkyl-perbenzoate in C₁-C₈, vorzugsweise C₃-C₄ (vor allem n-Butyl-perbenzoate, t-Butylperbenzoate, i-Propyl-perbonzoate und n-Propyl-perbenzoate), die Dialkyl-peroxydicarbonate oder die Alkylgruppen, die 1 bis 8 Kohlenstoftatome enthalten, vorzugsweise 3 bis 4 Kohlenstoffatome (vor allem das Diisopropyl-peroxydicarbonat), das Cumen-hydroxyperoxid, das Azo-bis(isobutyronitril), das 2,2'-Azo-bis(2,4-dimethylvaleronitril), das 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan) und ihre möglichen Additionssalze, wie z. B. die Chlorhydrate und ihre Analoga. Unter den Erzeugern von oxydationsfördernden freien Radikalen werden diejenigen bevorzugt, die eine Kinetik bzw. Reaktionsgeschwindigkeit der Ordnung 0 (das Freisetzen der freien Radikalen ist zeitlich konstant) oder besser der Ordnung 1 aufweisen (das Freisetzen der freien Radikalen ist zeitlich linear). Die erfindungsgemäß bevorzugten Erzeuger von oxydationsfördernden freien Radikalen sind einerseits das 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)-dichlorhydrat, welches in wäßrigem Medium eine Kinetik der Ordnung 1 aufweist und andererseits das 2,2'-Azo-bis(2,4-dimethylvaleronitril), welches in öligflüssigem oder organischem Medium eine Kinetik der Ordnung 1 aufweist. Das Freisetzen der freien Radikale ausgehend von einem Erzeuger von freien Radikalen erfolgt nach einer an sich bekannten Methode, z. B. durch Wärme, Licht (insbesondere das Licht des sichtbaren Spektrums oder die UV-Strahlen), Protonen, Elektronen, Röntgenstrahlen; vorzugsweise wird dieses Freisetzen durch Photonen oder Wärme geleitet. Zum Beispiel reicht die Tatsache, das 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)-dichlorhydrat in wäßriger Lösung auf die Temperatur von 37⁰C zu bringen, um das Freisetzen von oxydationsfördernden freien Radikalen nach der Reaktion

Cl^-H₂N⁺ CH₃ CH₃ ⁺NH₂C1" Cl^-H₃N⁺ CH₃

C-C-N=N- C-C 2 C-C ♦ + N₂

/I 1 \ Δ ^/ \

H₀N CH₀ CH, NH₅, H₀N CH,

... c. dot: c- ο

auszulosen.

Das erfindungsgemäße Zellmaterial I umfaßt Zellen menschlichen, tierischen, pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs bzw. Fragments der genannten Zellen, wie zum Beispiel die Zellwände.

Vorzugsweise wird ein Material I verwendet, welches einen gefärbten oder fluoreszierenden Marker enthält, der unter Einwirkung der freien Radikale freigesetzt wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Zellmaterial I wird vor allem auf pigmentierte lebende Zellen menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs zurückgegriffen, d. h., daß sie ein Pigment oder einen Farbstoff, wie zum Beispiel Hämoglobin, Chlorophyll, Xanthophyll, Karotin oder Anthocyane enthalten, deren Freisetzung bei der Zellauflösung vor allem durch Messen der Schwankung der optischen Dichte mit Hilfe eines Spektrophotometers nachweisbar ist. Die empfohlenen lebenden Zellen stammen von Erythrozyten tierischen Ursprungs, wobei die roten Blutkörperchen vorzugsweise Warmblütern wie den Säugetieren und vor allem dem Menschen entnommen werden. Die Auswahl der roten Blutkörperchen beruht auf den folgenden Kriterien:

- die Blutzellen, wie z. B. die Erythrozyten, haben eine relativ kurze Halbwertszeit (80 Tage bei roten Blutkörperchen menschlichen Ursprungs);

- die Erythrozyten besitzen die ganze molekulare und enzymatische Ausstattung zum Schutz gegen Radikale und werden aus diesem Grunde als typische Vertreter der anderen Zellen des Organismus betrachtet; und

- die Zugänglichkeit und große Verfügbarkeit der roten Blutkörperchen, vor allem durch einfache Blutentnahme von einigen Millilitern.

Werden die von ihrem Plasma getrennten roten Blutkörperchen einem Angriff oxydierender Art mit freien Radikalen ausgesetzt, setzen dio Erythrozyten ihre gesamte enzymatische und molekulare Ausstattung ein, um diesem Angriff zu widerstehen, bis die Zellmembran oder -wand soweit veränderi ist, daß der ZelHnhalt entweicht. Im Fall der roten Blutkörperchen kann dieses Freisetzen des genannten Inhalts durch Spektrophotometrie leicht bestimmt werden, indem die in das biologische Medium übergehende Hämoglobinmenge gemessen wird. Die Abwehr der getesteten Erythrozytenpopulation wird entweder durch die Zeit für die Freisetzung von 50% p/p des in den Blutkörperchen enthaltenen Hämoglobins gemessen (kinetische Bewertung) oder durch die Konzentration des Erzeugers freier Radikale (CHeos), die die 50%ige Hämolyse hervorrufen (Bewertung vom Dosis-Wirkungstyp).

Das Zellmaterial kann ebenfalls aus Zellwänden bzw. Fragmenten von Zellwänden, vorzugsweise pigmentierter Zellen bestehen. Die am besten geeigneten Wände sind diejenigen, die eine ausreichend große Menge an Pigmenten bzw. Farbstoffen enthalten, die bei der Auflösung durch die freien Radikale freigesetzt werden können.

Das Zellmaterial kann ebenfalls aus einer synthetischen Zellwand bestehen. Bei den synthetischen Zellwänden werden die Substanzen bevorzugt, die Liposome enthalten, in denen ein Mittel zur Farbmarkierung eingehüllt, fixiert oder immobilisiert ist, welches bei der Auflösung durch die freien Radikale freigesetzt werden kann. Die Liposome und solche farbige Marker enthaltenden Membransubstanzen sind besonders vorteilhaft, da es so vermieden werden kann, für die Kontrollversuche gesunde menschliche, tierische oder pflanzliche Versuchsobjekte zu suchen und sie so eine bessere Standardisierung des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens gewährleisten.

Erfindungsgemäß soll das bevorzugt zu verwendende Zellmaterial aus roten Blutkörperchen bestehen, besser noch aus Liposomen, die einen Farbmarker verdeckt enthalten, fixieren oder immobilisieren, der im Verlauf der Auflösung durch die freien Radikale freigesetzt werden kann. Die getestete Resistenz gegen die freien Radikale wird dann entweder durch die Zeit bis zur 50%igen Auflösung, d. h. die Zeit zur Freisetzung von 50% p/p des Farbmarkers (kinetische Messung), oder durch die Konzentration des Erzeugers freier Radikale, die eine 50%ige Auflösung induzieren (Messung Dosis-Wirkung) ausgedrückt. Unter einem von einem potentiell aggressiven Agens Il kontaminierten Zellmaterial ist ein wie oben definiertes Zellmaterial I zu verstehen, das mindestens 0,5h vor Anwendung des Verfahrens mit dem genannten Agens Il in Kontakt gebracht wurde oder welches mindestens 0,5h vor dem Beginn des Verfahrens der Erfindung der Wirkung des genannten Agens Il ausgesetzt worden ist.

Das Zusammenbringen des genannten Zellmaterials I mit dem genannten Agens Il kann in der Einführung des Agens Il in den lebenden Organismus und dann in der Wiedergewinnung der pigmentierten, durch dieses A^ens Il kontaminierten Zellen bestehen, um das erfindungsgemäße Verfahren anzuwenden. Ein Kontakt kann ebenfalls hergestellt werden, das in dem Agens Il in die Zellen des Materials I nach einem an sich bekannten Verfahren entweder durch Injektion (nach einer der In-vitro-Befruchtung ähnlichen Technologie) oder durch Osmose eingebracht wird.

Das potentiell aggressive Agens Il kann physikalischer Natur (Bestrahlung mit Röntgenstrahlen, beta-Strahlen, Protonen usw.) oder chemischer Natur (zu testende Substanzen, Vergleichssubstanzen, Metaboliten usw.), aber auch physikalisch-chemischer Natur (Tabakrauch, der vor allem die Emission freier Radikale durch Pyrolyse impliziert) sein.

Das biologische Versuchsmilieu, das ein wässerig-flüssiges Medium bzw. ein organisch-flüssiges Medium ist, enthält das Zellmaterial I, welches vorher durch das Agens Il kontaminiert wurde sowie einen Erzeuger freier Radikale und gegebenenfalls einen oder mehrere Zusatzstoffe, die auf dem Gebiet der Zellkulturen und der biologischen Bestimmungen gebräuchlich sind, vor allem ein Konservierungsmittel. Das Agens II, das das genannte flüssige Versuchsmilieu kontaminiert, wird entweder allein und als solches in das genannte biologische Medium, welches das Zellmaterial und den Erzeuger freier Radikale enthält, mindestens 0,5h vor dem Auslösen der Freisetzungsreaktion der freien Radikale eingeführt, oder vorher mit dem genannten Zellmaterial nach Kontaminierung zusammengebracht. Die Kontaminierung kann sich aus der (absichtlichen oder zufälligen) Verabreichung des genannten Agens Ii (oder eines seiner Präkursoren) an den Organismus, den Zellen entnommen werden, oder aus der In-vitro-Absorption des genannten Agens Il durch die Zellmembran ergeben.

Im Fall von lebenden Zellen enthalten die Zellen infolgo der Kontaminierung durch Verabreichung an den Organismus die genannte kontaminierende Substanz oder zumindest einen ihrer Metaboliten in ihrem Zellinhalt und/oder im Bereich ihrer Membrane. Im Fall der Kontaminieiung von lebenden oder synthetischen Zellen durch Absorption ist der größte Teil der kontaminierenden Subtanz in und/oder an der Zellwand fixiert. Die Kontaminierung durch Adsorption erfolgt vorteilhafterweise durch lipophile kontaminierende Substanzen. Die Adsorption im Bereich der Zellwand kann durch Inkubation des Zellmaterials und der kontaminierenden Substanz, die vorher in einem selektiven Lösungsmittel verdünnt wurde, in einem geeigneten Medium und bei geeigneter Temperatur erfolgen; je nach Unkubationsdauer und Konzentration des verwendeten Zellmaterials wird die gesamte kontaminierende Substanz des Inkubationsmediums oder (was häufiger der Fall ist) lediglich ein Teil dieser Substanz durch Adsorption in den natürlichen oder synthetischen Zellwänden fixiert.

Ist das Mittel Il eine chemische Substanz, kann letztere eine beliebige zu testende Substanz sein. Es kann sich vor allem um eine oxydierende Substanz, um eine oxydationsnemmende Substanz, um eine Zusammensetzung oder Kombination von Produkten oder um einen Metaboliten handeln. Von den Substanzen, die getestet und/oder bestimmt werden können, sind die Pigmente (vor allem die Flavonoide), die Proteine, die Enzyme, die Peptide, die Aminosäuren, die Antikörper und die Antigene sowie ganz allgemein alle Produkte zu nennen, auf deren Grundlage Antikörper hergestellt werden können. Bei den Substanzen, die getestet und/oder bestimmt werden können, sind insbesondere die Produkte oder Mittel anzuführen, die im Organismus und/oder in den Zellen wirksam werden.

Zur Anwendung des erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahrens wird das isolierte und gewaschene Zellmaterial in einem flüssigen, biologischen, vorzugsweise isotonischen Milieu in Suspension gebracht. Es wird bei einer Temperatur in der Größenordnung von 10 bis 60°C, vorzugsweise bei 15 bis 4O⁰C und noch besser bei einer Temperatur von 37°C in Anwesenheit eines Erzeugers von freien Radikalen bei einer Konzentration vcn 10 bis 20% p/v Zellmaterial inkubiert. Die beste Art des Einsatzes des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, entweder ein aus roten Blutkörperchen bestehendes Zellmaterial oder Fragmente synthetischer Zollwand, die Liposome enthalten, und einen freisetzbaren Farbmarker in einem physiologischen, isotonischen Serum, das gegebenenfalls gepuffert wurde, in Suspension zu bringen und bei 37⁰C in Anwesenheit von 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrat mit einer Konzentration von 10OnM für ein endgültiges Volumen von 2 ml (vorzugsweise) wäßrig-flüssigem, biologischem Medium oder von 2,2'-Azo-bis(2,4-dimethylvaleronitril) in den gleichen Proportionen für ein organisches, biologisches, flüssiges Medium zu inkubieren. Die Freisetzung der freien Radikale, ausgehend vom Erzeuger freier Radikale, wird vorzugsweise durch Photonen und besser durch einen Wärmeschock (im Sonderfall eine Erwärmung auf 37⁰C) initiiert. In regelmäßigen Zeitabständen (zum Beispiel alle 20 Minuten) erfolgen Probenentnahmen (0,02 ml), so lange, bis der Zellrückstand verschwunden ist (das entspricht im allgemeinen einer Dauer von 150 bis 600 Minuten, und insbesondere 200 bis 300 Minuten); jede Probe wird mit Hilfe von 1 ml physiologischem Serum verdünnt und zentrifugiert (z.B. 10-60 Sekunden bei 3000-900Og, vorzugsweise bei 3000-600Og [ein zu starkes Zentrifugieren, insbesondere bei über 9000g kann die Messung stören, indem eine mechanische Lyse induziert wird)); ein ohne Rest aufgehender Teil (0,2 ml) des so gewonnenen Überstands wird dann in die Vertiefungen einer Mikrotestplatte oder einer Gruppe von Mikroküvetten zum Ablesen der optischen Dichte durch Spektrophotometrie gegeben (insbesondere bei 350-600nm, unabhängig von der Herkunft der pigmentierten Zellen oder der synthetischen Wände und insbesondere bei 405-410 und 540 nm, wenn das Zellmaterial aus roten Blutkörperchen besteht).

In der Praxis werden die Ergebnisse der Schwankungen der optischen Dichte in % im Verhältnis zur maximalen Auflösung des Zellmaterials (100%) ausgedrückt. Eine an den experimentellen Punkten ausgerichtete theoretische Kurve ermöglicht es, insbesondere die einer 50%igen Auflösung entsprechende Zeit zu erhalten (diese Zeit ist um so langer, je besser die roten Blutkörperchen oder die synthetischen Wände dem oxydativen Streß in vitro, der unter den vorher genannten Bedingungen geführt wurde, standhalten), weiterhin die Neigung der Sigmoiden des Peaks sowie die (durch die Tangente des Wendepunktes der genannten Sigmoiden bestimmte) Latenzzeit.

Die oben beschriebene kinetische Bewertung kann durch eine Bewertung vom Dosis-Wirkungstyp ersetzt werden. Das erfindungsgemäße Bestimmungsverfahren ist sehr einfach anzuwenden und kann in Form eines Sets, einer Tasche oder eines Bestimmungsbaukastensets entweder zu Diagnosezwecken oder für „Screening"-Untersuchungen verschiedener Moleküle und ihrer Metaboliten, vor allem einerseits der Moleküle, die eine oxydierende oder oxydationshemmende Aktivität haben und andererseits der Moleküle mit einer Langzeitwirkung, in den Handel kommen. Das Bestimmungsverfahren kann ebenfalls an menschlichem oder tierischem Plasma ausgeführt werden, um den Einfluß der genannten Moleküle auf das genannte Plasma, das dann bei solchen Bestimmungen das Agens Il darstellt, zu bewerten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders interessant für (i) die Bestimmung der Anti-Malaria-Agenzien, die im allgemeinen Substanz sind, die die Resistenz der Erythrozyten und der Liposome gegenüber den freien Radikalen herabsetzen, (ii) für die Diabetes-Diagnose, sobald Krankheit im Organismus eine hypo-oxydative Wirkung hervorruft, und um (iii) den Einfluß von Nahrungsmitteln oder Lebensmittelzusatzstoffen, insbesondere der Farbstoffe auf den Organismen, zu bewerten.

Dieses Bestimmungsverfahren weist den Vorteil auf, daß es in sehr kurzen Zeiträumen, vorzugsweise in 5 Stunden oder schneller, durchgeführt werden kann.

Bei der Verwendung von Liposomen als erfindungsgemäßes Zellmaterial werden die folgenden Liposompräparate vorgeschlagen.

Präparat A:

Partikel, die eine Kombination von Liposomen, ein farbiges oder fluoreszierendes Mittel zur Markierung, welches unter der Einwirkung der freien Radkaie freigesetzt wird, und ein Bindemittel enthalten, welches die Kohäsion eines jeden Partikels gewährleistet.

Präparat B:

Liposomen-Matrix, die aus einer Kombination von Liposomen, einem farbigen oder fluoreszierenden Mittel zur Markierung, welches unter der Wirkung der freien Radikale freigesetzt werden kann, und aus einem Bindemittel besteht, das die Kohäsion der Matrix gewährleistet.

PrSparat C:

Inertes Substrat, an das adhäsiv eine Liposomschicht gebunden ist, die die Matrix entsprechend dem obengenannten Präparat B darstellt.

PrSparat D:

Inertes Substrat, das an mindestens einer seiner Flächen mindestens einen Bereich umfaßt, der mit einem farbigen oder fluoreszierenden Mittel zur Markierung überzogen ist, welches unter der Einwirkung der freien Radikale freigesetzt werden kann, wobei die genannte Fläche und die genannte Zone mit einer Schicht überzogen sind, die aus einer Mischung aus Liposomen und Dindemittel besteht, das die Kohäsion an genannter Schicht gewährleistet; hier maskiert die Liposomenschicht die mit dem farbigen oder fluoreszierenden Marker bedeckte Zone.

PrSparat E:

Inertes poröses Substrat, das ein farbiges oder fluoreszierendes Mittel zur Markierung enthält, das unter der Einwirkung der freien Radikale freigesetzt wird und das durch Tränken zugeführt wurde, wobei das genannte Substrat mit einer Liposomenschicht überzogen ist, die gleich derjenigen aus Präparat D ist, welche den genannten Marker maskiert.

PrSparat F:

Liposomenmatrix entsprechend Präparat D, die durch einen chromogenen Marker, der aof dem Gebiet der chromogenen peptidischen Substrate bekannt ist (siehe EP-A-0280610) an der Oberfläche sensibilisiert wurde; unter Einwirkung der freien Radikale werden Fragmente oder Trümmer von Liposomen, die den genannten Marker enthalten, von der Matrix getrennt, diese Fragmente oder Trümmer der Matrix isoliert und durch Filtern oder Zentrifugieren aufgefangen, dann werden die genannten Fragmente oder Trümmer in einem geeigneten, biologischen Milieu wieder in Suspension gebracht, um nach ainem bekannten Verfahren die Färbung zu entwickeln (siehe obengenanntes Dokument EP-A-0280610).

In den obengenannten Präparaten D-E wird das farbige oder fluoreszierende Mittel zur Markierung, welches unter Einwirkung der freien Radikale freigesetzt werden kann, physikalisch durch die Liposomenmatrix maskiert, deren Dicke relativ gering sein muß, um bei Einwirkung der freien Radikale leicht Zugang zu dem genannten Marker zu haben. Bei den Präparaten A-C kann es sich entweder um eine rein physikalische Maskierung des farbigen oder fluoreszierenden Agens zur Markierung handeln, welches unter Einwirkung der freien Radikale freigesetzt werden kann, oder um eine Verbindung des genannten Markers mit den stärker verarbeiteten Liposomen, wie zum Beispiel Fixierung, Immobilisierung oder Sequestration.

Schließlich wird eine Tasche, ein Kit oder ein Set zur Bestimmung empfohlen, die das erfindungsgemäße Zellmaterial (i) und gegebenenfalls den Erzeuger freier Radikale und/oder die flüssigen biologischen Verdünnungsmedien enthalten.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an einigen Beispielen näher erläutert.

Beim Lesen der folgenden Ausführungsbeispiele werden weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung deutlich. Alle diese Elemente sind keineswegs einschrän end, sondern sie werden als Beispiele zur Veranschaulichung angeführt. Die Beispiele 1-9 betreffen die kinetischen Bestimmu igen und die Beispiele 10-15 Bestimmungen vom Dosis-Wirkungstyp.

Beispiel 1

Um das erfindungsgemäße Verfahren zu quantifizieren, wurde dor Einfluß der Konzentration des 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrats auf die roten Blutkörperchen von Ratten untersucht.

Nach Entnahme und Waschen werden die Rattenerythrozyten in isotonischem physiologischem Serum (Hämatrocrit 15% p/v) suspendiert. Diese roten Blutkörperchen werden mit dem 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrat in Dosen von OmM (Kontrolle), 25mM, 5OmM und 10OmM in Kontakt gebracht, wobei das endgültige Volumen des wäßrig-flüsäigen biologischen Mediums 2 ml beträgt. Die Freisetzung der freien Radikale wird durch Wärme eingeleitet, indem das Reaktionsmedium auf 37⁰C erwärmt wird. Während 200 bis 240 Minuten erfolgen alle 20 Minuten lang Entnahmen von 0,02 ml, wobei jede Probe in 1 ml physiologischem Serum verdünnt und zentrifugiert wird (15 Sekunden; 4000g). Ein ohne Rest aufgehender Teil (0,2 ml) des

Überstands wird dann zum Ablesen der optischen Dichte (insbesondere bei 540 nm) durch Spektrometrie in die Vertiefungen einer Mikrotestplatte übertragen.

Die in Fig. 1 aufgeführten Ergebnisse werden durch die Zeit {in Minuten) ausgedrückt, die einer 50%igen Hämolyse (t_M%) entspricht. Die Kurve (a) bezieht sich auf die Konzentration von 10OmM 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan!dichlorhydrat und gibt einen Wert t_MS = 158 Minuten an; die Kurve (b) bezieht sich auf die Konzentration von 5OmM 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrat und gibt einen Wert t_Ws = 176 Minuten an; die Kurve (c) bezieht sich auf die Konzentration von 25mM 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrat und gibt einen Wert t_M% = 214 Minuten an, und die Kurve (d) bezieht sich auf den Kontrollversuch bei Abwesenheit von 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrat.

Die Ergebnisse der Figur 1 veranschaulichen das Dosis-Wirkungö-Verhältnis bei der Zellauflösung in bezug auf das freie Radikale erzeugende Molekül.

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft die Wirkung eines oxydationshemmenden Agens im Sonderfall der Ascorbinsäure.

Es wird entsprechend der in obengenanntem Beispiel 1 beschriebenen Versuchsbedingungen vorgegangen, indem ein wässerig-flüssiges, biologisches Medium, (physiologisches Serum) verwendet wird, welches Rattenerythrozyten, 10OmM 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrat und 0 (Fehlen des oxydationshemmenden Agens) bzw. 0,1 mM Ascorbinsäure enthält, wobei die Freisetzung der freien Radikale 0,5 h nach dem Zusammenbringen der Ascorbinsäure mit den roten Blutkörperchen und dem Erzeuger freier Radikale initiiert wird.

Die in Fig. 2 aufgeführten Ergebnisse zeigen, daß bei Fohlen der Ascorbinsäure (Kurve [a]) der Wert t_M% gleich 158 Minuten ist und daß in Gegenwart von 0,1 mM Ascorbinsäure (Kurve (b)) der Wert t_M% gleich 244 Minuten ist. Anders ausgedrückt: Das Vorhandensein eines Antioxydans, wie z. B. der Ascorbinsäure, verzögert die Zellauflösung, die durch die freien Radikale hervorgerufen wird.

Beispiel 3

Dieses Beispiel betrifft die Wirkung eines oxvdationshemmenden Agens, das in der Membrane von den Rattenerythrozyten aufgenommen wurde, nämlich des Butylhydroxytoluen [abgekürzt: BHT; systematische Nomenklatur: 2,6-Di-(1,1-dimethylethyl)-4-methylphenoll.

Es wird entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Versuchsbedingungen verfahren, wobei rote Blutkörperchen gesunder Ratten (Kontrolle) Erythrozyten, die vorher bei 37 ⁰C 0,5h lang in Anwesenheit von BHT und seines Lösungsmittels, dem Ethanol (zur Absorption des BHT in der Zellmembran der Blutkörperchen), vorinkubiort werden, verwendet werden, die dann wieder suspendiert werden, um die Bestimmung durchzuführen. Die so behandelten roten Blutkörperchen werden in das physiologische Serum aus Beispiel 1 eingebracht und mit 10OmM 2,2'-Azo-bis(amidinopropan)dichlorhydrat zusammengebracht und das dadurch anstehende Reaktionsmedium wird dann auf 37°C erwärmt.

Die Ergebnisse sind in Fig. 3 aufgeführt, uie Kontrollkurve (a) ergibt einen Wert t_M% gleich 163 Minuten. Die Kurve (b), die sich auf die Erythrozyten gesunder Ratten bezieht, die vorher mit dem Lösungsmittel des BHT, dem Ethanol, bei einer Konzentration von 0.5% p/v 0,5h lang bei 37⁰C vorinkubiert wurden, ergibt einen Wert t«>% gleich 107 Minuten. Die Kurve (c), die sich auf die gleichen roten Blutkörperchen wie die Kurve (b) bezieht, die jedoch unter den gleichen Bedingungen mit BHT und Ethanol vorkinkubiert wurden (das Versuchsmedium enthält 0,03mM BHT und 0,5% p/v Ethanol), ergibi einen Wert t_so?i gleich 193 Minuten. Der Vergleich der Kurve (c) mit den Kurven (a) und (b) veranschaulicht den Schutz, den das BHT gegenüber der Zellauflösung verleiht. Anders ausgedrückt: das hier verwendete oxydationshemmende Agens bewirkt eine zeitliche Verzögerung der von den freien Radikalen hervorgerufenen Zellauflösung.

Beispiel 4

Dieses Beispiel bezieht sich auf den Vergleich von Erythrozyten, die von zwei unterschiedlichen Versuchsobjekten stammen.

Diese roten Blutkörperchen werden nach Trennen und Waschen in der gleichen Konzentration wieder in Suspension gebracht, um der Wirkung der freien Radikale ausgesetzt zu werden, die von einem Erzeuger freier Radikale stammen, der im besonderen Fall 10OmM 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrat ist.

Die Ergebnisse werden in Figur 4 aufgeführt. Die Kurve (a) stellt den HämolyseprozentsaU von Blutkörperchen eines erwachsenen Rauchers dar und ergibt einen Wert t_M% gleich 84,4 Minuten. Die Kurve (b) stelle den Hämolyseprozentsatz eines erwachsenen Nichtrauchers dar und ergibt einen Wert t_60% gleich 93,3 Minuten. Der Vergleich der Kurven (a) und (b) zeigt, daß beim Raucher die normale Abwehr gegenüber dem Angriff durch freie Radikale im Vergleich zu nichtrauchenden Versuchspersonen herabgesetzt ist.

Beispiel 5

Dieses Beispiel bezieht sich auf die Verwendung von pflanzlichen Zellen, um den Einfluß einer Bestrahlung auf den oxydativen Zustand zu bewerten.

Kamillenzellen wurden in zwei Lose eingeteilt, eines der Lose wird einer Bestrahlung mit einer radioaktiven Quelle von 3,7 χ 10^eBq (100 Mikrocurie) ausgesetzt, dann werden das bestrahlte und das nichtbestrahlte Los 7 Monate lang in inerter Atmosphäre (Stickstoff oder Argon) aufbewahrt. Danach werden die Zellen der beiden Lose in wässerig-flüssigem, biologischem Medium suspendiert und dann mit einem Erzeuger freier Radikale, dem 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrat 0,5h lang bei 15⁰C in Berührung gebracht. Das Freisetzen der freien Radikale wird durch Erwärmung auf 37-4O⁰C initiiert, dann werden entsprechend den Bedingungen aus Beispiel 1 die Entnahmen und Analysen vorgenommen. Die kinetische Untersuchung der Auflösung des Zellmaterials zeigt, daß die vorher bestrahlten Zellen eine niedrigere Abwehr gegen die freien Radikale aufweisen als die nichtbestrahlten Zellen. Die entsprechenden Kurven ähneln denen aus Figur 3 (wobei die Kinetik der Auflösung der bestrahlten Zellen bzw. die der nichtbestrahlten Zeller, annähernd den Verlauf der Kurven a bzw. b oder c der genannten Figur 3 aufweist).

Beispiele

Es wird ein Los von Kamillensamenkörnern mit einer radioaktiven Quelle von 3,7 χ 10⁶Bq bestrahlt, und dieses Los wird ebenso wie ein nichtbestrahltes Los 8 Monate lang in inerter Atmosphäre gelagert. Dann werden die bestrahlten 'ind nichtbestrahlten Samenkörner gemahlen, und die entstandenen zerkleinerten Teilchen werden 1 h lang bei 15°C mit den in tinem physiologischen Serum in Suspension befindlichen Rattenerythrozyten in Kontakt gebracht. Danach wird der Erzeuger freier Radikale, das 2,2'-Azo-bis(2-amidinopiopan)dichlorhydrat eingeführt und wie in Beispiel 1 angegeben verfahren. Die Untersuchung der Kinetik der Auflösung der Blutkörperchen in Anwesenheit von zerkleinerten Teilchen von bestrahlten bzw. nichtbestrahlten Kamillensamenkörnern ergibt Kurven, die annähernd den Kurven a bzw. b oder c der Figur 3 ähneln.

Daraus geht hervor, daß das enzymatische Molekülmaterial der Samenkörner durch die Strahlung verändert und im besonderen Fall teilweise zerstört wurJe.

Dieses Beispiel 6 und obengenanntes Beispiel 5 veranschaulichen, daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren die Qualität von Nahrungsmitteln tierischen und/oder pflanzlichen Ursprungs bewertet werden kann, um zu ermitteln, ob das zu prüfende Nahrungsmittel vor seinem Verbrauch einen mehr oder weniger starken Abbau erfahren hat rder nicht.

Beispiel 7

Es wird wie in Beispiel 3 angegeben verfahren, wobei das BHT durch Phenothiazin ersetzt wird. Es ist festzustellen, daß das Phenothiazin in dem Sinne eine unerwartete oxydationshemmende Wirkung hat, daß es die durch die freien Radikale eingeleitete Auflösung der roten Blutkörperchen verzögert.

Beispiele

Es wird wie in Beispiel 7 angegeben vorgegangen, wobei die Erythrozyten durch ein synthetisches Zellmaterial ersetzt werden, das Liposom entsprechend dem obengenannten Präparat C enthält. Es ist wie in Beispiel 7 die oxydationshemmende Wirkung des Phenothiazin zu beobachten,

Beispiel 9

Es wird durch Extraktion von getrockneten Blähern mit Wasser, das vorher zum Kochen gebracht wurde, und Lyophilisierung des entstehenden Filtrates ein Tee-Lyophilisat bereitet, wobei ein Los vor der Lyophilisierung einer ionisierenden Bestrahlung (5OkGy) ausgesetzt wird und das Kontrollos nicht bestrahlt wird. Dann werden beide Lose 9 Monate im Vakuum aufbewahrt.

Nun wird wie in Beispiel 3 verfahren, wobei das BHT durch das bestrahlte Teelos oder das nichtbestrahlte Vergleichslos ersetzt wird. Es ist festzusxsllen, daß das bestrahlte Los eine geringere Abwehr gegenüber den freien Radikalen aufweist als das Kontrollos.

Beispiel 10-15

Die folgenden Beispiele 10-15 veranschaulichen die Messung der Antiradikalaktivität unter den Bedingungen der Bestimmung nach dem Dosis-Wirkungsprinzip.

Wachsende aliquote Mengen (20 bis 3OmM) vom Erzeuger freier Radikalo [2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrat], der in einem wässerigen Medium (Wasser oder physiologischos Serum) gelöst ist, werden in Reagenzgläser gegeben und dann lyophilisiert. Nach der Resolubilisierung der genannten Mengen an Erzeuger freier Radikale in einem konstanten Volumen physiologischen Versuchsserums, das gegebenenfalls eine zu untersuchende Substanz enthält, wird in konstanter Menge das erfindungsgemäße Zellmaterial zugesetzt.

Die entsprechenden Versuchsmedien werden ober einen festgesetzten Zeitraum hinweg (2,5 h) bei 37 ⁰C inkubiert. Dann wird die Wirkung der freien Radikale durch die Zellüuflösung bewertet.

In Beispiel 10 wurde mit roien Blutkörperchen gesunder Ratten gearbeitet und festgestellt, daß die Konzentration an den Erzeuger freier Radikale (CH_MS), die die 50%ige Auflösung der roten Blutkörperchen bewirkten, 108,0 ± 20mM/l betrug.

In Beispiel 11 wurde mit den gleichen roten Blutkörperchen gesunder Ratten gearbeitet, die auch in Beispiel 10 verwendet wurden, wobei das Versuchsmedium außerdem 1OmM Mannitol enthielt. Es ist festzustellen, daß das CH₆Ov 155,6 + 6,1 mM/l beträgt, was die oxydationshemmende Wirkung des Mannitols in bezug auf das CH₆₀S aus Beispiel 10 bestätigt.

In Beispiel 12 wurde mit den gleichen roten Blutkörperchen gesunder Ratten gearbeitet, die auch in Beispiel 10 verwendet wurden, wobei das Versuchsmedium außerdem ein Oxydationsmittel, das bis(Dimethylanid) der Azo-dicarboxylsäure (es handelt sich um eine oxydierende Verbindung der Thiole) in einer Dosis von 25OmM enthielt. Es ist festzustellen, daß das genannte ρ oxydierende Mittel die roten Blutkörperchen für die Wirkung der freien Radikale empfänglicher macht, um das Erythrozyten-Glutathion zu verringern, wobei das CH₆Os auf einen Wert von 60,8 ± 8,1 mM/l herabgesetzt wird (im Vergleich zu dem Wert aus Beispiel 10).

In den Beispielen 13-15 wurden ähnliche Ergebnisse wie die der Beispiele 10-12 erhalten, wobei die roten Blutkörperchen durch ein synthetisches Zellmaterial ersetzt wurden, das Liposome entsprechend dem obengenannten Präparat C enthält.

Claims (11)

1.3 die Zellauflösung durch die freien Radikale in bezug auf eine das genannte, nicht kontaminierte Zellmatenal enthaltende Kontrollprobe bewertet wird.

1.2 die Freisetzung der freien Radikale ausgehend von dem Erzeuger freier Radikale induziert wird, und

1.1 in einem geeigneten, flüssigen, biologischen Medium ein Erzeuger freier Radikale und ein Zellmaterial zusammengebracht werden, das aus dem Komplex von

a) menschlichen, tierischen und pflanzlichen Zellen

b) Fragmenten der genannten Zellen und

c) synthetischen Wänden und deren Liposome enthaltenden Fragmenten

ausgewählt wurde, wobei das genannte Zellmaterial vorher uurch ein potentiell aggressives Agens kontaminiert wurde;

1. Verfahren zur Bestimmung oder Bewertung der oxydationshemmenden Aktivitäten eines lebenden Organismus oder eines potentiell aggressiven Agens, wobei das genannte Verfahren, welches die Verwendung von freien Radikalen als Mittel zur Induktion der Zeliauflösung umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellmaterial aus dem von pigmentierten Zellen menschlichen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs gebildeten Komplex ausgewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die genannten pigmentierten Zellen Erythrozyten menschlichen odei tierischen Ursprungs sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellmaterial ein Fragment von synthetischen Zellwänden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Zellmaterial ein Lipobomenmaterial ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Erzeuger freier Radikale aus dem Komplex ausgewählt wird, der aus den Produkten besteht, die freie Radikale entsprechend einer Kinetik !er Ordnung 0 bis 1 freisetzen.

7. Vorfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Erzeuger freier Radikale aus dem Komplex ausgewählt wird, der aus den Produkten besteht, die oxydierende freie Radikale freizusetzen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß der genannte Erzeuger freier Radikale das 2,2'-Azo-bis(2-amidinopropan)dichlorhydrat ist.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß 50 bis 20OmM des Erzeugers treier Radikaie mit einem Zeümateria! bei einer Konzentration von 10 bis 20% p/v in wässerigbiologischem Medium zusammengebracht werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 9, dadurch gekennzeichnet, daß die freien Radikale durch Inkubation bei 37°C erzeugt werden.

11. Bestimmungsset, dadurch gekennzeichnet, daß es (i) das Zellmaterial nach Anspruch 1 und gegebenenfalls (ii) den Erzeuger freier Radikale und/oder die flüssigen biologischen Verdünnungsmedien enthält.