DD286597A5 - Verfahren zur herstellung wasserloeslicher makromolekuele mit primaeren aminogruppen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wasserloeslicher Makromolekuele mit primaeren Aminogruppen. Anwendungsgebiete sind unter anderem die Biotechnologie, Biochemie und Medizin. Durch Umsetzung wasserloeslicher, nukleophile Gruppen enthaltender Makromolekuele mit Halogenverbindungen, Schwefelsaeureestern, Salpetersaeureestern oder Sulfonsaeureestern von organischen Verbindungen mit zusaetzlichen, primaeren Aminogruppen im Molekuel werden wasserloesliche Polymere mit primaeren Aminogruppen synthetisiert. Die Reaktionen werden in organischen Loesungsmitteln oder Gemischen organischer Loesungsmittel oder Gemischen organischer Loesungsmittel mit Wasser in Gegenwart eines saeurebindenden Mittels durchgefuehrt. Die Reaktionstemperaturen liegen im Bereich von 20C bis 150C und die Reaktionszeiten bei 1 Stunde bis 10 Stunden.{Verfahren; nukleophile Substitution; wasserloesliche Makromolekuele mit primaeren Aminogruppen; saeurebindende Mittel; organische Loesungsmittel}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung wasserlöslicher Makromoleküle mit primären Aminogruppen. Diese aminogruppenhaltigen Makromoleküle können in der stoffwandelnden Industrie, Biochemie, Pharmazie und Medizin angewendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Ttciinlk

D'o wasserlöslichen Makromolekülo besitzen fur die kovalente Bindung niedermolekularer und hochmolekularer, biologisch aktiver Verbindungen erhebliche Bedeutung sowohl in der Forschung als auch in der Praxis. Niedermolekulare, biologisch aktive Verbindungen wie die Kofaktoren werden dadurch erst in Zweiphasensystemen zur ökonomischen Enzymreinigung einsetzbar, und biologisch aktive Makromoleküle, zum Beispiel verschiedene Enzyme, werden durch eine Modifizierung mit anderen, wasserlöslichen Makromolekülen teilweise erheblich stabilisiert. Diese Vorteile der kovalenten Verbindung wasserlöslicher, vor sllem synthetischer Makromoleküle, mit biologisch aktiven Verbindungen werden tber erst dann umfassend wirksam, wenr. für die Verknüpfungsreaktionen Makromoleküle mit geeigneten, funktionellen Gruppen zur Verfügung stehen. Außer bei den Polyaminosäuren und dem Polyethylenimin enthalten die für den Einsatz in Forschung und Praxis geeigneten, wichtigsten wasserlöslichen und synthetischen Makromoleküle wie die Dextrane, Polyoxyaikylenglykole oder der Polyvinylalkohol aber lediglich die wenig reaktiven Hydroxylgruppen als funktionalisierbaro Gruppen. Die Möglichkeiten der Modifizierung und Aktivierung von Hydroxylgruppen sind zudem noch gegrenzt und häufig werden dezu auch noch giftige Chemikalien verwendet, so daß immer wieder nach neuen Methoden gesucht wird, die Hydroxylgruppen durch andere reaktive, funktioneile Gruppen zu ersetzen, die ein.'ache Verknüpfungsreaktionen unter Ausbildung stabiler Bindungen erlauben. Primäre Aminogruppen sind ebenfalls geeignete, funktioneile Gruppen zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen an Makromoleküle. Im Gegensatz zu unlös'chon Polymeren, bei denen eine Vielzahl von präparativen Methoden zur Einführung von primären Aminogruppen in diese Makromoleküle bekannt sind (Methods Enzymol. 1988,137 [Immobilized Enzymes and Cells), Pt. A and Pt. B) existieren für wasserlösliche, synthetische und hydroxylgruppenhaltige Makromoleküle nur wenige solche Methoden. Nur einige wenige nukleophile Substitutionsreaktionen an aktivierten, wasserlöslichen Makromolekülen werden angewendet, um für weitere Modifizierungs- und Aktivierungsreaktionen geeignete, wasserlösliche Makromoleküle mit primären Aminogruppen zu erhalten. (Makromol. Chem. 1981,182,1379-1384). Andere Synthesowege und andersartig substituierte Derivate wasserlöslicher und synthetischer Makromoleküle wurden zur Synthese von Makromolekülen mit primären Aminogruppen bisher nicht herangezogen.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, durch eine einfache Substitutionsreaktion primäre Aminogruppen aliphatischer oder aromatischer Natur in wasserlösliche, synthetische und hydroxylgruppenhaltige Makromoleküle einzuführen, um reaktive, amlriogruppenhaltlge Makromoleküle zur Immobilisierung von biologisch aktiven Verbindungen zu erhalten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist die Herstellunf wasserlöslicher Makromoleküle mit primären Aminogruppen. Erfindungsgemäß werden hydroxylgruppenhaltige, thiolgruppenhaltige oder primäre beziehungsweise sekundäre Aminogruppen enthaltende, wasserlösliche Makromoleküle in Gegenwert säurebindender Mittel mit Halogenverbindungen, Schwefelsäureester, Salpeteisäureestern oder Sulfonsäureestem organischer Verbindungen mit zusätzlichen primären Aminogruppen in organischen Lösungsmitteln oder Mischungen dieser mit wäßrigen Lösungen oder Gemischen organischer Lösungsmittel bei 20⁰C bis 15O⁰C umgesetzt. Als säurebindende Mittel kommen bevorzugt tertiäre Amine wieTrialkylamineoder Heterocyclen mit endocyclischem, tertiärem Stickstoffatom wie Pyridin oder Imidazol oder Alkalihydroxide, Alkalikarbonate, Alkalialkoholate oder Alkalisalze kondensierter Aromaten und Heteroaromatenzum Beispiel der Naphthalins in Frage, und als Sulfonsäureester werden bevorzugt substituierte Alkyl- oder aromatische Sulfonsäureester eingesetzt. Mit Vorteil arbeitete man bei den Umsetzungen der Makromoleküle mit den reaktiven, funktionellen Gruppen und den aktivierten, organischen Verbindungen mit zusätzlichen, primären Aminogruppen im Molekül in organischen Lösungsmitteln wie Alkoholen, Ketonen, den cyclischen Ethern Tetrahydrofuran beziehungsweise Dioxan, den aprotischen Lösungsmitteln Acetonitril, Dimethylformamid beziehungsweise Dimethylsulfoxid oder Gemischen dieser organischen Lösungsmittel untereinander oder Gemischen dieser organischen Lösungsmittel mit in Wasser nicht löslichen oder mischbaren, organischen Lösungsmittel wie Chloroform, Methylenchlorid, Benzen oder Toluen. In Abhängigkeit vom verwendeten Lösungsmitte! oder Lösungsmittelgemisch liegen die Reaktionszeiten bei den Umsetzungen im Bereich von 1 Stunde bis 10 Stunden. Bei der Verwendung von Lösungsmittelgemischen mit Wasser müssen die längeren Reaktionszeiten gewählt werden.

Die Isolierung der mit primären Aminogruppen - die in Abhängigkeit von den in den nukleophilen Substitutionsreaktionen eingesetzten, niedermolekularen Kopplungsreagentien sowohl aliphatischer als auch aromatischer Natur sein können -modifizierten, wasserlöslichen Makromoleküle erfolgt, nachdem die Reaktionslösungen mit mindestens dem dreifachen Volumen destilliertem Wasser versetzt wurden. Bei den nur in wäßrigen Lösungen löslichen und modifizierten Makromolekülen werden die niedermolekularen Reaktionskomponenten zuerst durch Dialyse und/oder Ultrafiltration entfernt. Anschließend werden aus diesen wäßrigen Lösungen die erfindungsgemäßen, neuen und in Wasser löslichen Makromoleküle mit aliphatischen oder aromatischen, primären Aminogruppen durch Lyophilisierung oder durch Ausfällen mit wassermischbaren, organischen Lösungsmitteln wie niedere Alkohole oder Ketone beziehungsweise Tetrahydrofuran oder Dioxan und anschließender Trocknung der Niederschläge in der Regel bei Zimmertemperatur in fester Form gewonnen. In organischen Lösungsmitteln wie Chloroform, Methylenchlorid, Benzen oderToluen und Wasser lösliche Makromoleküle wie zum Beispiel die Polyoxyalkylenglykole oder ihre Monoalkoxyderivate werden dagegen vorteilhafter zunächst durch Extraktion mit den genannten, organischen Lösungsmittel aus den Reaktionslösungen abgStrennt, aus den eingoengten organischen Lösungsmitteln mit Ether oder Petrolether ausgefällt und bei Zimmertemperatur getrocknet.

Elementaranalyse, Umsetzungen mit Trinitrobenzensulfonsäure und auch die IR-Spektren bolegen zusammengenommen das Vorliegen primärer Aminogruppen in den wasserlöslichen Makromolekülen. Die erfindungsgemäßen, aminogruppenhaltigen Makromoleküle sind stabil, einfach herstellbar und zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen geeignet. Der Gegenstand der Erfindung wird durch Beispiele weiter erläutert.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

3g Polyethylenglykol (MG 6000) werden in 15ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung werden 0,5g Kaliumkarbonat und 0,5g p-Aminophenylsulfonyletliylsulfat addiert. Das Reaktionsgemisch wird bei 80°C 6 Stunden gerührt und danach in 100ml destilliertes Wasser eingetragen. Der ausgefallene Niederschlag wird abg&i: ' und verworfen, und aus der resultierenden Lösung wird das amlnogruppenhaltige Polymere durch dreimaliges Ausschüttein mit jeweils 20ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformlösung wird mit Natriumsulfat getrocknet, eingeengt, und das aminogruppenhaltige Polymere wird mit Ether oder Petrolether ausgefällt.

Beispiel 2

1 ',j Polyvinylalkohol werden in 20ml eiskaltem, destilliertem Wasser gelöst. 0,5g festes Natriumhydroxid werden zu dieser Lösung gegeben, und es wird so lange gerührt, bis alles Natriumhydroxid gelöst ist. Danach werden zu dieser Lösung 15 ml frisch destilliertes Dimethylformamid addiert, in dem zuvor 0,8g Ethanolamin-O-sulfat aufgelöst wurden. Das Reaktionsgemisch wird 8 Stunden bei 80^cC gerührt. Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur wird die Reaktionslösung gegen destilliertes Wasser diaiysiert, ihr Volumen durc! ι Ultrafiltration verringert und das aminogruppenhaltige Polymere daraus durch Lyophilisierung in fester Form erhalten.

Beispiel 3

3g w.w'-Dimerkapto-polyothylenglykol (MG 6C00) worden in 20ml Chloroform gelöst. Zu dieser Lösung v/erden zuerst 0,5g p-Aminophenylsulfonylethylsulfat, aufgelost in 20ml Aceton, zugetropft und danach 0,5g festes Kaliumkarbonat addiert. Das Reaktionsgemisch wird 10 Stunden bei 60⁰C gerührt und anschließend mit 50ml destilliertem Wasser versetzt. Die Lösung wird noch 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt, und danach wird die organische Phase abgetrennt. Sie wird noch zweimal mit jeweils 20ml destilliertem Wasser ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und auf etwa 5ml eingeengt. Aus dor eingeengten Lösung wird das aminogruppenhaltige Polymere mit Ether oder Petrolether ausgefällt und getrocknet.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung neuer, wasserlöslicher Makromoleküle mit primären Ai, inogruppen, dadurch gekennzeichnet, daß Hydroxylgruppen oder Thiolgruppen oder primäre beziehungsweise sekundäre Aminogruppen enthaltende, wasserlösliche Makromoleküle in Gegenwart eines säurebindenden Mittels mit Halogenverbindungen, Schwefelsäureestern, Salpetersäureestern oder Sulfonsäureestern organischer Verbindungen mit zusätzlichen, primären Aminogruppen im Verlaufe von 1 Stunde bis 10 Stunden in organischen Lösungsmitteln oder Mischungen dieser mit wäßrigen Lösungen oder Gemischen organischer Lösungsmittel bei 2O⁰C bis 15O⁰C umgesetzt werden, und die neuen, wasserlöslichen Makromoleküle mit primären Aminogruppen durch Dialyse, Ultrafiltration und Lyophilisierung oder durch Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln oder, nach eventuell erforderlicher Addition von destilliertem Wasser zu den Reaktionslösungen aus organischen Lösungsmitteln, durch Extraktion mit in Wasser nicht löslichen oder mischbaren, organischen Lösungsmitteln und Ausfällen aus diesen mit anderen organischen Lösungsmitteln aus den Reaktionslösungen gewonnen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als säurebindende Mittel die zu bindenden Verbindungen mit primären Aminogruppen selbst, tertiäre Amine, Heterocyclen mit endocyclischem, tertiärem Stickstoffatom, Alkalihydroxide, Alkalikarbonate, Alkalialkoholate oder Alkalisalze kondensierter Aromaten und Heteroaromaten verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Sulfonsäureester der organischen Verbindungen mit zusätzlichen, primären Aminoverbindungen Alkyl- oder substituierte Alkyl-, Aryl- oder Hetaryl-, substituierte Aryl- oder Hetaryl-, kondensierte und/oder substituierte Aryl- oder Hetarylsulfonsäureester eingesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bisS.dadurchgekennzelchnetdaßfürdieUmsetzungenalsorganische Lösungsmittel Alkohole, Ketone, cyclische Ether wie Tetrahydrofuran und Dioxan oder aprotische Lösungsmittel wie Acetonitril, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid oder Gemische dieser organischen Lösungsmittel untereinander oder Gemische dieser mit in Wasser nicht löslichen oder nicht mischbaren, organischen Lösungsmitteln wie Chloroform, Methylenchlorid, Benzen oder Toluen verwendet werden.