DD279498A1

DD279498A1 - Verfahren zum mikrobiellen abbau von phosphono- bzw. phosphinoverbindungen

Info

Publication number: DD279498A1
Application number: DD32500489A
Authority: DD
Inventors: Werner Lerbs; Rosemarie Weidhase; Birgit Slama; Dieter Janke; Benno Parthier; Reinhard Weidhase
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1989-01-12
Filing date: 1989-01-12
Publication date: 1990-06-06

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum mikrobiellen Abbau von Phosphono- bzw. Phosphinoverbindungen, wobei der aus diesen Substanzen freigesetzte Phosphor dem Stoffwechsel der Bakterien zugeführt wird. Die beiden eingesetzten Stämme Pseudomonas spec. GS und Alcaligenes spec. GL sind in der Lage, auch toxische Phosphonate, wie z.B. Glyphosat oder Buminafos abzubauen. Der Einsatz phosphonatabbauender Mikroorganismen ist beispielsweise für den Abbau herbizider Phosphonate in der Landwirtschaft und für den Abbau von Phosphonaten in belasteten Abwässern (z.B. Waschmittelablaugen) von potentieller Bedeutung. Erfindungsgemäß werden die Phosphone- bzw. Phosphinoverbindungen dem Nährmedium als Phosphorquelle zugesetzt und das Nährmedium anschließend mit Bakterien beimpft, oder phosphonathaltige Medien beliebiger Zusammensetzung werden mit einer ausreichenden Menge an vorkultivierten Bakterien versetzt. Für die Fermentation ungeeignete Medien werden durch die Zugabe einer Kohlenstoff- und einer Stickstoffquelle sowie durch Einstellung eines physiologischen pH-Wertes so modifiziert, dass ein Abbau der darin enthaltenen Phosphonate möglich wird. Diese Abbau findet auch in Gegenwart von anorganischen Phosphat statt.{mikrobieller Phosphonatabbau; Bakterien; Pseudomonas; Alcaligenes; Glyphosphat; Buminafos; Nährmedien; Phosphorquelle; Abwasserreinigung; Fermentationsbedingungen}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum mikrowellen Abbau von Phosphono- bzw. Phosphinoverbindungen (in dieser Patentbeschreibung gemeinsam als Phosphonate bezeichnet) unter Freisetzung von anorganischem Phosphat. Die Fähigkeit zur Spaltung der Kohlenstoff-Phosphor-Bindung erlaubt den abbauenden Organismen die Nutzung solcher Stoffe zur Abdeckung ihres für Wachstum und Vermehrung notwendigen Phosphatbedarfs. Im Falle pestizider Eigenschaften von Xenobiotika auf Phosphonatbasis können die Organismen durch deren Abbau sowohl sich selbst schützen (Resistenz) als auch zu einer Entgiftung ihrer Umwelt beitragen.

Der Einsatz pnosphonatabbauender Mikroorganismen ist beispielsweise für den Abbau herbizider Phosphonate in der Landwirtschaft und für den Abbau von Phosphonaten in belasteten Abwässern (z. B. Waschmittelablaugen) von potentieller Bedeutung.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Ei; ist bekannt, daß die verschiedensten Mikroorganismen in der Lage sind, sich Phosphono- bzw. Phosphinoverbindungen zur Dnckung ihr js Phosphatbedarfes zugänglich zu machen (Wackett et al., J.Bacteriol. 16911987], 710-717, Cook et al. J. Bacteriol. 133 [19781,85-90, Cordeiro et al., J. Am. ehem. Soc. 10811986], 332-334. Diese Abbauleistung ist jedoch weitgehend auf die VE'iAvertung von Alkylphosphonaten bzw. anderer, dem Abbau leicht zugänglicher nichttoxischer Phosphonate beschränkt. Pestizide Substanzen, wie z. B. N-fPhosphonoJmethylglycin (Glyphosat) oder Phosphonomycin, können nur von einigen Mikroorganismen als Phosphatquelle verwendet werden, da die Kohlenstoff-Phosphor-Bindung eine hohe biochemische Stabilität aufweist. Bei de "n als Herbizid eingesetzten Glyphosat erfolgt der Abbau im Boden durch das Zusammenwirken veischiedenor Spezies von Mikroorganismen, wobei der Primärschrilt der Entgiftung in der Bildung eines nichttoxischen Phosphonates (Aminomethylphosphonsäure) besteht, welches eine biochemisch relativ leicht zugängliche Phosphatquelle darstellt (Roslucky, E. P. Soil. Bio!. Bioc'nem. 14 [1982], 87-92). Dieser Kometabolismus verschiedener Spezies ist für den gezielten Einsatz in biotechnologischen Verfahren zum kontrollierten Phosphonatabbau nicht nutzbar.

Andererseits wurde für verschiedene Mikroorganismen auch die vollständige Metabolisierung von Glyphosai beschrieben (Jacob et al. J. Biol. Chem. 262 [1987], 1 552-1 557, Pipke et al. Eur. J Biochem. 165 [1987], 267-273, FEBS Letters 236 [1988] 135-138). Als Abbauprodukte des Glyphosatss in mikrowellen Kulturen konnten die zitierten Autoren die Verbindungen Sarkosin, Glycin und Aminomethylphosphonsäure (AMPA) nachweisen.

Der Stamm Pseudomonas PG 2982 (Jscob et al. 1987) wurde aus einem Pseudomonas aeruginosa Stamm als Vsrunreinigung isoliert, wobei Glyphosat als einzige Phosphorquelle angeboten wurde. Einen grundlegenden Nachteil des Stammes Pseudomonas PG 2982 stellt das zur Glyphosatverwertung notwendige Anzuchtmedium da^r, das als Kohlenstoffquelle das teure D-Gluconat und als Vitamin Thiaminhydrochlorid enthalten muß. Die Verwertung von I m'/iql Glyphosat nimmt die relativ lange Zeitdauer von 96 Stunden in Anspruch. '

Aus glyphosathaltigen Abwässern konnte ein Mikroorganismus der Gattung Flavobacterium isoliert werden. Auch in diesem Falle wurde Glyphosat als einzige Phosphorquelle angeboten.

Eine detaillierte Charakterisierung dieses Stammes ist nicht bekannt (Balthazor et al., Appl. Environ. Microbiol. 51 [1986] 432-

Der Stamm Arthrobacter spec. GLP-1 (Pipke et al., 1987) wurde aus Anreicherungskultursn in glyphosathaltigen Medien (5-10mMol/l) isoliert und zeichnet sich durch eine hohe Glyphosattoleranz aus. Dieser und der Stamm Arthrobacter atrocyaneus ATCC 13752 weisen im Vergleich zu anorganischem Phosphat als Phosphorquello mit Glyphosat eine reduzierte spezifische Wachstumsrate auf (Pipke et al., 1987,1988).

Das von Waukett et al. (1987) isolierte Agrobacterium radiobacter zeigt eine C-PLyaseaktivität mit breiter Substratspezifitat. Die spezifische Wachstumsraie mit Glyphosat als Phosphorquelle ist gegenüber anorganischem Phosphat drastisch gesenkt.

Talbot et al. (Cun·. Microbiol. 10 [19841,255-260) gelang es, 21 nicht näher charakterisierte glyphosatabbauende Stämme aus Umweltproban zu isolieren. Der isolierte Alcaligenes-Stamm ist zwar gegenüber 50mMol/l Glyphosat resistent, wächst aber auch auf Glyphosat wesentlich langsamer als auf anorganischem Phosphat.

Alle bisher aus der Literatur bekannten glyphosatabbauenden Stämme werden durch anorganisches Phosphat in ihrer Abbaufähigkeit gehemmt.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, ein mikrobielles Verfahren zur Spaltung von Kohlenstoff-Phosphor-Bindungen zu entwickeln, das einen ökonomischen Einsatz in Industrie und Landwirtschaft ermöglicht und Voraussetzungen zur Reinigung phosponatverseuchter Abwässer schafft.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Abbau von Phosphonaten durch solche Mikroorganismen zu entwickeln, die ein breites Spektrum von Phosphonaten ohne Beeinträchtigung des Wachstumsverhaltens verwerten können.

Erfindungsgemäß werden zum Phosphonatabbau die Stämme Alcalioenes spec. GL bzw. Psaudorr onas spec. GS bzw. deren Varianten oder Mutanten verwendet. Diu Stämme Alcaligenes spec. Gl und Pseudomonas spec. GS sind in der IMET-h'interlegungsstelle im Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena unter den Bezeichnungen IMET 11314 und IMET 11315 hinterlegt.

Es handelt sich dabei um Stämme, die Phosphonate unter Freisetzung von anorganischem Phosphat spalten u'-.d das freigesetzte Phosphat zum eigenen Wachstum verwerten.

Im folgenden v/erder, die Stämme GL und GS ausführlich charakterisiert:

Stammbeschreibung Alcaligenes spec. GL. IMET11314

Stamm bildet auf Nähragar weiße, gnnzrandige, runde, schleimige Kolonien. Im mikroskopiscrmn Bild 'agen Ko'<ken vor. Die Bcc.eißelurig ist polar monotrich.

Weitere Angaben v/erden tabellarisch aufgeführt.

Gram-Reaktion:	negativ
Katalane:	negativ
Wachstum bei 40⁰C:	negativ
Wachstum be· pH 4.5:	negativ
Bildung fluoreszierender Farbstoffe:	negativ
Cytchromoxidase:	positiv
Arginin-Dihydrolase:	negativ
Stärkehydrolyse:	negativ
Gelatinase:	positiv
Urease:	positiv
Reduktion von Nitrat zu Nitrit:	positiv
DNase:	positiv
Phenyliilanindeamiricsi?:	positiv
Äskulinhydiolase:	positiv
H₂S-Bildunc\|:	negativ
Sarkosin-Dehydrogenase:	negativ
Indolbiidung:	negativ
Atmonij:	aerob
Verwertung von Glukose oxid/furm.:	+/-
Verwertung von Lactat:	negativ
Verwertung \ on Pyruvat:	positiv
Verwertung ν η Mannit:	negativ
Verwertung von Acetat:	negativ
Verwertung vonAdonit:	negativ
Verwerfung von Inosit:	negativ
Verwertung von Saccharose:	negativ
Verwertung von Sarkosin:	negutiv
Verwertung von D-Xylose:	negativ

Verwertung von verschiedenen Phosphonaten als Phosphorquelle: Verwertung von N-Phosphonomethylglycin (Glyphosat): positiv Verwertung von Aminomethylphosphcnsäure (AMPA): positiv

C₂H₅O_x? „„ ₊H

U ^c ι *

C₂H₅

?, H

CHo-P-CH₉-N-CH₉COOH positiv

OH

Antibiotikaresistenzen:

Streptomycin: resistent

Rifampicin: msistent

Tetracyclin: sensitiv ab 25 mg/1

Kanamycin: msistent

Ampicillin: sensitiv ab 100 mg/ml

Chloramphenicol: sensitiv ab 50 mg/ml

Polymyxin B: sensitiv

Nalidixin: sensitiv ab 500 mg/ml

Stammbeschreibung Pseudomon&s spec. GS. IMET11315

Stamm bildet auf Nähi agar weiße ganzrandige, runde, schleimige Kolonien. Im mikroskopischen Bild liegt er als bewegliches Stäbchen vor. Die Begeißelung ist monotrich polar, z.T. lateral. Weitere Angaben werden tabellarisch aufgeführt.

Gram-Reaktion:	negativ
Sporenfärbung:	negativ
Katalase:	positiv
Wachstum bei 40"C:	positiv
Wachstum bei 42°C:	negativ
Wachstum bei pH4.5°C	negativ
Bildung fluoreszierenden Farbstoffe:	negativ
Cytochromoxidase:	positiv
Arginin-Dihydrolase:	verzögert
Stärkehydrolyse:	negativ
Gelatinase:	positiv
Urease:	positiv
Reduktion von Nitrat zu Nitrit:	positiv
DNase:	negativ
Phenylalanindeaminase:	negativ
Lysindecarboxylase:	negativ
Ornithindecarboxylase:	negativ
H₂S-Bildung:	negativ
Sarkosin-Dehydrogenase:	positiv
Indolbildung:	negativ
Atmung:	aerob
Verwertung von Glukose oxid./ferm.:	+/-
Verwertung von Lactat:	positiv
Verwertung von Pvruvat:	positiv
Verwertung von Acetat:	positiv
Verwertung von Adonit:	positiv, verzögert
Verwertung von Inosit:	negativ
Verwertung von Glycerin:	positiv
Verwertung von D-Xylose:	positiv
Verwertung von Saccharose	positiv
Verwertung von Sarkosin a!s N-Quelle:	positiv

Verwertung von verschiedenen Phosphonaten als Phosphorquelle: N-Phosphoriomethylglycin (Glyphosat positiv

Aminomethylphosphonsäure (AMPA) positiv

N-Isopropylphosphinomothylglycin positiv

2-Amino-3-phosphonopropiünsäure positiv

C₂H₅O

₊ ^H

η CH₃-P-CH₂-N-CHoCOOH

OH

positiv

^PDBitiv

Antibiotikaresistenzen:

Streptomycin

Rifampicin

Tetracyclin

Kanamycin

Ampicillin

Chloramphenicol

Nalidixin

Polymyxine

sensitiv ab 200 mg/1

sensitiv

sensitiv ab 1 000 mg/1 sensitiv ab 500 mg/1 sensitiv ab 30 mg/1

sensitiv

Beide Stämme können ein breites Spektrum von Phosphonaten als Phosphatquelle benutzen und tolerieren auch hohe Konzentrationen dieser Phosphonate. Weiterhin zeichnen sich die beiden Stämme dadurch aus, daß ihr Wachstumsverhalten in Gegenwart von Phosphonaten nicht von dem in Gegenwart von anorganischem Phosphat unterscheidbar ist. Vorteilhaft ist, daß diese Stämme an das Kultivierungsmedium nur geringe Ansprüche stellen (Glukose oder Saccharose als C-Quelle. köin Vitaminzusatz). Verwendet man als Inokulum die Stämme Alcaligene'j spec. GL oder Pseudomonas spec. GS bzw. deren Mutanten oder Varianten, so müssen die phosphonathültigen Nährmedien neben einer gut verwertbaren Kohlenstoffquelle eine Stickstoffquelle und Mineralsalze enthalten. Dabei wird oas Wachstum in oder auf diosen Medien durch das vorliegende Phosphonatangebot limitiert. Setzt man als Inokulum die gesamte Biomasse einer Vorkultur ein, brauchen die phosphonathaltigen Medien keine Nährlösungsqualität zu besitzen, aber die metabolische Leistungsfähigkeit der Bakterien muß über den für den Abbauprozeß notwendigen Zeitraum erhalten bleiben.

Die Kultivation wird bei einem pH-Wert von 5-8, vorzugsweise jedoch bei pH 7-7,5 durchgeführt. Der Phosphonatabbau erfolgt auch in Gegenwart von anorganischem Phosphat. Als phosphonathaltige Medien finden beispielsweise landwirtschaftliche oder industrielle Abwässer Verwendung. Um den Mikroorganismen einen effizienten Phosphonatabbau zu ermöglichen, ist es zweckmäßig, diese Medien mit Nährstoffen, vor allem Kohlenhydraten und assimilierbarem Stickstoff, anzureichern.

Der Phosphonatabbau nach dem erfindungsgemäßen Verfahren kann sowohl im batch-Verfahren als auch in kontinuierlicher Kultur erfolgen, wobei unter letztgenannten Bedingungen in Abhängigkeit von der Verdünnungsrate Phosphonate nicht vollständig aus der Nährlösung entfernt werden. Ein nahezu vollständiger Abbau auch toxischer Phosphonate (z. B. Buminafos) ist möglich, wenn die Stämme in einem Medium mit gut verwertbaren Phosphonaten (z. B. Glyphosat 5-10 mM/l· zur Biomasse-Produktion vorkultiviert werden und nach anschließender Verarmung in P-freiem Medium in einem neuen Medium resuspendieri werden, welches die abzubauenden Phosphoric»- oder Phosphinoderivate enthält. Die Erfindung wird nachstehend auch Ausführungsbeispiele erläutert.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Ein phosphonathaltiges flüssiges Nährmedium (z. B. mit 1 mM Glyphosat) wird mit einem Aliquot einer phosphatverarmten Kultur des Stammes Pseudomonas spec. GS inokuliert (1 ml Inokulum für 200ml Nährlösung). Innerhalb von 36 Stunden erreichen die Bakterien die stationäre Wachstumsphase und produzieren mit 1mM Glyphosat als Phosphorquelle die gleiche Biotrockenmasse, die mit anorganischem Phosphat als Phosphorquelle erreicht wird.

Dabei wird das eingesetzte Glyphosat vollständig metabolisiert. Mit Hilfe von ¹⁴C₃-Glyphosat· Metabolismusstudien konnte nachgewiesen werden, daß 12% der eingesetzten Radioaktivität als CO; abgegeben werden, 1 % im wäßrigen Zellextrakt zu finden sind, 11,5% in das Protein und 40% in Membranbestandteile eingebaut werden. 36% der Radioaktivität wurden als Glyphosatmetabolite in das Nährmedium wieder ausgeschieden.

Zusammensetzung des flüssigen Nährmediums:

- Kohlenstoffquelle: 7gNatriumpyruvatoder

4 g Sacharose t- 0,1 g Glyzerin

- Stickstoffquelle: 0,9 g Sarkosin oder 1 g NH₄NO₃

(1OmM)

- Phosphorquelle: 0,169gGlyphosatoderO,136g KH₂PO₄

(1mM) (1mM)

6,05 g Tris 15 mg CaCI₂

- 200 mg MgSO₄ x 7 H₂O

- 40 mg KCI

1 mg FeSO₄ χ 7 H₂O

2 ml Spurenelemantelösung

mit HCI auf pH 7,5 einstellen, ad 11H₂O dest. Spurenelementelösung: 500mg H₃BO₃

400mg MnSO₄ x H₂O 400mg ZnSO, χ H₂O 200mg Na₂MoO₄ x 2H₂O 100mg CuSO₄ χ 5H₂O 100 mg KJ ad 11 H₂O dest.

Beispiel 2

Mit Bakterien des Stammes GS wird eine Nährlösung mit 1 mM Glyphosat als einziger Phosphorqueile beimpft. Nach 4öh Wachstum wird die Biomasse durch Zentrifugation geerntet und in einem Medium zur Phosphatverarmung (d. h. ohne Phosphorquelle) suspendiert. Nach 24h wird die gesamte Biomasse geerntet und in ein Medium gebracht, welches das abzubauende Phosphonat enthält. Im Falle von Glyphosat werden in weiteren 24h 100% der Substanz abgebaut. Zusammensetzung des flüssigen Nährmediums wie im Beispiel

Beispiel 3

Mit Bakterien des Stammes GL wird eine Nährlösung mit 5mM Glyphosat als einziger Phosphorquelle beimpft. Nach 48h Wachstum wird die Biomasse durch Zentrifugation geerntet und in einem Medium zur Phosphatverarmung (d. h. ohne Phosphorquelle) suspendiert. Nach 24h wird die gesamte Biomasse geerntet und in ein Medium gebracht, welches das abzubauende Phosphonat enthält. Im Falle von Glyphosat werden in weiteren 48 h Inkubation 30-80% der Substanz abgebaut (30% bei einem Glyphosateinsatz von 90:nM/l, 80% bei einem Glyphosateinsatz von 2mM/l).

Zusammensetzung des N.ihrmedi'jrns:

50mM/ITris/HCIpH7,5 20mM/INaCI 4mM/l NH₄CI 0,4mM/l CaCI₂ 1mM/l MgSO₄ 0,8% Glukose

Beispiel 4

Industrieabwässer, die Phosphonate enthalten, werden durch Zusatz von 8g/l Glukose und 0,2g/l NH₄CI sowie durch Korrektur des pH-Wertes mit NaOH auf pH 7,5 als Medium für die phosphonatabbauenden Bakterien geeignet gemacht. Mit nach Beispiel 3 phosphatverarmter Biomasse beimpft, wird innerhalb von 24-28h ein Abbau von 50-80% Phosphonat (z. B. Buminafos) gemessen.

Claims

-1- £.'9 498 Patentansprüche:

1. Verfahren zum mikrowellen Abbau von Phosphono- bzw. Phosphinoverbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Stämme Alcaligenes spec. GL oder Pseudomonas spec. GS bzw. deren Mutanten oder Varianten verwendet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man diese Mikroorganismen als Inokulum für phosphonathaltige Nährmedien nutzt, wo'oei diese Nährmedien eine gut verwertbare Kohlenstoffquelle, eine Stiv-kstoffquelle und Mineralsalze enthalten, und der Phosphatbedarf der Mikroorganismen wahrend des Wachstums in oder auf diesen Medien durch das vorliegende Phosphonatangebot limitiert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Inokulum die gesamte Biomasse einer Vorkultur einsetzt, wobei das phosphonathaltige Medium keine Nährlösungsqualität zu besitzen braucht, aber die metabolische Leistungsfähigkeit der Bakterien über den für den Abbauprozeß notwendigen Zeitraum erhalten bleiben muß.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadu'ch gekennzeichnet, daß man die Kultivation bei einem pH-Wert von &-8 durchführt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kultivation bei pH 7-7,5 durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium Phosphonate enthält, die für die Bakterien toxisch sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,3 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Phosphonatabbau in Gegenwart von anorganischem Phosphat durchführt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1,3, 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als phosphonathaltige Medien landwirtschaftliche oder industrielle Abwässer verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man vor dem Zusatz der Mikroorganismen diese Medien mit Nährstoffen anreichert.