DD274447C2 - Verfahren zur herstellung definierter proteine - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von definierten Proteinen mi* Hilfe gentechnisch modifizierter Mikroorganismen. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die mikrobiologische Industrie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Seit längerem ist bekannt, daß mit den Methoden der Gentechnik Gene von Tieren, Pflanzen, Prokaryonten und Viren zur Expression gebracht werden können. Das eröffnet die Möglichkeit, spezielle Proteine dieser Organismen mikrobiell zu erzeugen. Bekannt geworden sind besonders die Beispiele Humaninsulin (DD-AP 155004), Interferon (DD-AP 202085, DD-AP 202307, DD-AP 160280), menschliches Wachstumshormon (DD-AP 202045, DD-AP 202046) und verschiedene mikrobielle Enzyme. Als Vektoren werden Plasmide und deren Derivate sowie Bakteriophagen und deren Derivate verwendet. Als Wirte, bei denen diese Vektoren repliziert und die Gene e^primiert werden, sind bisher am häufigsten Escherichia coli, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerovisiae verwendet worden.

Ein Nachteil der bisher entwickelten Verfahren besteht darin, daß komplexe und teure Medien verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen werden in der Regel Kohlenhydrate verwendet; die Medien weisen eine neutralen pH-Wert auf. Diese Faktoren begünstigen die Kontamination durch andere Mikroorganismen. Sie machen eine strenge Sterilhaltung oes Prozesses erforderlich und erschweren die Durchführung einer kontinuierlichen Kultivierung und der Massenproduktion. Es wird daher die Anwendung protektiv wirkender Kohlenstoffquellen und einfacher Medien, wie z. B. Methanol und einfacher Mineralsalzlösungen angestrebt. Ein Ausdruck dafür sind Wirt-Vektorsysteme, die methylotrophe Bakterien einbeziehcn (GB-PS 2003926, EP 0066994). Der Nachteil der bisher bekannten Systeme mit methylotrophen Bakterien besteht jedoch darin, daß das Wachstumsoptimum der Wirte im neutralen pH-Bereich liegt, wodurch sie ebenfalls der Konkurrenz einer Vielzahl von Kontaminantun ausgesetzt sind, die sich beispielsweise als Substratkonkurrenten oder als Sekundärflora auf den gebildeten Fermentationsprodukten entwickeln können. Ein weiterer Nachteil solcher Wirte wie E. coli besteht darin, daß die Produktbildung mit einer Toxinbildung einhergeht, was aufwendige Maßnahmen zur Abtrennung des Toxins vom Produkt erforderlich macht.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, für die Gewinnung definierter Proteine Wirt-Vektor-Systeme zu schaffen, die fähig sind, solche Substrate mit protektiver Wirkung wie Methanol zu verwerten, auf einfachen Mineralsalzlösungen zu wachsen und durch ein pH-Optimum des Wachstums im sauren Bereich Schutz vor Kontaminationen zu erreichen. Durch die Einführung solcher

Wirts-Vektor-Systeme werden Voraussetzungen für eine industrielle Massenproduktion geschaffen. Darüber hinaus sollen als Wirte solche Mikroorganismen verwendet werden, die apathogen und toxlnfrei sind, was nicht nur unter Aspekten des Arbeitsschutzes und der allgemeinen Sicherheit im Produktionsprozeß, sondern auch im Hinblick auf eine vereinfachte Aufarbeitung des Produkts von Bedeutung ist.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß für die Herstellung von Proteinen tierischer, pflanzlicher, mikrobieller oder viraler Herkunft Wirt-Vektor-Systeme benutzt werden, bei dem die Wirte acidophile methanoloxidierende oder methanolutilisierende Bakterien sind. Diese Bakterien gehören bevorzugt den Gattungen Acetobacter und Gluconobacter an. Die Methylotrophie ist fakultativ. Bevorzugte Wirte sind erfindungsgemäß Stämme der Art Acetobacter methanolicus, die sich durch Methylotropnie in Kombination mit einer ausgeprägten Acidophilie und, im Vergleich zu anderen Acetobncterien hohe Reproduktionsfähigkeit auszeichnen. Das pH-Optimum für das Wachstum liegt bei 3,8-4,0. Die Bakterien dieser Gruppe sind apathogen und toxinfrei. Als Basisvektoren zur Realisierung der Erfindung werden bekannte Klonierungsvektoren, Plat, aide der Gattungen Acetobacter und Gluconobacter oder Phagen der Gattungen Acetobacter und Gluconobacter eingesetzt.

Bevorzugt werden Hasmide der Inkompatibilitätsgruppen Ine P1 und Inc P4 (ζ. B. RP4, R68.45 und RSF1010) sowie deren Derivate einerseits und Plasmide von Stämmen der Gattungen Acetobacter oder Gluconobacter andererseits verwendet. Als weitere Vektoren we'den erfindungsgemäß virulente und temperent'e Phagen von Acetobacter oder Gluconobacter, bevorzugt von Acetobacter methanolicus, eingesetzt. Dies betrifft beispielsweise die Phagen M01, MO2, MO5 und MO6. Des weiteren werden bekannte Klonierungsvektoren, beispielsweise pBR322, für die Konstruktion von Hybridplasmiden mit den oben aufgeführten Vektoren eingesetzt.

Die Konstruktion der Vektoren und der Gentransfer erfolgen nach an sich bekannten Methoden, Als Substrate für dio Fermentation werden Methanol und/oder Stoffe mit C-C-Bindungen eingesetzt. Bevorzugte Stoffe mit C-C-Bindungen sind Ethanol, Glucose, Glycerol oder Essigsäure.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die vorgesehenen Zielstellungen erreicht. Es ermöglicht die Bildung, Akkumulation und Gewinnung definierter Proteine aus Methanol oder aus Substraten mit C-C-Bindungen durch mikrobielle Fermentation. Solche Proteine können Insulin, Interferon, Chymosin, PLV-Protein sowie intra- und extrazelluläre mikrobielle Enzyme sein. Die Akkumulation intrazellulärer Enzyme kann mit dem Ziel der Überproduktion bestimmter Metabolite (ζ. Β. Aminosäuren, organische Säuren, Vitamine) oder der Effektivierung von Stoffwechselwegen (ζ. Β. verbesserte Ausbeutekoeffizienten bei Fermentationen, Erweiterung des Substratspektrums) erfolgen. Die Erfindung soll anschließend mit folgenden Beispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel 1

Herstellung von Genprodukten (Proteinen) durch Expression von artfremden Antibiotikaresistenzgenen In den methanolutilislerenden Stamm Acetobacter methanolicus IMET B 346

1.1. Kurzbeschreibung des Stammes Acetobacter methanolicus IMET B 346

Acetobacter methanolicus IMET B346 ist ein Stamm der neubeschriebenen Bakterienspecies Acetobacter methanolicus. Er wurde in der Kulturensammlung des Zentralinstitutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena der AdW der DDR hinterlegt.

Der Stamm wurde aus einem Hefe-Fermentationsprozeß mit Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle isoliert.

Er ist acidophil und fakultativ methylotroph. Im Unterschied zu anderen Acetobacter-Stämmen zeigt IMET B 346 gutes Wachstum auf Methanol, Glukose, Glukonsäure, 2,3-Butandiol und Capronsäure als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle. Zum Wachstum wird Pantothensäure oder Hefeextrakt benötigt.

DNS-rRNS-Hybridisierungsexperimente bestätigen die Zugehörigkeit zu Acetobacter. Die Inkorporation von Methanol erfolgt über den Hexulosephosphat-Weg. Der GC-Gehalt des Stammes beträgt 62,3 Mol-%.

Ein bevorzugtes Anzuchtmedium hat folgende Zusammensetzung (Angaben mg/l):

NH₄CI-761,4; CaCI₂ · 6 H₂O - 5,47; MgSO₄ · 7 H₂O - 71,2; ZnSO₄ 7 H₂O - 0,44; MnSO₄ · 4 H₂O - 0,785; CuSO₄ · 5H₂O-0,785; Na₂MoO₄ · 2 H₂O - 0,252; FeSO₄ · 7 H₂O - 4,98; KH₂PO₄ - 68,05; K₂HPO₄ - 87,09, Pantothensäure -10, Methanol -1 Vol.-% auf 1 Liter Aqua dest. Es wird pH4,0 eingestellt.

1.2. Konjugative Übertragung des Plasmid3 R68.45 in den Stamm IMET B346 und Expression von Pseudomonas-Antiblotlkareslstenzgenen in diesem Stamm Das Plasmid Π68.45 (Haas and Holloway, 1976) gehört der IncPI-lnkompatibilitätsgruppe von Pseudomonas an.

R 68.45 (37,5 Md) kodiert Tetrazyklin-, Kanamycin- und Carbenicillinreslsienz.

Als Donoren werden die Stämme Pseudomonas PAD ML 4262 (Sagai et. al., 1975) und Escherichia coli SK 1590 (Kushner, 1978), in die das Plasmid R68.45 konjugativ übertragen wurde, verwendet. Die konjugative Übertragung des Plasmids aus den neutrophilen Referenzstämmen in den acidophilen methylotrophon Stamm IMET B346 wird durch die unterschiedlichen pH-Optima für das Wachstum erschwert.

In Wachstumsversuchen wurde ermittelt, daß bei pH = 6 die Kultivierung sowohl der neutrophilen Stämme als auch des acidophilen Stammes möglich ist.

Für die Konjugationsversuche wird ein mit Phosphatpuffer nach Sörensen stabilisierter Agar (pH = 6) verwendet, der neben den in 1.1. angegebenen Spurensalzen 1 % Methanol, 0,1 % Glukose, 20μς/ητιΙ Pantothensäure und 20ng/ml Thiamin (bei Kreuzungen mit E.coli SK1590 (R68.45) bzw. je 50\ig/m\ Tryptophan, Isoleucin, Valin und Methionin (bei Kreuzungen mit Ps. aeruginosa ML 4262 (R68.45) sowie 1,8% Agar-Agar enthält.

Donor und Rezipient werden his zu einer Zelldichte von etwa 10" Zellen/ml gezüchtet und im Verhältnis 1:3 gemischt. 0,2ml des Gemisches werden auf Konjugationsplatten mit dem oben beschriebenen Agar gespatelt. Nach 24stündiger Inkubation bei 3O⁰C werden die Zellen in 2ml Sörensenpuffer aufgenommen und auf Selsktionsplatten zur Erfassung der Transkonjugenten (Selektion auf Tetrazyklinreslstenz-6(^g/mlTetrazyklln)sowiezur Titerbestimmung von Donor und Reziplentausgespatelt. Die Transkonjuganten werden auf den Gleichzeitigen Erwerb der anderen Antibiotikaresistenzmarker des Plasmids (Kanamycin, Carbenicillin) überprüft.

Die Übertragung des Plasmids R68.45 aus den Stämmen Ps.aeruglnosa ML4262 (R68.45) bzw. E.coli SK1590 (R68.45) erfolgt mit einer Frequenz von 10² bzw. ca. 10~⁴ Transkonjuganten pro Rezipientenzelle in den Stamm IMET B346.

Von jeweils 100 überprüften Transkonjuganten erweisen sich normalerweise alle gegenüber Kanamycin (200 Mg/ml) und Carbenicillin (2QQ0\ig/m\) als resistent, während der Stamm IMET 8346 bei diesen Antibiotikakonzentrationen zum Wachstum nicht fähig ist.

Die Fähigkeit zur konjugativen Übertragung des Plasmids wird durch Konjugationen zwischen den plasmidtragenden Transkonjuganten IMET B346 (R68.45) und einer rifampicinresistenten Mutante dieses Stammes überprüft. Das Selektionsmedium enthält Tetra2yklin (50pg/ml) und Rifampicin (50pg/ml). Tetrazyklinresistente Transkonjuganten treten mit einer Rate von 10"³-10 ⁵ pro Donorzelle in Abhängigkeit vom plasmidtragenden Donor auf. Die Transkonjuganten erwerben gleichzeitig Kanamycin- und Carbenicillinresistenz.

Es ist auch die Rückübertragung von R68.45 aus IMET B346 (R68.45) in die Stämme Ps. aeruginosa ML4262 und E.coli C600 möglich. Die Selektion erfolgt auf Tetrazyklinresistenz, zur Gegenselektion wird Rifampicin eingesetzt. Die Transferraten des Plasmids liegen bei etwa 10"' Transkonjuganten pro Rezipientenzejle (bei Kreuzungen mit Ps.aeruginosa ML4262) bzw. etwa 10"⁴ Transkonjuganten pro Rezipientenzelle (bei Kreuzungen mit E.coli C600). Die Transkonjuganten erwerben gleichzeitig Kanamycin- und Carbenicillinresistenz.

Durch die gleichzeitige konjugative Übertragung verschiedener Plasmidmarker (Antibiotikaresistenzen, Replikationsursprung, Tra-Gene) ist gezeigt, daß das Plasmid R 68.45 vollständig in den Stamm IMET B346 übertragen wird. Die auftretenden Antibiotikaresistenzen beweisen, daß die verantwortlichen Genprodukte (z.B. ß-Lactamase, Phosphotransferase) durch Expression der Pseudomonas-Antibiotikaresistenzgene in dem methylotrophen Bakterium synthetisiert werden.

1.3. Mobilisierung des Plasmids RSF1010 mittels R68.45 durch Konjugation in den Stamm Ac. methanolicus IMET B346 und Expression des Escherichia coil - Streptomycinresistenzgens in diesem Stamm Das Plasmid RSF1010 (Guerry et. al., 1974) gehört zur Inkompatibilitätsgruppe IncQ; (lncP4 von Pseudomonas) und determiniert Streptomycinresistenz. Es ist selbst nicht konjugativ übertragbar, kann aber durch andere Plasmide (z. B. R68.45) mobilisiert werden.

Zur Mobilisierung werden als Donorstämme Pseudomonas aeruginosa PAO ML 4262 (RSF1010, R68.45) und Escherichia coli SK1590 (RSF 1010, R 68.45) verwendet.

Doncr und Rezipient werden bis zu einer Zelldichte von etwa 10⁸-10⁹ Zellen/ml gezüchtet und im Verhältnis 1:5 gemischt. 0,2 ml des Gemisches werden auf Konjugationsplatten, die die gleiche Zusammensetzung wie in 1.2. haben, gespatelt. Nach 24stündiger Inkubation bei 30°C werden die Zellen in 2ml Sörensenpuffer aufgenommen und auf Selektionsplatten ausgespatelt.

Die Selektionsplatten enthalten neben dem in 1.1. beschriebenen Medium mit 1,8% Agar-Zusatz noch 50pg/ml Tetrazyklin (Selektion auf R68.45 Transfer), 200pg/ml Streptomycin (Selektion auf RSF1010-Transfer) oder beide Antibiotika (Selektion auf Transfer beider Plasmide). Gleichzeitig werden Lebendzellzahlbestimmungen für Donor und Rezipient auf entsprechenden Selektivnährböden und Kontrollen zur Erfassung antibiotikaresistenter Mutanten durchgeführt.

Die Transferraten des Pasmids RSF1010 betragen bei Kreuzungen unter Verwendung von Ps.aerugionosa ML4262 (RSF1010, R 68.45) etwa 10~² Transkonjuganten pro Donorzelle, bei Kreuzungen unter Verwendung von E.coli SK1590 (RSF 1010, R 68.45) etwa 10~⁴ Transkonjuganten pro Donorzelle. Die entsprechenden Transferraten des Plasmids R68.45 liegen in beiden Kreuzungen etwa vierfach höher. Ungefähr 10-20% der RSF1010 tragenden Transkonjuganten enthalten gleichzeitig R68.45.

Die Resistenz gegenüber Streptomycin in IMET B346 (RSF 1010) beweist, daß das verantwortliche Genprodukt (Phosphotransferase) durch Expression des Escherichia coli-Antibiotikaresistenzgens in dem methylotrophen Bakterium synthetisiert wird.

Literatur

Guerry, P., J.VanEmbden, S.Falkow, 1974.

J.Bacteriol. 117: 619-630.

Haas, D., B.W.Holloway, 1976.

Molec. Gen. Genetics 144: 243-251.

Kushner.S.R., 1978.

In: Genetic Engineering (H.VV. Boyer, S. Nikosia, ede.), Elsevier/North-Holland, pp. 17-23.

Sagai, H., V.Kremen/, K.Hasuda, S.lyobe, H.Knothe, S.Mitsuhashi, 1975, Jpn. J.Microbiol. 19:427-432.

Beispiel 2

Herstellung des Phagenvektors

Durch Fermentation des Stammes MB70 auf Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wurden Kulturfiltrate erzeugt und 2 Phagenstämme mit voneinander abweichenden Wirtsspektren isoliert. Die Phagen wurden als MO 5 und MO 6 bezeichnet.

Beide Phagen sind zur Lysogenisierung des sensiblen MB70-Stammes befähigt:

Genetisches Material (Phagengenom) wird mit dem Phagen MO5 in den acidophilen methanolassimilierenden Bakterienstamm MB70 eingeführt. Der Phage MO5 enthält Doppelstrang-DNA und vermehrt sich virulent auf dem Stamm MB70 mit einer Latenzzeit von 90 Minuten und einer Wurfgröße von 58 pfu/ml infizierte Zelle. Zur Einführung des Phagengenoms in die Wirtszelle (Lysogenisierung) werden gleiche Anteile einer Suspension des Bakterienstammes (etwa 10⁹cfu/ml) und einer

Suspension des Phagen MO5 (etwa 10⁹pfu/ml) gemischt und auf Grundagarplatten ausgespatelt. Nach einer Inkubationszeit von 3 bis 4 Tagen werden die überlebenden Kolonion isoliert und auf Sensitivität gegen den Phagen MO 5 geprüft. Ausgewählte M05-unempfindliche isolate werden in Submerskultur gezüchtet und zur Induktion des lytischen Zyklus des eingeführten Prophagen mit UV-Licht bestrahlt. Ausgangsmaterial für die Induktionsversuche waren exponentiell gewachsene Submerskulturen des MO5-lysogenisierten Stammes MB70.

Die UV-Bestrahlung der Bakteriensuspension erfolgte in Petrischalen (Schichthöhe 0,2cm) unter einer Niederdruck-Quecksilberdampflampe mit einem Emissionsmaximum bei 253,7nm im Dosisbereich zwischen 250 und 3000erg · mm"¹. Bei allen untersuchten MO5-resistenten Isolaten konnte eine Freisetzung des Phagen MO5 durch UV-Bestrahlung der lysogenisierten Wirtszellen erreicht werden.

Nach dem im Beispiel erläuterten Prinzip zur Isolierung von Phagenvektoren aus dem Stamm MB70 sind weitere Vektoren aus anderen acidophilen r-.ethanolverwertenden Bakterienstämmen isolierbar (Wünsche u.a., Z.AIIg.Mikrobiol., 23 [2] 1983,81 bis 94).

Claims (9)

1. Verfahren zur Herstellung definierter Proteine durch Rekombination einer DNA-Sequenz mit einem Vektor, Transfer der resultierenden Rekombinanten in einem Mikroorganismus und nachfolgende Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirte acidophile methanoloxidierende oder methanolutibisierende Bakterien, als Basisvektoren bekannte Klonierungsvektoren, Plasmide der Gattungen Acetobacter und Gluconobacter oder Phagen der Gattungen Acetobacter und Gluconobacter und als Substrate Methanol und/oder Stoffe mit C-C-Bindungen eingesetzt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirte Bakterien der Gattungen Acetobacter und Gluconobacter verwendet werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirte Stämme der Art Acetobacter methanolicus verwendet werden.

4. Verfahren nach Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Wirte die Stämme IMET10945 oder IMET B 346 oder Acetobacter methanolicus MB 70 verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektoren Plasmide der Inkompatibilitätsgruppen IncPI und Ine P4, wieRP4, R68.45 und RSF1010 sowie deren Derivate verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektoren Plasmide von Stämmen der Gattungen Acetobacter oder Gluconobacter verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektoren Phagen von Acetobacter methanolicus, wie MO 1,MO2, MO5 und MO6, verwendet werden.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Vektoren Hybride aus bekannten Klonierungsvektoren und den Vektoren nach Anspruch 6 rnd 7 verwendet werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als Stoffe mit C-C-Bindungen Ethanol, Glucose, Glycerol oder Essigsäure verwendet werden.