DD274447C2

DD274447C2 - PROCESS FOR PRODUCING DEFINED PROTEINS

Info

Publication number: DD274447C2
Application number: DD25726483A
Authority: DD
Inventors: Karl Sattler; Joachim Engel; Lothar Wuensche; Dierck-Hartmut Liebscher
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1983-11-30
Filing date: 1983-11-30
Publication date: 1990-10-24
Also published as: DD274447A1

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von definierten Proteinen mi* Hilfe gentechnisch modifizierter Mikroorganismen. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die mikrobiologische Industrie.The invention relates to a process for the production of defined proteins with the aid of genetically modified microorganisms. Field of application of the invention is the microbiological industry.

Characteristic of the known technical solutions

Seit längerem ist bekannt, daß mit den Methoden der Gentechnik Gene von Tieren, Pflanzen, Prokaryonten und Viren zur Expression gebracht werden können. Das eröffnet die Möglichkeit, spezielle Proteine dieser Organismen mikrobiell zu erzeugen. Bekannt geworden sind besonders die Beispiele Humaninsulin (DD-AP 155004), Interferon (DD-AP 202085, DD-AP 202307, DD-AP 160280), menschliches Wachstumshormon (DD-AP 202045, DD-AP 202046) und verschiedene mikrobielle Enzyme. Als Vektoren werden Plasmide und deren Derivate sowie Bakteriophagen und deren Derivate verwendet. Als Wirte, bei denen diese Vektoren repliziert und die Gene e^primiert werden, sind bisher am häufigsten Escherichia coli, Bacillus subtilis und Saccharomyces cerovisiae verwendet worden.It has long been known that genes from animals, plants, prokaryotes and viruses can be expressed by genetic engineering methods. This opens up the possibility of microbially producing special proteins of these organisms. Particularly noteworthy are the examples human insulin (DD-AP 155004), interferon (DD-AP 202085, DD-AP 202307, DD-AP 160280), human growth hormone (DD-AP 202045, DD-AP 202046) and various microbial enzymes. The vectors used are plasmids and their derivatives as well as bacteriophages and their derivatives. As hosts in which these vectors are replicated and genes are primed, Escherichia coli, Bacillus subtilis and Saccharomyces cerovisiae have been most commonly used.

Ein Nachteil der bisher entwickelten Verfahren besteht darin, daß komplexe und teure Medien verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen werden in der Regel Kohlenhydrate verwendet; die Medien weisen eine neutralen pH-Wert auf. Diese Faktoren begünstigen die Kontamination durch andere Mikroorganismen. Sie machen eine strenge Sterilhaltung oes Prozesses erforderlich und erschweren die Durchführung einer kontinuierlichen Kultivierung und der Massenproduktion. Es wird daher die Anwendung protektiv wirkender Kohlenstoffquellen und einfacher Medien, wie z. B. Methanol und einfacher Mineralsalzlösungen angestrebt. Ein Ausdruck dafür sind Wirt-Vektorsysteme, die methylotrophe Bakterien einbeziehcn (GB-PS 2003926, EP 0066994). Der Nachteil der bisher bekannten Systeme mit methylotrophen Bakterien besteht jedoch darin, daß das Wachstumsoptimum der Wirte im neutralen pH-Bereich liegt, wodurch sie ebenfalls der Konkurrenz einer Vielzahl von Kontaminantun ausgesetzt sind, die sich beispielsweise als Substratkonkurrenten oder als Sekundärflora auf den gebildeten Fermentationsprodukten entwickeln können. Ein weiterer Nachteil solcher Wirte wie E. coli besteht darin, daß die Produktbildung mit einer Toxinbildung einhergeht, was aufwendige Maßnahmen zur Abtrennung des Toxins vom Produkt erforderlich macht.A disadvantage of the methods developed so far is that complex and expensive media are used. As carbon sources, carbohydrates are usually used; the media have a neutral pH. These factors promote contamination by other microorganisms. They require strict sterility control of the process and make it difficult to carry out continuous cultivation and mass production. It is therefore the application of protective carbon sources and simple media such. As methanol and simple mineral salt solutions sought. One expression of this is host-vector systems which include methylotrophic bacteria (GB-PS 2003926, EP 0066994). The disadvantage of the previously known systems with methylotrophic bacteria, however, is that the growth optimum of the hosts in the neutral pH range, whereby they are also exposed to the competition of a variety of Kontaminantun, developing, for example, as substrate competitors or as secondary flora on the fermentation products formed can. Another disadvantage of such hosts, such as E. coli, is that product formation is associated with toxin formation, requiring elaborate measures to separate the toxin from the product.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Die Erfindung hat das Ziel, für die Gewinnung definierter Proteine Wirt-Vektor-Systeme zu schaffen, die fähig sind, solche Substrate mit protektiver Wirkung wie Methanol zu verwerten, auf einfachen Mineralsalzlösungen zu wachsen und durch ein pH-Optimum des Wachstums im sauren Bereich Schutz vor Kontaminationen zu erreichen. Durch die Einführung solcherThe object of the invention is to provide host-vector systems capable of exploiting such substrates with protective action such as methanol, growing on simple mineral salt solutions, and protecting by a pH optimum of the growth in the acidic region for the recovery of defined proteins to achieve contamination. By introducing such

Wirts-Vektor-Systeme werden Voraussetzungen für eine industrielle Massenproduktion geschaffen. Darüber hinaus sollen als Wirte solche Mikroorganismen verwendet werden, die apathogen und toxlnfrei sind, was nicht nur unter Aspekten des Arbeitsschutzes und der allgemeinen Sicherheit im Produktionsprozeß, sondern auch im Hinblick auf eine vereinfachte Aufarbeitung des Produkts von Bedeutung ist.Host vector systems are being created for industrial mass production. In addition, the hosts to be used are those microorganisms which are non-pathogenic and toxin-free, which is important not only in terms of occupational safety and general safety in the production process, but also in terms of simplified processing of the product.

Explanation of the essence of the invention

Das Wesen der Erfindung besteht darin, daß für die Herstellung von Proteinen tierischer, pflanzlicher, mikrobieller oder viraler Herkunft Wirt-Vektor-Systeme benutzt werden, bei dem die Wirte acidophile methanoloxidierende oder methanolutilisierende Bakterien sind. Diese Bakterien gehören bevorzugt den Gattungen Acetobacter und Gluconobacter an. Die Methylotrophie ist fakultativ. Bevorzugte Wirte sind erfindungsgemäß Stämme der Art Acetobacter methanolicus, die sich durch Methylotropnie in Kombination mit einer ausgeprägten Acidophilie und, im Vergleich zu anderen Acetobncterien hohe Reproduktionsfähigkeit auszeichnen. Das pH-Optimum für das Wachstum liegt bei 3,8-4,0. Die Bakterien dieser Gruppe sind apathogen und toxinfrei. Als Basisvektoren zur Realisierung der Erfindung werden bekannte Klonierungsvektoren, Plat, aide der Gattungen Acetobacter und Gluconobacter oder Phagen der Gattungen Acetobacter und Gluconobacter eingesetzt.The essence of the invention is that host-vector systems are used for the production of proteins of animal, plant, microbial or viral origin in which the hosts are acidophilic methanol oxidizing or methanolutilizing bacteria. These bacteria belong preferably to the genera Acetobacter and Gluconobacter. The methylotrophy is optional. Preferred hosts according to the invention are strains of the species Acetobacter methanolicus, which are distinguished by methylotropnia in combination with a pronounced acidophilicity and, in comparison to other acetobacteria, high reproductive capacity. The pH optimum for growth is 3.8-4.0. The bacteria of this group are non-pathogenic and toxin-free. As basis vectors for the realization of the invention known Klonierungsvektoren, Plat, aide of the kinds Acetobacter and Gluconobacter or phages of the kinds Acetobacter and Gluconobacter are used.

Bevorzugt werden Hasmide der Inkompatibilitätsgruppen Ine P1 und Inc P4 (ζ. B. RP4, R68.45 und RSF1010) sowie deren Derivate einerseits und Plasmide von Stämmen der Gattungen Acetobacter oder Gluconobacter andererseits verwendet. Als weitere Vektoren we'den erfindungsgemäß virulente und temperent'e Phagen von Acetobacter oder Gluconobacter, bevorzugt von Acetobacter methanolicus, eingesetzt. Dies betrifft beispielsweise die Phagen M01, MO2, MO5 und MO6. Des weiteren werden bekannte Klonierungsvektoren, beispielsweise pBR322, für die Konstruktion von Hybridplasmiden mit den oben aufgeführten Vektoren eingesetzt.Hasmids of the incompatibility groups Ine P1 and Inc P4 (B. B. RP4, R68.45 and RSF1010) and their derivatives on the one hand and plasmids of strains of the genera Acetobacter or Gluconobacter on the other hand are preferably used. According to the invention, virulent and temperate phages of Acetobacter or Gluconobacter, preferably of Acetobacter methanolicus, are used as further vectors. This applies, for example, phages M01, MO2, MO5 and MO6. Furthermore, known cloning vectors, for example pBR322, are used for the construction of hybrid plasmids with the vectors listed above.

Die Konstruktion der Vektoren und der Gentransfer erfolgen nach an sich bekannten Methoden, Als Substrate für dio Fermentation werden Methanol und/oder Stoffe mit C-C-Bindungen eingesetzt. Bevorzugte Stoffe mit C-C-Bindungen sind Ethanol, Glucose, Glycerol oder Essigsäure.The construction of the vectors and the gene transfer are carried out according to known methods, as substrates for dio fermentation methanol and / or substances with C-C bonds are used. Preferred substances with C-C bonds are ethanol, glucose, glycerol or acetic acid.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden die vorgesehenen Zielstellungen erreicht. Es ermöglicht die Bildung, Akkumulation und Gewinnung definierter Proteine aus Methanol oder aus Substraten mit C-C-Bindungen durch mikrobielle Fermentation. Solche Proteine können Insulin, Interferon, Chymosin, PLV-Protein sowie intra- und extrazelluläre mikrobielle Enzyme sein. Die Akkumulation intrazellulärer Enzyme kann mit dem Ziel der Überproduktion bestimmter Metabolite (ζ. Β. Aminosäuren, organische Säuren, Vitamine) oder der Effektivierung von Stoffwechselwegen (ζ. Β. verbesserte Ausbeutekoeffizienten bei Fermentationen, Erweiterung des Substratspektrums) erfolgen. Die Erfindung soll anschließend mit folgenden Beispielen näher erläutert werden.By the method according to the invention, the intended objectives are achieved. It allows the formation, accumulation and recovery of defined proteins from methanol or substrates with C-C bonds through microbial fermentation. Such proteins may be insulin, interferon, chymosin, PLV protein as well as intracellular and extracellular microbial enzymes. The accumulation of intracellular enzymes can be carried out with the aim of overproduction of certain metabolites (ζζΒ amino acids, organic acids, vitamins) or the optimization of metabolic pathways (verbesserte Β., Improved yield coefficients in fermentations, extension of the substrate spectrum). The invention will be explained in more detail with the following examples.

Embodiment 1

Herstellung von Genprodukten (Proteinen) durch Expression von artfremden Antibiotikaresistenzgenen In den methanolutilislerenden Stamm Acetobacter methanolicus IMET B 346Production of gene products (proteins) by expression of alien antibiotic resistance genes into the methanolutilislerenden strain Acetobacter methanolicus IMET B 346

1.1. Kurzbeschreibung des Stammes Acetobacter methanolicus IMET B 3461.1. Brief description of the strain Acetobacter methanolicus IMET B 346

Acetobacter methanolicus IMET B346 ist ein Stamm der neubeschriebenen Bakterienspecies Acetobacter methanolicus. Er wurde in der Kulturensammlung des Zentralinstitutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena der AdW der DDR hinterlegt.Acetobacter methanolicus IMET B346 is a strain of the newly described bacterial species Acetobacter methanolicus. He was deposited in the culture collection of the Central Institute for Microbiology and Experimental Therapy Jena of the AdW of the GDR.

Der Stamm wurde aus einem Hefe-Fermentationsprozeß mit Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle isoliert.The strain was isolated from a yeast fermentation process with methanol as sole carbon and energy source.

Er ist acidophil und fakultativ methylotroph. Im Unterschied zu anderen Acetobacter-Stämmen zeigt IMET B 346 gutes Wachstum auf Methanol, Glukose, Glukonsäure, 2,3-Butandiol und Capronsäure als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle. Zum Wachstum wird Pantothensäure oder Hefeextrakt benötigt.It is acidophilic and facultative methylotrophic. Unlike other Acetobacter strains, IMET B 346 shows good growth on methanol, glucose, gluconic acid, 2,3-butanediol and caproic acid as the sole source of carbon and energy. For growth, pantothenic acid or yeast extract is needed.

DNS-rRNS-Hybridisierungsexperimente bestätigen die Zugehörigkeit zu Acetobacter. Die Inkorporation von Methanol erfolgt über den Hexulosephosphat-Weg. Der GC-Gehalt des Stammes beträgt 62,3 Mol-%.DNA-rRNA hybridization experiments confirm that they belong to Acetobacter. The incorporation of methanol takes place via the hexulose phosphate pathway. The GC content of the strain is 62.3 mol%.

Ein bevorzugtes Anzuchtmedium hat folgende Zusammensetzung (Angaben mg/l):A preferred culture medium has the following composition (mg / l):

NH₄CI-761,4; CaCI₂ · 6 H₂O - 5,47; MgSO₄ · 7 H₂O - 71,2; ZnSO₄ 7 H₂O - 0,44; MnSO₄ · 4 H₂O - 0,785; CuSO₄ · 5H₂O-0,785; Na₂MoO₄ · 2 H₂O - 0,252; FeSO₄ · 7 H₂O - 4,98; KH₂PO₄ - 68,05; K₂HPO₄ - 87,09, Pantothensäure -10, Methanol -1 Vol.-% auf 1 Liter Aqua dest. Es wird pH4,0 eingestellt.NH ₄ CI-761.4; CaCl ₂ · 6H ₂ O - 5.47; MgSO ₄ .7H ₂ O - 71.2; ZnSO ₄ 7H ₂ O - 0.44; MnSO ₄ .4H ₂ O - .775; CuSO ₄ .5H ₂ O-0.785; Na ₂ MoO ₄ .2H ₂ O - 0.252; FeSO ₄ .7H ₂ O - 4.98; KH ₂ PO _{4 to} 68.05; K ₂ HPO ₄ - 87.09, pantothenic acid -10, methanol -1 vol .-% to 1 liter of distilled water. It is adjusted pH4.0.

1.2. Konjugative Übertragung des Plasmid3 R68.45 in den Stamm IMET B346 und Expression von Pseudomonas-Antiblotlkareslstenzgenen in diesem Stamm Das Plasmid Π68.45 (Haas and Holloway, 1976) gehört der IncPI-lnkompatibilitätsgruppe von Pseudomonas an.1.2. Conjugative transfer of plasmid 3 R68.45 into strain IMET B346 and expression of Pseudomonas antiblotic residues in this strain Plasmid Π68.45 (Haas and Holloway, 1976) belongs to the IncPI incompatibility group of Pseudomonas.

R 68.45 (37,5 Md) kodiert Tetrazyklin-, Kanamycin- und Carbenicillinreslsienz.R 68.45 (37.5 Md) encodes tetracycline, kanamycin and carbenicillinresity.

Als Donoren werden die Stämme Pseudomonas PAD ML 4262 (Sagai et. al., 1975) und Escherichia coli SK 1590 (Kushner, 1978), in die das Plasmid R68.45 konjugativ übertragen wurde, verwendet. Die konjugative Übertragung des Plasmids aus den neutrophilen Referenzstämmen in den acidophilen methylotrophon Stamm IMET B346 wird durch die unterschiedlichen pH-Optima für das Wachstum erschwert.The donors used are the strains Pseudomonas PAD ML 4262 (Sagai et al., 1975) and Escherichia coli SK 1590 (Kushner, 1978) into which the plasmid R68.45 was conjugatively transferred. The conjugative transfer of the plasmid from the neutrophil strains into the acidophilic methylotrophone strain IMET B346 is hampered by the different pH optima for growth.

In Wachstumsversuchen wurde ermittelt, daß bei pH = 6 die Kultivierung sowohl der neutrophilen Stämme als auch des acidophilen Stammes möglich ist.In growth experiments it was determined that at pH = 6, the cultivation of both the neutrophils and the acidophilic strain is possible.

Für die Konjugationsversuche wird ein mit Phosphatpuffer nach Sörensen stabilisierter Agar (pH = 6) verwendet, der neben den in 1.1. angegebenen Spurensalzen 1 % Methanol, 0,1 % Glukose, 20μς/ητιΙ Pantothensäure und 20ng/ml Thiamin (bei Kreuzungen mit E.coli SK1590 (R68.45) bzw. je 50\ig/m\ Tryptophan, Isoleucin, Valin und Methionin (bei Kreuzungen mit Ps. aeruginosa ML 4262 (R68.45) sowie 1,8% Agar-Agar enthält.For the conjugation experiments, an agar (pH = 6) stabilized with Sörensen phosphate buffer is used, which in addition to the in 1.1. specified trace salts 1% methanol, 0.1% glucose, 20μς / ητιΙ pantothenic acid and 20ng / ml thiamine (in crosses with E. coli SK1590 (R68.45) or 50 \ ig / m \ tryptophan, isoleucine, valine and methionine (at crosses with Ps. aeruginosa ML 4262 (R68.45) and 1.8% agar-agar.

Donor und Rezipient werden his zu einer Zelldichte von etwa 10" Zellen/ml gezüchtet und im Verhältnis 1:3 gemischt. 0,2ml des Gemisches werden auf Konjugationsplatten mit dem oben beschriebenen Agar gespatelt. Nach 24stündiger Inkubation bei 3O⁰C werden die Zellen in 2ml Sörensenpuffer aufgenommen und auf Selsktionsplatten zur Erfassung der Transkonjugenten (Selektion auf Tetrazyklinreslstenz-6(^g/mlTetrazyklln)sowiezur Titerbestimmung von Donor und Reziplentausgespatelt. Die Transkonjuganten werden auf den Gleichzeitigen Erwerb der anderen Antibiotikaresistenzmarker des Plasmids (Kanamycin, Carbenicillin) überprüft.Donor and recipient are his grown to a cell density of about 10 "cells / ml and the ratio of 1:.. 0.2 ml of the mixture are mixed for 3 spatulated on Konjugationsplatten with the above-described agar After 24 hours of incubation at 3O ⁰ C, the cells are in 2ml of Sörensen buffer was sampled on Selsktionsplatten for detection of the Transkonjugenten (selection on Tetracycline Residue-6 (^ g / mlTetrazyklln) and for titer determination of donor and Reziplent.) The transconjugants are checked for the simultaneous acquisition of other antibiotic resistance markers of the plasmid (kanamycin, carbenicillin).

Die Übertragung des Plasmids R68.45 aus den Stämmen Ps.aeruglnosa ML4262 (R68.45) bzw. E.coli SK1590 (R68.45) erfolgt mit einer Frequenz von 10² bzw. ca. 10~⁴ Transkonjuganten pro Rezipientenzelle in den Stamm IMET B346.The transfer of the plasmid R68.45 from the strains Ps.aeruglnosa ML4262 (R68.45) or E. coli SK1590 (R68.45) takes place with a frequency of 10 ² or about 10 ~ ⁴ transconjugants per recipient cell into the strain IMET B346.

Von jeweils 100 überprüften Transkonjuganten erweisen sich normalerweise alle gegenüber Kanamycin (200 Mg/ml) und Carbenicillin (2QQ0\ig/m\) als resistent, während der Stamm IMET 8346 bei diesen Antibiotikakonzentrationen zum Wachstum nicht fähig ist.Of every 100 transconjugants tested, all are normally resistant to kanamycin (200 μg / ml) and carbenicillin (2QQ0 \ ig / m \) , while the strain IMET 8346 is not capable of growth at these antibiotic concentrations .

Die Fähigkeit zur konjugativen Übertragung des Plasmids wird durch Konjugationen zwischen den plasmidtragenden Transkonjuganten IMET B346 (R68.45) und einer rifampicinresistenten Mutante dieses Stammes überprüft. Das Selektionsmedium enthält Tetra2yklin (50pg/ml) und Rifampicin (50pg/ml). Tetrazyklinresistente Transkonjuganten treten mit einer Rate von 10"³-10 ⁵ pro Donorzelle in Abhängigkeit vom plasmidtragenden Donor auf. Die Transkonjuganten erwerben gleichzeitig Kanamycin- und Carbenicillinresistenz.The ability to conjugate the plasmid is checked by conjugations between the plasmid-bearing transconjugant IMET B346 (R68.45) and a rifampicin-resistant mutant of this strain. The selection medium contains Tetra2yklin (50pg / ml) and rifampicin (50pg / ml). Tetracycline-resistant transconjugants occur at a rate of 10 ^{-3 3} -10 ⁵ per donor cell as a function of the plasmid-bearing donor, and the transconjugants simultaneously acquire kanamycin and carbenicillin resistance.

Es ist auch die Rückübertragung von R68.45 aus IMET B346 (R68.45) in die Stämme Ps. aeruginosa ML4262 und E.coli C600 möglich. Die Selektion erfolgt auf Tetrazyklinresistenz, zur Gegenselektion wird Rifampicin eingesetzt. Die Transferraten des Plasmids liegen bei etwa 10"' Transkonjuganten pro Rezipientenzejle (bei Kreuzungen mit Ps.aeruginosa ML4262) bzw. etwa 10"⁴ Transkonjuganten pro Rezipientenzelle (bei Kreuzungen mit E.coli C600). Die Transkonjuganten erwerben gleichzeitig Kanamycin- und Carbenicillinresistenz.It is also the reverse transfer of R68.45 from IMET B346 (R68.45) in the strains Ps. Aeruginosa ML4262 and E. coli C600 possible. The selection is based on tetracycline resistance, for counterselection rifampicin is used. The transfer rates of the plasmid are about 10 "transconjugants per recipient (in crosses with Ps.aeruginosa ML4262) and about 10" ⁴ transconjugants per recipient cell (in crosses with E. coli C600). The transconjugants acquire kanamycin and carbenicillin resistance simultaneously.

Durch die gleichzeitige konjugative Übertragung verschiedener Plasmidmarker (Antibiotikaresistenzen, Replikationsursprung, Tra-Gene) ist gezeigt, daß das Plasmid R 68.45 vollständig in den Stamm IMET B346 übertragen wird. Die auftretenden Antibiotikaresistenzen beweisen, daß die verantwortlichen Genprodukte (z.B. ß-Lactamase, Phosphotransferase) durch Expression der Pseudomonas-Antibiotikaresistenzgene in dem methylotrophen Bakterium synthetisiert werden.The simultaneous conjugative transfer of various plasmid markers (antibiotic resistance, origin of replication, Tra genes) shows that the plasmid R 68.45 is completely transferred to the strain IMET B346. The antibiotic resistances that occur prove that the responsible gene products (e.g., β-lactamase, phosphotransferase) are synthesized by expression of the Pseudomonas antibiotic resistance genes in the methylotrophic bacterium.

1.3. Mobilisierung des Plasmids RSF1010 mittels R68.45 durch Konjugation in den Stamm Ac. methanolicus IMET B346 und Expression des Escherichia coil - Streptomycinresistenzgens in diesem Stamm Das Plasmid RSF1010 (Guerry et. al., 1974) gehört zur Inkompatibilitätsgruppe IncQ; (lncP4 von Pseudomonas) und determiniert Streptomycinresistenz. Es ist selbst nicht konjugativ übertragbar, kann aber durch andere Plasmide (z. B. R68.45) mobilisiert werden.1.3. Mobilization of the plasmid RSF1010 by means of R68.45 by conjugation into the strain Ac. methanolicus IMET B346 and expression of the Escherichia coli Streptomycin resistance gene in this strain The plasmid RSF1010 (Guerry et al., 1974) belongs to IncQ Incompatibility Group; (lncP4 from Pseudomonas) and determines streptomycin resistance. It is not transmissibly conjugative, but can be mobilized by other plasmids (eg R68.45).

Zur Mobilisierung werden als Donorstämme Pseudomonas aeruginosa PAO ML 4262 (RSF1010, R68.45) und Escherichia coli SK1590 (RSF 1010, R 68.45) verwendet.For mobilization, Pseudomonas aeruginosa PAO ML 4262 (RSF1010, R68.45) and Escherichia coli SK1590 (RSF 1010, R 68.45) are used as donor strains.

Doncr und Rezipient werden bis zu einer Zelldichte von etwa 10⁸-10⁹ Zellen/ml gezüchtet und im Verhältnis 1:5 gemischt. 0,2 ml des Gemisches werden auf Konjugationsplatten, die die gleiche Zusammensetzung wie in 1.2. haben, gespatelt. Nach 24stündiger Inkubation bei 30°C werden die Zellen in 2ml Sörensenpuffer aufgenommen und auf Selektionsplatten ausgespatelt.Doncr and recipient are cultured to a cell density of about 10 ⁸ -10 ⁹ cells / ml and mixed in a ratio of 1: 5. 0.2 ml of the mixture are applied to conjugation plates having the same composition as in 1.2. have, spat. After 24 hours incubation at 30 ° C, the cells are taken up in 2 ml Sörensenpuffer and herauspatelt on selection plates.

Die Selektionsplatten enthalten neben dem in 1.1. beschriebenen Medium mit 1,8% Agar-Zusatz noch 50pg/ml Tetrazyklin (Selektion auf R68.45 Transfer), 200pg/ml Streptomycin (Selektion auf RSF1010-Transfer) oder beide Antibiotika (Selektion auf Transfer beider Plasmide). Gleichzeitig werden Lebendzellzahlbestimmungen für Donor und Rezipient auf entsprechenden Selektivnährböden und Kontrollen zur Erfassung antibiotikaresistenter Mutanten durchgeführt.The selection plates contain in addition to the 1.1. described medium with 1.8% agar supplement still 50pg / ml tetracycline (selection on R68.45 transfer), 200pg / ml streptomycin (selection on RSF1010 transfer) or both antibiotics (selection for transfer of both plasmids). At the same time, live cell count determinations are performed on donor and recipient on appropriate selective media and controls for detecting antibiotic-resistant mutants.

Die Transferraten des Pasmids RSF1010 betragen bei Kreuzungen unter Verwendung von Ps.aerugionosa ML4262 (RSF1010, R 68.45) etwa 10~² Transkonjuganten pro Donorzelle, bei Kreuzungen unter Verwendung von E.coli SK1590 (RSF 1010, R 68.45) etwa 10~⁴ Transkonjuganten pro Donorzelle. Die entsprechenden Transferraten des Plasmids R68.45 liegen in beiden Kreuzungen etwa vierfach höher. Ungefähr 10-20% der RSF1010 tragenden Transkonjuganten enthalten gleichzeitig R68.45.The transfer rates of the Pasmids RSF1010 be at intersections using Ps.aerugionosa ML4262 (RSF1010, R 68.45) about 10 ~ ² transconjugants per donor cell, wherein crosses using E. coli SK1590 (RSF 1010 R 68.45) about 10 ~ ⁴ transconjugants per donor cell. The corresponding transfer rates of the plasmid R68.45 are about four times higher in both crosses. Approximately 10-20% of the RSF1010-bearing transconjugants simultaneously contain R68.45.

Die Resistenz gegenüber Streptomycin in IMET B346 (RSF 1010) beweist, daß das verantwortliche Genprodukt (Phosphotransferase) durch Expression des Escherichia coli-Antibiotikaresistenzgens in dem methylotrophen Bakterium synthetisiert wird.Resistance to streptomycin in IMET B346 (RSF 1010) proves that the responsible gene product (phosphotransferase) is synthesized by expression of the Escherichia coli antibiotic resistance gene in the methylotrophic bacterium.

Literaturliterature

Guerry, P., J.VanEmbden, S.Falkow, 1974.Guerry, P., J. VanEmbden, S. Falkow, 1974.

J.Bacteriol. 117: 619-630.J. Bacteriol. 117: 619-630.

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Molec. Gen. Genetics 144: 243-251.Molec. Gene. Genetics 144: 243-251.

Kushner.S.R., 1978.Kushner S.S., 1978.

In: Genetic Engineering (H.VV. Boyer, S. Nikosia, ede.), Elsevier/North-Holland, pp. 17-23.In: Genetic Engineering (H.VV. Boyer, S. Nicosia, ed.), Elsevier / North-Holland, pp. 17-23.

Sagai, H., V.Kremen/, K.Hasuda, S.lyobe, H.Knothe, S.Mitsuhashi, 1975, Jpn. J.Microbiol. 19:427-432.Sagai, H., V.Kremen /, K.Hasuda, S.lyobe, H.Knothe, S.Mitsuhashi, 1975, Jpn. J.Microbiol. 19: 427-432.

Example 2

Herstellung des PhagenvektorsProduction of the phage vector

Durch Fermentation des Stammes MB70 auf Methanol als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle wurden Kulturfiltrate erzeugt und 2 Phagenstämme mit voneinander abweichenden Wirtsspektren isoliert. Die Phagen wurden als MO 5 und MO 6 bezeichnet.By fermentation of strain MB70 on methanol as sole carbon and energy source, culture filtrates were generated and 2 phage strains were isolated with differing host spectra. The phages were designated MO 5 and MO 6.

Beide Phagen sind zur Lysogenisierung des sensiblen MB70-Stammes befähigt:Both phages are capable of lysogenizing the sensitive MB70 strain:

Genetisches Material (Phagengenom) wird mit dem Phagen MO5 in den acidophilen methanolassimilierenden Bakterienstamm MB70 eingeführt. Der Phage MO5 enthält Doppelstrang-DNA und vermehrt sich virulent auf dem Stamm MB70 mit einer Latenzzeit von 90 Minuten und einer Wurfgröße von 58 pfu/ml infizierte Zelle. Zur Einführung des Phagengenoms in die Wirtszelle (Lysogenisierung) werden gleiche Anteile einer Suspension des Bakterienstammes (etwa 10⁹cfu/ml) und einerGenetic material (phage genome) is introduced with the phage MO5 in the acidophilic methanolassimilierenden MB70 bacterial strain. The phage MO5 contains double-stranded DNA and proliferates virally on strain MB70 with a latency of 90 minutes and a litter size of 58 pfu / ml of infected cell. For the introduction of the phage genome in the host cell (lysogenization) are equal proportions of a suspension of the bacterial strain (about 10 ⁹ cfu / ml) and a

Suspension des Phagen MO5 (etwa 10⁹pfu/ml) gemischt und auf Grundagarplatten ausgespatelt. Nach einer Inkubationszeit von 3 bis 4 Tagen werden die überlebenden Kolonion isoliert und auf Sensitivität gegen den Phagen MO 5 geprüft. Ausgewählte M05-unempfindliche isolate werden in Submerskultur gezüchtet und zur Induktion des lytischen Zyklus des eingeführten Prophagen mit UV-Licht bestrahlt. Ausgangsmaterial für die Induktionsversuche waren exponentiell gewachsene Submerskulturen des MO5-lysogenisierten Stammes MB70.Suspension of phage MO5 (about 10 ⁹ pfu / ml) mixed and herauspatelt on Grundagarplatten. After an incubation period of 3 to 4 days, the surviving colonions are isolated and tested for sensitivity to the phage MO 5. Selected M05-insensitive isolates are grown in submerged culture and irradiated with UV light to induce the lytic cycle of the introduced prophage. The starting material for the induction experiments were exponentially grown submerged cultures of the MO5 lysogenized strain MB70.

Die UV-Bestrahlung der Bakteriensuspension erfolgte in Petrischalen (Schichthöhe 0,2cm) unter einer Niederdruck-Quecksilberdampflampe mit einem Emissionsmaximum bei 253,7nm im Dosisbereich zwischen 250 und 3000erg · mm"¹. Bei allen untersuchten MO5-resistenten Isolaten konnte eine Freisetzung des Phagen MO5 durch UV-Bestrahlung der lysogenisierten Wirtszellen erreicht werden.The UV irradiation of the bacterial suspension was carried out in Petri dishes (bed height 0.2 cm) under a low-pressure mercury vapor lamp having an emission maximum at 253,7nm in the dose range between 250 and 3000erg · mm ^'1. For all examined MO5-resistant isolates could be a release of phage MO5 can be achieved by UV irradiation of the lysogenized host cells.

Nach dem im Beispiel erläuterten Prinzip zur Isolierung von Phagenvektoren aus dem Stamm MB70 sind weitere Vektoren aus anderen acidophilen r-.ethanolverwertenden Bakterienstämmen isolierbar (Wünsche u.a., Z.AIIg.Mikrobiol., 23 [2] 1983,81 bis 94).According to the principle explained in the example for the isolation of phage vectors from the MB70 strain, further vectors can be isolated from other acidophilic r. Ethanol-utilizing bacterial strains (desires et al., Z.Allg.Mikrobiol., 23 [2] 1983, 81 to 94).

Claims

1. A process for the preparation of defined proteins by recombination of a DNA sequence with a vector, transfer of the resulting recombinants in a microorganism and subsequent fermentation, characterized in that as hosts acidophilic methanol oxidizing or methanolutibisierende bacteria, known as base vectors cloning vectors, plasmids of the genera Acetobacter and Gluconobacter or phages of the genera Acetobacter and Gluconobacter and used as substrates methanol and / or substances with CC bonds.

2. The method according to claim 1, characterized in that bacteria are used as hosts of the genera Acetobacter and Gluconobacter.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that are used as hosts strains of the species Acetobacter methanolicus.

4. Process according to Claims 1 to 3, characterized in that the strains IMET10945 or IMET B 346 or Acetobacter methanolicus MB 70 are used as hosts.

5. The method according to claim 1, characterized in that are used as vectors plasmids of incompatibility groups IncPI and Ine P4, such as RP4, R68.45 and RSF1010 and their derivatives.

6. The method according to claim 1, characterized in that are used as vectors plasmids of strains of the genera Acetobacter or Gluconobacter.

7. The method according to claim 1, characterized in that are used as vectors phages of Acetobacter methanolicus, such as MO 1, MO2, MO5 and MO6.

8. The method according to claim 1, characterized in that hybrids from known cloning vectors and the vectors according to claim 6 and 7 are used as vectors.

9. The method according to claim 1 to 8, characterized in that are used as substances with C-C bonds, ethanol, glucose, glycerol or acetic acid.