DD273073A1 - Verfahren zur quantitativen bestimmung von citrat - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Citrat der allgemeinen Formel R1R2R3&OOCCH2C(OH)(COO)CH2COO!.Citratbestimmungen werden insbesondere benoetigt bei der Untersuchung von chemischen Reaktionsgemischen, Lebensmitteln, biologischen Medien mit Zellstoffwechsel und Koerperfluessigkeiten, d. h. in der klinisch-chemischen Analytik. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass das in der Probe enthaltene Citrat spezifisch enzymatisch gespalten, in Oxalat ueberfuehrt und anschliessend die Photonenemission bei dessen oxydativer Zersetzung mit einem Chemilumineszenzmessgeraet registriert wird. Dabei koennen auch sehr kleine Mengen Citrat quantitativ erfasst werden.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Citrat der allgemeinen Formel R1R2R3IOOC-Ch2-C(OH)(COO)-CH2-COO),
wobei R'"3 = beliebige anorganische oder organische Reste, wie z.B.: Wasserstoff, Metallatome, Ammonium-, Alkyl-, Aryl-, Amid-, Cycloalkvlgruppen, heterocyclische Ringsysteme oder negative Ladungen sein können.
Citratbestimmungen sind fester Bestandteil des chemisch-analytischen Arbeitens. Insbesondere werden sie benötigt bei der Untersuchung von Reaktionsgemischen, Lebensmitteln, Körperflüssigkeiten u. 9., d. h. in der klinisch-chemischen und biochemischen Analytik.
Neben älteren, wenig spezifischen und nur mäßig empfindlichen gravimetrischen, titrimetrlschen bzw. photometrischen Verfahren sind gegenwärtig folgende technische Lösungen praxisrelevant:
1. Oxydation zu Acetondicarbonsäure, welche als Pentubromaceton bestimmt wird (S. NATELSON, J. B. PINCUS, I. K. LUGOVOY; J. biol. Chem. 175,745/1948). Nachteilig hierbei ist insbesondere die geringe Spezifität des Verfahrens in Verbindung mit mehreren arbeitsschutz-technisch anspruchsvollen und energieintensiven Zwischenschritten (z.B. Abrauchen von konzentrierter Schwefelsäure)
2. Oxydation zu Aceton und dessen Bestimmung nach TAEUFEL und MAYR (Z. anal. Chem. 93,14/1933). Nachteilig hierbei ist insbesondere der Verbrauch sehr großer Probemengen, die geringe Spezifität der Reaktion bzw. die Störung durch zahlreiche andere organische Säuien.
3. Enzymatische Bestimmung nach WARTY (Clin. Chem. 30,1231/1984) bzw. mlrtols Boehringer-Mannheim-Testkomblnation (Best.-Nr. ' .9076). Dabei wird Citrat durch Citratlyase in Oxalacetat und Acetat überführt. Oxalacetat und dessen Decarboxylierungsprodukt Pyruvat werden dann durch NADH in Kombination mit Lactatdehydrogenase und Malatdehydrogenasezu Lactat bzw. Malat reduziert. NADH ist Meßgröße und wird aufgrund seiner Absorption bei 334,340 oder 365nm spoktrophotometrisch bestimmt. Nachteilig hierbei ist der hohe Preis der benötigten Enzymkombinationen. Chemilumineszenzmessungen haben sich gegenwärtig vor allem in der klinisch chemischen und biochemischen Analytik etabliert. Bezüglich der quantitativen Bestimmung von Citrat ist bisher keine chemiluminometrische Methode bekannt.
Ziel der Erfindung ist die Entwicklung eines einfachen, ökonomisch günstigen Verfahrens zur quantitativen Citratbestimmung, welches universell für verschiedenste Untersuchungsmaterialien bzw. Stoffgemische einsetzbar ist und eine hohe Sensivität bzw. Spezifität aufweist.
Aufgabe der Erfindung ist es, Citronensäure bzw. citrathaltige Stoffgemische so aufzubereiten, daß auch kleinste Mengen Citrat quantitativ mittels Chemilumineszenzmessung erfaßbar sind.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Citronensäure bzw. die citrathaltige Probelösung spezifisch enzymatisch mittels Citratlyase in Oxalessigsäure und Essigsäure gespalten wird. Oxalessigsäure und dessen
Decarboxylierungsprodukt Brenztraubensäure werden dann mit einem geeigneten Oxydationsmittel, vorzugsweise einem löslichen Salz einer HalogensauerstoffsBure mit oder ohne Katalysator in Oxalat überführt. Dieses wird oxydativ zersetzt und die dabei auftretende Photonenemission registriert.
Citratlyase -CO2
C i t r a t ' t— Acetat + Oxalacetat » Pyruvot
Oxydator
Oxalat
Oxydator
chemiluminometrische Bes t iinmung
Die Menge der emittierten Photonen steht in direktem Zusammenhang mit der Citratkonzentration. Schwerlösliche Citrate bzw. organische CitronensSurederivate müssen entsprechend aufgeschlossen werden. Je nach Empfindlichkeit des Photomultipliers im verwendeten Luminometer lassen sich dabei Citratkonzentrationen im μπιοΙ- bis nmol-Bereich erfassen. Die chemiluminometrische Messung erfolgt im Temperaturbereich von 20 bis 500C, vorzugsweise bei Zimmertemperatur. Besondere Vorzüge des Verfahrens sind:
1. hohe Sensitivität durch das angewendete Lumineszenzmeßprinzip
2. hohe Spezifität bedingt durch den enzymatischen Teilschritt mittels Citratlyase
3. großo Anwendungsbreite
4. größere Wirtschaftlichkeit im Vergleich zum einzig ähnlich sensitiven vollenzymatischen Verfahren (vgl. Pkt. 3. bei Charakteristik des bekannten Standes der Technik) durch Einsparung der Enzyme Malatdehydrogenase, Lactatdehydrogenase bzw. des Coenzyme NADH
5. energieintensive Vörfahrensschrltte (Erhitzen, Einengen, Destillieren) entfallen
einwirken läßt und dann 100μΙ 10η HCI zusetzt.
absolutem Ethanol. Gleichzeitig wird die Messung der Photonenemission gestartet. Aus dem über die ersten zwei Sekunden integrierten Meßwert erholt man durch eine unter analogen Bedingungen aufgestellte Eichkurve (10,20,40,60,80,100mg/l
B'iiplel 2
zusammengestellt:
5g N-Cyclohexyl-N'-S-trimethylammonium-propyl-carbodiimid-p-toluensuifonat (Me)N-(CHi)1-NBC=N-CeHnI^ (H)C-C(H4-
zu einem Mililiter Reagenzlösung in die Meßkr/nmer des Luminometen dosiert, bei simultaner Messung der Photonenemission über die ersten Ί Sekunden. Zur Ermittlung der cltratunspeiifischen Emission (Eigengehalt der Probe an Oxalat) werden 100μ| analog vorbereitete Probenlösung ohne Citratlyasezusatz eingesetzt. Die Differenz der beiden Meß '/orte ergibt den Eigengehalt der Probe an Citrat, welcher einef entsprechend aufgestellten Elchkurve aus wflßriger Citratlösu. ,g entnommen werden kann.
Claims (4)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Citrat der allgemeinen Formel
wobei R1"3 = beliebige anorganische oder organische Reste, wie z. B. Wasserstoff, Metallatome, Ammonium-, Alkyl-, Aryl-, Amid-, Cycloalkylgruppon, heterocyclische Ringsysteme oder negative Ladungen sein können, gekennzeichnet dadurch, daß das in der Probe enthaltene Citrat spezifisch enzymatisch gespalten, in Oxalat überführt und anschließend die Photonenemission bei dessen oxydativer Zersetzung mit einem Chemilumineszenzmeßgerät registriert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als spezifisches Enzym vorzugsweise Citratlyase eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß zur Überführung in Oxalat ein Oxydator, vorzugsweise ein lösliches Salz einer Halogensauerstoffsäure, wie z. B. Natriumchlorat oder Natriumchlorit, mit oder ohne Katalysator, wie z. B. Osmiumtetroxid, eingesetzt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Messung der Photonenemission im Temperaturbereich von 20 bis 500C, vorzugsweise bei Zimmertemperatur, durchgeführt wird.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31697388A DD273073A1 (de) | 1988-06-21 | 1988-06-21 | Verfahren zur quantitativen bestimmung von citrat |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD31697388A DD273073A1 (de) | 1988-06-21 | 1988-06-21 | Verfahren zur quantitativen bestimmung von citrat |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD273073A1 true DD273073A1 (de) | 1989-11-01 |
Family
ID=5600201
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD31697388A DD273073A1 (de) | 1988-06-21 | 1988-06-21 | Verfahren zur quantitativen bestimmung von citrat |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD273073A1 (de) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1088886A1 (de) * | 1999-09-30 | 2001-04-04 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Holo-Citratlyase |
| EP1090988A1 (de) * | 1999-09-30 | 2001-04-11 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Holo-Citratlyase |
-
1988
- 1988-06-21 DD DD31697388A patent/DD273073A1/de not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1088886A1 (de) * | 1999-09-30 | 2001-04-04 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Holo-Citratlyase |
| EP1090988A1 (de) * | 1999-09-30 | 2001-04-11 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Holo-Citratlyase |
| US6812019B1 (en) | 1999-09-30 | 2004-11-02 | Roche Diagnostics Gmbh | Process for the recombinant production of holo-citrate lyase |
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