DD264457A1 - Verfahren zum abbau von staerkepolysacchariden mittels immobilisierter enzyme - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abbau von Staerkepolysacchariden mittels immobilisierter Enzyme und laesst sich in der Staerkeindustrie anwenden. Ziel der Erfindung ist es, die Totalhydrolyse von Maisstaerke mit Hilfe immobilisierter, staerkeabbauender Enzyme so zu gestalten, dass die Probleme des Langzeitbetriebes von Enzymreaktoren in einfacher Weise geloest sind, dass die Hydrolyse in oekonomisch guenstiger Weise erfolgt und dass die Produkte eine solch hohe Reinheit besitzen, dass sie ohne weitere Reinigung in einer handelsueblichen Form konfektioniert werden koennen. Erfindungsgemaess laesst sich die Aufgabe loesen, indem man eine Staerkemilch mit Saeure verfluessigt, zum Zwecke der Reinigung und Keimzahlreduzierung einer Pre-coat-Filtration und einer kurzzeitigen, kontinuierlichen Waermebehandlung unterwirft und anschliessend einer Feinreinigung in einem Adsorberrohr unterzieht. Die kontinuierliche Prozessfuehrung wird dabei durch mindestens zwei, parallel geschaltete Adsorberrohre erreicht. Die Totalhydrolyse der Staerkeoligosaccharide erfolgt in einem Reaktionsrohr, das mit einem Enzymtraegermaterial auf Polystyrenbasis gefuellt ist. Die staerkeabbauenden Enzyme sind an dieses Traegermaterial kovalent gebunden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Abbau von Störkepolyuacchariden, deren Abbauprodukten oder anderen stärkehaltigen Rohstoffen zum Zwecke der Gewinnung fester oder flüssiger Glucose, Maltose, Oligosaccharide, niedermolekularer Stärkepolysaccharide, deren Gemische oder Totalzucker mittels trägerfixierter stärkehydrolysierender Enzyme. Das Verfahren läßt sich in der Stärkeindustrie anwenden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Umwandlung stärkehaltigen Materials in Glucose, oder die Herstellung verschiedener Oligasaccharidlösungen, die eine möglichst exakt definierbare Zusammensetzung haben sollen, ist ein seit längerer Zeit beherrschtes großtechnisches Verfahren.

Entsprechend der Natur der Stärkepolysaccharide—diese Bezeichnung soll der Einfachheit halber auch die anderen stärke- oder dextrinhaltigen Rohstoffe mit einschließen — läßt sich die Spaltung der glycosidischen Rindungen zwischen den Polysaccharidgrundbausteinen durch verschiedene Methoden erreichen, di zugleich die Grundlage der heute gängigen großtechnischen Verfahren zur Gewinnung von Glucose oder anderen Abbauprodukten der Stärke darstellen. Derartige Verfahren lassen sich in drei Gruppen einteilen.

Bei den Säure-Enzym-Verfahren führt man mit der hochmolekularen Stärkemilch (30-40% Feststoffanteil) zunächst eine Druckerhitzung bei verhältnismäßig hohen Temperaturen in Anwesenheit verdünnter Säuren (beispielsweise Salzsäure, Oxalsäure) durch. Dadurch verkürzt sich die Kettenlänge der ursprünglich eingesetzton Stärke auf etwa 5 bis 6 Anhydroglucoseeinheiten. Nach dem Abkühlen des Dextringemisches, der Neutralisation der überschüssigen Säure und der Korrektor des pH-Wertes auf den für das jeweilige Enzym optimalen Wert, läßt man unter geeigneten Bedingungen stärkehydrolysierende Enzyme einwirken, bis der Umwandlungsgrad den gewünschten Wert erreicht hat. Um ein konkretes Beispiel anzuführen, läßt man Glucoamylase (A. niger) auf das Stärkevorhydrolysat einwirken, so wird der Großteil der eingesetzten Dextrine zu Glucose umgewandelt.

Diese Verfahrensweise ist Gegenstand zahlreicher Patentschriften, wie z. B. der US-Patente Nr. 2.304.168,2.893.921 oder der DD WP119341.

Glucoamylase als exoamylolytisches Enzym bewirkt die Abspaltung von Glucoseresten aus dem Stärkemolekül, wobei der Abbau vom nichtreduziorenden Kettenende her erfolgt. Die zur Verfahrensdurchführung bonötigten Glucoamylasezubereitungen sind kommerziell leicht erhältlich und werden aus der Kulturflüssigkeit zahlreicher Mikroorganismen isoliert. Für die großtechnische Herstellung solcher Glucoamyfasezubereitungen haben sich Aspergillus-, Rhizopus- und Endomycopsisspezies durchgesetzt.

Die dritte allgemeine Gruppe substitiert den ersten Verfahrensschritt des soeben erläuterten Säure-Enzym-Verfahrens dahingehend, daß ?ur Verflüssigung der hochmolekularen Stärke a-Amylase bacterieilen oder pilzlichen Ursprungs verwendet

a-Amylasepräparate wirken als Endohydrolasen und bringen unter geeigneten Bedingungen als Reaktionsprodukte Dextrine hervor, deren durchschnittlicher Polymerisationsgrad dem bei der sauren Vorhydrolyse entspricht.

Derartige Verfahren weisen trotz der Tatsache, daß sie bereits im großen Umfang industriell genutzt werden, wesentliche Nachteile auf. Wegen des Einsatzes der Enzyme in löslicher Form kann damit nur ein chargenweiser Betrieb realisiert werden.

Daraus ergibt sich bei der großen Menge zu produzierender Glucose, daß das Volumen der benötigten Apparate und Mebeneinrichtungen im Verhältnis zur erzeugten Glucosemenge ungerechtfertigt hoch ist. Um die diskontinuierlich geführte Verzuckerung der Stärke an die nachfolgenden kontinuierlichen Prozesse zu adaptieren machen sich umfangreiche Zwischenlager mit einem erhöhten Bedienungsaufwand erfordorlich. Der Energieaufwand ist relativ hoch, weil die Reaktionstemperatur um 30 bis 4O⁰C (je nach verwendetem Verzuckerungsenzym) über der Umgebungstemperatur liegt und über einen Zeitraum von 48 bis 96 Stunden aufrecht erhalten werden muß.

Die Größe der Anlage, der ri.argenbetriob, die lange Reaktionszeit und die relativ niedrige Prozeßtemperatur begünstigen das Eindringen unerwünschter Mikroorganismen, die ihrerseits biochemische Nebenreaktionen auslösen können und somit unter Umständen die Produktausbeute empfindlich verringern können.

Weitere Nachteile liegen darin begründet, daß die Enzyme, die nach Ablauf eines Reaktionszyklus als Biokatalysatoren prinzipiell unverändert wieder vorliegen, unter großtechnischen Bedingungen aber nicht oder nur unter großem matoriell-technischon Aufwand zurückgewonnen werden können.

Die DE-AS 2402226 umgeht diesen Nachteil, indem die Enzyme über einen Polystyrolsulfonaustauscher durch lonenaustauschchromatographie zurückgewonnen werden. Die Rückgewinnung der Enzyme läßt sich ohne größeren Aktivitätsverlust etwa 7 bis 10mal wioderholen. Das in der beschriebenen DE-AS vorgeschlagene Verfahren weist zwar gegenüber der DE-OS 2039222 (Enzymrückgewinnung mittels Ultrafiltration) wesentliche Vorteile auf, bringt aber dennoch Nachteile mit sich. Diese bestehen z. B. darin, daß die Austauscherkolonnen ein sehr großes Volumen aufweisen müssen, um das Eruym quantitativ zurückgewinnen. Da bei diesem Prozeß Wasser als Elutionsmittel verwendet wird, bewirkt dies gleichzeitig eine nicht zu unterschätzende Verdünnung, sowohl des Enzyms, als auch der erzeugten Monosaccharidlösung. Die vorgeschlagene Konzentrierung beider Komponenten erfordert einen erhöhten Energie- und Ausrüstungsaufwand. Es lag deher nahe, die zur Verzuckerung eingesetzten Enzyme derart zu modifizieren, daß sie leicht und ohne großen Aufwand aus dem Reaktionsansatz entfernt werden können. Dieses Ziel erreicht man beispielsweise durch die prinzipiell bekannte Methode dor chemischen odor physikalischen Bindung der als Biokatalysatoren verwendeten Proteino an hochpolymere, meist wasserunlösliche, feste Träger, din im allgemeinen hochporös sind, um die Oberfläche, die zur Bindung des Enzyms zur Verfugung steht, entscheidend zu vergrößern.

Die hergestellten Enzym-Träger-Komplexe können dann stationär oder fluid in geeigneten Behältnissen (Rührgefäße oder κ

Strömungsrohre) angeordnet werden und in einom kontinuierlichen PRozeß mit der zu behandelnden Lösung eines Stoffes ir Γ Kontakt gebracht werden. Auf diese Weise gelingt es, einige der Nachteile von Verfahren mit löslichen Enzymen zu umgehen J

bzw. abzubauen. Dies betrifft besonders solche, die aus der Größe der Anlagen, dem hohen Verbrauch an Energie und Enzymen ^u

und dem chargenweisen Betrieb resultieren.

Die Herstellung und die Eigenschaften von Enzym-Träger-Komplexen sowie die potentiellen Anwendungsmöglichkeiten ist in zahlreichen Druckschriften beschrieben, so z.B. bei LANG et al. in: Chemikerzeitung 96 (11), 69&-602 (1972), bei OLSON in Scienza I Tecnica Lattiero-Casearia 27 (5), 365-384 (1974), bei FINK et al. in AlChe Symp. Ser. 172,74,18-24 (1978), bei van BEYNUM in Biotechnol. Letters 2,127-132 (1980), bei MANECKE und VOGT in J. Membrane Science 6,61-67 (1980) oder in „Methods in Enzymology" 44, Academic Press Inc. New York (1976). Auf Grund der Bedeutung der Glucoseherstellung hat es nicht an Vorsuchen gemangelt, Glucoamylase oder auch andere stärkehydrolysierende Enzyme in immobilisierter Form einzusetzen. Der Stand der Technik widerspiegelt sich in zahlreichen Druck- und Patentschriften. Folgende Beispiele sollen dies verdeutlichen:

KRASNOBAJEW und BÖNIGER in Chimia 29 (3), 123 (1975), ALLEN et al. in Biotechnol. Bioongn. 21,689 (1979), WEETALL in „Immobilized Enzymes for Industrial Reactors" (Ed. by R.A.Messing), Academic Press, New York (1975), US-Petente 4.029.546, 4.033.820,4.132.595, DE-OS 2538322, 2334290,2527884,3010790,2855392,2146390.

Die DE-OS 2855392 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung maltosehaltiger Sirupe, bei dem das Verzuckerungsenzym auch in immubilisierter Form eingesetzt werden kann. Eine Stärkoaufschlümmung wird zunächst mit a-Amylase verflüssigt und anschließend mit Pullulanase und ß-Amylase behandelt. Nach einer Reihe von Reinigungsoperationen wird die gareinigte, maltosereiche Lösung über eine Säule geleitet, die immobilisierte Glucoamylase enthält. Das Enzym ist adsorptiv an einen makroporösen Polystyrenanionenaustauscher gebunden (z. B. XN 1009 von RÖHM & HAAS). Die Glucoamylasebehandlung verfolgt das Ziel, den Gehalt an Dextrinen in der Lösung entscheidend zu verringern. Der allgemein bekannte Nachteil der geringeren Stabilität von adsorptiv gebundenen Enzymen dürfte insbesondere bei höheren Substratkonzentrationen ein „Ausweichen" des Enzyms bewirken.

In der DE-OS 3010790 wird als Trägermaterial für Glucoamylase u.a. ein Mischpolymerharz vorgeschlagen, welches durch Mischpolymerisation von Styren mit verschiedenen substituierten Monomeren, ζ. B. Methylstyren, Nitrostyren, Divinylbenzen, Isopren o.a. hergestellt wird.

Die adsorptive Bindung der Glucoamylase erfolgte nach einer geringfügigen Vernetzung des löslichen Proteins mit mono-, bi- oder polyfunktionellen Reagenzien (z. B. Toluen-2,4-isothiocyanat) und anschließender Kontaktierung des modifizierten Enzyms mit einem Mischpolymerharz (IMAC SYN-46).

Das immobilisierte Enzym wurde daraufhin einem Strömungsrohr zur Stärkehydrolyse eingesetzt, wobei die erreichten Halbwertszeiten bei 5O⁰C etwa 300h betrugen.

Diese Verfahrensweise beinhaltet den Nachteil, daß für die chemische Modifizierung des Enzyms relativ teure Chemikalien verwendet werden, über deren Toxizität und Verfügbarkeit für großtechnische Prozesse in der vorliegenden DE-OS keine Angaben gemacht werden. Außerdem muß berücksichtigt werden, daß für die Modifizierung des Enzyms zusätzliche Behältnisse und daß somit der notwendige Investitionsaufwand wieder in die Höhe getrieben wird.

Die Reaktionszeit der Glucoamylase mit dem Modifizierungsmittel Toluen-2,4-lsothiocyanat muß sehr exakt eingehalten werden, da es sonst, bedingt durch das Fortschreiten der Modifizierungsreaktion, zu einem irreversiblen Ausflocken des Enzyms kommt. In diesem Fall das Enzym nicht mehl /ur Immobilisierung vorwendet werden.

Insgesamt kann eingeschätzt werden, daß derartige Versuche zwar die prinzipielle Eignung immobi isierter Glucoamylasepräparate zur Stärkehydrolyse bestätigt haben, aber bisher nicht zu industriell verwertbaren Erfolgen geführt haben, weil entweder die Art, die Zugänglichkeit, din mechanische Belastbarkeit und der Preis des Trägers oder aber die enzymatische Wirksamkeit und/oder Beständigkeit der Enzym-Träger-Komplexe weit von solchen Kennziffern entfernt liegen, wie sie für den erfolgreichen großtechnischen Einsatz erforderlich sind.

Die Tatsache, daß die Trägermatrix mit ihren spezifischen Eigenschaften die enzymatische Aktivität und Stabilität der Enzym-Träger-Komplexe, die Bindungsfähigkeit für Proteine ebenso beeinflußt wie z. B. die Bindungsmethode, läßt es angebracht erscheinen, für eine bestimmte zu lösende Aufgabe, nach einer optimalen Trägerstruktur zu suchen. Diese kann beispielsweise durch physikalische (Poi envolumen, spezifische Oberfläche, Porendurchmesser) und chemische (Art der funktioneilen Gruppen, Ausmaß der Funktionalisierung) Parameter beschrieben werden.

Diese Aufgabe kann vorteilhaft mit synthetisch hergestellten Trägern, insbesondere mit solchen auf der Basis vernetzten Polystyrens gelöst werden, da hier bei der Synthese und Funktionalisierung der Trägermatrix nahezu alle Parameter so eingestellt werden können, daß sich unter bestimmten Bedingungen eine optimale Trägorstruktur ergibt. Potentielle Trägermaterialien auf Polystyrenbasis sind, allerdings ohne für eine optimale Enzymbindung geeignete Struktur, oeit langem bekannt und leicht beschaffbar (z. B. DIAION HPA 11, AMBERLITE XE-305 oder IRA-305, XN 1009 von RÖHM & HAAS oder das DOWEX-Harz X 2). Verfahren, die derartige Träger verwenden, haben sich bei der großtechnischen Stärkehydrolyse durchsetzen können, weil entweder das Verzuckerungsenzym nur adsorptiv gebunden wurde und damit nur oino geringe Stabilität besonders bei hohen Stärkekonzentrationtin aufwies, oder weil bedingt durch die verringerte Diffusionsgeschwindigkeit in den Trägerporen solche Bedingungen erzeugt wurden, die den maximal erreichbaren Umsatzgrad (DE-Wert) so verringerten, daß teilweise nicht einmal die Werte des Verfahrens mit löslichen Enzymen erreicht wurdon. Die biochemische Ursache dieser Erscheinung liegt in der bei hohen Produktkonzentratior.an in den Trägerporen auftretenden Produktinhibierung und der bei langen Verweilzeiten der gebildeton Glucose in den Poren des Trägers sich deutlich bemorkbar machenden Synthesewirkung der Glucoamylase, d. h. der Übertragung von Glucosemolekülen auf andere Glucosemoleküie, auf Maltose oder andere Oligosaccharide.

Überraschenderweise hat sich nun ergeben, daß es möglich ist, ein Derivat des vernetzten Polystyrens, nämlich ein mit Amiriomethyl- oder Ethylendiaminomethylgruppen substituiertes poröses Styren-Divinylbenzen-Copolymeres in seiner Struktur so zu optimieren, daß es als Trägermaterial zur Immobilisierung von stärkehydrolysierenden Enzymen verwendet und unter solchen Bedingungen eingesetzt werden kann, die eine rationelle technische Prozeßführung gewährleisten. Ein weiteres Problem beim Einsatz stärkehydrolysierendor immobilisierter Enzyme bosteht darin, daß das eingesetzte Substrat keimfrei und frei von ungelöston Bestandteilen sein muß, um die optimale Betriebsdauer der Reaktoren zu sichern. L

Für die Reinigung von Substraten, die in Reaktoren mit immobilisierten Enzymen eingesetzt werden sollen, existieren bereits eine ganze Reihe von Möglichkeiten, die jedoch nicht immer allen Ansprüchen gerecht werden. Dazu gehört beispielsweise die Kombination mehrerer Filter, die, wenn erforderlich, mit Filterhilfsmitteln ausgestattet werden können, welche eine weitgehende Keimarmut garantieren. Nachteilig wirken sich bei diesen Methoden die unter Umständen beträchtlichen Kosten für das Filterhilfsmittel sowie die teilweise geringen Standzeiten der Filter, bzw. die erforderlichen großen Filterflächen aus. Die Reinigung und Erneuerung verbrauchter Filter stellt eine Aufgabe dar, die nur mit einem hohen Aufwand an körperlicher Arbeit gelöst werden kann.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, ein Verfahren zum Abbau von Stärkepolysao hariden zu entwickeln, wobei die Produkte der Wirkung der immobilisierten stärke- oder anderer stärkehaltigen Rohstoffe hydrolysierenden Enzyme in ökonomisch günstiger Weise erfolgt und bei dem das Problem des Langzeitbetrieöes der Enzymreaktoren gelöst ist sowie die gebildeton Produkte, wie z. B. Glucose, Maltose, andere Oligosaccharide oder deren Gemische in einer außerordendlich großen Reinheit erzeugt werden, so daß sie ohne größere Reinigung in einer der zahlreichen handelsüblichen Formen konfektioniert werden können.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegft die Aufgabe zugrunde, unter Verwendung immobilisierter stärkehydrolysierender Enzyme eine ökonomisch günstige Verfahrensweise für den Abbau von Stärkepolysacchariden zu entwickeln, wobei die Abbauprodukte Glucose, Maltose, Oligosaccharide, Dextrine oder deren Gemische in einer kürzeren Zeit und in einei höheren Reinheit hergestellt worden können, als es bei den derzeitigen Verfahron mit löslichen Enzymen der Fall ist. Dabei sollen die in einem früheren Schutzrecht des Anmelders beschriebenen, mechanisch stabilen, zur Bindung hoher Enzymaktivitäten geeigneten Copolymeren aus Styren und Divinylbenzen in gepackten Säulenreaktoren unter Ausschaltung bzw. Beseitigung solcher Einflußfaktoren auf die Standzeit der Reaktorsäulen, wie beispielsweise der Verstopfung der Oberflächenporen des Trägers durch im Substrat mitgeführte Verunreinigungen oder der Kontamination des Substrates mit Mikroorganismen, über so lange Zeiträume kontinuierlich betrieben werden, daß die Standzeit der Reaktoren im wesentlichen nur durch die thermische Denaturierunp des Enzymproteins limitiert wird.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß zunächst nach bekannten Methoden aus einem stärkehaltigen Rohstoff eine Stärkeaufschlämmung hergestellt wird, deren Feststoffgehalt zwischen 20 und 40 Bri:<° liegen soll. Zur Verbesserung der Löslichkeit der langkettigon Stärkemoleküle und zur Verringerung der Viskosität der Suspension unterzieht man die Stärkemilch einer kontinuierlichen oder chargenweisen Druckerhitzung in Gegenwart verdünnter Säuren (z. B. Salzsäure, Oxalsäure). Im Ergebnis der aus der Literatur unter dem Namen Vorhydrolyso oder Stärkeverflüssigung bekannten Methode liegt ein Stärkehydrolysat vor, bei dem die durchschnittliche Kettenlänge der Moleküle etwa 5 bis 7 Anhydroglucoseeinheiten beträgt. Zum Zwecke der Reinigung und Keimzahlreduzierung wird das als Substrat für die immobilisierten stärkehydrolysierenden Enzyme dienende Vcrhydrolysat nach an sich bekannten Methoden der Fest-Flüssig-Stofftrennung (z. B. Separation oder Pre-coat-Filtration) von einem Großteil der enthaltenen unerwünschten festen oder gelösten Begleitstoffe befreit. Das derart behandelte Stärkevorhydrolysat wird nunmehr zur Abtötung unerwünschter Mikroorganismen einer kurzzeitigen, kontinuierlichen Wärmebehandlung (10 bis 15 Minuten bei 9O⁰C) unterworfen und anschließend auf die optimale Prozeßtemperatur abgekühlt, worauf die Feinreinigung des Substrates in einem im folgenden als Vorsäule bezeichneten Adsorptionsrohr, das gegebenenfalls temperiert werden werden kann, erfolgt. Die Größe der Vorsäule hängt von den Ausmaßen des Hauptreaktors ab, und sollte zwischen 10 und ü0% des Volumens des Hauptreaktors betragen. Als Adsorptionsmittel können granulierte Aktivkohle, Adsorberharze (z. B. Wofatit EA60), Enzymträgermaterialien auf Polystyrenbasis (z. B. Wofatit YE8, Versuchsprodukt des VEB Chemiekombinat Bitterfeld), aktive, partiell inaktivierte oder inaktive Enzymträgerkomplexe, wobei das immobilisierte Enzym die Fähigkeit zur Stärkehydrolyse hat oder hatte sowie ander e granuläre Adsorptionsmittel verwendet werden.

Von wesentlicher Bedeutung für das erfindungsgemäße Verfahren ist die Reihenfolge in der Hi? beiden letztgenannten Schritte realisiert werden. Während normalerweise der keimzahlreduzierende Schritt erst unmittelbar vor dom Reaktor erfolgen sollte, erfolgt bei dem orfindungsgemäßen Verfahren die Wärmebehandlung vor der adsorptiven Reinigung des Substrates. Diese Maßnahme dient der Sicherung einer langen Reaktorstandzeit und einer hohen Reinheit der erzeugten Produkte, denn durch die Wärmebehandlung werden in der Substratlösung noch enthaltene Proteine denaturiert und flocken bei der sich anschließenden Abkühlung des Substrates auf die optimale Prozeßtemperatur aus. Sie können dann bedingt durch die natürliche Filterwirkung einer mit granulären Stoffen gefüllten Säule leicht entfernt werden. Ein zweiter Grund besteht in der Tatsache, daß durch die Kurzzeiterhitzung der zuckerhaltigen Substratlösung (DE 10 bis 20) Substanzen mit Farbstoffcharakter (Kondensationsprodukte der MAILLARD-Reaktion) gebidlet werden können, die bei der Verwendung von Polystyrenadsorberharzen ohne großen Aufwand in der Vorsäule adsorbiert werden können.

Besonders vorteilhaft ist hei dem erfindungsgemäßen Verfahren der Einsatz mehrfach regenorierler Enzymträgermaterialien (gemäß DD-WP Nr. 144559) auf Polystyrenbasis mit partiell inaktivierten stärkehydrolysiorenden Enzymen in der Vorsäule, die in diesem Fall die Funktion eines Vorroaktors übernimmt. Diese Verfahrensweise besitzt den Vorteil, daß der Polysaccharidabbau bis zu einem gewissen Grad in dem Vorreaktor erfolgt, wodurch sich die Konzentration an monomeren oder dimeren Zuckern im Vorhydrolysat bereits auf solche Werte erhöht, die ein Wachstum vieler Mikroorganismenspezies weitestgehond unmöglich machen oder doch zumindest stark einschränken. Der Hauptreaktor wird in diesem Fall also besonders wirksam vor mikrobiellen Kontaminationen geschützt.

Die Einschaltung einer Vorsäule in den Substratsti om bewirkt außerdem, daß die am meiston exponierte Schicht des Hauptreaktors im Hinblick auf eine mögliche Verstopfung wesentlich entlastet wird. Dadurch erhöht sich die Standzeit des Reaktors beträchtlich.

Das Öffnen versto pftei Trägerporen erfolgt zweckmäßig entsprechend der in der DD-PS Nr. 2221090 dargelegten Methode F

mittels Ultraschallbehandlung oder durch Behandeln mit Natronlauge. Es ist günstiger, das Adsofberharz eines kleinen \ ;

Vorreaktors zu rei ligcn, als das große Harzvolumen des Hauptreaktors durch Rückspülen mit Wasser in ein anderes Gefäß zu ίί·

verlagern, um dort die Reinigung vorzunehmen.

Um den kontinuierlichen Betrieb des Hauptreaktors zu sichern, wird die prinzipiell bekannte Methoria der Parallelschaltung

zweier oder mehrerer Vorsäulen bzw. Vorreaktoren angewandt, von denen jeweils eine bzw. einer mittels geeigneter

Rohrverbindungen und Absperrvorrichtungen mit dem Hauptreaktor und dem Wärmeaustauscher zum Temperieren des Vorhydrolysates verbunden ist, die anderen jedoch nach einer de oben genannten Methoden von adsorptiven

'. oiunreinigungen befreit werden odor in Roserve verbleiben.

Nach Passieren der Vorsäulen, bzw. der Vorreaktoren wird das Stä kehydrolysat mit einer Dosierpumpe durch den Hauptreaklor

gepumpt. Dieser enthält a-Amylase, ß-Amylaso oder Glucoamylase. Die F.nzyme sind an einen Träger auf Polystyrenbasis, deraus einem mit Stickstoff enthaltenden Gruppen, am aromatischen Kern substituierten, porösen Copolymerisat aus Styrenund/oder einem substituierten Styren und einer oder mehrerer Vorbindungen mit mehreren nicht konjugierten Vinylgruppensowie gegebenenfalls anderen Monomeren, das in Gegenwart von porenbildenden Hilfss· >ffen hergestellt wurde und (fassen

Struktur dadurch bestimmt ist, daß das Verhältnis der Monomeren mit einer und den Monomeren mit mehreren Vinylgruppen

zwischen 8:2 und 9,5:0,5 Gewichtsteilen liegt und der porenblldende Hilfsstoff in einer Menge von 0,76 bis 0,90 Gewichtsteilenpro Gewichtsteil der Monomeren eingesetzt wird. Die Bindung der Enzyme erfolgt nach Aktivierung der sich am ai omatischen ^%

Kern des Trägers befindlichen stickstoffhaltigen funktionollen Gruppen mit 1,4-Benzochinon (J.FISCHER, R.ULBRICH und A.SCHELLENBERGER (1978), Acta Biol. Med. Gerrn. 37,1413-1424) oder mit Glutaraldehyd (M.D.LILLY (1976), „Methods in Enzymology", 44,46). Um eventuelle mikrobiologische Kontaminationen rechtzeitig zu erkennen, wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren

vorgeschlagen, den pH-Wert der den Hauptreaktor verlassenden Produkte kontinuierlich zu registrieren, denn es stellte sichüberraschenderweise heraus, daß ein verminderter Umwandlungsgrad der Stärkepolysaccharide und ein absinkender pH-Wertder Produkte mit einer erfolgten mikrowellen Kontamination korreliert werden kann. Diese Methode gestattet es, sofort

Maßnahmen zur Desinfektion der Gesamtanlage oder auch nur des Hauptreaktors einzuleiten, als wenn die Keimzahl des Produktes z. B. nach der KOCH'schen Plattenverdünnungsmethode bestimmt würde. Dio im Hauptreaktor erzeugten Produkte — Glucose, Maltose, Oligosaccharide, Dextrine oder deren Gemische — können nach

einer Vakuumeinengung und einer eventuellen Aktivkohleklärung sofort zur Sprühtrocknung, Kristallisation oder zur

Konfektionierung in andere handelsübliche Abgabeformen verwendet werden. Ausführungsbeispiele ·

Die folgenden Ausfühiungsbeispiele sollen die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Totalhydrolyso von Stärkepolysacchariden und bei der Herstellung maltosoroicher Sirupe demonstrieren. Außordem soll gezeigt werden, welche Auswirkungen Abweichungen vom erfindungsgemäßen Verfahren haben.

Beispiel 1: Es wurden 120g Glucoamylase-Polystyren-Komplex verwendet. Zur Herstellung des Substrates wird Maisstärke in Wasser

aufgoschlämmt (Feststoffgehalt 300-450g/l) und nach der an sich bekannten Methode der Säureverflüssigung solange in

Anwesenheit verdünnter Salzsäure druckerhitzt, bis der DE-Wert 10-20 beträgt. Die überschüssige Salzsäure wird mit Natronlauge soweit neutralisiert, bis der pH-Wert des Reaktionsansatzes zwischen 5,0 und 5,5 liegt. Entsprechend des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Vorhydrolysat einer Pre Coat-Filtration unterzogen

(Hoizmehlfilterschicht) und das Filtrat in einem mit einen Rührwerk ausgerüsteten Vorratsbehälter überführt. Der pH-Wert desvorgereinigten Substrates wird mit verdünnter Salzsäure auf 4,6 korrigiert.

Durch eine geeignete Pumpe (z. B. Peristaltikpumpe der Fa. LKB, Schweden) wird das Substrat in einen auf 9O⁰C temperierten Wärmeaustauscher gepumpt, der in seinen Abmessungen so bemessen ist, daß die Verweilzeit des Substrates bei einer Flußgeschwindigkeit von 700ml/h etwa 10-15 Minuten beträgt. Um diese Verweilzeit zu realisieren, verwendet man eine Glaswendel mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Länge von 12 m. Der Substratstrom wird nun durch einen Kühler

geleitet, welcher die gleic hen Abmessungen aufweist wie der soeben beschriebene Wärmeaustauscher. Das Substrat weistanschließend die für die Durchführung der Totalhydrolyse bevorzugte Temperatur von 37⁰C auf.

Das Vorhydrolysat passiert nun eine ebenfalls temperierte Vorsäule (37⁰C), deren Volumen etwa 10-40% des Hauptreaktors

ausmacht und die mit 50ml Wofatit Y58 gefüllt ist. Nach Erreichen eines vorher festgelegten Druckabfalls in der Vorsäule wirddie für die Adsorption unbrauchbare Säule außer Betrieb genommen und der Substratstrom statt dessen über eine zweiteparallel geschaltete Vorsäule gelei'et.

Die Harzfüllung der außer Betrieb genommenen Vorsäule wird durch Umpumpen von Natronlauge von adsorptiven Verunreinigungen befreit. Sie steht nach dem Auswaschen überschüssiger Natronlauge mit Wasser erneut für die Feinreinigung

des Vorhydrolysates zur Verfügung.

Nach dem Verlassen der Vorsäule gelangt der Substratstrom in den auf 37 ⁹C temperierten, im Abwärtsstrom betriebenen Hauptreaktor (3,5 χ 50cm), der den Glucoamylase-Polystyren-Komplex enthält. Während das Substrat den Reaktor

durchströmt, werden die enthaltenen Dextrine bei Durchflußgeschwindigkeiten zwischen 250 und 680 ml/h bis zu DE-Wertenvon 95-99 abgebaut.

Der Glucosegehalt des Produktes wurde mittels HPLC bestimmt und beträgt bei einem DE-Wert von 99 etwa 98%. Neben Glucose

konnten auch Maltose oder/und Isomaltose (etwa 2%) nachgewiesen werden, während höhere Oligosaccharide unterhalb der

Nachweisgrenze des verwendeten Detektionssystems (Differentialrefraktometer) lagen. Die Reinheit der aus dem Reaktorablauf hergestellten kristallinen Glucose war außerordentlich hoch und entsprach in allen

wesentlichen Eigenschaften dem AB der DDR (7.Ausgabe).

... ..i Die Tabelle 1 enthält eine Zusammenstellung verschiedener Reinheitsparameter der produzierten Glucose.

Tabelle 1	95-99
DE-Wert
Lichtdurchlässigkeit einer	55%
55%igen Lösung bei 465 nm
Chloridgehalt	0,01 %
(bezogen auf TS)	homogen
chromatographisches Verhalten	0%
Proteingehalt

Die Standzeit der Säule mit polystyrongebundener Glucoamyiase betrug bei Einhaltung aller Im erfindungsgemäßen Verfahren' dargelegten Parameter etwa 2U0 Tage, wobei kontinuierlich DE-Werte von 95-99 erzielt wurden.

Beispiel 2:

Beispiel 2 soll die Leistungsfähigkeit des Glucoamylaso-Polystyren-Komplexes im Technikumsmaßstab darlegen. Dazu wird sinngemäß die Versuchsanordnung gemäß Beispiel 1 verwendet, mit dem Unterschied, daß alle benötigten Aggregate usw.

entsprechend den Angaben in Tabelle 2 zu dimensionieren sind.

Gemäß Beispiel 1 werden zunächst 1500g Glucoamylase-Polystyren-Komplex hergestellt und in eine temperierbare Reaktorsäule (8 x 135cm, V4A —Stahl) gefüllt.

Tabelle 2: Dimensionierung der Aggregate zur Durchführung von Beispiel 2 Aggregat Dimensionierung

Vorratsbehälter 150-l-Glashängegefäße (Schott &

Gen., Jena) Pumpe tür Substrat Kolbendosierpumpe PAE 22/12

(VEB Pumpenwef ke Salzwedel) Wärmeaustauscher Glaswendel mit i. D. 3,0 cm und

10m Länge Vorsäule Stahlsäule, V4A, i.D. 9,0 cm,

L = 40cm

gefülltmit2,0IWofatitY58 Reaktorsäule Stahlsäule, V4A, i. D. 8,0 cm,

L= 135 cm

Um die Leistungsfähigkeit der Glucoamyiase Polystyron-Komplexo zu charakterisieren, wird dio Flußgeschwindigkeit (Q) des Substrates durch den Reaktor in weiten Grenzen variiert. Tabelle 3 zeigt, daß der Reaktor etwa 3 Bettvolurnina/h zu einem Glucose-Sirup mit sehr gutem Kristallisationsverhalten umsetzen kann.

Tabelle 3: Abhängigkeit dos DE-Wortos von dor Fallgeschwindigkeit in einem gepackten Säulenreaktor (V = 51) mit polystyrengebundener Gluconmylase TrockensuL stanzgehalt des Substrates: 350 g/l

Q (ml/h)	3000	4650	5400	105000	18000
DE	98.0	98,0	99,0	9/,5	94,0

Beispiel 3:

Dieses Beispiel zeigt, welche Auswirkungen Abweichungen vom orfindungsgemäßon Verfahren haben können.

Die apparatetechnische Ausrüstung des Beispiels 3 unterscheidet sich von der des Beispiels 2 dadurch, daß dor Wärmeaustauscher zur Kurzzeiterhitzung des Substrates und die Vorsäulen aus der Anlage entfernt wurden.

Maisstärkehydrolysat mit einem DE-Wert von 10-20 und einem Feststoffgehalt von etwa 350o./l .vird mit einer Flußgoschwindigkeit von 5000ml/h durch den Reaktor mit immobilisierter Glucoamyiase gepumpt. Der Reaktor erreicht zunächst wie gewohnt DE-Werte zwischen 95 und 98. Bereits nach G bis 10 Stunden beginnen die DE-Worto wieder zu fallon (vgl.

Abb. 2), so daß nach etwa 15 Stunden ein Produkt den Reaktor verläßt, aus dom keine kristalline Glucose mehr gewonnen werden kann.

Das Absinken der DE-Werte kann mit sinkendem pH-Worten korreliert werden. Die Ursache für die schlechte Produktqualität liegt bei den im Substrat enthaltenen Mikroorganismen, die zu einer Kontamination des Hauptreaktors führten.

Der sinkende pH-Wert kann deshalb auch zur Früherkennung einer mikrowellen Kontamination genutzt werden.

Boi3piol4:

Beispiel 4 soll die Herstellung inaltosereicher Sirupe mit dem erfindungsgemäßen Verfahren demonstrieren.

Es unterscheidet sich von Beispiel 1 dadurch, daß das Substrat im Vorratsgefäß auf einen pH-Wert von 5,0 eingestellt wird. Im Hauptreaktor befindet sich anstelle immobilisierter Glucoamyiase polystyrongebundene a-Amylase (A.oryzae). Die übrige Versuchsanordnung entspricht der des Beispiels 1.

Die Durchflußgeschwindigkeit des Substrates durch den Hauptreaktor wird entsprechend dem im Endprodukt erforderlichen DE-Wert eingestellt, wobei die Erhöhung des DE-Wertos während der Hydrolyse durch die gezielte Erhöhung des

Maltosogehaltos erreicht wird. ,

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Bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 3000ml/h (etwa tifaches Volumen des Katalysatorbettes) wird ein DE-Wart von 40 erreicht. Die gezielte Erhöhung dee Maltosegehaltes im Sirup kann durch papier- oder dünnschlchtchromatographlsche Auftrennung des Zuckergemisches nachgewiesen werden.

Das Reaktionsprodukt läßt sich zu einem Stärkesirup mit erhöhtem Maltosegehalt konfektionieren, wie or boispieisweise in der Süß- und Backwarenindustrio benötigt wird.

Claims (11)

1. Verfahren zum Abbau von Stärkepolysacchariden sowie deren Abbauprodukten oder anderen stärkehaltigen Rohstoffen zum Zwecke der Gewinnung fester oder flüssiger Glucose, Maltose, Oligosaccharide, niedermolekularer Stärkepolysaccharide, deren Gemische oderTotalzuckor mittels trägerfixierter stärkehydrolisierender Enzyme, gekennzeichnet dadurch, daß zuerst in an sich bekannter Weise vorhydrolysiert und mittels Pre-Coat-Filtration oder Separation vorgereinigt wird, danach nacheinander kontinuierlich, kurzzeitig erwärmt, auf optimale Prozeßtemperatur gekühlt wird, worauf das so behandelte Vorhydrolysat über mindestens zwei zueinander parallel geschaltenen, wechselseitig betriebenen Vorsäulen oder Vorreaktoren und anschließend über einen Hauptreaktor geleitet wird, in dem es mit einem stationär angeordneten Bett aus Teilchen eines porösen, vernetzten Trägermaterials auf Polystyrenbasis mit stickstoffhaltigen funktioneilen Gruppen, das mit γ¹™ stärkehydrolysierenden Enzymen beladen ist, in Kontakt gebracht und danach ir Produkist >vn zur Kontrolle einer etwaigen Kontamination des Enzymträgerkomplexes der pH-Wert kontinuierlich überwacht und die Abbauprodukte in an sich bekannter Weise aufgearbeitet werden.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die stärkehydrolysierenden Enzyme a-Amylase, ß-Amylase oder Glucoamylase sind.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, gekonnzeichnet dadurch, daß das Trägermaterial für die stärkehydrolysierenden Enzyme ein Stickstoff enthaltende Gruppen, am aromatischen Kern substituiertes poröses Copolymerisat aus Styren und/oder einem substituierten Styren und einer oder mehreren Vorbindungen mit mehreren nicht konjugierten Vinylgruppnn sowie gegebenenfalls anderen Monomeren verwendet wird, das in Gegenwart von porenbildenden Hilfsstoffen hergestellt wird und dessen Struktur dadurch bestimmt ist, daß das Verhältnis der Monomeren mit einer und mit mehreren Vinylgruppen zwischen 8:2 und 9,5:0,5 Gewichtsteilen liegt und der porenbildende Hilfsstoff in einer Menge von 0,75 bis 0,9 Gewichtsteilen pro Gewichtsteil der Monomeren eingesetzt wird.

4. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Wärmebehandlung des stärkehaltigen Substrates in einem kontinuierlichen System bei einer Temperatur von 70 bis 100⁰C, vorzugsweise jedoch bei 9O⁰C durchgeführt wird.

5. Verfahren nach den Punkten 1 und 4, gekennzeichnet dadurch, daß die Dauer der Wärmebehandlung des stärkehaltigen Substrates 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise jedoch zwischen 10 und 15 Minuten beträgt.

6. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß die adsorptive Reinigung des stärkehaltigen Substrates in einem kontinuierlich temperierbaren System aus mehreren jedoch mindestens zwei zueinander parallel geschaltenen wechselseitig betriebenen Vorsäulen erfolgt.

7. Verfahren nach den Punkten 1 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß die Größe der Vorsäulen zur adsorptiven Reinigung so bemessen ist, daß sie 10 bis 50% des Volumens des Hauptreaktors beträgt.

8. Verfahren nach den Punkten 1,6 und 7, gekennzeichnet dadurch, daß als Füllstoff für die Vorsäulen granulierte Aktivkohle, Adsorberharze oder Enzymträgermaterialien auf Polystyrenbasis, vorzugsweise jedoch das zur Immobilisierung der stärkehydrolysierenden Enzyme verwendete optimale Polymere auf Polystyrenbasis verwendet wird.

9. Verfahren nach den Punkten 1, 6,7 und 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Vorsäulen zusätzlich die Funktion eines Vorreaktors übernehmen können.

10. Verfahren nach den Punkten 1,2 und 6 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß die Vorreaktoren immobilisierte stärkehydrolysierende Enzyme, vorzugsweise jedoch partiell inaktive

_t stärkehydrolysierende Enzyme, oder solche enthalten, die an mehrfach regenerierte, mindestens jedoch dreimal regenerierte Enzymträgermaterialien auf Polystyrenbasis gebunden sind und deren Einsatz wegen der geringen Aktivität im Hauptreaktor nicht mehr gerechtfertigt ist.

11. Verfahren nach den Punkten 1 und 6 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Regenerierung verbrauchter Füllmaterialien der Vorsäulen bzw. der Vorreaktoren durch Behandeln mit einer wäßrigen Alkalihydroxidlösung, vorzugsweise jedoch Natronlauge erfolgt.