DD261807A1 - Verfahren zur herstellung von ethanol oder bier mit immobilisierten mikroorganismen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Gaerungsprodukten insbesondere Ethanol oder Bier aus zuckerhaltigen Medien mittels immobilisierter Mikroorganismen. Mit dem erfindungsgemaessen Verfahren soll aus zuckerhaltigen Medien mittels immobilisierter Mikroorganismen Ethanol oder Bier hergestellt werden, deren Stabilitaet ueber lange Fermentationsperioden bei kurzen Verweilzeiten eine hohe Produktanreicherung bei weitestgehender Substratverwertung unter intensivem Gasaustausch ermoeglicht. Das Verfahren besteht erfindungsgemaess in der enzymatischen Herstellung von Ethanol oder Bier, mit an sich bekannten Mikroorganismen, die in einem pflanzlichen Hohltraeger immobilisiert, durch ein dichtes Abschlussgewebe abgeschlossen sind und in ein Aerenchym eingefuehrt wurden.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung findet in der Lebensmittelindustrie, in der Pharmazie und in der technischen Mikrobiologie Anwendung.

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Die Herstellung der Gärungsprodukte Ethanol oder Bier durch mikrobielle Umwandlung geeigneter Substrate ist seit langem bekannt.

Eine vorteilhafte Variante für biotechnologische Stoffwandlungen im allgemeinen und die Ethanolsynthese im besonderen ist der Einsatz sogenannter immobilisierter Mikroorganismen. Für die Immobilisierung von Mikroorganismen sind verschiedene Prinziplösungen (Adsorption oder kovalente Bindung an feste Träger, Vernetzung und Einhüllung) sowie Mischformen und Modifikationen dieser Lösungen bekannt (J. KLEIN, F.WAGNER: DECHEMA-Monografie 82 [1978] 142-164; R.BERGER: Aeta Biotechnol. 2 [1982] 4, 343-358).

Die für die Herstellung von Massenprodukten, wie Ethanol oder andere Gärungsprodukte, aus ökonomischen und technischen Gründen am häufigsten eingesetzte Immobilisierungsmethode ist der Einschluß der Mikroorganismen in Alginat oder Carragelnan. Nachteile der Verwendung von Alginat oder in ähnlichen Gelen eingeschlossenen Mikroorganismen sind die Instabilität der Gele und für bestimmte Anwendungen auch die hohen Kosten für die Reinigung der Kohlenhydrate aus den natürlichen, stark verunreinigten Rohstoffen (Algenmassen). So verringern Beimengungen von — Carrageonan nicht nur die Gelfestigkeit, sondern machen das Carrageonansol auch sehr viskos, so daß ein Einsatz von Rohcarrageonan für technische Anwendungen nicht in Frage kommt (W. Y. KUU and J. A.POLACK: Biotechnol. Bioeng. 25 [1983] 1995-2006).

Darüber hinaus ist für einen Einsatz der Gelbildner zur Herstellung von Produkten der Getränkeindustrie entscheidend, daß er keine geschmacksbeeinflussenden Verunreinigungen enthält.

Ein wesentlicher Nachteil des bekannten Ca-Alginats ist die Instabilität gegenüber Ionen, wie Mg²⁺, K⁺, PO₄ ³" sowie Cakomplexierenden organischen Säuren, die zum Herauslösen des Calciums aus dem Gel führen und dadurch die mechanische Festigkeit des Gels stark beeinträchtigen, was bis hin zur Auflösung des Gels gehen kann (J. S. CHEETHAM, K.W. BLUNT and CH.BUCK: Biotechnol. Bioeng. 21 [1979], 2155-2168).

Unentbehrlich ist deshalb der Zusatz von Calciumionen zum Fermentationsmedium, da auf die Phosphatsalze als einer der Hauptnährstoffe zur Erhaltung der Lebensfähigkeit mikrobieller Zellen nicht verzichtet werden kann. Auch hierdurch können Anwendungsbereiche in der Getränkeindustrie eingeschränkt werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Gärungsprodukte, wie Ethanol oder Bier, aus zuckerhaltigen Medien mittels immobilisierter Mikroorganismen herzustellen, deren Stabilität über lange Fermentationsperioden bei kurzen Verweilszeiten eine hohe Produktanreicherung bei weitestgehender Substratverwertung unter intensivem Gasaustausch ermöglicht. Weiterhin bestand die Aufgabe darin ein Verfahren zu entwickeln, das zu einem Produkt führt, welches die Qualität gegenüber bekannten Verfahren verbessert.

Die Erfindungsaufgabe wird durch das im Patentanspruch gekennzeichnete Verfahren gelös^f. Dieses Verfahren besteht erfindungsgemäß in der mikrowellen Herstellung von

— Ethanol aus Mono-, Di- und Trisaccharide enthaltenden Flüssigkeiten, beispielsweise Zuckerlösung, wie verdünnte Melasse oder

— Bier aus Bierwürze

durch Behandeln der flüssigen Medien mit an sich bekannten Mikroorganismen, die in einem pflanzlichen Hohlträger immobilisiert sind, der nach außen durch ein hochpermeables und dicht schließendes Abschlußgewebe begrenzt wird. In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die immobilisierten Mikroorganismen mit einem flüssigen Medium in Kontakt gebracht, welches die enzymatisch zu behandelnden Ausgangsstoffe, sowie die für die Gewinnung und/oder Erhaltung der physiologischen Aktivität notwendigen Nährstoffe enthält. Zur Aufrechterhaltung der Festigkeit der Immobilisate ist eine Zugabe von stabilisierenden Ionen zum Medium nicht erforderlich.

Hinsichtlich der Behandlung respektive des Inkontaktbringens bestehen grundsätzlich keine Einschränkungen. Erfindungsgemäß sollten Fest- oder Fließbettreaktoren eingesetezt werden, wodurch die besonderen Eigenschaften der neuartigen Immobilisate voll ausgenutzt werden.

Die durchgeführten Untersuchungen haben in nicht vorhersehbarer Weise gezeigt, daß das erfindungsgemäße Verfahren bei der Umwandlung von Zucker in Ethanol bzw. Bierwürze in Bier in an sich bekannten Reaktoren und unter an sich bekannten Reaktionsbedingungen (pH, Temperatur etc.) hohe Produktivitäten liefert, die mit vorbekannten Immobilisaten nur bei ständiger Zugabe stabilisierender Ionen zum Medium erreichbar sind. Weiterhin zeigte sich, daß die erfindungsgemäß eingesetzten Hohlträger gegenüber einem starken pH-Wert Abfall von 6,0 auf pH-Werte von 2,8 bis 3,0 sowie gegenüber hohen Produktkonzentrationen und den Enzymen der Mikroorganismen stabil sind, so daß ohne Kontaminationen die Operationsstabilität über lange Fermentationsperioden gewährleistet werden kann.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich bei der Umwandlung von Bierwürze in Bier die Gärungs- und Reifungszeiten deutlich senken, beispielsweise von mehreren Tagen auf ca. 2 Tage (Bedingung: gleicher Reaktor). Da die eingesetzten immobilisierten Biokatalysatoren völlig geschmacksneutral sind, wird ein Produkt mit hoher Qualität gewonnen. Weiterhin zeigte sich, das die Hohlträger ohne Verwendung von Filterhilfsmitteln, wie Kieselgur, problemlos aus dem Medium abgetrennt werden können.

Da diese Hohlträger eine gute mechanische Festigkeit aufweisen, enthält das Medium nach Abtrennung der Hohlträger praktisch keine freien Zellen.

Aufgrund geringer Diffusiumsstrecken sind bevorzugte Ausgangsmaterialien für die Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Hohlträger die Sproßglieder von Lemnaceen, die mit vitalen Mikroorganismen gefüllt sind. Der Hohlträger und seine Herstellung sind Gegenstand einer gesonderten Anmeldung.

Ausführungsbeispiel 1

Herstellung des Biokatalysemoduls

Wasserlinsen der Art Woffia arrhiza werden mit Ethanol bei 60°C bis zur völligen Entfärbung extrahiert. In dieethanolhaltige Packung mischt man nach Ablaufen des beweglichen Ethanols Glycerin im Gewichtsverhältnis 1:10 und läßt anschließend das Ethanol im Luftstrom verdunsten.

Die glycerinhaltigen geschrumpften Extraktionsprodukte werden mit einer konzentrierten Suspension von Hefe in Wasser (3 Volumenteile einer Suspension von 100 g Frischmasse/l) versetzt. Die Hefezellen werden kurz zuvor in der Wachstumsphase durch Zentrifugation geerntet. Die extrahierten Wasserlinsen quellen in der Hefe-Suspension. Es wird bei Bedarf soviel Wasser zugegeben, daß über den gepackten Füllkörpern etwas Flüssigkeit steht. Die Suspension wird 2h lang bewegt bzw. geschüttelt. Anschließend läßt man die freie Flüssigkeit abtropfen und inkubiert die Füllkörper in einem belüfteten Melasse-Wachstumsmedium (1 % Trockenmasse, 5 Volumenteile auf 1 Teil gequollenes Immobilisat) bei Zimmertemperatur. Das Medium wird in bestimmten Abständen erneuert. Der Zeitpunkt des Medienwechsels sollte am Ende der log-Phase der Entwicklung freier Zeilen liegen. Die Füllung der extrahierten Wasserlinsen mit Hefe ist bei Lupenvergrößerung im Lichtmikroskop durch die Ausbreitung stark lichtstreuender Zonen deutlich erkennbar. Ein ausreichender Füllungsgrad (ca. 30g Hefeprotein/kg Frischmasse) wird nach 5-8maligem Wechsel des Mediums erreicht. Das Hefe-Immobilisatwird auf einem Sieb mit Wasser gewaschen und ist anwendungsbereit.

Auch bei einer Erhöhung der Durchflußgeschwindigkeit des Mediums auf das Doppelte werden noch 69% des angebotenen Substrates umgesetzt, daß daraus eine volumetrische Ethanolproduktivität von 22,5g/l · h resultiert. Während des Untersuchungszeitraumes wurden im Fermentationssystem keine Kontaminationen festgestellt.

Ausführungsbeispiel 2

Die Fermentation wurde in einem an sich bekannten horizontal gelagerten, temperierbaren Säulenreaktor (d = 35mm, I = 300mm) mit Segmentierung durchgeführt.

Das Fassungsvermögen dersegmentierten Säule beträgt 138ml.

Die Säule wurde mit 20g feuchtem Immobilisat (Wolffia arrhiza-Saccharomyces serevisiae Kolin) gefüllt, wobei jedes Segment 4g Immobilisat enthielt. Zu Beginn der Fermentation befanden sich 1,128g Hefetrockensubstanz/20g Immobilisatim Reaktor.¹¹ Durch den Säulenreaktor wurde bei30°C mit konstanter Durchflußgeschwindigkeit von 5 bis 12ml/h kontinuierlich ein steriles auf pH 6,0 gepuffertes komplexes Nährmedium, das 12-20% Saccharose enthielt, gepumpt. Das bei der anaeroben Gärung gebildete Kohlendioxid entweicht gleichförmig aus dem Immobilisatbett in den oberen Gasraum und kann von dort über Gasableitungsstutzen aus dem Reaktor abgeführt werden. Das Flüssigvolumen von 28-3OmI bildet das Bezugsvolumen für die Umsetzberechnungen. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse zeigt Tabelle 1.

Tabelle 1: Ergebnisse der kontinuierlichen Ethanolproduktion _:

Zeit	F	S0	S	P	P	YP/S
(h)	(ml/h)	(g/l)	(%)	(g/l)	(g/l - h)	(g/g)
17	6,3	133	83,3	53,6	12,1	„0,483
41	5,8	167	89,0	69,0	14,3	0,460
65	11,9	167	69,0	53,0	22,5	0,460
116	5,0	150	87,0	58,5	10,4	0,448
137	5,7	150	92,0	61,7	12,6	0,447
185	5,1	155	86,0	59,0	10,7	0,440
233	4,5	138	97,0	56,8	9,15	0,423
257	4,7	174	98,0	71,8	12,3	0,419
329	6,2	172	85,0	63,3	13,9	0,4333
353	4,1	192	89,0	73,9	9,4	0,434

Bei einem kontinuierlichen Dauerbetrieb von 350 Stunden stellte sich nach einer Anlaufphase von 10 bis 20 Stunden eine konstante Ethanolbildungsproduktivität von 9 bis 15g/l · h bei einer Ethanolkonzentration im Auslauf von 57 bis74g/l. Diese Ergebnisse wurden erzielt bei einer Substratverwertung von 85 bis 98%.

1 Der Hefegehalt des Immobilisats wurde anhand der Kjeldahl-Stickstoffbestimmung ermittelt.

Auch bei einer Erhöhung der Durchflußgeschwindigkeit des Mediums auf das Doppelte werden noch 69% des angebotenen Substrates umgesetzt, daß daraus eine volumetrische Ethanolproduktivität von 22,5g/l.h resultiert.

Während des Untersuchungszeitraums wurden im Fermentationssystem keine Kontaminationen festgestellt.

Ausführungsbeispiel 3

In dem horizontal gelagerten Säulenreaktor (siehe Beispiel 1) erfolgte die Vergärung einer Würze (Stammwürzegehalt 11,75%) mit in Wolffia arrhiza immobilisierter Hefe Saccharomyces uvarum. 35g Immobilisatfrischmasse wurde zu gleichen Anteilen in die fünf Segmente des Säulenreaktors gefüllt, so daß sich zu Beginn der Fermentation 1,5g Hefetrockensubstanz im Reaktor befanden. Durch den Säulenreaktor wurde bei 12°C bis 14°C mit konstanter Durchflußgeschwindigkeit von 7 bis 11 ml/h kontinuierlich sterilisierte Würze gepumpt. Das bei der anaeroben Gärung gebildete Kohlendioxid bleibt teilweise in der Nährlösung gelöst bzw. entweicht in den oberen Gasraum und wird über die Gasableitungstutzen aus dem Reaktor abgeführt. Für die Umsatzberechnungen dient das Flüssigvolumen von 28 bis 30 ml als Bezugsvolumen. Eine Übersicht der Ergebnisse zeigt Tabelle 2.

Tabelle 2: Ergebnisse der kontinuierlichen Vergärung von Würze

Zeit	F	So	S	P	Vol.-%	P	Y P/S
(h)	(ml/h)	(g/l)	(%)	(g/l)		(g/l-h)	(g/g)
23	11,6	82,40	24,4	9,33	1,18	0,462	3,86
51	7,05	80,77	63,29	25,14	3,19	6,31	0,492
70	8,47	80,77	63,29	25,00	3,17	7,55	0,489
125	7,91	83,25	66,49	27,64	3,50	7,79	0,499
138	8,02	84,90	63,71	26,49	3,36	7,58	0,489
168	9,27	82,56	57,47	24,30	3,08	8,04	0,512
192	9,32	85,46	73,60	27,41	3,47	9,13	0,436
204	7,90	85,58	70,65	29,40	3,72	8,29	0,486
215	7,90	85,58	70,92	27,58	3,49	7,78	0,454

Bei einem kontinuierlichen Dauerbetrieb von 215 Stunden stellte sich nach einer Anlaufphase von 10-40 Stunden eine Ethanolbildungsproduktivität von 6 bis 9g/l h bei einer Ethanolkonzentration im Auslauf von 24 bis 30g/l (3,0 bis 3,8 Vol.-%) ein.

Diese Ergebnisse wurden bei einer Substratverwertung von 60 bis 70% erreicht.

Der Fermentationsprozeß dauerte 2,0 bis 3,5 Stunden und der sich anschließende Reifungsprozeß, in dem der Diacetylgehalt bis unter den Grenzwert reduziert wurde, betrug 28 bis 48 Stunden.

Das daraus resultierende bier wird charakterisiert durch:

Vol.-%	3,99
pH-Wert	4,30
Diacetyl (mg/l)	0,17
Ester (mg/l)	10,75
höhere Alkohole (mg/I)	3,70

und entspricht den sensorischen Anforderungen eines Bieres vom Pilsner Typ.

Abkürzungsverzeichnis

F— Durchflußrate (ml/h)

S₀— Anfangssubstratkonzentration

bestimmt als reduzierende

Substanz mit 3,5-

Dinitrosalicylsäure (g/l)

S— Substratverwertung (%)

P— Produkt-(Ethanol)-konzentration (g/l)

P— volumetrische Produktivität

bezogen auf das Flüssigvolumen (g/l · h) YP/S— Produkt-(Ethanol)-

Ausbeutekoeffizient (g/g)

Claims (3)

1. Verfahren zur Herstellung von Ethanol oder Bier durch Behandlung flüssiger Medien, mit immobilisierten Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung mit extrahierte Pflanzen oder Pflanzenorganen, deren Aerenchym mit Mikroorganismen gefüllt ist und nach außen durch ein dicht schließendes Abschlußgewebe begrenzt wird, erfolgt.

2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Hohlträger, vorzugsweise Lemnaceem, mit an sich bekannten Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevisiae oder Saccharomyces uvarum gefüllt sind.

3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß dem flüssigen Medium keine Ionen zur Stabilisierung des Immobilisats zugesetzt werden.