DD256196A1

DD256196A1 - TEST STRIP FOR DETERMINING THE ETHANOL CONTENT IN LIQUIDS AND METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF

Info

Publication number: DD256196A1
Application number: DD28712486A
Authority: DD
Inventors: Dieter Felscher; Klaus Lehmann
Original assignee: Carus Carl Gustav
Priority date: 1986-02-18
Filing date: 1986-02-18
Publication date: 1988-04-27

Abstract

Die Erfindung betrifft einen Teststreifen zur Bestimmung des Ethanolgehaltes, insbesondere in einer biologischen Koerperfluessigkeit. Die Erfindung ermoeglicht ohne apparative Voraussetzungen an jedem beliebigen Einsatzort im Routinebetrieb den Ethanolgehalt zu bestimmen und gilt auch fuer schwerverletzte oder bewusstlose Patienten. Der erfindungsgemaesse Teststreifen ist gekennzeichnet durch ein saugfaehiges Material, das mit Reagenzien impraegniert ist, die die Umsetzung von Ethanol zu Acetaldehyd und die anschliessend ausgewertete Farbreaktion, die Formazanbildung, bewirken. Als Reagenzien dienen Alkoholdehydrogenase (ADH), gegebenenfalls ADH-Inhibitoren, Nikotinadenindinukleotid, Tetrazoliumsalze, 1-Methoxy-phenazin methosulfat oder aehnliche Verbindungen der allgemeinen Formel und Puffer (p H 2 bis 9) sowie, falls benoetigt, Antioxydationsmittel, Netzmittel und Mittel zur Verhinderung eines chromatographischen Effektes. Hauptanwendungsgebiet der Erfindung ist die Medizin, insbesondere fuer klinische und forensische Probleme, z. B. Verkehrspolizei, und verwandte Grenzgebiete. FormelThe invention relates to a test strip for determining the ethanol content, in particular in a biological body fluid. The invention makes it possible to determine the ethanol content without any equipment requirements at any location in routine operation and also applies to seriously injured or unconscious patients. The test strip according to the invention is characterized by an absorbent material which is impregnated with reagents which bring about the conversion of ethanol to acetaldehyde and the subsequently evaluated color reaction, formazan formation. The reagents used are alcohol dehydrogenase (ADH), optionally ADH inhibitors, nicotinic adenine dinucleotide, tetrazolium salts, 1-methoxy-phenazine methosulfate or similar compounds of the general formula and buffer (p H 2 to 9) and, if necessary, antioxidants, wetting agents and prevention agents a chromatographic effect. Main field of application of the invention is medicine, especially for clinical and forensic problems, eg. B. traffic police, and related border areas. formula

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft einen Teststreifen zur einfachen und schnellen Bestimmung des Ethanolgehaltes in Flüssigkeiten, insbesondere in biologischen Körperflüssigkeiten.The invention relates to a test strip for the simple and rapid determination of the ethanol content in liquids, in particular in biological body fluids.

Characteristic of the known technical solutions

Verfahren zur Schnellbestimmung des Ethanolgehaltes sind bekannt. Sie beruhen fast überwiegend auf der Bestimmung des Ethanolgehaltes in der Ausatemluft. Alle Verfahren, die bis jetzt bekannt sind, weisen mehrere Nachteile auf.Methods for rapid determination of the ethanol content are known. They are based almost exclusively on the determination of the ethanol content in the exhaled air. All of the methods known so far have several disadvantages.

Die Atem-Ethanol-Prüfröhrchen sind umständlich in der Handhabung, erlauben nur eine grobe Einschätzung des Ethanolgehaltes, sind bei schwerverletzten, bewußtseinsgetrübten oder bewußtlosen Patienten nicht einsetzbar, da sie eine aktive Mitarbeiterfordern. Sie sind nur für eine einmalige Anwendung geeignet, so daß ihr Einsatz in größer Anzahl beträchtliche Kosten verursacht.The breath-ethanol test tubes are cumbersome to handle, allow only a rough estimate of the ethanol content, are not applicable to seriously injured, unconscious or unconscious patients, as they require an active employee. They are only suitable for a single use, so that their use in large numbers causes considerable costs.

Außerdem ist in der Praxis der gesetzmäßige Zusammenhang zwischen Ethanolgehalt der Ausatemluft und dem eigentlich interessierenden Blutethanolspiegel beim Atem-Ethanol-Prüfröhrchen nicht immer in ausreichendem Maße gegeben. Dieser Nachteil kann durch Infrarot-Meßgeräte, welche die Ethanolkonzentration in ausgeatmeter tiefer Lungenluft messen, weitgehend vermieden werden. Diese Ethanol bestimmung erfolgt zwar schnei I und genau, erfordert aber eine aktive Teil nah me des Patienten.In addition, in practice, the legal relationship between the ethanol content of the exhaled air and the actually interesting Blutethanolspiegel the respiratory ethanol test tube is not always given sufficiently. This disadvantage can be largely avoided by infrared measuring instruments, which measure the ethanol concentration in exhaled deep lung air. Although this determination of ethanol takes place precisely and precisely, it requires an active part of the patient.

Ein weiterer erheblicher Nachteil dieser Infrarot-Meßgeräte besteht im hohen Anschaffungspreis.Another significant disadvantage of these infrared measuring instruments is the high purchase price.

Die Bestimmung des Ethanolgehaltes in der flüssigen Phase erfordert bei den bisher bekannten Verfahren neben einer relativ langen Analysendauer bestimmte apparative Voraussetzungen, die einen Transport der Geräte von Einsatzort zu Einsatzort äußerst erschweren bzw. verhindern. Ebenfalls treten hohe Anschaffungskosten für diese Geräte auf.The determination of the ethanol content in the liquid phase requires in the previously known methods in addition to a relatively long analysis time certain equipment requirements that make it extremely difficult or prevent transport of equipment from site to site. There are also high initial costs for these devices.

Bekannt ist ein Teststreifen zur Bestimmung des Ethanolgehaltes, der die oben beschriebenen Nachteile vermeidet, wie z. B.Known is a test strip for determining the ethanol content, which avoids the disadvantages described above, such. B.

nicht ausreichende oder zu grobe Differenzierung des Ethanolgehaltes, hoher Anschaffungspreis und den teilweise nur stationär möglichen Einsatz. Die Ethanolkonzentration wird hier über eine Farbreaktion, bei derTetrazoliumsalzezu stark gefärbten Formazan-Farbstoffen reduziert werden, bestimmt. Eine entscheidende Rolle spielt bei diesem Teststreifen das Enzym Diaphorase, das die Umsetzung derTetrazoliumsalzezu den Formazanen bewirkt. Diese Diaphorase ist bereits bei Zimmertemperatur von beschränkter Haltbarkeit und sehr teuer, so daß eine Substitution der Disphorase durch einen anderen Elektronenüberträger mit günstigeren Eigenschaften hinsichtlich Haltbarkeit bei Raumtemperatur und geringeren Kosten erforderlich ist.Insufficient or too coarse differentiation of the ethanol content, high purchase price and sometimes only stationary possible use. The ethanol concentration is determined here via a color reaction in which tetrazolium salts are reduced to strongly colored formazan dyes. A crucial role in this test strip is the enzyme diaphorase, which effects the conversion of the tetrazolium salts to the formazans. This diaphorase is already at room temperature of limited durability and very expensive, so that a substitution of the disphorase by another electron transfer agent with more favorable properties in terms of durability at room temperature and lower cost is required.

Ferner ist neuerdings ein Teststreifen bekannt, bei dem die Ethanolkonzentration ebenfalls über eine Farbreaktion, bei der Tetrazoliumsalze zu stark gefärbten Formazan-Farbstoffen reduziert werden, bestimmt wird. Eine entscheidende Rolle spielt bei diesem Teststreifen der Farbstoff Meldolablau, der die Umsetzung der Tetrazoliumsalze zu den Formazanen bewirkt.Furthermore, a test strip is now known in which the ethanol concentration is also determined by a color reaction in which tetrazolium salts are reduced to strongly colored formazan dyes. A crucial role in this test strip is the dye Meldola blue, which causes the conversion of the tetrazolium salts to formazans.

Weiterhin sind Versuche bekannt, unter Verwendung von Phenazinmethosulfat (PMS) geeignete Teststreifen zur Ethanolbestimmung herzustellen, die jedoch keine befriedigenden Ergebnisse brachten. Phenazinmethosulfat verliert innerhalb von 14 Tagen bei Lichteinwirkung 70 bis 80% seiner Wirksamkeit, so daß die Herstellung eines geeigneten Teststreifens, der bereits alle für eine Farbreaktion nötigen Reagenzien enthält, bis jetzt nicht möglich war.Furthermore, experiments are known using phenazine methosulfate (PMS) to produce suitable test strips for ethanol determination, but did not bring satisfactory results. Phenazine methosulfate loses within 14 days of exposure to light 70 to 80% of its effectiveness, so that the production of a suitable test strip, which already contains all the reagents necessary for a color reaction, was not possible until now.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Teststreifens zur schnellen Bestimmung des Ethanolgehaltes in Flüssigkeiten, irisbesondere Körperflüssigkeiten, wie z. B. Speichel, Harn, Serum, Plasma, Blut usw., welcher eine hohe diagnostische Relevanz in der Notfalldiagnostik bei Ethanolbeteiligung oder zum Ausschluß einer Ethanolbeteiligung aufweist und damit der qualitativen Verbesserung der medizinischen Betreuung dient.The aim of the invention is to provide a test strip for rapid determination of the ethanol content in liquids, Irisbesondere body fluids such. As saliva, urine, serum, plasma, blood, etc., which has a high diagnostic relevance in emergency diagnostics in ethanol involvement or to the exclusion of ethanol participation and thus serves the qualitative improvement of medical care.

Eine weitere Bedeutung des Teststreifens, gemäß der Zielstellung ist für forensische Belange vorhanden. So benötigt die Verkehrspolizei Hilfsmittel zur schnellen und genauen Feststellung des Alkoholisierungsgrades verdächtiger Verkehrsteilnehmer.Another meaning of the test strip, according to the objective is available for forensic matters. For example, the traffic police need tools to quickly and accurately determine the degree of alcoholism of suspicious road users.

Explanation of the essence of the invention

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, einen Teststreifen zu schaffen, der bei Anwendung an jedem beliebigen Einsatzort eine diagnostisch spezifische, empfindliche, schnelle und einfache Bestimmung des Ethanolgehaltes gestattet unter Verwendung von Reagenzien, die bei großer Haltbarkeit unter Einsatzbedingungen ständig zur Verfügung stehen bzw. billig auf einfachem Weg hergestellt werden könnenThe object of the invention is to provide a test strip which, when used at any place of use, allows a diagnostically specific, sensitive, rapid and simple determination of the ethanol content using reagents that are constantly available or inexpensive at high durability under conditions of use can be made in a simple way

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß Verbindungen der allgemeinen Formel According to the invention the object is achieved in that compounds of the general formula

CHCH

in der Ri eine Alkylgruppe und R₂eine Alkoxygruppe oder ein Wasserstoffatom bedeuten kann; als Elektronenüberträger von guter Stabilität bei Raumtemperatur und gegenüber Licht für die Farbreaktion Tetrazoliumsalz zu Formazanfarbstoff bei der Ethanolbestimmung eingesetzt werden.Ri may be an alkyl group and R _{2 may be} an alkoxy group or a hydrogen atom; be used as an electron carrier of good stability at room temperature and light for the color reaction tetrazolium salt to formazan dye in the ethanol determination.

Erfindungsgemäß bevorzugte Verbindungen sind das 1-Methoxy-5-methyl-phenazinium-methylsulfat (1-Methoxy-phenazin methosulfat) und das 5-Ethyl-phenazinium-methylsulfat (Phenazin ethosulfat).Preferred compounds according to the invention are 1-methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate (1-methoxy-phenazine methosulfate) and 5-ethyl-phenazinium-methylsulfate (phenazine ethosulfate).

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß als Elektronenüberträger 1-Methoxy-phenazin methosulfat oder eine andere vorhergehend definierte Verbindung zur Anwendung kommt und wird in Konzentrationen von etwa 0,00001 bis etwa 0,020 Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,0001 bis 0,06 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Teile wäßriger Lösung bzw. Pufferlösung, verwendet.The process according to the invention is characterized in that the electron transfer agent used is 1-methoxy-phenazine methosulfate or another previously defined compound and is used in concentrations of about 0.00001 to about 0.020 parts by weight, preferably about 0.0001 to 0.06 parts by weight. based on 100 parts of aqueous solution or buffer solution used.

Das zweite Reagenz, das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Teststreifen verwendet wird, ist ein Tetrazoiiumsalz. Diese Elektronenträgerkomponente verleiht der Fläche des Teststreifens, die letztlich mit der Untersuchungsprobe behandelt wird, eine Farbe (Formazanfarbstoff) derart variierender Intensität, daß sich hierdurch die Konzentration des Ethanols ermitteln läßt.The second reagent used to make the test strips of the invention is a tetrazolium salt. This electron carrier component imparts a color (formazan dye) of varying intensity to the area of the test strip which is ultimately treated with the test sample in order to determine the concentration of the ethanol.

Geeignete Salze sind beispielsweise MTT[3-(4.5-Dimethylthiazolyl-2)-2.5-diphenyltetrazolium], INT[2-(4-Jodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium], TTC[2.3.5-Triphenyltetrazolium], Niiroblautetrazolium, Blautetrazolium u. dgl.Suitable salts are, for example, MTT [3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazolium], INT [2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyltetrazolium], TTC [2.3.5- Triphenyltetrazolium], Niiroblautetrazolium, Blautetrazolium u. like.

Diese Salze werden der Tränklösung in Konzentrationen von etwa 0,1 bis etwa 0,5 Gewichtsteilen, vorzugsweise 0,05 bis 0,2 Gewichtsteilen zugesetzt, und zwar bezogen auf 100 Teile wäßriger Lösung bzw. Pufferlösung. Die Löslichkeit der Tetrazoliumsalze in der Tränklösung kann durch Zusatz geeigneter Löslichkeitsverbesserer, wie beispielsweise Dimethylformamid u. dgl. in Konzentrationen von etwa 0,1 bis etwa 5,0 Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,5 bis 4,0 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Teile wäßriger Lösung bzw. Pufferlösung erhöht werden.These salts are added to the impregnating solution in concentrations of about 0.1 to about 0.5 parts by weight, preferably 0.05 to 0.2 parts by weight, based on 100 parts of aqueous solution or buffer solution. The solubility of the tetrazolium salts in the impregnation solution can be improved by addition of suitable solubility improvers, such as, for example, dimethylformamide and the like. Like. In concentrations of about 0.1 to about 5.0 parts by weight, preferably about 0.5 to 4.0 parts by weight, based on 100 parts of aqueous solution or buffer solution can be increased.

Es findet folgender Reaktionsablauf statt:The following reaction sequence takes place:

Ethanol + NAD NADH + MTT + HEthanol + NAD NADH + MTT + H

ADH_V Acetaldehyd + NAD + H 1-Methoxy-phenazin methosulfat ADH _V acetaldehyde + NAD + H 1-methoxy-phenazine methosulfate

NADNAD

+ Formazan+ Formazan

Der genannten Gleichung ist zu entnehmen, daß außerdem für die erfindungsgemäßen Teststreifen das Enzym Alkoholdehydrogenase zur Anwendung kommt, das im folgenden als ADH bezeichnet wird.It can be seen from the said equation that, in addition, the enzyme alcohol dehydrogenase, which is referred to below as ADH, is used for the test strips according to the invention.

Es wird in Konzentrationen im Bereich zwischen 0,01 bis 2,0 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Teile wäßriger Lösung bzw. Pufferlösung verwendet.It is used in concentrations in the range of 0.01 to 2.0 parts by weight based on 100 parts of aqueous solution or buffer solution.

Ein weiteres Reagenz des erfindugnsgemäßen Teststreifens ist Nikotinamidadenindinukleotid, das im folgenden als NAD bezeichnet wird. Es wird in Konzentrationen im Bereich zwischen 0,01 bis.2,0 Gewichtsteilen, vorzugsweise von 0,2 bis 1,0 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Teile wäßriger Lösung bzw. Pufferlösung, verwendet. Dieses Reagenz wirkt als Oxydationsmittel, welches das Tetrazoliumsalz in den gefärbten Formazanfarbstoff umwandelt, wobei es selbst in reduziertes NAD (NADH) übergeht.Another reagent of the test strip of the invention is nicotinamide adenine dinucleotide, hereinafter referred to as NAD. It is used in concentrations ranging from 0.01 to 2.0 parts by weight, preferably from 0.2 to 1.0 parts by weight, based on 100 parts of aqueous solution or buffer solution. This reagent acts as an oxidizing agent which converts the tetrazolium salt into the colored formazan dye, thereby transforming itself into reduced NAD (NADH).

Für eine bessere farbliche Differenzierung von unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen, insbesondere oberhalb 0,5 mg Ethanol/g der Flüssigkeitsprobe, wird die zusätzliche Anwesenheit von kompetitiven Inhibitoren für die enzymatische Reduktion des Ethanols zu Acetaldehyd vorgeschlagen. Derartige Inhibitoren sind bekannt. Es handelt sich dabei um chemische Verbindungen, wie beispielsweise Pyrazol, 4-Methylpyrazol, 4-Brompyrazol, 4-Jodpyrazol, Ethanolamin, Tribrommethanol, 5-Hydroxymethylfurfurol, 1.2-Propandiol, 3-0-Toloxy-1.2-propandiol, o-Phenanthrolin, Ethylendiamintetraessigsäure, Natriumazid, Natriumsulfid u. dgl.For a better color differentiation of different ethanol concentrations, in particular above 0.5 mg ethanol / g of the liquid sample, the additional presence of competitive inhibitors for the enzymatic reduction of the ethanol to acetaldehyde is proposed. Such inhibitors are known. These are chemical compounds, such as, for example, pyrazole, 4-methylpyrazole, 4-bromopyrazole, 4-iodopyrazole, ethanolamine, tribromethanol, 5-hydroxymethylfurfurol, 1,2-propanediol, 3-O-toloxy-1,2-propanediol, o-phenanthroline, Ethylenediaminetetraacetic acid, sodium azide, sodium sulfide and the like. like.

Diese Inhibitoren können in Mengen von etwa 0,001 bis etwa 0,10 Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,005 bis 0,05 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Teile wäßriger Lösung bzw. Pufferlösung, zugesetzt werden.These inhibitors may be added in amounts of about 0.001 to about 0.10 parts by weight, preferably about 0.005 to 0.05 parts by weight, based on 100 parts of aqueous solution or buffer solution.

Es ist möglich, während der Herstellung des Teststreifens diesen mit einem Stabilisator zu versetzen, so daß man den Teststreifan längere Zeit lagern und zu einem späteren Zeitpunkt verwenden kann. Dies läßt sich durch Einarbeiten eines bekannten Antioxydationsmittels für das Tetrazoliumsalz erreichen.It is possible during the manufacture of the test strip to provide it with a stabilizer so that the test strip can be stored for a longer time and used at a later time. This can be achieved by incorporating a known antioxidant for the tetrazolium salt.

Beispiele geeigneter derartiger Antioxydationsmittel sind alkylierte Phenole, wie 2.6-Di-tertiäres Butyl-p-cresol, 4-t-Butylcatechol, Octadecyl-S.ö-di-t-butyl^-hydroxyhydrocinnamat, Alkyliden-bisphenole, wie 2.2-Methylenbis (6-t-butyl-4-methylphenol), 4.4-Butylidenbis (6-t-butyl-3-methylphenol), Thiobisphenole, wie 4.4-Thiobis (6-t-butyl-3-methylphenol), 2.2-Thiobis (6-t-butyl-4-methylphenol), Polyphenole, wie Tetrakis [methylen-(3.5-di-t-butyl-4.hydroxyhydrocinnamat)] methan, 1.3.5-Trimethyl-2.4.6-tris (3.5-di-t-butyl-4-hydroxybenzyl) benzol, Ester, wie Ditridecylthiodipropionat, Distearylthiodipropionat, Dilaurylthiodipropionat, Amine, wie diaryl- oder dialkylsubstituierte p-Phenylendiamine, Diphenylamin, N-Phenyl-alphanapthylamin, organische Phosphite, wie Dibutylphosphit, Didecylphosphit, Dioctylphosphit, Diphenyldecylphosphit, Ditetradecylphosphit, Phenyldidecylphosphit, Phenylneopentylphosphit, Tridecylphosphit, Trilauryltrithiophosphit, Triphenylphosphit, Trisnonylphosphit, sowie zahlreiche andere bekannte Antioxidationsmittel, wozu auch Chinone gehören, wie beispielsweise Hydrochinon, Hydrochinonmonomethyläther, Mono-t-butyl-hydrochinon, 2.5-Di-t-Butylhydrochinon, Toluhydrochinon, 2.5-Di-t-amylhydrochinon und dergleichen.Examples of suitable such antioxidants are alkylated phenols such as 2,6-di-tertiary butyl-p-cresol, 4-t-butylcatechol, octadecyl-S-di-t-butyl-hydroxyhydrocinnamate, alkylidene-bisphenols such as 2,2-methylene-bis ( 6-t-butyl-4-methylphenol), 4,4-butylidenebis (6-t-butyl-3-methylphenol), thiobisphenols such as 4,4-thiobis (6-t-butyl-3-methylphenol), 2,2-thiobis (6 t-butyl-4-methylphenol), polyphenols such as tetrakis [methylene (3,5-di-t-butyl-4-hydroxyhydrocinnamate)] methane, 1.3.5-trimethyl-2.4.6-tris (3.5-di-t-butyl) butyl-4-hydroxybenzyl) benzene, esters such as ditridecyl thiodipropionate, distearyl thiodipropionate, dilauryl thiodipropionate, amines such as diaryl- or dialkyl-substituted p-phenylenediamines, diphenylamine, N-phenyl-alphanapthylamine, organic phosphites such as dibutyl phosphite, didecyl phosphite, dioctyl phosphite, diphenyldecyl phosphite, ditetradecyl phosphite, Phenyldidecyl phosphite, phenylneopentyl phosphite, tridecyl phosphite, trilauryl trithiophosphite, triphenyl phosphite, trisnonyl phosphite, see above such as numerous other known antioxidants, including quinones, such as hydroquinone, hydroquinone monomethyl ether, mono-t-butyl-hydroquinone, 2,5-di-t-butylhydroquinone, toluhydroquinone, 2,5-di-t-amylhydroquinone, and the like.

Ferner lassen sich hierfür auch Phenothiazine, Hydroxybenzophenon, p-Dimethylamino-nitrobenzol, Thiodipropionsäure und dergleichen verwenden.Furthermore, phenothiazines, hydroxybenzophenone, p-dimethylamino-nitrobenzene, thiodipropionic acid and the like can also be used for this purpose.

Die obigen Antioxydationsmittel werden in Mengen von etwa 0,01 bis 2,0 Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,02 bis 1,0 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Teile Lösung bzw. Pufferlösung, eingesetzt, und sie können zusammen mit dem Tetrazoliumsalz, vor diesem oder nach dem Aufbringen dieses Tetrazoliumsalzes, angewandt werden.The above antioxidants are used in amounts of about 0.01 to 2.0 parts by weight, preferably about 0.02 to 1.0 parts by weight, based on 100 parts of solution or buffer solution, and they may be used together with the tetrazolium salt, before this or after application of this tetrazolium salt.

Für eine gleichförmige Verteilung der Bestandteile des erfindungsgemäßen Teststreifens über die Oberfläche der saugfähigen Bahn können alle geeigneten nichtionischen Netzmittel verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Die Anwesenheit bestimmter Netzmittel, wie z. B. Tween 80 oder Triton X100, erhöht nicht nur die gleichförmige Verteilung der Bestandteile sondern beschleunigt auch die Reduktion derTetrazoliumsalze.For a uniform distribution of the constituents of the test strip according to the invention over the surface of the absorbent web, it is possible to use all suitable nonionic wetting agents which are known to the person skilled in the art. The presence of certain wetting agents, such. Tween 80 or Triton X100 not only increases the uniform distribution of the ingredients but also accelerates the reduction of the tetrazolium salts.

Eine ähnliche Beschleunigung bewirkt auch eine Zugabe von Polyvinylpyrrolidon. Diese Materialien werden in Mengen von etwa 0,01 bis etwa 1,0 Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,02 bis 0,1 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Teile wäßriger Lösung bzw. Pufferlösung, verwendet.A similar acceleration also causes an addition of polyvinylpyrrolidone. These materials are used in amounts of about 0.01 to about 1.0 parts by weight, preferably about 0.02 to 0.1 parts by weight, based on 100 parts of aqueous solution or buffer solution.

Um eine chromatographische Bewegung des Farbstoffes durch den Celluloseträger zu verhindern, können in die Teststreifen ferner Materialien eingearbeitet werden, wie z. B. Polymethacrylsäure, Carboxymethylcellulose, Copolymere von Maleinsäure, Methylvinylether, Silikonöle, Alaune u. dgl. Diese Materialien werden in Mengen von etwa 0,1 bis etwa 3,0 Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,5 bis 2,5 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Teile wäßriger Lösung bzw. Pufferlösung, verwendet.In order to prevent a chromatographic movement of the dye by the cellulose carrier, further materials can be incorporated into the test strip, such. Polymethacrylic acid, carboxymethyl cellulose, copolymers of maleic acid, methyl vinyl ether, silicone oils, alums and the like. These materials are used in amounts of about 0.1 to about 3.0 parts by weight, preferably about 0.5 to 2.5 parts by weight, based on 100 parts of aqueous solution or buffer solution.

Die oben zusammen mit den Komponenten, die dem erfindungsgemäßen Teststreifen zugesetzt werden können, angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf die Lösungen dieser Bestandteile, mit denen der saugfähige Träger lediglich gesättigt wird, und betreffen nicht die Menge einer jeden Komponente, die evtl. auf dem saugfähigen Träger vorhanden ist.The concentrations given above together with the components which can be added to the test strip according to the invention relate to the solutions of these constituents which merely saturate the absorbent carrier and do not relate to the amount of each component which may be present on the absorbent carrier is available.

Dies bedeutet, daß durch Sättigen des saugfähigen Trägers mit einer spezifischen Konzentration einer bestimmten Komponente in Lösung nicht einfach auch die gleiche Prozentmenge der in der Lösung vorhandenen Komponente auf dem saugfähigen Träger erhalten werden muß. Es zeigt sich, daß die obigen Lösungskonzentrationen im allgemeinen ausreichen, damit das saugfähige Material nach entsprechender Sättigung hiermit über eine ausreichende Menge der jeweiligen Komponente verfügt und ein funktionsfähiger Teststreifen gemäß der Erfindung erhalten wird, wobei die Absorptionsfähigkeit des saugfähigen Materials charakteristisch ist für Materialien, die normalerweise zu diesem Zweck verwendet werden. Dieses saugfähige Material ist an sich nicht Gegenstand der Erfindung, sondern lediglich eine Komponente des gesamten erfindungsgemäßen Teststreifens.This means that by saturating the bibulous carrier with a specific concentration of a particular component in solution, it is not simply necessary to obtain the same percentage of the component present in the solution on the bibulous carrier. It is found that the above solution concentrations are generally sufficient for the saturable material after adequate saturation to have a sufficient amount of the particular component and to obtain a functional test strip according to the invention, the absorbency of the absorbent material being characteristic of materials which normally used for this purpose. This absorbent material is not the subject of the invention per se, but merely a component of the entire test strip according to the invention.

Beispiele von für eine Anwendung geeigneter Puffer sind Glycin-Salzsäure-Puffer, Semicarbazid-Glycin-Puffer, Trispuffer, Phosphatpuffer, Phthalatpuffer, Citrat-Phosphat-Puffer, Borat-Succinat-Puffer u. dgl.Examples of suitable buffers for use include glycine hydrochloric acid buffer, semicarbazide-glycine buffer, Tris buffer, phosphate buffer, phthalate buffer, citrate-phosphate buffer, borate-succinate buffer and the like. like.

Die bevorzugten Puffer sind Semicarbazid-Glycin-Puffer und Glycin-Salzsäure-Puffer, und zwar in einer 0,025 bis 0,2molaren Konzentration.The preferred buffers are semicarbazide-glycine buffer and glycine-hydrochloric acid buffer in a 0.025 to 0.2 molar concentration.

Der erfindungsgemäße Teststreifen ist ein wesentlicher Beitrag zur Verbesserung der medizinischen Betreuung und Versorgung.The test strip according to the invention is an essential contribution to the improvement of medical care and care.

Mittels einer einfachen, schnellen und spezifischen Methode kann vorzugsweise Speichel, Harn, Serum, Plasma und Blut der Ethanolgehalt bestimmt worden.By means of a simple, fast and specific method can be determined preferably saliva, urine, serum, plasma and blood of the ethanol content.

Die Erfindung besitzt weiterhin eine große Bedeutung fürforensische Belange, wie z. B. Feststellung des Alkoholisierungsgrades Verdächtiger verkehrsteilnehmer oder bei der Untersuchung und Aufklärung von Straftaten.The invention also has great importance for forensic issues, such as. B. Determination of the degree of alcoholisation Suspicious road users or in the investigation and investigation of criminal offenses.

Embodiment 1

Die in der nachfolgenden Tabelle angeführten Verbindungen wurden zur Bestimmung des Ethanolgehaltes verwendet. Für die Tränkung des saugfähigen Materials, hier Filterpapier, zur Herstellung des Teststreifens wurden folgende Lösungen bzw. Substanzen verwendet:The compounds listed in the table below were used to determine the ethanol content. For the impregnation of the absorbent material, here filter paper, for the preparation of the test strip, the following solutions or substances were used:

Impregnation solutions of the reagents in water or buffer

1-Methoxy-phenazinmethosulfat (c = 0,01 mg/mi)1-methoxy-phenazine methosulfate (c = 0.01 mg / ml)

NAD (c = 5,0 mg/ml)NAD (c = 5.0 mg / ml)

INT (c= 1,0 mg/ml)INT (c = 1.0 mg / ml)

ADH . (c = 2,0 mg/ml)ADH. (c = 2.0 mg / ml)

Pyrazol (c = 0,1 mg/mi)Pyrazole (c = 0.1 mg / ml)

Starting materials or additives

Semicarbazid-Glycin-Puffer pH 8,6Semicarbazide-glycine buffer pH 8.6

(Semicarbazid 0,075 mol/l) (Glycin 0,075 mol/l)(Semicarbazide 0.075 mol / l) (glycine 0.075 mol / l)

Glycin-Salzsäure-Puffer pH 2,5Glycine hydrochloric acid buffer pH 2.5

(Glycin 0,1 mol/l) (Salzsäure0,1 mol/l)(Glycine 0.1 mol / l) (hydrochloric acid 0.1 mol / l)

Dimethylformamid i. . . . (c = 25 mg/ml)Dimethylformamide i. , , , (c = 25 mg / ml)

Tween 80 (c = 0,4 mg/ml)Tween 80 (c = 0.4 mg / ml)

2.6-Di-tertiäres-butyl-4-methylphenol (c = 10 mg/ml)2,6-di-tertiary-butyl-4-methylphenol (c = 10 mg / ml)

Nach Tränkung der Papierstreifen mit den oben aufgeführten Reagenzien und Stoffen entweder an einer Stelle hintereinander oder getrennt voneinander an im wesentlichen getrennten, sich nicht berührenden Stellen, werden die Papierstreifen durch Lufttrocknung von anhaftender Feuchtigkeit befreit. Nach Benetzung des Teststreifens mit einer ethanolhaltigen Flüssigkeit, beispielsweise Speichel, erfolgt nach 2min der Vergleich der ausgebildeten roten Farbflecke mit einer Vergleichsskala. Die Vergleichsskala wurde vorher durch Messung von Ethanolstandardlösungen im Bereich 0,15 bis 3,0mg/g erhalten. Die festgestellten Farbtiefen und-differenzen zwischen den einzelnen Meßpunkten blieben über einen längeren Zeitraum konstant.After impregnation of the paper strips with the reagents and substances listed above, either at one point in succession or separately from one another at substantially separate, non-contacting points, the paper strips are freed of adherent moisture by air drying. After wetting the test strip with an ethanol-containing liquid, for example saliva, the comparison of the formed red color spots with a comparison scale takes place after 2 minutes. The comparative scale was previously obtained by measuring ethanol standard solutions in the range of 0.15 to 3.0 mg / g. The observed color depths and differences between the individual measuring points remained constant over a longer period of time.

Embodiment 2

Die in der nachfolgenden Tabelle angeführten Verbindungen wurden zur Bestimmung des Ethanolgehaltes verwendet. Für die Tränkung des saugfähigen Materials, hier Polymere, zur Herstellung des Teststreifens wurden folgende Lösungen bzw. Substanzen verwendet:The compounds listed in the table below were used to determine the ethanol content. For the impregnation of the absorbent material, here polymers, for the preparation of the test strip, the following solutions or substances were used:

Impregnation solutions of the reagents in water or buffer

Phenazin ethosulfat (c = 0,01 mg/ml))Phenazine ethosulfate (c = 0.01 mg / ml))

NAD (c = 5,0 mg/ml)NAD (c = 5.0 mg / ml)

MMT (C= 1,2 mg/mlMMT (C = 1.2 mg / ml

ADH (c = 5,0 mg/ml)ADH (c = 5.0 mg / ml)

Ethylendiamintetraessigsäure(EDTA) (c=1,0mg/ml)Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (c = 1.0 mg / ml)

Starting materials or additives

Semicarbazid-Glycin-Puffer pH 8Semicarbazide-glycine buffer pH 8

(Glycin 0,075 mol/l) (Semicarbazid 0,075 mol/l)(Glycine 0.075 mol / l) (semicarbazide 0.075 mol / l)

Glycin-Salzsäure-Puffer pH 2Glycine hydrochloric acid buffer pH 2

Triton X 100 (c = 0,4 mg/ml)Triton X 100 (c = 0.4 mg / ml)

Alle Substanzen wurden zu einer gemeinsamen Tränklösung vereinigt. In dieser Tränklösung taucht man den Polymerstreifen, welcher dann anschließend durch Lyophilisation von anhaftender Flüssigkeit befreit wird. Als ethanolhaltige Flüssigkeit kommt Urin zur Anwendung. Die Auswertung der blauen Farbflecke erfolgt analog AusführungsbeispielAll substances were combined to a common watering solution. In this impregnation solution, the polymer strip is dipped, which is then subsequently freed from adhering liquid by lyophilization. Urine is used as the ethanol-containing fluid. The evaluation of the blue color spots is analogous to the embodiment

Claims

Invention claim:

1. test strip for determining the ethanol content in a liquid, in particular in a body fluid such. Saliva, urine, serum, plasma, etc. containing

(1) a compound which is useful as an electron transfer agent, according to the formula given below, in particular 1-methoxy-phenazine methosulfate;

(2) a tetrazolium salt, in particular

MTT [3- (4,5-dimethyl (thiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazolium] and / or JNT [2- (4-iodophenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyltetrazolium],

(3) an alcohol dehydrogenase (ADH),

(4) a nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) and

(5) a buffer pH 1 to 4, in particular, glycine hydrochloric acid buffer, and a buffer pH7 to 9, in particular semicarbazide buffer,

characterized in that the test strip contains a methosulfate obtained by impregnating an absorbent material with in particular 1-methoxyphenazine dry residue.

2. Test strip according to item 1, characterized in that they are compounds which are suitable as electron transfer agents, of the general formula

CH ₃ Sun ₄

wherein R _{1 is} an alkyl group and R _{2 is} an alkoxy group or a hydrogen atom is.

3. test strip according to item 1 and 2, characterized in that the test strip additionally contains a obtained by impregnating the absorbent material with an ADH inhibitor, in particular pyrazole, dry residue.

4. test strip according to item 1 to 3, characterized in that the test strip additionally by impregnating an absorbent material with

(1) a nonionic wetting agent, in particular Tween 80 or Triton X100 and / or

(2) a means for preventing a chromatographic effect and / or

(3) an antioxidant
obtained dry residue.

5. Test strip according to items 1 to 4, characterized in that the test strip contains a dry residue obtained by impregnating the absorbent material with a means for improving the dissolution of the tetrazolium salts, in particular dimethylformamide.

6. Test strip according to items 1 to 5, characterized in that the test strip contains a dry residue obtained by impregnating the absorbent material with a glycine hydrochloric acid buffer pH2.5, which improves the stability of the electron transferring.

7. Test strip according to item 1 to 6, characterized in that the absorbent material consists of paper, cellulosic fibers for papermaking, polymers, gel layers or combinations of these materials, including special pre-treatments are included.

A method according to any of claims 1 to 7, characterized in that the impregnation of the absorbent material with at least two impregnating solutions is carried out separately from one another at substantially separate, non-contacting points.

9. The method according to item 1 to7, characterized in that the impregnation of the absorbent material with a single impregnation solution or several impregnation solutions is carried out in succession in one and the same place.