DD244823A1

DD244823A1 - Verfahren zur eliminierung von sauerstoff bei durch sauerstoff gestoerten prozessen

Info

Publication number: DD244823A1
Application number: DD28536185A
Authority: DD
Inventors: Reinhard Renneberg; Frieder Scheller; Florian Schubert
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1985-12-24
Filing date: 1985-12-24
Publication date: 1987-04-15

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Eliminierung von Sauerstoff bei durch Sauerstoff gestoerten Prozessen, die in fluessigen Phasen ablaufen. Ziel ist es, auf einfache und sparsame Weise den Zutritt von Sauerstoff zu verhindern. Aufgabe ist es, eine effektive Anordnung von sauerstoffverbrauchendem Enzym zur Verhinderung des Zutritts von stoerendem Sauerstoff zu erreichen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass eine mit Sauerstoff verbrauchendem Enzym beladene Membran zwischen dem Sauerstoff liefernden Medium und dem System angeordnet wird, in dem der durch Sauerstoff gestoerte Prozess ablaeuft, wobei das Substrat des Sauerstoff verbrauchenden Enzyms ueber eine fluessige Phase in die Membran transportiert wird. Die Erfindung wird in Forschung und Produktion der photochemischen und biotechnologischen Industrie, aber auch in klinischen Labors angewendet.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Eliminierung von Sauerstoff bei durch Sauerstoff gestörten Prozessen. Das Verfahren wird in bei Normaltemperatur und in flüssiger Phase ablaufenden Prozessen, wie elektrochemische, biochemische und photochemische Prozesse, angewendet.

Der Einsatz erfolgt in Forschung und Produktion der photochemischen und biotechnologischen Industrie, aber auch in klinischen Labors.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Bisher war es üblich, störenden Sauerstoff durch Schaffung einer sauerstofffreien Atmosphäre, z. B. durch Begasen mit Stickstoff oder Edelgasen, von durch Sauerstoff gestörten Prozessen fernzuhalten. Das Begasen erfordert einen hohen Zeit- und Kostenaufwand und gewährleistet oft keine vollständige Entfernung des Sauerstoffs, insbesondere gelösten Sauerstoffs, aus

dem Medium. · ·

Um insbesondere gelösten Sauerstoff aus flüssigen Medien zu entfernen, werden in der Bier- und Konservenindustrie häufig Glukoseoxidase und Katalase eingesetzt. Da diese Enzyme jedoch nur einmal verwendet werden können, ist ihr Einsatz sehr kostenaufwendig.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist es, auf einfache und sparsame Weise den Zutritt von Sauerstoff zu durch Sauerstoff gestörten Prozeßabläufen in flüssigen Phasen zu verhindern.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine effektive Anordnung von sauerstoffverbrauchendem Enzym zur Verhinderung des Zutritts von störendem Sauerstoff zu erreichen.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß dadurch, daß eine mit Sauerstoff verbrauchende^ Enzymbeladene Membran zwischen dem Sauerstoff liefernden Medium und dem System angeordnet wird, in dem der durch O₂ gestörte Prozeß abläuft, wobei das Substrat des O₂ verbrauchenden Enzyms über eine flüssige Phase in die Membran transportiert wird.

Aus dem sauerstoffhaltigen Medium diffundieren sowohl gelöster Sauerstoff als auch die Reaktanten der sauerstoffsensitiven Reaktionen durch die Membran. Der gelöste Sauerstoff wird dabei durch die vorgelagerte sauerstoffverbrauchende Enzymschicht in gebundene Formen überführt, wenn dem sauerstoffhaltigen Gemisch oder der Enzymschicht eine bestimmte Menge des spezifischen Substrates der jeweiligen Oxidase zugesetzt wird.

Reaktanten > Reaktanten

iten O₂

Substrat+O₂ ^; ^Oxidase gebundener

Sauerstoff + Oxidationsprodukt

(Enzymschicht)

sauerstoffhaltiges Membran Reaktionsraum der

Medium durch O₂ gestörten

Reaktion

Falls bestimmte Formen des gebundenen Sauerstoffs (z. B. H₂O₂) ebenfalls die Realisierung der unempfindlichen Reaktion behindern, werden zusätzliche Enzyme wie Kätalase oder Peroxidase in die Enzymschicht eingearbeitet, die nichtstörende Formen des gebundenen Sauerstoffs bilden (z. B. Wasser).

Es hat sich gezeigt, daß die enzymatische Sauerstoffentfernung unter Verwendung von in oder auf Membranen immobilisierten Oxidasen und ggf. Kätalase sowei ggf. der spezifischen Substrate der jeweiligen Oxidasen eine sehr wirkungsvolle und sparsame Methode (hohe Lebensdauer, geringer Enzymverbrauch und Wiederverwendbarkeit) dargestellt. Insbesondere die Eigenschaften von Membranen, sich praktisch jeder Form anzupassen und für Reaktanten durchlässig zu sein, ermöglichen ein breites Anwendungsgebiet.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen erläutert.

Beispiel 1 Bestimmung von NAD⁺, Pyruvat und NAD⁺- sowie pyrovatumsetzenden Enzymen

Eineflache, mit einer Dialysemembran (Dicke 15μ,ηη) bedeckte Hg-E!ektrode(d = 2 mm) wird mit einer Enzymmembran, diel mg Glukoseoxidase (50U) und 5000U Kätalase je cm² in Gelatine immobilisiert enthält, bedeckt. Die Enzymmembran ist von einer weiteren Dialysemembran abgedeckt. Die so präparierte Elektrode taucht in 5 ml 0,075 M Phosphatpuffer, pH 5,5, der 5OmM Glukose sowie Luft enthält. Die Elektrode wird mittels eines Polarographen auf-1,2V bzw. —1,5V gegen eine Kalomelelektrode polarisiert. Als Gegenelektrode dient eine Pt-Elektrode. Die Pufferlösung wird mit einem Magnetrührer gerührt. Durch 5malige Zugabe von jeweils 50/xl 1OmM NAD⁺wird eine Kalibrierungskurve aufgenommen. Zur Messung der Laktatdehydrogenase (LDH)-Aktivität in Serum werden 100μΙ der Serumprobe mit 1OmM Laktat und 1 mM NADH in 5ml Phosphatpuffer, pH 5,5, inkubiert. Die Strom-Zeit-Kurve bei —1,2V wird mit einem Schreiber registriert und aus dem Anstieg über die Eichkurve die LDH-Aktivität der Serumprobe ermittelt.

Zur Bestimmung der Aktivität von Pyrovatkinase wird analog wie bei der LDH-Messung verfahren, die Strom-Zeit-Kurve wird bei — 1,5V registriert, die Eichung mit Pyrovat durchgeführt, und die Inkubation erfolgt mit 1OmM Phosphoenolpyrovat und 1 mM ADP.

Beispiel 2 Elektrochemische Regenerierung von NADPH

EineHg-Pool-Elektrode(d = 2cm) wird mit einer Membran, diel mg (12U) Laktatoxidaseund5000U Kätalase je cm² enthält wie. in Beispiel 1 bedeckt. Diese Elektrode wird mittels Potentiosat auf -1,8 V gegen eine Kalomelelektrode polarisiert. Dazu wird eine Pt-Netzelektrode von 10 m² Oberfläche verwendet. Die Hg-Elektrode taucht in 2 ml 0,5 M Phosphatpuffer, pH 7,0, mit 5OmM Laktat, 1OmM Phenobarbital und 200 mg Lebermikrosomen der Ratte. Bei Zusatz von NADP⁺erfolgt die kathodische Reduktion zu NADPH, das durch das lebermikrosomale Cytochrom P-450-System für die Umsetzung von Phenobarbital unter Verbrauch von O₂ in NADP⁺ zurückoxidiert wird. Damit wird die O₂ maskierte NADP⁺-Reduktion mit der überfordernden P-450 Katalyse gekoppelt.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Eliminierung von Sauerstoff bei durch Sauerstoff gestörten Prozessen, die bei Normaltemperatur und in flüssiger Phase ablaufen, gekennzeichnet dadurch, daß eine mit Sauerstoff verbrauchendem Enzym und ggf. mit H₂O₂ verbrauchendem Enzym beladene Membran zwischen dem Sauerstoff enthaltenden gasförmigen oder flüssigen Medium und dem System angeordnet wird, in dem der durch Sauerstoff gestörte Prozeß abläuft, wobei das Substrat des Sauerstoff verbrauchenden Enzyms über eine flüssige Phase in die Membran transportiert wird oder ggf. bereits in der Membran enthalten ist.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Substrat des O₂-verbrauchenden Enzyms der flüssigen Phase zugesetzt wird, in der der durch Sauerstoff gestörte Prozeß abläuft.
3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Substrat des (^-verbrauchenden Enzyms einerflüssigen Phase zugesetzt wird, die außerhalb des Systems, in dem der durch Sauerstoff gestörte Prozeß abläuft, mit der Membran in Kontakt gebracht werden.
4. Verfahren nach Punkt 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß das In-Kontaktbringen der flüssigen Phase, die das Substrat enthält, mit der Membran mittels eines saugfähigen Materials erfolgt.
5. Verfahren nach Punkt 1-4, gekennzeichnet dadurch, daß die Membran aus natürlichen, modifizierten natürlichen oder synthetischen Polymeren bzw. Polymergemischen besteht, die ggf. mit Stützschichten versehen sind.
6. Verfahren nach Punkt 1-5, gekennzeichnet dadurch, daß als Sauerstoff verbrauchende Enzyme H₂0₂-erzeugende0xidasen (z. B. Glucose-, Alkohol-, NADH-, Glutamatoxidase) gegebenenfalls in Kombination mit H₂O₂ verbrauchenden Enzymen oder H₂O₂-erzeugende Oxidasen (z. B. Askorbatoxidase, Bilirubinoxidase, Laktatmonoxygenase, desaminierende Glutamatoxidase) eingesetzt werden.
7. Verfahren nach Punkt 1-6, gekennzeichnet dadurch, daß die flüssige Phase eine wäßrige Phase mit 0-30/VoI.-% eines organischen mit Wasser mischbaren Lösungsmittels ist.
8. Verfahren nach Punkt 1-7, gekennzeichnet dadurch, daß als organische mit Wasser mischbare Lösungsmittel Ethanol, Aceton, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid verwendet werden.
9. Verfahren nach Punkt 1-8, gekennzeichnet dadurch, daß die Membranen Elektrodenoberflächen bedecken, an denen durch Sauerstoff störbare elektrochemische Reaktionen (z. B. die Reduktion von NAD(P)⁺, Methylviologen, Pyruvat) ablaufen oder

photochemische, photobiologische oder biochemische Systeme bedecken oder umschließen

durch Sauerstoff störbare bzw. anaerob lebende Organismen bedecken, umgeben oder umschließen.