DD244823A1 - METHOD FOR ELIMINATING OXYGEN IN OXYGEN-PROCESSED PROCESSES - Google Patents

METHOD FOR ELIMINATING OXYGEN IN OXYGEN-PROCESSED PROCESSES Download PDF

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DD244823A1
DD244823A1 DD28536185A DD28536185A DD244823A1 DD 244823 A1 DD244823 A1 DD 244823A1 DD 28536185 A DD28536185 A DD 28536185A DD 28536185 A DD28536185 A DD 28536185A DD 244823 A1 DD244823 A1 DD 244823A1
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Reinhard Renneberg
Frieder Scheller
Florian Schubert
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Adw Ddr
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Eliminierung von Sauerstoff bei durch Sauerstoff gestoerten Prozessen, die in fluessigen Phasen ablaufen. Ziel ist es, auf einfache und sparsame Weise den Zutritt von Sauerstoff zu verhindern. Aufgabe ist es, eine effektive Anordnung von sauerstoffverbrauchendem Enzym zur Verhinderung des Zutritts von stoerendem Sauerstoff zu erreichen. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass eine mit Sauerstoff verbrauchendem Enzym beladene Membran zwischen dem Sauerstoff liefernden Medium und dem System angeordnet wird, in dem der durch Sauerstoff gestoerte Prozess ablaeuft, wobei das Substrat des Sauerstoff verbrauchenden Enzyms ueber eine fluessige Phase in die Membran transportiert wird. Die Erfindung wird in Forschung und Produktion der photochemischen und biotechnologischen Industrie, aber auch in klinischen Labors angewendet.The invention relates to a method for the elimination of oxygen in oxygen-perturbed processes that take place in liquid phases. The aim is to prevent the access of oxygen in a simple and economical way. The object is to achieve an effective arrangement of oxygen-consuming enzyme to prevent the entry of interfering oxygen. According to the invention, the object is achieved by arranging a membrane loaded with oxygen-consuming enzyme between the oxygen-supplying medium and the system in which the process disturbed by oxygen takes place, the substrate of the oxygen-consuming enzyme being transported into the membrane via a liquid phase becomes. The invention is used in research and production of the photochemical and biotechnological industry, but also in clinical laboratories.

Description

Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Eliminierung von Sauerstoff bei durch Sauerstoff gestörten Prozessen. Das Verfahren wird in bei Normaltemperatur und in flüssiger Phase ablaufenden Prozessen, wie elektrochemische, biochemische und photochemische Prozesse, angewendet.The invention relates to a method for the elimination of oxygen in oxygen-disrupted processes. The process is used in normal temperature and liquid phase processes such as electrochemical, biochemical and photochemical processes.

Der Einsatz erfolgt in Forschung und Produktion der photochemischen und biotechnologischen Industrie, aber auch in klinischen Labors.It is used in research and production of the photochemical and biotechnological industry as well as in clinical laboratories.

Charakteristik der bekannten technischen LösungenCharacteristic of the known technical solutions

Bisher war es üblich, störenden Sauerstoff durch Schaffung einer sauerstofffreien Atmosphäre, z. B. durch Begasen mit Stickstoff oder Edelgasen, von durch Sauerstoff gestörten Prozessen fernzuhalten. Das Begasen erfordert einen hohen Zeit- und Kostenaufwand und gewährleistet oft keine vollständige Entfernung des Sauerstoffs, insbesondere gelösten Sauerstoffs, ausSo far, it has been common to disturbing oxygen by creating an oxygen-free atmosphere, eg. B. by gassing with nitrogen or noble gases, disturbed by oxygen-disrupted processes. Fumigating requires a great deal of time and expense, and often does not ensure complete removal of the oxygen, especially dissolved oxygen

dem Medium. · ·the medium. · ·

Um insbesondere gelösten Sauerstoff aus flüssigen Medien zu entfernen, werden in der Bier- und Konservenindustrie häufig Glukoseoxidase und Katalase eingesetzt. Da diese Enzyme jedoch nur einmal verwendet werden können, ist ihr Einsatz sehr kostenaufwendig.In order to remove in particular dissolved oxygen from liquid media, glucose oxidase and catalase are frequently used in the beer and canning industry. However, since these enzymes can only be used once, their use is very costly.

Ziel der ErfindungObject of the invention

Ziel der Erfindung ist es, auf einfache und sparsame Weise den Zutritt von Sauerstoff zu durch Sauerstoff gestörten Prozeßabläufen in flüssigen Phasen zu verhindern.The aim of the invention is to prevent in a simple and economical way the access of oxygen to oxygen-disrupted processes in liquid phases.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine effektive Anordnung von sauerstoffverbrauchendem Enzym zur Verhinderung des Zutritts von störendem Sauerstoff zu erreichen.The object of the invention is to achieve an effective arrangement of oxygen-consuming enzyme for preventing the entry of interfering oxygen.

Die Lösung der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß dadurch, daß eine mit Sauerstoff verbrauchende^ Enzymbeladene Membran zwischen dem Sauerstoff liefernden Medium und dem System angeordnet wird, in dem der durch O2 gestörte Prozeß abläuft, wobei das Substrat des O2 verbrauchenden Enzyms über eine flüssige Phase in die Membran transportiert wird.The object is achieved according to the invention by arranging an oxygen-consuming membrane loaded with oxygen between the oxygen-supplying medium and the system in which the process disturbed by O 2 takes place, the substrate of the O 2- consuming enzyme being introduced via a liquid phase the membrane is transported.

Aus dem sauerstoffhaltigen Medium diffundieren sowohl gelöster Sauerstoff als auch die Reaktanten der sauerstoffsensitiven Reaktionen durch die Membran. Der gelöste Sauerstoff wird dabei durch die vorgelagerte sauerstoffverbrauchende Enzymschicht in gebundene Formen überführt, wenn dem sauerstoffhaltigen Gemisch oder der Enzymschicht eine bestimmte Menge des spezifischen Substrates der jeweiligen Oxidase zugesetzt wird.From the oxygen-containing medium both dissolved oxygen and the reactants of the oxygen-sensitive reactions diffuse through the membrane. The dissolved oxygen is converted into bonded forms by the upstream oxygen-consuming enzyme layer when the oxygen-containing mixture or the enzyme layer, a certain amount of the specific substrate of the respective oxidase is added.

Reaktanten > ReaktantenReactants> Reactants

iten O2 O 2

Substrat+O2 ; ^Oxidase gebundenerSubstrate + O 2 ; ^ Oxidase bound

Sauerstoff + OxidationsproduktOxygen + oxidation product

(Enzymschicht)(Enzyme layer)

sauerstoffhaltiges Membran Reaktionsraum deroxygenated membrane reaction space of

Medium durch O2 gestörtenMedium disturbed by O 2

Reaktionreaction

Falls bestimmte Formen des gebundenen Sauerstoffs (z. B. H2O2) ebenfalls die Realisierung der unempfindlichen Reaktion behindern, werden zusätzliche Enzyme wie Kätalase oder Peroxidase in die Enzymschicht eingearbeitet, die nichtstörende Formen des gebundenen Sauerstoffs bilden (z. B. Wasser).If certain forms of bound oxygen (eg H 2 O 2 ) also hinder the realization of the insensitive reaction, additional enzymes such as catalase or peroxidase are incorporated into the enzyme layer forming non-interfering forms of bound oxygen (eg water). ,

Es hat sich gezeigt, daß die enzymatische Sauerstoffentfernung unter Verwendung von in oder auf Membranen immobilisierten Oxidasen und ggf. Kätalase sowei ggf. der spezifischen Substrate der jeweiligen Oxidasen eine sehr wirkungsvolle und sparsame Methode (hohe Lebensdauer, geringer Enzymverbrauch und Wiederverwendbarkeit) dargestellt. Insbesondere die Eigenschaften von Membranen, sich praktisch jeder Form anzupassen und für Reaktanten durchlässig zu sein, ermöglichen ein breites Anwendungsgebiet.It has been found that the enzymatic oxygen removal using immobilized in or on membranes oxidases and optionally Kätalase sowei and possibly the specific substrates of the respective oxidases a very effective and economical method (high life, low enzyme consumption and reusability). In particular, the properties of membranes, which can be adapted to virtually any shape and permeable to reactants, allow a wide range of applications.

Ausführungsbeispieleembodiments

Die Erfindung wird nachstehend an 2 Ausführungsbeispielen erläutert.The invention will be explained below with reference to two exemplary embodiments.

Beispiel 1example 1 Bestimmung von NAD+, Pyruvat und NAD+- sowie pyrovatumsetzenden EnzymenDetermination of NAD + , pyruvate and NAD + - as well as pyro-converting enzymes

Eineflache, mit einer Dialysemembran (Dicke 15μ,ηη) bedeckte Hg-E!ektrode(d = 2 mm) wird mit einer Enzymmembran, diel mg Glukoseoxidase (50U) und 5000U Kätalase je cm2 in Gelatine immobilisiert enthält, bedeckt. Die Enzymmembran ist von einer weiteren Dialysemembran abgedeckt. Die so präparierte Elektrode taucht in 5 ml 0,075 M Phosphatpuffer, pH 5,5, der 5OmM Glukose sowie Luft enthält. Die Elektrode wird mittels eines Polarographen auf-1,2V bzw. —1,5V gegen eine Kalomelelektrode polarisiert. Als Gegenelektrode dient eine Pt-Elektrode. Die Pufferlösung wird mit einem Magnetrührer gerührt. Durch 5malige Zugabe von jeweils 50/xl 1OmM NAD+wird eine Kalibrierungskurve aufgenommen. Zur Messung der Laktatdehydrogenase (LDH)-Aktivität in Serum werden 100μΙ der Serumprobe mit 1OmM Laktat und 1 mM NADH in 5ml Phosphatpuffer, pH 5,5, inkubiert. Die Strom-Zeit-Kurve bei —1,2V wird mit einem Schreiber registriert und aus dem Anstieg über die Eichkurve die LDH-Aktivität der Serumprobe ermittelt.A flat Hg electrode (d = 2 mm) covered with a dialysis membrane (thickness 15 μ, ηη) is covered with an enzyme membrane which contains immobilized mg mg glucose oxidase (50 U) and 5000 U catalase per cm 2 immobilized in gelatin. The enzyme membrane is covered by another dialysis membrane. The prepared electrode is immersed in 5 ml of 0.075 M phosphate buffer, pH 5.5, containing 5 mM of glucose and air. The electrode is polarized by means of a polarograph to-1.2V or -1.5V against a calomel electrode. The counter electrode is a Pt electrode. The buffer solution is stirred with a magnetic stirrer. 5 times the addition of 50 / xl 1OmM NAD + a calibration curve is recorded. To measure lactate dehydrogenase (LDH) activity in serum, 100 μM of the serum sample are incubated with 10 mM lactate and 1 mM NADH in 5 mL phosphate buffer, pH 5.5. The current-time curve at -1.2 V is recorded with a recorder and the LDH activity of the serum sample is determined from the increase over the calibration curve.

Zur Bestimmung der Aktivität von Pyrovatkinase wird analog wie bei der LDH-Messung verfahren, die Strom-Zeit-Kurve wird bei — 1,5V registriert, die Eichung mit Pyrovat durchgeführt, und die Inkubation erfolgt mit 1OmM Phosphoenolpyrovat und 1 mM ADP.The activity of pyrovatkinase is determined analogously to the LDH measurement, the current-time curve is recorded at -1.5V, the pyrovate is calibrated, and the incubation is carried out with 10 mM phosphoenolpyrovate and 1 mM ADP.

Beispiel 2Example 2 Elektrochemische Regenerierung von NADPHElectrochemical regeneration of NADPH

EineHg-Pool-Elektrode(d = 2cm) wird mit einer Membran, diel mg (12U) Laktatoxidaseund5000U Kätalase je cm2 enthält wie. in Beispiel 1 bedeckt. Diese Elektrode wird mittels Potentiosat auf -1,8 V gegen eine Kalomelelektrode polarisiert. Dazu wird eine Pt-Netzelektrode von 10 m2 Oberfläche verwendet. Die Hg-Elektrode taucht in 2 ml 0,5 M Phosphatpuffer, pH 7,0, mit 5OmM Laktat, 1OmM Phenobarbital und 200 mg Lebermikrosomen der Ratte. Bei Zusatz von NADP+erfolgt die kathodische Reduktion zu NADPH, das durch das lebermikrosomale Cytochrom P-450-System für die Umsetzung von Phenobarbital unter Verbrauch von O2 in NADP+ zurückoxidiert wird. Damit wird die O2 maskierte NADP+-Reduktion mit der überfordernden P-450 Katalyse gekoppelt.An Hg pool electrode (d = 2cm) is fitted with a membrane containing mg (12U) lactate oxidase and 5,000U catalase per cm 2 . covered in Example 1. This electrode is polarized by means of potentiosate to -1.8 V against a calomel electrode. For this purpose, a Pt mesh electrode of 10 m 2 surface is used. The Hg electrode is dipped in 2 ml of 0.5 M phosphate buffer, pH 7.0, with 50 mM lactate, 10 mM phenobarbital and 200 mg rat liver microsomes. With the addition of NADP + the cathodic reduction to NADPH, which is reoxidized + lebermikrosomale by the cytochrome P-450 system for the implementation of phenobarbital with the consumption of O 2 in NADP occurs. Thus, the O 2 masked NADP + reduction is coupled with the overburdening P-450 catalysis.

Claims (9)

Erfindungsanspruch:Invention claim: 1. Verfahren zur Eliminierung von Sauerstoff bei durch Sauerstoff gestörten Prozessen, die bei Normaltemperatur und in flüssiger Phase ablaufen, gekennzeichnet dadurch, daß eine mit Sauerstoff verbrauchendem Enzym und ggf. mit H2O2 verbrauchendem Enzym beladene Membran zwischen dem Sauerstoff enthaltenden gasförmigen oder flüssigen Medium und dem System angeordnet wird, in dem der durch Sauerstoff gestörte Prozeß abläuft, wobei das Substrat des Sauerstoff verbrauchenden Enzyms über eine flüssige Phase in die Membran transportiert wird oder ggf. bereits in der Membran enthalten ist.1. A process for the elimination of oxygen in processes disturbed by oxygen, which proceed at normal temperature and in the liquid phase, characterized in that an oxygen-consuming enzyme and optionally with H 2 O 2 consuming enzyme-loaded membrane between the oxygen-containing gaseous or liquid Medium is arranged and the system in which runs the process disturbed by oxygen, wherein the substrate of the oxygen-consuming enzyme is transported via a liquid phase in the membrane or possibly already contained in the membrane. 2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Substrat des O2-verbrauchenden Enzyms der flüssigen Phase zugesetzt wird, in der der durch Sauerstoff gestörte Prozeß abläuft.2. The method according to item 1, characterized in that the substrate of the O 2- consuming enzyme is added to the liquid phase in which the process disrupted by oxygen takes place. 3. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß das Substrat des (^-verbrauchenden Enzyms einerflüssigen Phase zugesetzt wird, die außerhalb des Systems, in dem der durch Sauerstoff gestörte Prozeß abläuft, mit der Membran in Kontakt gebracht werden.3. Method according to item 1, characterized in that the substrate of the (--consuming enzyme is added to a liquid phase which is brought into contact with the membrane outside the system in which the oxygen-perturbed process takes place. 4. Verfahren nach Punkt 1 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß das In-Kontaktbringen der flüssigen Phase, die das Substrat enthält, mit der Membran mittels eines saugfähigen Materials erfolgt.4. The method according to item 1 and 3, characterized in that the contacting of the liquid phase, which contains the substrate, takes place with the membrane by means of an absorbent material. 5. Verfahren nach Punkt 1-4, gekennzeichnet dadurch, daß die Membran aus natürlichen, modifizierten natürlichen oder synthetischen Polymeren bzw. Polymergemischen besteht, die ggf. mit Stützschichten versehen sind.5. The method according to item 1-4, characterized in that the membrane consists of natural, modified natural or synthetic polymers or polymer mixtures, which are optionally provided with support layers. 6. Verfahren nach Punkt 1-5, gekennzeichnet dadurch, daß als Sauerstoff verbrauchende Enzyme H202-erzeugende0xidasen (z. B. Glucose-, Alkohol-, NADH-, Glutamatoxidase) gegebenenfalls in Kombination mit H2O2 verbrauchenden Enzymen oder H2O2-erzeugende Oxidasen (z. B. Askorbatoxidase, Bilirubinoxidase, Laktatmonoxygenase, desaminierende Glutamatoxidase) eingesetzt werden.6. The method according to item 1-5, characterized in that as oxygen-consuming enzymes H 2 0 2 -producing oxidases (eg, glucose, alcohol, NADH, glutamate) optionally in combination with H 2 O 2 consuming enzymes or H 2 O 2 -generating oxidases (eg ascorbate oxidase, bilirubin oxidase, lactate monoxygenase, deaminating glutamate oxidase) can be used. 7. Verfahren nach Punkt 1-6, gekennzeichnet dadurch, daß die flüssige Phase eine wäßrige Phase mit 0-30/VoI.-% eines organischen mit Wasser mischbaren Lösungsmittels ist.7. The method according to item 1-6, characterized in that the liquid phase is an aqueous phase with 0-30 / VoI .-% of an organic water-miscible solvent. 8. Verfahren nach Punkt 1-7, gekennzeichnet dadurch, daß als organische mit Wasser mischbare Lösungsmittel Ethanol, Aceton, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid verwendet werden.8. The method according to item 1-7, characterized in that are used as organic water-miscible solvents, ethanol, acetone, dimethylformamide or dimethyl sulfoxide. 9. Verfahren nach Punkt 1-8, gekennzeichnet dadurch, daß die Membranen Elektrodenoberflächen bedecken, an denen durch Sauerstoff störbare elektrochemische Reaktionen (z. B. die Reduktion von NAD(P)+, Methylviologen, Pyruvat) ablaufen oder9. The method according to item 1-8, characterized in that the membranes cover electrode surfaces on which elusive by oxygen electrochemical reactions (eg., The reduction of NAD (P) + , methyl viologen, pyruvate) expire or photochemische, photobiologische oder biochemische Systeme bedecken oder umschließencover or enclose photochemical, photobiological or biochemical systems durch Sauerstoff störbare bzw. anaerob lebende Organismen bedecken, umgeben oder umschließen.cover, surround or enclose organisms susceptible to oxygen or anaerobes.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5190870A (en) * 1989-05-16 1993-03-02 Amoco Corporation Method for oxidizing hydrocarbons with a hydroxylase from a methane monooxygenase
US5192672A (en) * 1989-05-16 1993-03-09 Amoco Corporation Method for oxidizing hydrocarbons with a hydroxylase from a methane monooxygenase

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5190870A (en) * 1989-05-16 1993-03-02 Amoco Corporation Method for oxidizing hydrocarbons with a hydroxylase from a methane monooxygenase
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