DD243714A1

DD243714A1 - Verfahren zur stabilisierung von immobilisierter glukoseoxidase

Info

Publication number: DD243714A1
Application number: DD28149585A
Authority: DD
Inventors: Dieter Kirstein; Frieder Scheller
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-10-08
Filing date: 1985-10-08
Publication date: 1987-03-11

Abstract

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Stabilisierung von immobilisierter Glukoseoxidase bzw. von Glukoseoxidase enthaltenden Biokatalysatoren zu entwickeln, das eine Erhoehung der Arbeitsstabilitaet der genannten Katalysatoren bei der Herstellung von Hydrochinon und Glukonsaeure bewirkt. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass zur Stabilisierung eine Peroxidase, insbesondere Meerrettichperoxidase am bzw. im gleichen Traeger coimmobilisiert wird und dass die Reaktionsloesung Zusaetze eines Peroxidasesubstrates insbesondere von Hydrochinon enthaelt. Das Verfahren ist in der biotechnologischen Produktion anwendbar, insbesondere bei der Herstellung von Glukonsaeure aus Glukose und der Herstellung von Hydrochinon aus Chinon.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung von immobilisierter Glukoseoxidase (GOD) bzw. von glukoseoxidasehaltigen Biokatalysatoren gegenüber dem Angriff durch Wasserstoffperoxid bzw. andere Produkte) die bei GOD-katalysierten Oxidationen entstehen; Das Verfahren ist in der Biotechnologie; insbesondere? bei der enzymatischen Hydrochinonproduktion anwendbar.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Glukoseoxidase ist ein Enzym, das neben der Oxidation von Glukose durch Sauerstoff (nach Gl, T)

Glukose -KOz = Glukonolacton + H₂O₂ (1)

weitere Reaktionen katalysiert,

Glukose kann z. B, durch 2-Desoxygiukose, 4-0-Methylglukoseund Mannose-ersetztwerden, Reaktionen, die von geringer technischer Bedeutung sind. Sauerstoff ist durch andere Oxidationsmittel, wie p-Benzochinon (Chinon), Methylenblau, 2,6-Dichlorphenolindophenol u.a. ersetzbar, wobei das während der Reaktion mit Chinon gebildete Hydrochinon für die photographische Industrie interessant ist.

Bisheriger Nachteil des Einsatzes von Glukoseoxidase, insbesondere in immobilisierter Fornr, d.h. an unlöslicheTräger gebunden, ist die Empfindlichkeit gegenüber dem ReaktionsproduktWasserstoffperoxid (H₂O₂) bzw. eventuellen Intermediaten, die zu einer geringen Arbeitsstabilität Glukoseoxidase enthaltender Biokatalysatoren führen (D. Kirstein, W. Kühn und P. Mohr „Zum Einsatz immobilisierter GOD in Enzymreaktoren" Lebensmittelindustrie 2$ 444-[198I]). Es ist versucht worden, durch Einsati von coimmobilisierterKatalase das entstehende H₂O₂ katalytisch zu zersetzen und damit die Arbeitsstabilitätdei GOD zu erhöhen („ImrnobilizedEnzymesin Food and Microbial Processes", Plenum Press.1974S. 149 Hrsg:: Olson u. Cooney);, Die dabei erzielten Ergebnisse sind allerdings nicht so gut, daß eine technische Anwendung immobilisierterGOD für präparative Zwecke möglich wurde.

Die Produktion von Hydrochinon aus Chinon mit Hilfe-von GOD und Glukose wurde als ökonomisch vertretbare Prozeßvariante vorgeschlagen, muß aber unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt werden, um die H₂O₂-Bildung aus der Nebenreaktion der Glukose mit Luftsauerstoff zu unterbinden (Alberti, B. N. und Klibanov, M. Enzyme Microb. Technot.*, 47 [1982]).

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die H₂O₂-lnaktivierung immobilisierter GOD zu unterdrücken bzw. die Prozeßführung bei der Herstellung von Hydrochinon mit biotechnologischen Verfahren zu vereinfachen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Stabilisierung von GOD enthaltenden Uiokatalysatoren zu erzielen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, da an den bzw. im unlöslichen Biokatalysator neben GOD bzw. GOD enthaltenden Zellen oder Präparaten eine Peroxidase immobilisiert wird und daß der Reaktionslösung neben dem umzusetzenden Substrat (z. B. Glukose) ein Peroxidasesubstrat zugesetzt wird. Eine besonders vorteilhafte Variante des Verfahrens gegenüber Stabilisierung mit Katalase besteht darin, daß bei der Herstellung von Glukonsäure nach folgendem Schema aufgrund der Reaktion (2) entstehendes H₂O₂ mit Hydrochinon durch POD zu Chinon umgesetzt wird (3) und daß dieses Chinon ein Substrat für die GOD darstellt, das wesentlich schneller als Sauerstoff mit der GOD reagiert.

Glukose-

Glukonolact on

(2)

(3)

Bei geeigneten Konzentrationsverhältnissen lassen sich dadurch sowohl die H₂O₂- als auch die Chinonkonzentrationen außerordentlich gering halten, so daß die oxidative Inaktivierung der GOD verringert wird. Bei der Produktion von Hydrochinon aus Chinon mit immobilisierter GOD bzw. GOD enthaltenden Zellen wird Chinon im Überschuß eingesetzt und anstelle der Stickstoffatmosphäre (s. Alberti und Klibanov) wird die Inaktivierung der GOD durch entstehendes Wasserstoffperoxid infolge des Peroxidase-katalysierten H₂O₂-Verbrauches nach Reaktion (3) minimalisiert.

Besonderer Wert ist dabei auf eine räumlich sehr enge Bindung beider Enzyme am Träger zu legen, wobei durch Verkürzung der Diffusionswege der Reaktanten zwischen beiden Enzymen eine Erhöhung der Stabilisierung gegenüber dem Einsatz beider Enzyme irr Lösung erreicht wird.

Ausführungsbeispiele

Beispiel T

An 10Og eines bekannten organischen oder anorganischen Trägers für Enzymimmobilisierung (z. B. einem Polysacharid, einem Ionenaustauscher, einem porösen Glas oder Metalloxid) werden in bekannter Weise (z. B. durch Ionenaustausch, Adsorption, Geleinschluß oder kovalente Bindung) 335/ikat GOD und 700ftkat POD fixiert.

Das Produkt wird zur Glukonsäureherstellung in einer Lösung von 200 g/l Glukose und 10 g/l Hydrochinon eingesetzt.

Das Hydrochinon wird nach beendeter Glukoseoxidation vom Glukonolacton bzw. der Glukonsäure abgetrennt und in den Prozeß zurückgeführt. Die Zufuhr an Oxidationsmittel erfolgt entwederdurch intensiveBelüftung der Reaktionsmischung (z.B. in einem Wirbelschichtreaktor) oder durch Zufuhr einer H₂O₂-Lösung (z.B. in einem Rezirkulationsreaktor) in einer Reaktionsmediumkonzentration zwischen 0.34 und 3.4g/l.

Beispiel 2

In einem bekannten Enzymreaktor wird der im Beispiel 1 beschriebene GOD und POD enthaltende Träger als Katalysator für die Hydrochinonherstellung aus Chinon in einer gesättigten Chinonlösung, die 20 g/l Glukose enthält, eingesetzt. Zur Erhöhung der Reaktionsausbeute wird dabei entweder in einer Chinonsuspension, in einem Rezirkulationsreaktor oder unterAnwesenheitvon bis zu 5% organischen Lösungsmitteln (z.B. Alkohole, Ketone) gearbeitet. Die Arbeitsstabilität der Träger in diesem Medium beträgt zumindest die zehnfache Zeit wie bei unstabilisierter GOD.

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Stabilisierung von immobilisierter Glukoseoxidase bzw. von Glukoseoxidase enthaltenden immobilisierten Biokatalysatoren, gekennzeichnet dadurch, daß zur Stabilisierung eine Peroxidasean den gleichen Trägerimmobilisiert wird und daß der Reaktionslösung ein Peroxidasesubstrat zugesetzt wird.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Peroxidase Meerrettichperoxidase oder Lactoperoxidase benutzt werden.
3. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Peroxidasesubstrat eine chemische Verbindung eingesetzt wird, deren Oxidationsprodukt ein Cosubstrat der Glukoseoxidase ist.
4. Verfahren nach Punkt 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Peroxidasesubstrat Hydrochinon eingesetzt wird;
5. Verfahren nach Punkt 1,3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrochinon durch enzymkatalysierten Umsatz von Glukose und Chinon in der Reaktionsmischung aus Chinon gebildet wird.