DD243714A1

DD243714A1 - PROCESS FOR STABILIZING IMMOBILIZED GLUCOSE OXIDASE

Info

Publication number: DD243714A1
Application number: DD28149585A
Authority: DD
Inventors: Dieter Kirstein; Frieder Scheller
Original assignee: Akad Wissenschaften Ddr
Priority date: 1985-10-08
Filing date: 1985-10-08
Publication date: 1987-03-11

Abstract

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Stabilisierung von immobilisierter Glukoseoxidase bzw. von Glukoseoxidase enthaltenden Biokatalysatoren zu entwickeln, das eine Erhoehung der Arbeitsstabilitaet der genannten Katalysatoren bei der Herstellung von Hydrochinon und Glukonsaeure bewirkt. Erfindungsgemaess wird die Aufgabe dadurch geloest, dass zur Stabilisierung eine Peroxidase, insbesondere Meerrettichperoxidase am bzw. im gleichen Traeger coimmobilisiert wird und dass die Reaktionsloesung Zusaetze eines Peroxidasesubstrates insbesondere von Hydrochinon enthaelt. Das Verfahren ist in der biotechnologischen Produktion anwendbar, insbesondere bei der Herstellung von Glukonsaeure aus Glukose und der Herstellung von Hydrochinon aus Chinon.The object of the invention is to develop a process for the stabilization of immobilized glucose oxidase or of glucose oxidase-containing biocatalysts which causes an increase in the working stability of said catalysts in the production of hydroquinone and gluconic acid. According to the invention, the object is achieved by coimmobilizing a peroxidase, in particular horseradish peroxidase, on or in the same carrier to stabilize it and that the reaction solution contains additives of a peroxidase substrate, in particular of hydroquinone. The method is applicable in biotechnological production, in particular in the production of gluconic acid from glucose and the production of quinone hydroquinone.

Description

Field of application of the invention.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung von immobilisierter Glukoseoxidase (GOD) bzw. von glukoseoxidasehaltigen Biokatalysatoren gegenüber dem Angriff durch Wasserstoffperoxid bzw. andere Produkte) die bei GOD-katalysierten Oxidationen entstehen; Das Verfahren ist in der Biotechnologie; insbesondere? bei der enzymatischen Hydrochinonproduktion anwendbar.The invention relates to a process for the stabilization of immobilized glucose oxidase (GOD) or of glucose oxidase-containing biocatalysts against attack by hydrogen peroxide or other products) which arise in GOD-catalyzed oxidations; The procedure is in biotechnology; in particular? applicable to enzymatic hydroquinone production.

Characteristic of the known technical solutions

Glukoseoxidase ist ein Enzym, das neben der Oxidation von Glukose durch Sauerstoff (nach Gl, T)Glucose oxidase is an enzyme that in addition to the oxidation of glucose by oxygen (according to Gl, T)

Glukose -KOz = Glukonolacton + H₂O₂ (1)Glucose -KOz = gluconolactone + H ₂ O ₂ (1)

weitere Reaktionen katalysiert,catalyses further reactions,

Glukose kann z. B, durch 2-Desoxygiukose, 4-0-Methylglukoseund Mannose-ersetztwerden, Reaktionen, die von geringer technischer Bedeutung sind. Sauerstoff ist durch andere Oxidationsmittel, wie p-Benzochinon (Chinon), Methylenblau, 2,6-Dichlorphenolindophenol u.a. ersetzbar, wobei das während der Reaktion mit Chinon gebildete Hydrochinon für die photographische Industrie interessant ist.Glucose can be B, replaced by 2-deoxygucose, 4-O-methylglucose and mannose, are reactions of minor technical importance. Oxygen is oxidized by other oxidants such as p-benzoquinone (quinone), methylene blue, 2,6-dichlorophenolindophenol, and the like. replaceable, wherein the hydroquinone formed during the reaction with quinone is interesting for the photographic industry.

Bisheriger Nachteil des Einsatzes von Glukoseoxidase, insbesondere in immobilisierter Fornr, d.h. an unlöslicheTräger gebunden, ist die Empfindlichkeit gegenüber dem ReaktionsproduktWasserstoffperoxid (H₂O₂) bzw. eventuellen Intermediaten, die zu einer geringen Arbeitsstabilität Glukoseoxidase enthaltender Biokatalysatoren führen (D. Kirstein, W. Kühn und P. Mohr „Zum Einsatz immobilisierter GOD in Enzymreaktoren" Lebensmittelindustrie 2$ 444-[198I]). Es ist versucht worden, durch Einsati von coimmobilisierterKatalase das entstehende H₂O₂ katalytisch zu zersetzen und damit die Arbeitsstabilitätdei GOD zu erhöhen („ImrnobilizedEnzymesin Food and Microbial Processes", Plenum Press.1974S. 149 Hrsg:: Olson u. Cooney);, Die dabei erzielten Ergebnisse sind allerdings nicht so gut, daß eine technische Anwendung immobilisierterGOD für präparative Zwecke möglich wurde.Previous disadvantage of the use of glucose oxidase, especially in immobilized Fornr, that is bound to insoluble carriers, the sensitivity to the reaction product hydrogen peroxide (H ₂ O ₂ ) or any intermediates that lead to low stability of glucose oxidase-containing biocatalysts (D. Kirstein, W. Kühn and P. Mohr "On the Use of Immobilized GOD in Enzyme Reactors" Food Industry 2 $ 444- [198I]). It has been attempted to catalytically decompose the resulting H ₂ O ₂ by employing co-immobilized catalase and thereby increase labor stability of GOD (" Imrnobilized Enzyme in Food and Microbial Processes, Plenum Press, 1974, 149 eds., Olson and Cooney); however, the results obtained are not so good that a technical application of immobilized GOD for preparative purposes has become possible.

Die Produktion von Hydrochinon aus Chinon mit Hilfe-von GOD und Glukose wurde als ökonomisch vertretbare Prozeßvariante vorgeschlagen, muß aber unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt werden, um die H₂O₂-Bildung aus der Nebenreaktion der Glukose mit Luftsauerstoff zu unterbinden (Alberti, B. N. und Klibanov, M. Enzyme Microb. Technot.*, 47 [1982]).The production of quinone hydroquinone with the aid of GOD and glucose has been proposed as an economically viable process variant, but must be carried out under a nitrogen atmosphere to prevent H ₂ O ₂ formation from the side reaction of glucose with atmospheric oxygen (Alberti, BN and Klibanov , M. Enzyme Microb. Technot. *, 47 [1982]).

Object of the invention

Das Ziel der Erfindung besteht darin, die H₂O₂-lnaktivierung immobilisierter GOD zu unterdrücken bzw. die Prozeßführung bei der Herstellung von Hydrochinon mit biotechnologischen Verfahren zu vereinfachen.The aim of the invention is to suppress the H ₂ O ₂ -Innaktivierung immobilized GOD and to simplify the process control in the production of hydroquinone with biotechnological processes.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Stabilisierung von GOD enthaltenden Uiokatalysatoren zu erzielen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, da an den bzw. im unlöslichen Biokatalysator neben GOD bzw. GOD enthaltenden Zellen oder Präparaten eine Peroxidase immobilisiert wird und daß der Reaktionslösung neben dem umzusetzenden Substrat (z. B. Glukose) ein Peroxidasesubstrat zugesetzt wird. Eine besonders vorteilhafte Variante des Verfahrens gegenüber Stabilisierung mit Katalase besteht darin, daß bei der Herstellung von Glukonsäure nach folgendem Schema aufgrund der Reaktion (2) entstehendes H₂O₂ mit Hydrochinon durch POD zu Chinon umgesetzt wird (3) und daß dieses Chinon ein Substrat für die GOD darstellt, das wesentlich schneller als Sauerstoff mit der GOD reagiert.The invention has for its object to achieve a stabilization of GOD-containing Uiokatalysatoren. According to the invention, this object is achieved in that a peroxidase is immobilized on the or in the insoluble biocatalyst in addition to GOD or GOD-containing cells or preparations and that a peroxidase substrate is added to the reaction solution in addition to the substrate to be reacted (eg glucose). A particularly advantageous variant of the method compared to stabilization with catalase is that in the production of gluconic acid according to the following scheme due to the reaction (2) resulting H ₂ O _{2 is} reacted with hydroquinone by POD to quinone (3) and that this quinone is a substrate represents the GOD, which reacts much faster than oxygen with the GOD.

Glukose-glucose

Glukonolact onGluconolactone

(2)(2)

(3)(3)

Bei geeigneten Konzentrationsverhältnissen lassen sich dadurch sowohl die H₂O₂- als auch die Chinonkonzentrationen außerordentlich gering halten, so daß die oxidative Inaktivierung der GOD verringert wird. Bei der Produktion von Hydrochinon aus Chinon mit immobilisierter GOD bzw. GOD enthaltenden Zellen wird Chinon im Überschuß eingesetzt und anstelle der Stickstoffatmosphäre (s. Alberti und Klibanov) wird die Inaktivierung der GOD durch entstehendes Wasserstoffperoxid infolge des Peroxidase-katalysierten H₂O₂-Verbrauches nach Reaktion (3) minimalisiert.At suitable concentration ratios, both the H ₂ O ₂ and the quinone concentrations can thereby be kept extremely low, so that the oxidative inactivation of the GOD is reduced. In the production of hydroquinone from quinone with immobilized GOD or GOD-containing cells, quinone is used in excess, and instead of the nitrogen atmosphere (see Alberti and Klibanov), the inactivation of GOD by resulting hydrogen peroxide as a result of peroxidase-catalyzed H ₂ O ₂ consumption minimized after reaction (3).

Besonderer Wert ist dabei auf eine räumlich sehr enge Bindung beider Enzyme am Träger zu legen, wobei durch Verkürzung der Diffusionswege der Reaktanten zwischen beiden Enzymen eine Erhöhung der Stabilisierung gegenüber dem Einsatz beider Enzyme irr Lösung erreicht wird.Special emphasis is placed on a spatially very close binding of both enzymes on the support, whereby by shortening the diffusion paths of the reactants between the two enzymes, an increase in the stabilization compared to the use of both enzymes irr solution is achieved.

Ausführungsbeispieleembodiments

Example T

An 10Og eines bekannten organischen oder anorganischen Trägers für Enzymimmobilisierung (z. B. einem Polysacharid, einem Ionenaustauscher, einem porösen Glas oder Metalloxid) werden in bekannter Weise (z. B. durch Ionenaustausch, Adsorption, Geleinschluß oder kovalente Bindung) 335/ikat GOD und 700ftkat POD fixiert.To 10,000 of a known organic or inorganic enzyme immobilization support (eg, a polysaccharide, an ion exchanger, a porous glass, or metal oxide) are prepared in a known manner (eg, by ion exchange, adsorption, gel inclusion or covalent bonding) 335 / ikat GOD and fixed 700ftkat POD.

Das Produkt wird zur Glukonsäureherstellung in einer Lösung von 200 g/l Glukose und 10 g/l Hydrochinon eingesetzt.The product is used to produce gluconic acid in a solution of 200 g / l glucose and 10 g / l hydroquinone.

Das Hydrochinon wird nach beendeter Glukoseoxidation vom Glukonolacton bzw. der Glukonsäure abgetrennt und in den Prozeß zurückgeführt. Die Zufuhr an Oxidationsmittel erfolgt entwederdurch intensiveBelüftung der Reaktionsmischung (z.B. in einem Wirbelschichtreaktor) oder durch Zufuhr einer H₂O₂-Lösung (z.B. in einem Rezirkulationsreaktor) in einer Reaktionsmediumkonzentration zwischen 0.34 und 3.4g/l.The hydroquinone is separated after completion of glucose oxidation of glukonolactone or gluconic acid and recycled to the process. The supply of oxidizing agent is carried out either by intensive aeration of the reaction mixture (eg in a fluidized bed reactor) or by supplying a H ₂ O ₂ solution (eg in a recirculation reactor) in a reaction medium concentration between 0.34 and 3.4 g / l.

Example 2

In einem bekannten Enzymreaktor wird der im Beispiel 1 beschriebene GOD und POD enthaltende Träger als Katalysator für die Hydrochinonherstellung aus Chinon in einer gesättigten Chinonlösung, die 20 g/l Glukose enthält, eingesetzt. Zur Erhöhung der Reaktionsausbeute wird dabei entweder in einer Chinonsuspension, in einem Rezirkulationsreaktor oder unterAnwesenheitvon bis zu 5% organischen Lösungsmitteln (z.B. Alkohole, Ketone) gearbeitet. Die Arbeitsstabilität der Träger in diesem Medium beträgt zumindest die zehnfache Zeit wie bei unstabilisierter GOD.In a known enzyme reactor, the carrier containing GOD and POD described in Example 1 is used as a quinone hydroquinone production catalyst in a saturated quinone solution containing 20 g / l of glucose. In order to increase the reaction yield, work is carried out either in a quinone suspension, in a recirculation reactor or in the presence of up to 5% of organic solvents (for example alcohols, ketones). The working stability of the carriers in this medium is at least ten times that of unstabilized GOD.

Claims

Invention claim:

A process for stabilizing immobilized glucose oxidase or glucose oxidase-containing immobilized biocatalysts, characterized in that a peroxidase is immobilized on the same support for stabilization and in that a peroxidase substrate is added to the reaction solution.

2. The method according to item 1, characterized in that are used as peroxidase horseradish peroxidase or lactoperoxidase.

3. The method according to item 1, characterized in that a chemical compound is used as Peroxidasesubstrat whose oxidation product is a cosubstrate of glucose oxidase.

4. The method according to item 1 and 3, characterized in that is used as the peroxidase substrate hydroquinone;

5. The method according to item 1,3 and 4, characterized in that the hydroquinone is formed by enzyme-catalyzed conversion of glucose and quinone in the reaction mixture of quinone.