DD236754A1

DD236754A1 - Verfahren zur herstellung von glukonsaeure mittels bakterien

Info

Publication number: DD236754A1
Application number: DD24633482A
Authority: DD
Inventors: Wolfgang Babel; Rolf Dueresch; Dietmar Miethe; Uwe Iske; Karl Sattler; Hans-Peter Richter; Joerg Schmidt
Original assignee: Adw Ddr
Priority date: 1982-12-22
Filing date: 1982-12-22
Publication date: 1986-06-18
Also published as: DD236754B1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von freier Glukonsaeure durch Oxydation von Glukose. Das Ziel besteht darin, ein kostenguenstiges und technologisch einfaches Verfahren zu entwickeln. Die Synthese wird katalysiert durch Verwendung acidophiler methylotropher Bakterien. Sie erfolgt unter unsterilen Bedingungen in einem p H-Bereich zwischen 6 bis 1, Neutralisation ist nicht erforderlich. Und da das Enzym konstitutiv ist, setzt die Oxydation sofort nach Zugabe der Glukose ein, was hoehere Raum-Zeit-Ausbeuten als fuer A. niger ermoeglicht. Die Produktivitaet betraegt bis 15 gh 1l 1 und es werden Konzentrationen bis 310 gl 1 und Ausbeuten bis 97% erreicht. Diese Werte sind auch mit Biomassekonzentrationen 5 gl 1 moeglich. Bei diesen geringen Biomassekonzentrationen eruebrigen sich - im Falle der Herstellung von Glukonsaeure fuer technische Zwecke - aufwendige Trennoperationen.

Description

Anwendungsgebiete der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Glukonsäurelösung durch Oxydation von Glukose mit Hilfe von Bakterien.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Glukonsäure kann im technischen Maßstab mikrobiell unter Verwendung von Schimmelpilzen oder Bakterien, biochemisch mit Hilfe immobilisierter Glucose-Oxidase (und Katalase) oder elektrochemisch durch Oxydation von Glukose hergestellt werden (s. H.J.Rehm: Industrielle Mikrobiologie, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1967). Die technische Herstellung von Glukonsäure, die gegenwärtig hauptsächlich in der Lebensmittel- und pharmazeutischen Industrie angewendet wird, erfolgt fast ausschließlich auf mikrobiellem Wege, wobei meist Stämme von Aspergillus niger benutzt werden. Obwohl die Fähigkeit zur Oxydation von Glukose unter Bildung von Glukonsäure (und H₂O₂) auch bei Penicillien und Pullularien bekannt ist und verschiedene Aceto-, Cluconobacter- und Pseudomonas-Species Glukose ebenfalls in Glukonsäure umwandeln können, werden in technischen Verfahren Bakterien nicht eingesetzt (s. K.Yamada: Biotechn. Bioeng. 19 [1977] 1563; H.J.Rehm: Industrielle Mikrobiologie. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York 1980). Die bekannten mikrowellen Verfahren zeichnen sich dadurch aus, daß hohe Glukonsäurekonzentrationen und hohe Ausbeuten erreicht werden. Sie haben alle den Nachteil, daß die Produktionskultur unter sterilen Bedingungen — und nur zum Zwecke der Glukoseoxydation — gewonnen werden und daß sowohl in der Wachstumsphase als auch in der ersten Produktbildungsphase („Gärphase") — bis die Enzymsynthese abgeschlossen ist—Sterilität gewahrt und der pH-Wert durch Titration mit Al kali — oder Erdalkali-Hydroxid zwischen 6 und 7 konstant gehalten werden müssen (s. Patent DE-AS 1817907). Diese Notwendigkeit zur Neutralisierung bedingt einen weiteren Nachteil insofern, als durch die damit eintretende Viskositätserhöhung erhebliche Schwierigkeiten für den weiteren technischen Prozeß (erhöhter Energieaufwand, Aufarbeitung usw.) entstehen (s. Patent DE-AS 1817907).

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von Glukonsäure mit geringem technologischen Aufwand zu entwickeln.

Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Glukonsäure unter unsterilen Bedingungen, ohne Neutralisation des Mediums während der Erzeugung des Produzenten und der Produktbildung und ohne Induktionsphase für die Bildung des Glukoseoxydierenden Enzyms herzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabeso gelöst, daß acidophile methylotrophe Bakterien-Species, z. B. MB 58 IMET B 346, auf Methanol (oder Glukr se) nach den für die SCP-Synthese bekannten Verfahren kultiviert werden, wobei diese Bakterien ein Glukose-oxydierendes Enzym synthetisieren. Diese Bakterienbiomasse kann als Eiweißquelle für Futter- oder Nahrungszwecke verwendet werden und/oder als Produzent für Glukonsäure aus Glukose. Die Glukonsäurebildung kann sntwsder nach Separierung der erzeugten Biomasse vom Fermentationsmedium in einer wäßrigen Glukoselösuny vorgenommen werden, was den Vorteil hoher Reinheit des Produktes und geringer Aufarbeitungsoperationen hat, oder direkt nach Auszehren des Wachstumsmediums (z. B. Methanol, NH₃) und Zugabe von Glukose im Fermentationsmedium durchgeführt werden (Glukosekonzentration 5 bis 20%). Letzteres bedingt eine durch die Nährlösung eingebrachte Verunreinigung mit Salzen. Da die Biomasse (Produzent) nach dem Chemostat-Prinzip unter C-Limitation erzeugt wird, sind Verunreinigungen durch Intermediate des Stoffwechsels vernachlässigbar klein. Hinzu kommt, daß die Biomassekonzentration in der Produktionsphase im Interesse hoher spez. Produktbildungsraten (bis 6g · h"¹ · g'¹) und Ausbeuten (bis 97%) unter 5g · Γ¹ gehalten werden kann. Dies ermöglicht — im Falle der Gewinnung von Glukonsäure für technische Zwecke, z.B. auch in der Wasch mittel Industrie — einfachste Aufarbeitung; eine vorherige Abtrennung der Biomasse ist nicht notwendig. Die wäßrige Glukonsäurelösung (bis 310g I"¹) kann durch bekannte Verfahren sofort konzentriert werden. Der Vorteil der Verwendung dieser Bakterien besteht darin, daß sie als Produzent für Glukonsäure unsteril, weil im sauren pH-Bereich wachsend, auf Methanol als Kohlenstoff- und Energiequelle erzeugt werden können, daß die Produktbildung sofort, d.h. ohne Verzögerung und nicht mit der wie für Aspergillus niger notwendigen Induktionsphase für das Glukose-oxydierende Enzym (s. Patent

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DE-AS 1817907, US-Patent 3669840) bei dem für das Wachstum optimalen pH-Wert, aber auch oberhalb pH4 bis pH 6, nach Zugabe von Glukose einsetzt, was im Vergleich zu den bekannten technischen Lösungen höhere Raum/Zeit-Ausbeuten ermöglicht (bis 15g · h"¹ · Γ¹). Daß der pH-Bereich der Glukose-Oxydation den für das Wachstum dieser acidophilen Bakterien bei weitem überschreitet, bedingt weitere Vorteile.

Die Produktbildung kann unsteril durchgeführt werden und Neutralisation ist nicht erforderlich, und somit kann die bei den bekannten mikrobiologischen Verfahren, die Glukonsäure im wesentlichen als Glukonat produzieren, nachteilige Viskositätserhöhung umgangen werden.

Schließlich erübrigen sich für die Gewinnung von Glukonsäure für technische Zwecke wegen der zur Produktion notwendigen geringen Biomassekonzentration aufwendige Operationen zur Abtrennung. Die Produktion von Glukonsäure kann sowohl diskontinuierlich als auch kontinuierlich durchgeführt werden.

Im Falle einer bestehenden SCP-Produktion auf der Basis dieser Bakterien ist eine enge Koppelung mit der Glukonsäureproduktion vorteilhaft insofern, als damit der Glukonsäureproduzent sofort zur Verfügung steht.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Die zur Produktion von Gluconsäure verwendete Bakterienbiomasse MB58 IMET B346 (vgl. Beispiel 5) wurde bei 7000xg mit einerT-23-Zentrifuge von der Kulturflüssigkeit abgetrennt, einrnalmit Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Sediment wurde in Wasser suspendiert. Der pH-Wert der Suspension betrug 6,0.

100 ml der Suspension (1,4g/l Trockenmasse) und 20g Glukose wurden in einen 500 ml Schüttelkolben gegeben und bei 30°C 40 Stunden unter unsterilen Bedingungen geschüttelt. Die mittels Titration bzw. spektrophotometrisch nach H. U. Bergmeyer (Methoden der enzymatischen Analyse, Berlin, Akademie-Verlag, 1970) bestimmte Glukonsäurekonzentration betrug 206, 8g/l; dies entspricht einer Ausbeute von 97,5%. Die Restglukose betrug 2,6%, die spezifische Produktbildungsrate lag bei 3,7g · g~¹ h"¹ und die Produktivität bei 5,2g · Γ¹ h"¹.

Beispiel 2

Zu 41 einer Suspension von MB 58IMET B346-Bakterien in wasser (50g/l Bakterientrockenmasse, pH-Wert 4,2) wurden in einem Rührkesselreaktor von 151 Gesamtvolumen zu Beginn 800g Glukosemonohydrat (Ausgangskonzentration an Glukose 15,4%), nach 21 und 35 Stundenweitere 500g Glukosemonohydrat zugegeben.

Folgende Prozeßparameter wurden eingehalten:

Rührerdrehzahl: 800U/min Belüftungsrate: 10l/h

Temperatur: 30°C

Eine Regelung des pH-Wertes erfolgt nicht.

Nach 11 Stunden wurden mittels spektrophotometrischer Messung (vgl. Beispiel 1) 161 g/l Glukonsäure ermittelt. Zu diesem Zeitpunkt betrugen die spezifische Produktbildungsrate 2,9g · g"¹ h"¹, die Produktivität 14,6g und die Ausbeute 92%. Nach 52 Stunden wurden 310g/l Glukonsäure bestimmt. Die Restgiucose im Fermentationsmedium war < 0,1 %. Dies entspricht einer durchschnittlichen Produktivität von 6,0g · Γ¹ h"¹, einer durchschnittlichen spezifischen Produktbildungsrate von 1,15g · g"¹ h~¹ und einer Ausbeute von 89,9%. Der zur Oxydation der Glukose benötigte Sauerstoffbedarf betrug in den ersten 20 Stunden 0,12g Sauerstoff/g Glukonsäure und stieg in den folgenden 30 Stunden auf 0,16g Sauerstoff/g Glukonsäure an.

Beispiel 3

Zu 121 einer Suspension von MB58IMETB346-Bakterienin Wasser (1 g/l Bakterientrockenmasse, pH-Wert 4,5) wurden in einem Rührkesselreaktor von 3Ol Gesamtvolumen 2,4kg Glukosemonohydrat, nach 21 Stunden 1,2kg und nach 31 Stunden 0,6kg Glukosemonohydrat zugegeben. Der Versuch wurde durchgeführt analog wie im Beispiel 2 beschrieben.

Folgende Werte wurden ermittelt:	121,5 g/l
nach 21 Stunden gebildete Glukonsäure:	95,4%
Ausbeute:	5,7g-r'-h
Produktivität:	5,7g-g-¹-l
spezifische Produktbildungsrate:	4,4%
Restglukose:	210g/l
nach 44,5 Stunden gebildete Glukonsäure:	91,1%
Ausbeute:	5%
Restglukose:	4Jg-T^h
durchschnittliche Produktivität:	4Jg^g-¹-!
durchschnittliche spezifische ProduktbildungsrateL

Beispiel 4

Zu einer wäßrigen Glukoselösung analog Beispiel 2 wird 1 g/l MB58 IMET B346 Bakterienbiomasse gegeben und bei gleichen Prozeßparametern fermentiert. Nach Erreichen einer Glukonsäurekonzentration von ca. 100g/l wird erneut 1 g Biomasse/l zugesetzt. Der Zusatz von weiteren 1 g Biomasse/l erfolgt nach Erreichen einer Säurekonzentration von 250g/l. Nach einer Gesamtfermentationsdauervon 60 Stunden wird der Produktbildungsprozeß bei einer Säurekonzentration von 359g/l entsprechend einer Raum-Zeit-Ausbeute von 5,98g/l · h beendet. Die substratbezogene Ausbeute beträgt 89,8% und der durchschnittliche Sauerstoffbedarf 0,12g/g Säure.

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Beispiel 5

In einem Laborrührkesselfermentorvon 121 Bruttovolumen mit 6 Blattscheibenrührern werden 51 eines Nährmediums folgender Zusammensetzung gegeben:

NH₄CI	2,0 g/l	H₃BO₃	7,0mg/l
K₂HPO₄	0,6 g/l	FeCI₂-7 H₂O	4,2mg/l
MgSO₄-7 H₂O	0,4 g/l	CaCI₂-6 H₂O	7,2mg/l
CuSO₄-5H₂O	2,4 mg/1	Na₂MoO₄-2 H₂O	7,8mg/l
CoSO₄-5H₂O	0,6 mg/1	ZnCI₂-7 H₂O	6,0mg/l
MnSO₄-4 H₂/	4,7 mg/1	Hefeextrakt 0,1 %

Dieses Nährmedium ermöglicht einen Organismenzuwachs von 5 g/l.

Nach Einstellung eines pH-Wertes von 4,1 und einer Temperatur von 32^CC wird das Fermentationsmedium mit der Kultur-MB 58 IMET B346 angeimpft, so daß sich eine Startkonzentration von ca. 0,5g Biomasse/l ergibt. Das Medium wird mit einer Belüftungsrate von 1001/h begast und mit 1 200U/min gerührt. Durch Zusatz von 15g Methanol/l wird der Wachstumsprozeß gestartet und die Methanolkonzentration durch portionsweise Zugabe im Bereich zwischen 0,2 und 0,4% gehalten. Die Regulierung des pH-Wertes erfolgt mittels 5%iger Natronlauge. Nach Erreichen einer Biomassekonzentration von ca. 5,5g/l, limitiert durch den Stickstoffgehalt des Fermentationsmediums, wird der diskontinuierliche Wachstumsprozeß beendet und dem biomassehaltigen stickstofffreien Fermentatinsmedium 200g/l Glukose zugesetzt.

Gleichzeitig wird die Rührerdrehzal auf 800 U/min und die Belüftungsrate auf 40 l/h reduziert.

Nach einer Produktbildungsdauer von 20 und 30 Std. werden jeweils weitere 125g Glukose/l dem Fermentationsmedium zugesetzt. Die erreichte Glukonsäureendkonzentration beträgt nach 44 Stunden 308g/l entsprechend einer Ausbeute von 89% und einer Raum-Zeit-Ausbeute von 7,0g Säure/l · h.

Der zur Glukoseoxydation benötigte durchschnittliche Sauerstoffbedarf beträgt 0,13g O₂/g Säure.

Beispiel 6

In einen 3Ol Membranrührkesselreaktor werden 121 wäßrige Glukoselösung (100g/l) gegeben und mit7g/l Bakterienmasse MB58 IMET B346 angeimpft.

Analog Beispiel 3 werden nach 21 Std. und 31 Std. 1,2kg bzw. 0,6kg Glukose dem Fermentationsmedium zugesetzt. Die Rührerdrehzahl und die Belüftungsrate während des Produktionsbildungsprozesses beträgt 100U/min bzw. 1,41/min. Nach einer Fermentationszeit von 45 Stunden ist eine Glukonsäurekonzentration von 215g/l erreicht. Zu diesem Zeitpunkt erfolgt die kontinuierliche Zudosierung einer 25,0%igen wäßrigen Glukoselösung mit einer Verweilzeit von 20 Stunden. Nach ca.

1,5 Verweilzeitperioden stellt sich ein stationärer Prozeßzustand bei einer durchschnittlichen Glukonsäurekonzentration von 227 g/l, entsprechend einer Produktivität von 11,3 g/Säure/l h ein. Das glukonsäurehaltige wäßrige Fermentationsmedium wird zellfrei aus dem Reaktor über ein geeignetes Membranfilter kontinuierlich abgezogen. Zu diesem Zweck wird mit Beginn der kontinuierlichen Betriebsweise der Reaktordruck auf 0,5MPa erhöht. Die Glukoserestkonzentration in der zellfreien wäßrigen Glukonsäurelösung beträgt <0,5%.

Nach einer kontinuierlichen Prozeßführung von ca. 300 Stunden wird der Prozeß unterbrochen und mit frischer Biomasse erneut gestartet.

Die Rückhaltung der für den Glukoseoxydationsprozeß erforderlichen Biomasse bzw. Enzymkonzentration kann darüber hinaus durch Trägerfixierung bzw. Immobilisierung nach einem der bekannten Verfahren erfolgen.

Eine periodische Erneuerung der Biomasse kann vermieden werden, wenn die zur Produktbildung erforderliche Biomasse analog einem 2stufigen Verfahren dem Prozeß kontinuierlich zugeführt wird. In diesem Falle wird jedoch zur Gewinnung einer zellfreien wäßrigen Glukonsäurelösung ein nachgeschalteter Aufarbeitungsprozeß erforderlich.

Claims

ι . -1-463 34

Erfindungsanspruch: ;

1. Verfahren zur Herstellung von Glukonsäure mittels Bakterien, gekennzeichnet dadurch, daß Glukose mittels acidophiler methylotropher Bakterien, die zur SCP-Synthese auf der Basis von Methanol geeignet sind, wie beispielsweise MB 58 IMET B346, unter unsterilen Bedingungen, sowohl für die Erzeugung des Produzenten als auch bei der Produktbildung, und ohne Neutralisation während der Produktbildung in einem pH-Bereich zwischen 6 und 1 und bei Temperaturen zwischen 10 bis 35°C zu freier Glukonsäure oxydiert wird, wobei die Produktbildung auch mit geringen Zellkonzentrationen (bis o,5 g · 1~¹) durchgeführt werden kann, weshalb im Falle der Herstellung von Glukonsäure für technische Zwecke eine Abtrennung der Biomasse sich erübrigt, und der Produktbildungsprozeß eng mit einem Verfahren zur SCP-Synthese gekoppelt werden kann.
2. Verfahren nach Pkt. 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Produktbildung entweder durch Zugabe von Glukose zum Wachstumsmedium, das den Produzenten enthält, oder durch Zugabe des Produzenten zu einer wäßrigen Glukoselösung erfolgt.