DD231006A1

DD231006A1 - Verfahren zur herstellung gerinnungsaktiver plasmafraktionen aus humanblut

Info

Publication number: DD231006A1
Application number: DD26665984A
Authority: DD
Inventors: Horst Hindorf
Original assignee: Bezirks Inst F Blutspende Und
Priority date: 1984-08-28
Filing date: 1984-08-28
Publication date: 1985-12-18

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung gerinnungsaktiver Plasmafraktionen aus Humanblut und beinhaltet eine technische Loesung, die eine sichere Fraktionierung von Humanblut zu einem Faktor-VIII-Konzentrat, einem Fibronectin-Praeparat und einem Fibrinogen-Praeparat mit der geraetemaessigen Grundausstattung einer Einrichtung des Blutspende- und Transfusionsdienstes ermoeglicht. Erfindungsgemaess erfolgt die Fraktionierung in geschlossenen Behaeltnissen unter aseptischen Bedingungen, wobei die Chemikalien pyrogenfrei sterilisiert in den Behaeltnissen vorhanden sind.

Description

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Erfindungsgemäße Lösung

Durch die Erfindung ist die technische Aufgabe gelöst worden, die Präparation eines Faktor-Vlll-Konzentrates ohne zusätzliche Geräte, die bei der industriellen Plasmafraktionierung erforderlich sind, zu ermöglichen. Die präparativen Unsicherheiten bei der Fraktionierung im offenen System, wie z. B. die Zugabe von Feststoffen, die pH-Einstellungen und die Zentrifugationsschritte, die zu einer Kontamination mit Mikroorganismen führen können, sind für ein Arbeiten im Mittelpool, bei dem das Humanplasma von etwa 200 Blutkonserven für eine Charge des Arzneimittels eingesetzt wird, erfindungsgemäß gemindert worden. Die Verfahrensschritte der erfindungsgemäßen Lösung können in folgender Weise dargelegt werden:

— Aus Humanblut wird unter Einsatz gerinnungshemmender Substanzen Human-Plasma hergestellt, aus dem Faktor-Vlllhaltige Präzipitate gewonnen werden, z. B. durch die Methode der Kryopräzipitation analog der Publikation von Pool und Mitarbeiter. Diese Präparation erfolgt in geeigneten Behältnissen im geschlossenen System, u. a. sind Blutkonservenflaschen einsetzbar_ _ ·

— Die Faktor-Vlll-haltigen Präzipitate mit geringer spezifischer Faktör-Vlll-Aktivität werden in Zitrat-Puffer gelöst, wobei möglichst der pH-Wert des Stabilitäts-Optimums für den Faktor-Vlll gewährleistet werden soll, gegebenenfalls erfolgt auch ein Zusatz von Heparin. Die Lösungen mehrerer Faktor-Vlll-Präzipitate können unter aseptischen Bedingungen im geschlossenen System vereinigt werden.

— In einem geeigneten Behältnis, z.B. einer Blutkonservenflasche, wird Glycin mit einer wäßrigen Lauge sehr niedriger Molarität versetzt und das verschlossene Behältnis wird in einem geeigneten Dampfsterilisator pyrogenfrei gemäß 2. AB-DDR sterilisiert. Die Menge an Glycin und Lauge im Behältnis wird so bemessen, daß nach Zugabe der Lösungen der Faktor-Vlll-Präzipitate analoge Kazal und Mitarbeiter eine 2 m Glycin-Konzentration resultiert und ein pH-Wert um den Neutralpunkt vorhanden ist, wobei eine Temperatur von +20⁰C bis +30⁰C eingehalten wird.

— Der sich bildende Fibriongen-Niederschlag wird durch Zentrifugation sedimentiert und anschließend die überstehende Lösung unter aseptischen Bedingungen in ein geeignetes Behältnis überführt, in dem Glycin, Natriumchlorid und wäßrige Lauge sehr niedriger Molarität pyrogenfrei sterilisiert vorliegen. Die Menge der Substanzen in dem Behältnis ist so bemessen, daß die Glycin-Konzentration um 0,1 m erhöht wird und eine Präzipitation von Faktor-Vlll bei einempH-Wert um den Neutralpunkt erreicht wird.

— Das Faktor-Vlll-Präzipitat mit hoher spezifischer Faktor-Vlll-Aktivität wird durch Zentrifugation sedimentiert und anschließend in einer geeigneten Pufferlösung gelöst. Die Lösungen mehrerer Behältnisse können gepoolt werden, anschließend wird unter aseptischen Bedingungen auf die Endbehältnisse portioniert. Aus dem nach der Abtrennung des Präzipitats verbleibenden proteinhaltigen Überstand, der Fibronectin enthält, kann in geeigneter Weise ein Fibronectin-Präparat gewonnen werden

Ausführungsbeispiel

Aus frisch abgenommenen ACD-AG-Human-Blutkonserven wird das Plasma abgetrennt. Das Plasma von jeweils 2 Konserven wird in einer 500-ml-Blutkonservenflasche der Wasserbeständigkeitsklasse I umgehend eingefroren. Nach dem Auftauen des Plasmas in einem Kryostat Typ MK 70 bei +5⁰C wird zentrifugiert und anschließend das Präzipitat vom Überstandsplasma getrennt. Das Präzipitat wird in einer 0,055 m Zitratlösung gelöst.

In einer verschlossenen Blutkonservenflasche werden 16,5g Glycin und 10ml 0,01 η NaOH 135 Minuten bei 121⁰C dampfsterilisiert. Die Lösung des Faktor-Vlll-Präzipitates wird in dieses Behältnis überführt.

Unter Schütteln löst sich das Glycin. Das sich bildende Fibrinogenpräzipitat wird durch Zentrifugation abgetrennt und die überstehende Lösung in eine 500 ml-Blutkonservenf lasche überführt, die 2,4gGlycin, 11g Natriumchlorid, 7 ml Wasser zur Injektion und 3 ml 0,1 μ NaOH dampfsterilisiert (135 Minuten, 121⁰C) enthalten.

Unter Schütteln lösen sich Glycin und Natriumchlorid, und es bildet sich ein Faktor-Vlll-Präzipitat mit hoher spezifischer Faktor-Vlll-Aktivität. Durch Zentrifugation erfolgt die Abtrennung des Präzipitates, das in einem geeigneten Puffer gelöst und konserviert wird.

Claims

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Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung gerinnungsaktiver Plasmafraktionen aus Humanblut, gekennzeichnet dadurch, daß aus den unter Einsatz gerinnungshemmender Substanzen hergestellten Human-Plasmen nach Gewinnung der Faktor Vlll-haitigen Präzipitate mit geringer spezifischer Faktor Vlll-Aktivität die Lösung dieser Präzipitate, ggf. in Anwesenheit von Heparin, in geschlossenen Infusionsflaschen mit dampfsterilisiertem Glycin versetzt wird, wobei sich ein fibrinogenhaltiger Niederschlag bildet, der unter aseptischen Bedingungen abgetrennt wird, so daß die verbleibende Faktor VIII- und Fibronectin-haltige Proteinlösung in geschlossene Infusionsflaschen überführt wird, die dampfsteriiisiertes Glycin und Natriumchlorid enthalten, wobei sich ein Faktor Vlll-Präzipitat mit hoher spezifischer Faktor Vlll-Aktivität bildet, das in einem geeigneten Puffer gelöst und anschließend lyonphilisiert werden kann, wobei erforderlichenfalls vor dem Portionieren auf die Endbehältnisse und Lyophilisation eine Sterilfiltration erfolgt, während die über dem Faktor Vlll-Präziptat befindliche, mit Glycin und Natriumchlorid angereicherte Proteinlösung für die Isolierung eines Fibronectin-Präparates einsetzbar ist.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß sowohl Blutkonservenflaschen und Plastbeutel als auch andere geeignete Behältnisse eingesetzt werden können, die einerseits die Dampfsterilisation der zur Präparation eingesetzten Substanzen im geschlossenen System gestatten und andererseits als Präparationsbehältnisse verwendet werden, wobei zur Trennung der Präzipitate von den Überstands-Proteinlösungen die Technik der Zentrifugation und/ oder der Filtration anwendbar ist.
3. Verfahren nach den Punkten 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß aus dem fibrinogenhaltigen Niederschlag ein Arzneimittel und/oder Diagnostikum gewonnen werden kann, das den Qualitätsparametern der Human-Plasmafraktion Cohn I oder Human-Fibrinogen-Fraktion I-O entspricht und erforderlichenfalls auch zur Präparation eines Gewebe- bzw. Fibrinklebers eingesetzt werden kann.
4. Verfahren nach den Punkten 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß aus der über dem Faktor-Vlll-Präzipitat mit hoher spezifischer Faktor-Vlll-Aktivität befindlichen, mit Glycin und Natriumchlorid angereicherten Proteinlösung das Fibronectin-Präparat entweder nach einer Gelfiltration und anschließender Lyophilisation und/oder durch Nutzung affinitätschromatographischer Methoden, wie z. B. durch Einsatz von Gelatin-Sepharose, gewonnen werden kann.
5. Verfahren nach den Punkten 1-4, gekennzeichnet dadurch, daß die Faktor-Vlll-, Fibrinogen- und/oder Fibronectin-Konzentrate als Arzneimittel in der Human-Medizin, als Diagnostikum oder zur Präparation von Diagnostika eingesetzt werden können.
6. Verfahren nach den Punkten 1-4, gekennzeichnet dadurch, daß die Verfahrensschritte auch unter Einsatz von tierischem Blut und tierischem Plasma möglich sind und die herstellbaren Faktor-Vlll-, Fibrinogen- und/oder Fibronectin-Konzentrate ggf. als Arzneimittel in der Human-Medizin, als Diagnostikum oder zur Präparation von Diagnostika eingesetzt werden können.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung gerinnungsaktiver Plasmafraktionen aus Humanblut und ist geeignet. Arzneimittel und/oder Diagnostika für die Anwendung vorwiegend in der Human-Medizin herzustellen, dies betrifft insbesondere eine Fraktion, die den Gerinnungsfaktor VIII in angereicherter Form enthält, sowie die während der Präparation anfallenden Konzentrate der Plasmaproteine Fibronectin und Fibrinogen.

Es ist bekannt, daß gerinnungsaktive Plasmafraktionen aus Humanblut mit einem erhöhten Gehalt der Gerinnungsfaktoren VIII, Fibrinogen und Fibronectin durch die Methoden der Kryopräzipitation und der Kälte-Präzipitation mit Äthanol nach Cohn herstellbar sind.

Durch verschiedene Reinigungsmethoden ist es möglich, unerwünschte Begleitproteine injhrem Gehalt zu vermindern, so daß die spezifische Faktor-Vlll-Aktivität, d. h. das Verhältnis der Menge des Gerinnungsfaktors VIII zum Gesamt-Proteingehalt, erhöht werden kann. Für diese Reinigung werden u. a. Polyäthylenglykol, Dextran, Aluminiumhydroxid und auch Glycin eingesetzt. Aus einer Proteinlösung mit einem erhöhten Gehalt der Gerinnungsfaktoren VIII, Fibrinogen und Fibronectin kann durch Glycin-Zusatz, Einstellung bestimmter Temperaturen und/oder Einhaltung von definierten pH-Wert eine weitgehende Trennung der enthaltenden Plasmaproteine erreicht werden, so daß Konzentrate der Gerinnungsfaktoren VIII und Fibrinogen und auch ein mit Fibronectin angereichertes Präparat herstellbar sind. Fraktionsverfahren, die mit Zusätzen von Polyäthylenglykol, Dextran und Aluminiumhydroxid arbeiten, haben den Nachteil, daß im Endpräparat nicht nur Reste der Fraktioniermaterialien nachweisbar sind, sondern zum Teil auch während des Herstellungsverfahrens die Bildung von Immunkomplexen und Faktor-Vlll-Fragmenten auftritt. Diese Nachteile sind bei Einsatz von Glycin nicht vorhanden.

Bei den bekannten technischen Lösungen wird zu einer Proteinlösung das Glycin als Feststoff in offenen Fraktionierbehältnissen zugegeben. Es folgen das Einstellen der Temperatur und des optimalen pH-Wertes. Bei diesem Fraktionierschritt können durch die Substanz und das Manipulieren im offenen System Mikroorganismen in die Proteinlösung gelangen. Die Abtrennung des sich bildenden Fibrinogenpräzipitats kann entweder kontinuierlich in Durchlaufzentrifugen oder in separaten Volumen-Anteilen durch Zentrifugation in Plaste- oder Glasbehältnissen erfolgen. Die Präzipitierung des Faktor VIII aus dem fibrinogenarmen Überstand kann durch Zugabe von Natriumchlorid als Feststoff erfolgen. Auch dieser Verfahrensschritt schließt das Arbeiten im offenen System und die Möglichkeit der Kontamination mit Mikroorganismen ein.

Um die Sterilität des Endproduktes zu gewährleisten, muß die Lösung des Faktor-Vlll-Präzipitates sterilfiltriert werden. Die Pyrogenfreiheit des Endproduktes ist aber trotz Sterilfiltration nur gewährleistet, wenn während der gesamten Präparation die Kontamination mit Mikroorganismen durch geeignete Maßnahmen gering gehalten wird, um die mögliche Freisetzung von Endotoxinen zu vermeiden.

Zweck der Erfindung

Ziel der Erfindung war, eine technische Lösung zu finden, die eine sichere Fraktionierung von Humanblut zu einem Faktor-Vlll-Konzentrat mit der gerätemäßigen Grundausstattung einer Einrichtung des Blutspende- und Transfusionsdienstes ermöglicht. Da weder die Feststoffe Glycin und Natriumchlorid völlig frei von Mikroorganismen sind und auch ein Arbeiten im offenen System unter Laminar-flow-Bedingungen zur Kontamination bei der Präparation führen kann, wurde erfindungsgemäß eine Lösung gefunden, die eine schnelle und sichere Präparation sicherstellt, wobei die Sterilität der Proteinlösung während des Herstellungsverfahrens gewahrt bleibt, so daß nur erforderlichenfalls eine Sterilfiltration vor dem Portionieren auf die Endbehältnisse vorzusehen ist.