DD218688A1 - Verfahren zur bestimmung der biomasseproduktion auf stickstofffreien kohlenstoffquellen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das es gestattet, waehrend des Fermentationsprozesses von Mikroorganismen die Substratabnahme und den Biomassezuwachs im Fermenter schnell und einfach zu bestimmen. Erfindungsgemaess werden Mikroorganismen in bekannter Art und Weise in Gegenwart einer stickstofffreien Kohlenstoffquelle und eines freien Sauerstoff enthaltenden Gases in einer waessrigen Naehrsalzloesung, die neben allen anderen erforderlichen Naehrelementen NH4 -Ionen als Stickstoffquelle enthaelt, vorbehandelt. Die Saeureausscheidung der Kultur on line wird aus dem Verbrauch an Base fuer die p H-Statierung der Kultur bestimmt und unter Beruecksichtigung von fuer den eingesetzten Mikroorganismus bekannten oder zu ermittelnden Proportionalitaetsfaktoren direkt als Mass fuer die Abnahme der stickstofffreien Kohlenstoffquelle und fuer den Biomassezuwachs im Fermenter verwendet.
Description
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Verfahren zur Bestimmung der Biomasseproduktion auf stickstofffreien Kohlenstoffquellen Anwendungsgebiet der Erfindung j
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, das es gestattet, während des Fermentationsprozesses von Mikroorganismen die Substratabnahme und den Biomassezuwachs im Fermenter schnell und einfach zu bestimmen. Das Verfahren findet Anwendung in der mikrobiologisch-biotechnologischen Industrie und Forschung, speziell in der Biomasse- bzw. Futtereiweißproduktion auf der Basis stickstofffreier Kohlenstoffquellen wie Kohlehydraten, organischen Säuren, Fetten und Kohlenwasserstoffen.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
Die üblichen Verfahren zur Bestimmung von Substrat- und Biomassekonzentrationen erfolgen off line anhand von entnommenen Proben. Diese Proben werden entsprechend ihrer geplanten Verwendung in mehr oder weniger komplizierten Prozeduren aufgearbeitet und analysiert. Die Ergebnisse liegen dann meist erst Stunden später oder bei Batch-Fermentationen häufig erst nach Abschluß des Prozesses vor, so daß eine rückwirkende Beeinflussung des Fermentationsverlaufes nicht möglich ist. .
1. Üblicherweise werden als Maß für die Biomasse das Frisch- oder Trockengewicht, der Proteingehalt der Biomasse, die Zellzahl oder die optische Dichte der Zellsusperision verwendet.
Die Frischgewichtsbestimmung erfolgt nach Abzentrifugieren oder Abfiltrieren einer Probe. Sie erfordert ca. 5 bis 20 Minuten, ist aber relativ ungenau.
Die Trockengewichtsbestimmung ist bedeutend genauer, jedoch liegen die Ergebnisse erst mit großem zeitlichen Verzug vor, da die Biomasse bis zu 72 Stunden (im Vakuum ca. 12 Stunden) bis zur Gewichtskonstanz getrocknet werden muß. Für die Bestimmung des Proteingehaltes der Biomasse ist eine Vielzahl von Methoden beschrieben. Am gebräuchlichsten ist die Proteinbestimmung nach LOWRY et. al. (J.Biol.Chem. 193,265-275,1951) in verschiedenen, modifizierten Formen bzw. der Einsatz spezieller Farbstoffe wie Coomassie-Brilliant-Blue nach BRADFORD, M. M. (Analyt.Biochem.7i2, 248-54,1976). Bei beiden Reaktionstypen wird die Intensität eines sich bildenden Farbstoffkomplexes als Maß für die Proteinkonzentration der Probe verwendet. Der Zeitraum zwischen Probenahme und vorliegendem Ergebnis beträgt mehrere Stunden. Da die Probenaufarbeitung relativ kompliziert ist, werden meist mehrere Proben gemeinsam aufgearbeitet, wodurch sich diese Zeitspanne noch vergrößert. Hinzu kommen eine Reihe von Fehlerquellen, die die gewonnenen Ergebnisse noch stark verfälschen können: ·
— Die Eichung der Methoden erfolgt mit Reinproteinen (Ovalbumin, Human- oder Rinderserumalbumin). Die zu bestimmenden Proteine der Biomasse sind dagegen ein Gemisch aus Tausenden verschiedener Eiweiße mit unterschiedlichsten katalytischen und Struktureigenschaften. Es ist bekannt, daß einzelne Proteinspezies mit den genannten Methoden z.T. gar nicht nachweisbar sind bzw. Signale abgeben, die anhand der verwendeten Eichkurve einem Vielfachen der eingesetzten Substanzmenge entsprechen würden.
— Beide Methoden sind sehr empfindlich gegenüber einer Vielzahl organischer Substanzen, die entweder als Substrate im Fermentationsprozeß eingesetzt werden (verschiedene Zucker, Polysaccharide, Peptide, Amine, Aminozucker usw.) bzw. von den Mikroorganismen selbst während des Fermentationsprozesses gebildet werden (eine Vielzahl niedermolekularer, organischer Verbindungen).
— Da beide Methoden auf die Absorption einer bestimmten Wellenlänge des Lichtes geeicht sind, ist die Untersuchung trüber Lösungen nicht möglich.
— Um klare Proteinlösungen zu erhalten, ist das Herauslösen der Proteine aus den Zellen mitteis Zelläufschluß notwendig (z. B. durch Kochen der Probe in Lauge). Daraus resultieren häufig Änderungen im Probevolumen. Andererseits erfolgt dabei mit Sicherheit keine 100%ige Freisetzung der Zellproteine (z. B. Membranproteine, Eiweiße, die an der Zellwand haften oder in diese eingebaut sind), und es kommt bereits zur Denaturierung von Eiweißen.
Die genannten Gründe führen dazu, daß die Proteinbestimmungsmethoden meist niedrigere Werte als erwartet ergeben. Die mikroskopische Zellzahlbestimmung erfordert nur 10 bis 20 Minuten Zeitaufwand, ist aber stark fehlerbehaftet. Allein der individuelle Zählfehler kann bis zu'20% betragen. Hinzu kommt, daß die Zellzahl oft nicht als Maß für.die Biomasse verwendet werden kann, da die Zellen in Abhängigkeit von ihrem physiologischen Zustand stark in Zellgröße und Proteingehalt der Biomasse variieren. Weitere Fehlerquellen sind die Interpretationen von Teilungsstadien, Knospen, Filamenten, Flocken, echten und Pseudomycelien. ,
Die Bestimmung der optischen Dichte der Zellsuspension ist in wenigen Minuten möglich. Sie ist jedoch wie die Proteinbestimmung von einer Eichung abhängig. Diese wird meist mit stationärphasigen Zellen vorgenommen. Somit gelten einige der bei der mikroskopischen Zellzahlbestimmung genannten Einschränkungen. Die durch unterschiedliche Zellformen, -größen und -aggregationen verursachten Fehler sind oft erheblich. Störend kommt hinzu, daß der lineare Bereich zwischen Extinktion und Zellzahl oft nur kurz ist. Die Bestimmung des Rohproteingehaltes der Biomasse ist in ca. 10 bis 30 Minuten durchführbar/Aus der Abnahme des freien Ammoniumstickstoffs im Kulturmedium und einem empirisch ermittelten Faktor, der den Stickstoffgehalt der Biomasse des untersuchten Mikroorganismus charakterisiert, läßt sich der Rohproteinzuwachs berechnen. Der Rohproteinwert gibt einen Pauschalwert für die Summe der stickstoffhaltigen Zellbestandteile (im wesentlichen Aminosäuren, Proteine, Nukleotide, Nukleinsäuren und Aminozucker) an. Dieser Wert ist nur insofern fehlerbehaftet, als sich das Verhältnis dieser Komponenten zueinander in Abhängigkeit vom physiologischen Zustand der Kultur ändern kann. Fast alle genannten Methoden bereiten beim Einsatz in technischen Prozessen große Probleme. Beim Einsatz von Rohstoffen in Partikelform versagen alle genannten Methoden mit Ausnahme der Rohproteinbestimmung. Gleiches oder Ähnliches gilt beim Einsatz schlecht oder nicht wasserlöslicher Substrate wie Fette, Kohlenwasserstoffe oder Erdölfraktionen.
2. Die Bestimmung von Substratkonzentrationen ist entsprechend der Vielfalt der möglichen Substrate methodisch sehr vielfältig, meist jedoch zeitaufwendig und kompliziert. Die Bestimmung von Zuckerkonzentrationen erfolgt meist mit Hilfe chemischer Derivatisierung und anschließender Chromatographie bzw. photometrisch mittels Farbreaktionen. Diese chemischen Reaktionen werden durch eine Vielzahl organischer Verbindungen beeinflußt, die zwangsläufig im Fermentationsprozeß entstehen. Hier bestehen etwa die gleichen Fehlermöglichkeiten, wie sie oben bereits für die gleichen Proteinbestimmungen genannt wurden. Für photometrische Bestimmungsmethoden gelten in etwa die Einschränkungen wie bei der Bestimmung der optischen Dichte. Für die Bestimmung einiger weniger Zucker existieren spezielle Enzymelektroden. Diese sind nur durch wenige Substanzen störbar, jedoch meist ungeeignet für den Einsatz in Fermentationskulturen von Mikroorganismen.
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Die Bestimmung polymerer Zucker (Stärke, Zellulose, Dextrine i/.a.) wirft noch größere Probleme auf.
Die Bestimmung von Kohlenwasserstoffen erfolgt nach Extraktion der Substanzen aus der wäßrigen Fermentationslösung meist gaschromatographisch. Dazu müssen vorher meist mehr oder weniger komplizierte Reinigungs- und Trennschritte durchlaufen werden. Die Ergebnisse liegen oft erst Tage nach der Probenahme vor. Eine quantitative Bestimmung ist nur für.
eine begrenzte Anzähl von Einzelsubstanzen möglich, und beim Einsatz komplexer Substrate wie Erdöl, Erdölfraktionen oder -destillaten versagt diese Methode.
Für Fette, Fettsäuren und Lipide gilt Ähnliches. . '
3. Die Säureausscheidung von Mikroorganismen während des Fermentationsprozesses ist seit Jahrzehnten bekannt und wird in der Praxis durch Laugedosierung ausgeglichen, ohne daß deren Ursache restlos geklärt ist. Letzteres ist vor allem im traditionellen Herangehen bei Untersuchungen zu Kationentransporten begründet. Wie bei physiologischen Untersuchungen von Muskel- oder Nervengeweben werden nichtwachsende Mikroorganismen verarmt oder ausgehungert, und sodann wird zumeist nach Glukosezugabe zur Aufrechterhaltung des Stoffwechsels der Kationentransport solcher Zellkulturen untersucht.
"Das Ergebnis sind hochkomplizierte Transportkinetiken, die sich oft nur mit Hilfe von Drei- oder Vier-Site-Carriern erklären lassen. Eine Zusammenfassung zu diesem Thema gibt das Review „lon Transport in Yeast" von G. W. F. H. BORST-PAUWELS (Biochimica etBipphysica Acta, 650, 88-127,1981) mit 348 Literaturreferenzen. Wie in diesen Publikationen bleibt die Frage nach der Ursache der Säureausscheidung der Kultur auch in neuesten mikrobiologischen und biotechnologischen Lehrbüchern offen (z.B. PRÄ VE, P. et al. (Eds.): Handbuch der Biotechnologie, Akademische Verlagsgesellschaft Wiesbaden, 1982).
Die von den genannten Autoren untersuchten Mikroorganismen verhalten sich allerdings anders als wachsende Zellkulturen in Fermentationsprozessen, welche einen physiologischen lonenbedarf haben (UEBEL, B. und HUTH, J.: Einige Besonderheiten Kalium-Iimitierter Chemostat-Kulturen von Hefen, Wissensch. Zeitschr. der. E. M.Arndt Univ. Greifswald DDR, Math.-Nat.-Reihe, XXIX, (4) 1980). In der Patentliteratur finden sich vereinzelt Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen Alkaliverbrauch und Biomassebildung im Fermentationsprozeß (GB-PS 1348074 und 1369091).
Das erstgenannte Patent beschreibt die Kopplung von Laugen- und Kohlenstoffdosierung zur Erhöhung der C-Ausbeute in der P.rozeßbilanz. Im zweiten Patent wird allgemein die Tatsache bestätigt, daß Ammonium-Verbrauch und Biomassebildung gut korrelieren. In beiden Fällen handelt es sich um Verfahren zur Erhöhung der Biomasseausbeute und nicht um analytische
Verfahren. , ~ ' ·
Ziel der Erfindung ist die Bestimmung von Substratverbrauch und/oder Biomassezuwachs in Fermentationsprozessen beim Wachstum von Mikroorganismen auf stickstofffreien Kohlenstoffquellen. Die Bestimmung soll on-line erfolgen und somit sofortige Veränderungen im Fermentationsregime beim Abweichen des Prozesses von den Sollparametern ermöglichen.
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Darlegung des Wesens der Erfindung .
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur on-line-Bestimmung von Substratverbrauch und/oder Bipmassezuwachs in Fermentationsprozessen zu entwickeln.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Säureausscheidung der Kultur on line aus dem Verbrauch an Base für die pH-Statierung der Kultur bestimmt und direkt als Maß für die Abnahme der stickstofffreien Kohlenstoffquelle und für den Biomassezuwachs im Fermenter verwendet wird. Je nach eingesetztem Mikroorganismus sind dabei bekannte oder in Vorversuchen zu ermittelnde Proportionalitätsfaktoren zu berücksichtigen.
Beijn Wachstum der Mikroorganismen auf stickstofffreien Kohlenstoffquellen wie Kohlehydraten, organischen Säuren, Fetten oder Kohlenwasserstoffen nehmen diese NH4 +-Stickstoff für die Synthese von Aminosäuren (Proteinen), Nukleotiden (Nukleinsäuren), Aminozückern und anderer stickstoffhaltiger Zellbestandteile auf. Diese Substanzen werden unter der Bezeichnung Rohprotein zusammengefaßt. .
Die aufgenommenen NH4 +-lonen werden über direkte Aminierungsreaktionen als NHrGruppe in den Stoffwechsel eingeschleust, wobei NAD(P)H + H+ entsteht/Zur Aufrechterhaltung eines physiologischen pH-Wertes im Zellinneren ist der Mikroorganismus gezwungen, H+-Iönen ins Außenmedium abzugeben. Bei Aufrechterhaltung des Membranpötentials an der Zellbegrenzung ist das nur im Austausch gegen andere Kationen möglich. Den Hauptteil der aufgenommenen Kationen stellt das NH4 + dar, das wiederum in den Stoffwechsel der wachsenden Zelle eingeht und somit für die Aufrechterhaitung dieses . Kreislaufes sorgt. Ein wesentlich geringerer Anteil der ausgeschiedenen Protonen wird gegen andere Kationen (K+, Na+, Ca++, Mg++, Spurenelemente...) ausgetauscht, die in der Zelle funktionell essentiell oder zum Aufbau eines physiologischen Koazervatzustarids in der beim Wachstumsprozeß neusynthetisierten Biomasse erforderlich sind.
Erfindungsgemäß wird die von der Fermenterkultur beim Wachstum ausgeschiedene Säuremenge mit einer Base bekannter Normalität neutralisiert und in bekannter Art und Weise der pH-Wert der Kultur konstant gehalten. Die aus Basenverbrauch und Normalität der Base sofort (on line) bestimmbare Säureausscheidung der Kultur steht in linearer Beziehung sowohl zum Verbrauch an stickstofffreier Kohlenstoffquelle als auch zur Biomasseproduktion der Kultur. Das ist ein überraschendes Ergebnis, denn diese Beziehung läßt sich aus den üblicherweise verwendeten Reaktionsgleichungen nicht ableiten. Es war darüber hjnaus nicht zu erwarten, daß diese Linearität vom physiologischen Zustand der Mikroorganismen unabhängig ist und somit die erfindungsgemäße Bestimmung von Substratverbrauch und Biomassezuwachs während aller Wachstumsphasen ermöglicht. Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die on-line-Erfassung der Säureausscheidungsgeschwindigkeit der Kultur als wesentliches Charakteristikum des Fermentationsverlaufes und erlaubt somit die frühzeitige Erkennung und Beseitigung von Störfaktoren im Fermentationsprozeß wie z. B. Limitationen durch verschiedene Nährstoffkomponenten (O2, NH4 +, Kohlenstoffquelle u. a.). Ein weiterer wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es, daß die Bestimmung der genannten Größen anhand bekannter bzw. leicht ermittelbarer Korrelationen sofort und direkt ohne Zwischenschaltung komplizierter und langwieriger off-line-Aufarbeitungs- und Bestimmungsschritte möglich ist. ,Das erfindungsgemäße Verfahren arbeitet ohne Probeentnahmen aus dem Fermenter und führt folglich zukeinem Volumenverlust. Somit entfällt auch bei Sterilprozessen die durch die Probeentnahme bedingte erhöhte Gefahr einer Fremdinfektion.
Das erfindungsgemäße Verfahren unterliegt keinem der für die anderen derzeit üblichen Bestimmungsmethoden bekannten Störfaktoren. Gegenüber allen genannten Methoden (mit Ausnahme der Rohproteinbestimmung) besteht keine Beeinflussung durch Substrate in Form von Festpartikeln oder Ölemulsionen bzw. durch Aggregation, Filament-, Pseudomycel- oder
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Mycelbildungen der Mikroorganismen bzw. durch Nebenwirkungen von Metaboliten. Gegenüber allen genannten Methoden einschließlich der Rohproteinbestimmung besteht der Vorteil, daß die Säureausscheidung unkompliziert direkt bestimmt und dafür kein Aufwand an Apparaten, Geräten, Chemikalien und Zeit erforderlich ist.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Tatsache, daß sie den Realverbrauch an Kohlenstoffsubstrat und den Realzuwachs an Biomasse im Fermenter anzeigt. Alle anderen Methoden, die auf einer Pobeentnahme aus dem Fermenter beruhen, sind neben den bereits genannten Schwächen zusätzlich fehlerbehaftet durch mögliche Entmischungen der Probe während der Probenahme aus dem Fermenter, Mischungs- und Verteilungsdifferenzen im Reaktor (zwischen Probeentnahmestelle und dem Restvolumen des Fermenters), und sie sind nicht in der Lage, die reale Biomasse bei Schaumund Rahmbildung sowie den Bewuchs der Wandungen und Einbauten des Fermenters zu erfassen. Die Erfindung soll nachstehend durch Beispiele erläutert werden.
Batch-Kultur von Lodderomyces elongisporus EH15 (D) auf n-Hexadekan in einem Mineralsalzmedium mit NH4 +-Salzen als Stickstoffquelle und Zusatz von 0,1 % Difco-Bacto-Yeast-Extract. Reaktionsbedingungen: Fermenter mit Schikanen, Volumen 101 bei 41 Arbeitsvolumen Rührung: 1 800 ±100rpm Belüftung: 0,75 ± 0,05V/V/m Temperatur: 32 ±0,5°C
pH-Statierung mit 2,50n NaOH auf 4,60 + 0,05 bis 0,3 Als Parameter wurden bestimmt: — Säureausscheidung der Kultur aus dem-Laugeverbrauch
— Trockengewicht nach Filtration auf Membranfilter und Waschen mit 5ml lsopröpanol:Heptan:1 η H2SO4 (40:10:1 V/V/V) und Vakuumtrocknung .
— Proteingehalt der Biomasse nach LOWRY et al. (1951)
— Optische Dichte der Kultur in einem Lösungsmittelgemisch
— Abnahme des freien NH4 +-Stickstoffs mit der KJELDAHL-Apparatur zur Bestimmung des Rohproteingehalts der Biomasse
— Mikrofotographie zur Zellzahlbestimmung
— Bestimmung der n-Hexadekankonzentration gaschromatographisch nach dreifacher Heptan-Extraktion.
Zur Bestimmung der genannten Parameter wurden dem Fermenter diskontinuierlich Proben entnommen und entsprechend aufgearbeitet. Die Ergebnisse sind in Abb. 1 dargestellt. (Wegen Pseudomycel- und Flockenbildung war das Auszählen der Zellzahl aus den Mikrofotographien nicht möglich).
Der Prozeß verläuft in vier Phasen.
In der „lag-Phase" wird der zugesetzte Hefeextrakt verwertet. Über die oxidative Desaminierung der angebotenen Aminosäuren kommt es in dieser Phase zur NH4 +-Ausscheidung ins Medium, was zu einem pH-Wert-Anstieg führt (Stickstoffhaltige
Kohlenstoffquelie!). .
In der logarithmischen und linearen Wachstumsphase wird das n-He"xadekan verwertet. Die Ergebnisse weisen eindeutig aus, daß die Säureausscheidung der Kultur die ersten signifikant meßbaren Signale für Substratverbrauch und Biomassezuwachs anzeigt, während alle anderen Meßverfahren unempfindlicher sind und stärker streuende Ergebnisse erbringen.
Nach Verbrauch des n-Hexadekans tritt in der stationären Phase wiederum über Proteolyse und oxidative Desaminierung eine NH4 +-Ausscheidung ins Medium auf, die erneut zum pH-Anstieg führt.
Batch-Kultur von Lodderomyces elongisporus EH15 (D) analog Beispiel 1. Untersucht wurden die Beziehungenzwischen der Säureausscheidung der Kultur und den gleichen Parametern wie in Beispiel 1. Die Ergebnisse sind in Abb. 2 dargestellt. Die Säureausscheidung der Kultur weist eine eindeutig sehr gute Korrelation zu allen untersuchten Größen auf, die als Maß für Substrat- bzw. Biomassekonzentration verwendet wurden. Die in der Abbildung dargestellten Geraden sind statistisch berechnete Korrelationsgeraden für jeweils 40 bis 90 Wertepaare aus drei analogen Parallelversuchen. Die Säureausscheidung χ (μ,ΜοΙ/ml) steht in folgenden Beziehungen zu den einzelnen Meßgrößen y:
y Maßeinheit Korrelationsgerade rxv
Rohprotein mg/ml y= 0,075 χ-0,189 98,7
Trockengewicht mg/ml y= 0,139 x+0,465 99,7
Optische Dichte E660/ml y= 0,0098 χ-0,082 98,3
Protein nach LOWRY mg/ml y= 0,073 χ-3,164 96,7
n-Hexadekan mg/ml y =-0,157 χ-22,600 98,1
Dabei stellt r^ den Korrelationskoeffizienten dar und drückt die statistische Wahrscheinlichkeit der berechneten Geraden in %
Saccharomyces cerevisiae 211-1ba wurde über Nacht in einem Mineralsalzmedium auf 3% Glukose Kultiviert. Die Zellen wurden abzentrifugier^und in frischem Mineralsalzmedium ohne Glukose aufgenommen. Die Untersuchungen wurden in' einem Kleinfermenter ohne Schikanen bei einem Arbeitsvolumen von 80ml unter Bedingungen analog Beispiel 1 durchgeführt. Nach Erreichen des C-Limits der Kultur, erkennbar an einem mehrere Minuten konstant bleibendem bzw. schwach ansteigendem pH-Wert, wurden der Kultur definierte Glukosemengen zugesetzt, und die Säureausscheidung der Kultur durch Titration mit 0,1 η NaOH registriert. Die Zugabe der Glukose erfolgte gelöst in A. dest. in Portionen von 50 bis 400μ\. Die Ergebnisse sind in Abb. 3 dargestellt
Zwischen zu dosierter Glukosemenge und Säureausscheidung besteht eine lineare Beziehung.
Candida lipolytica EH 52 wurde analog Beispiel 3 kultiviert. Abb.4 zeigt die lineare Beziehung zwischen zugegebener Glukosemenge und Säureausscheidung der Kultur.
Claims (1)
- , -4- 252 251Erfindungsanspruch: ; .Verfahren zur Bestimmung der Biomasseproduktion auf stickstofffreien Kohlenstoffquellen, wobei Mikroorganismen in bekannter Art und Weise in Gegenwart einer stickstofffreien Kohlenstoffquelle und eines freien Sauerstoff enthaltenen Gases in einer wäßrigen Nährsalzlösung, die neben allen anderen erforderlichen Nährelementen NH4 +-loneri als Stickstoffquelle enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Säureausscheidung der Kultur on-line aus dem Verbrauch an Base für die pH-Statierung der Kultur bestimmt und unter Berücksichtigung von für den eingesetzten Mikroorganismus bekannten oder zu ermittelnden Proportionalitätsfaktoren direkt als Maß für die Abnahme der stickstofffreien Kohlenstoffquelle und für den Biomassezuwachs im Ferrrienter verwendet wird.
Hierzu 3 Seiten Zeichnungen
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