DD159547A1 - Verfahren zur tritiierung von pyrimidin-bzw.p urinnucleosid-phosphaten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Verfahren zur Tritiierung von Pyrimidin- bzw. Purinnucleosidphosphaten. Sie hat das Ziel, die Herstellung tritiierter Nucleosidphosphate zu vereinfachen. Erfindungsgemäß werden halogenierte, insbesondere bromierte Pyrimidin- bzw. Purin-nucleosidphosphate in tertiäre oder Quartäre Ammoniumsalze überführt und diese Salze gegebenenfalls nach Ersatz austauchfähiger Wasserstoffatome durch Schutzgruppen in organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise DMF, mit Edelmetallkatalysatoren, vorzugsweise PD, und Tritiumgas tritiiert.

Description

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Dr. Bärwolff "

Dr. Bauschke Dr. Murawski

Ing/ Paul

"Verfahren zur Tritiierung von Pyrimidin- bzw. Purin-nucleosid-phosphaten" ;

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Tritiierung von J) Pyrimidin- bzw. Purin-nucleosid-phosphaten. Anwendungsgebiet der. Erfindung sind die Molekularbiologie und die Genetik.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Die Herstellung tritiierter Nucleosid-phosphate erfolgte bisher ausgehend von markierten lucleobasen bzw. ITucleosiden durch Glykosidierung und stufenweise Phosphorylierung zu Mono-, Di-, Tri- und Cyclophosphaten.

Diese Herstellungsmethode hat den Uachteil, daß das radioaktive Material zu einem frühen Zeitpunkt in die Gesamtsynthese eingebracht wird. Das erfordert, daß die weiteren Synthesestufen in kleinsten Mengen durchgeführt werden müssen. Spe-.^_n zielle, nur für radioaktives Arbeiten zugelassene Laborplätze '" - ' . werden benötigt. Der technische Aufwand für diese Synthesen ist also erheblich

Ziel der Erfindung

•Die Erfindung hat .das Ziel, die Herstellung tritiierter · . ^; Hucleosid-phosphate zu vereinfachen, insbesondere die Anzahl radioaktiver Synthesestufen zu verringern und damit die radiochemische Laborkapazität zu entlasten.

^SJUN, 1981*939200

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Darlegung des Wesens der Erfindung ' Erfindungsgemäß werden tritiierte Pyrimidin- bzw. Purinnucleosid-phosphate hergestellt, indem halogenierte, insbesondere bromierte Pyrimidin- bzw. Purin-nucleosid-phosphate in tertiäre oder quartäre Ammoniumsalze überführt und diese Salze gegebenenfalls nach Ersatz austauschfähiger Wasserstoffatome durch Schutzgruppen in organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise DMP, mit Edelmetallkatalysatoren, vorzugsweise Pd, und Tritiumgas tritiiert werden.

Die als Ausgangsverbindungen eingesetzten halogenierten Pyrimidin- bzw. Purin-nucleosid-phösphate (Mono~, Di-, Tri-) und Cyclophosphate) werden in an sich bekannter Weise' durch Halogenierung der Hucleobase und anschließende Phosphorylierung bzw. durch Halogenierung der Phosphate hergestellt. Ihre Überführung in die Ammoniumsalze erfolgt durch Umsetzung mit den entsprechenden Aminen bzw. Ammoniumhydroxyden, z. B. Tetrabutylammoniumhydroxyd, gegebenenfalls mit Hilfe eines Ionenaustauschers. Als organische Lösungsmittel für die Tritiierung werden aprotische und perfluorierte Lösungsmittel wie Dioxan, Amide, Trifluoracetanhydrid, vorzugsweise DMP, Dimethylacetamid, Hexamethylphosphorsäuretriamid (HMPT) verwendet, wobei gegebenenfalls zur neutralisation des entstehenden Halogenwasserstoffs eine Base, beispielsweise Tri-

^. äthylamin, zugesetzt wird. Der Ersatz austauschfähiger Wasserstoffatome erfolgt vorzugsweise durch Acyl-, Isopropyliden- und Benzylreste bzw, durch Borsäurederivate u. ä. -». Die Tritiierung wird zunächst bei Raumtemperatur, danach bei geringfügig erhöhter Temperatur (bis ca. 6O⁰C) durchgeführt

^! und ist nach 2-6 Stunden beendet. Die Isolierung der Substanz erfolgt durch mehrfaches Lyophilisieren und Ionenaustauschchromatographie.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird die Zahl der radioaktiven Synthesestufen auf 1 herabgesetzt (gegenüber 3 - 4 Stufen beim bisher bekannten Verfahren), was zu einer erheblichen Verminderung des technischen Aufwands führt. Die als

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vorletzte Stufe dienenden Substanzen (tertiäre oder quartäre Ammoniumsalze) sind stabil und dadurch praktisch Depotsubstanzen zur schnellen Herstellung der tritiierten Pyrimidin- bzw. Purin-nucleosid-phosphate.

Die Erfindung soll nachfolgend an Beispielen näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Tritiierung von 5-Brom-uridin-5'-<triphosphat (5-Br-UTP) als

,-. Triäthylammoniumsalz ' '

^ 108 mg (0.112 mMol) 5-Br-UTP-(tetra)-triäthylammoniumsalz werden in 3 ml DBHP gelöst. Unter Rühren gibt man 2 Tropfen Triäthylamin und 50 mg mit Tritium beladenes Palladium-Mohr zur Lösung. Das Gemisch v/ird in einer Tritiumatmosphäre mit leichtem Unterdruck insgesamt 3 Stunden gerührt. Hach dem Entfernen des freien Tritium wird die Lösung über einen Frittenansatz abgesaugt und mit 2 ml Methanol nachgespült, die klare Lösung wird lyophilisiert. Uach dem Aufnehmen mit 2 ml Methanol wird erneut lyophilisiert (Tritiumaustausch). Das Reaktionsprodukt wird in 4 ml ?/ässer gelöst, und auf eine A 25-DEAE-Sephadex-Säule (0,5 x 21), die in Bicarbonatform vorliegt, aufgetragen. Nach dem Waschen der Säule wird mit

- ^ ansteigendem, kontinuierlichem Gradienten (150 ml HpO/150 ml 0.7 M Triäthylammoniumbicarbonat) eluiert. Die FlieSgeschwindigkeit beträgt 70 ml/Std. lach 219 ml Eluat isoliert man eine 38 ml-Fraktion und lyophilisiert. Diese.Fraktion enthält die Hauptmenge- an 5-%-UTP (0.064 .mMol) mit einer Reinheit von 99'%· Das Produkt ist dünnschichtchromatographisch einheitlich. Die Gesamtaktivität beträgt 388 m Ci. Das 5-³H-UTP hat eine spezifische Aktivität von 6.1 Ci/mMol.

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Beispiel 2

Tritiierung von 5-Brom-2'-desoxycytidin-5'-triphosphat (5-Br

dCTP) als Triäthylamrnoniumsalz ' :

146 mg (0.153 mMol) 5-Br-dCTP-(tetra)-triäthylammoniumsalz werden in 5 ml DMF gelöst. Unter Rühren gibt man 2 Tropfen Triäthylamin und 130 mg mit Tritium beladenes Palladium-Mohr hinzu. Das Gemisch wird in einer Tritiumatmosphäre (p = 611 Torr) 5 Stunden gerührt. Uach dem Entfernen des freien Tritium wird die Lösung über einen Filter abgesaugt und mit 2 ml Methanol nachgespült. Die vereinigten Filtrate werden lyophilisiert. Das hellgelbe Glas wird in 2 ml Wasser aufgenommen und auf eine A-25-DEAE-Sephadexsäule (OJx 33) in Bi carbonatform gegeben. Nach dem Waschen der Säule wird mit an steigendem, kontinuierlichem Gradienten eluiert (200 ml H₂ 200 ml 0,7 M Triäthylammonium-bicarbonat THC). Die Fließgeschwindigkeit beträgt 90 ml/Std.

Hach 310 ml Eluat wird eine Fraktion von 76 ml Volumen isoliert, die 0.071 mMol H³-dCTP mit einer Reinheit von 99 % enthält. Die Gesamtaktivität beträgt 325 m Ci. Die spezifische Aktivität des erhaltenen H^-dCTP ist 4.61 Ci/mMol.

Claims (2)

2307 0 4 Brfindungsanspruch

1. Verfahren zur 'Tritiierung von halogenierten, insbesondere bromierten Pyrimidin- bzw. Purin-nucleosid-phosphaten, gekennzeichnet dadurch, daß die halogenierten Pyrimidin- bzw. Purin-nucleosid-phosphate in tertiäre oder quartäre Ammoniumsalze überführt und diese Salze in organischen Lösungsmitteln, vorzugsweise DIvIP, mit Edelmetallkatalysatoren, vorzugsweise Pd, und Tritiumgas tritiiert werden.

2, Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß austauschfähige Wasserstoffatome der tertiären oder quartären Ammoniumsalze durch Schutzgruppen ersetzt werden.