DD148881A3 - Verfahren zur herstellung von markierten gibberellinaldehyden - Google Patents

Abstract

Es ist das Ziel der Erfindung, ein allgemein anwendbares Verfahren zur Herstellung von markierten Gibberelin-(7)-aldehyden zu entwickeln. Erfindungsgemaesz wird ein Gibberellin-(7)-aldehyd unter dem Einflusz von ultravioletter Strahlung gegebenenfalls nach Isolierung eines entstehenden 7-Hydroxy-7,15-cyclobutan-Derivats in Gegenwart von Verbindungen mit Tritiumdonator- bzw. Deuteriumdonatoreigenschaften zum am Kohlenstoffatom 15 des ent-Gibberalan-Grundgeruests markierten Gibberellin-(7)-aldehyd umgesetzt. Insbesondere ist das Verfahren auch fuer die Markierung alkaliempfindlicher Gibberellin-(7)-aldehyde geeignet. Die nach dem erfindungsgemaeszen Verfahren hergestellten markierten Gibberellin-(7)-aldehyde besitzen beispielsweise als Ausgangsstoffe fuer die Gewinnung markierter natuerlicher Gibberelline und ihrer Derivate Bedeutung.

Description

Verfahren zur Herstellung von markierten Gibberellinaldehyden

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von markierten Gibberellin-(7)-aldehyden. Unter Gibberellin-(7)-aldehyden sind Gibberellin-Derivate zu verstehen, die in Position 6 des ent-Gibberellan-Grundgerüstes eine Aldehydgruppe besitzen. Dabei ist das ent-Gibberellan-Grundgerüst intakt oder geringfügig verändert (z.B. seco-, homo- oder nor-ent-Gibberellan, gegebenenfalls Mehrfachbindungen enthaltend) und gegebenenfalls in verschiedenster Weise substituiert. Als markierte Gibberellin-(7)-aldehyde werden solche Verbindungen definiert, die tritiiert oder deuteriert sind.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Gibberelline besitzen als Phytohormone multipler Wirkung großes biologisches Interesse. Insbesondere ist die Verwendung markierter Gibberelline und ihrer Derivate auf vielen Gebieten bedeutungsvoll, z.B. bei biotechnologischen und analytischen Verfahren, für Untersuchungen von Biosynthese, Metabolismus, Transport, Verteilung, Wirkungsweise und Struktur-Wirkungsbeziehungen dieser Phytohormongruppe und ihrer partialsynthetischen Analoga als Grundlage für die Synthese neuer Wirkstoffe.

Charakteristik.der bekannten technischen Lösungen

Die Herstellung einiger markierter Gibberellin~(7)-aldehyde wurde bereits beschrieben. So wurde, über die Darstellung von /6-%/- bzw. /"6- H/-markiertem Gibberellin-A^o-aldehyd und Gibberellin-A ₄-aldehyd berichtet /J.E. BEARDEE, J. MacMILLAN

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und B.O. PHINEEY, Photochemistry 12, 2173, 2615 (1973)ϊ J.H. GEAEBE, P. HEDDEN und J. MacMILLAN, J. ehem. Soc. Chem. Comm. τ£ΐ» ¹⁶¹' ^p· HEDDEN, J. MacMILLAN und B.O. PHINNEY, J. chem. Soc, Per kin I 1974, 587 J, Dieses Verfahren ist jedoch nicht allgemein anwendbar. Insbesondere können alkaliempfindliche Gibberellin-(7)-aldehyde, wie z.B. Gibberellin-Ao-(7)-aldehyd oder Gibberellin-Ar₇-(7)-aldehyd nicht nach dieser Methode hergestellt werden.

Ziel der Erfindung

Es ist das Ziel der Erfindung, ein allgemein anwendbares Verfahren zur Herstellung von markierten Gibberellin-(7)-aldehyden zu entwickeln. Insbesondere soll das Verfahren auch für die Markierung alkaliempfindlicher Gibberellin-(7)-aldehyde geeignet sein.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von markierten Gibberellin-(7)-aldehyden zu entwickeln, das die Markierung an einem Kohlenstoffatom des ent-Gibberellan-Grundgerüsts unter solchen Reaktionsbedingungen ermöglicht, die alkaliempfindliche Strukturmerkmale nicht verändern. Die Markierung soll an einer C-H-Bindung durchgeführt, wercten, die in nahezu allen von naüurlionen CribbereJ.JDrion una inren derivaten abgeleiteten Gibberellin-(7)-aldehyden unsubstituiert vorliegt, um eine große Anwendungsbreite des Verfahrens zu gewährleisten.

Erfindungsgemäß werden Gibberellin-(7)-aldehyde am Kohlenstoffatom 15 des ent-Gibberellan-Grundgerüsts markiert.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird ein Gibberellin-(7)-aldehyd unter dem Einfluß von ultravioletter Strahlung gegebenenfalls nach Isolierung eines entstehenden 7-Hydroxy-7,15-cyclobütan-Derivats in Gegenwart von Verbindungen mit Tritiumdonator-

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bzw. Deuteriumdonatoreigenschaften (im folgenden Tritium- bzw. Deuteriumdonatoren genannt) zum am Kohlenstoffatom 15 des

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ent-Gibberellan-Grundgerüsts markierten Gibberellin-(7)-aldehyd umgesetzt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist als einstufiges oder zweistufiges Verfahren durchführbar. Beim einstufigen Verfahren wird ein Gibberellin-(7)-aldehyd in Gegenwart von Tritium- bzw. Deuteriumdonatoren unter dem Einfluß von ultravioletter Strahlung zum markierten Gibberellin-(7)-aldehyd umgesetzt. Dagegen wird beim zweistufigen Verfahren ein bei der photochemischen Umsetzung entstehendes unmarkiertes 7-Hydroxy-7,15-oyclobutanDerivat als Zwischenprodukt isoliert, das in der zweiten Stufe in Gegenwart von Tritium- bzw. Deuteriumdonatoren zum markierten Gibberellin-(7)-aldehyd gespalten wird.

Die als Ausgangsstoffe eingesetzten Gibberellin-(7)-aldehyde wurden nach bekannten Verfahren auf chemischem /~M. LISCHEWSKI und G. ADAM, DDR-Patentschrift 112 7531 C 07 d, 5/06} DDR-Pat ent schrift 120 875, C 07 D, 307/77} M. LISCHEV/SKI und G. ADAM, Tetrahedron Letters 1974» 2835} ibid. 1975, 2569} ibid. 1975, 3691} Z. Chem. 16, 486 (1976)7 oder mikrobiellem Wege hergestellt /"J.B· BEARDER, J. MacMILLAN und 3.0. PHINNEY, Phytochemistry 12, 2173 (1973)} J.R. HAlTSON and J. HAWKER, J. chem. Soc, Chera. Comm. 1^211 208 und Phytochemistry 12, 1073 (1973)7-

Die photochemische Umsetzung unter dem Einfluß von ultravioletter Strahlung wird entweder in einem Lösungsmittel, z.B. in Benzol, Toluol, Essigsäuremethylester, Essigsäureäthylester, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylenchlorid, Methanol, tert. Butanol oder Wasser bzw. einem Lösungsmittelgemisch, z.B. in Benzol/Essigsäuremethylester, oder in wäßriger oder organischer Suspension durchgeführt, oder es wird ohne Lösungsmittel gearbeitet, wobei die Ausgangsstoffe in kristalliner oder in nichtkristalliner Form, wie z.B. als Film oder adsorbiert an einen anorganischen oder organischen Träger, einsetzbar sind. Als Träger kommen beispielsweise Aluminiumoxid, Kieselgel, Florisil,

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Celite, Cellulose oder organische Polymere zur Anwendung.

Als Tritium- bzw.. Deuteriumdonatoren sind die verschiedensten Substanzen mit austauschfähigem Tritium bzw. Deuterium geeignet. Besonders vorteilhafte Tritiumdönatoren sind beispielsweise %₂0, XO-% und XS-³H, wobei für X eine Alkyl-, Aryl- oder Acylgruppierung steht, die substituiert oder unsubstituiert ist.

Analoges gilt für die Deuteriumdonatoren. Auch die folgenden Ausführungen über die Markierung mit Tritium sind entsprechend auf die Deuterierung anzuwenden.

Zur Erzielung einer hohen spezifischen Radioaktivität bzw. einer hohen Einbaurate ist der Einsatz von ^H₂O oder CH^O-^H zweckmäßig. Aus dem gleichen" Grunde ist es vorteilhaft, in den Gibberellin-Derivaten alle austauschfähigen Wasserstoffatome zu substituieren, damit die gesamte spezifische Radio-.aktivität des Tritiumdonators zur gezielten Markierung am Kohlenstoffatom 15 wirksam wird. Hieraus folgt, daß das erfindungsgemäße Verfahren Tritiummarkierungen ermöglicht, die bis zur spezifischen Radioaktivität von trägerfreiem Tritium reichen. Dies wird entweder durch Einsatz substituierter Gibberellin-(7)-aldehyde oder durch Substitution austauschfähiger Wasserstoffatome auf der Stufe des 7-Hydroxy-7,15-cyclobutan-Derivats erreicht. Beispielsweise ist es günstig, vor der Spaltung des 7-Hydroxy-7,15-cyclobutan-Derivats den Wasserstoff der 7-Hydr oxy lgr uppe durch eine Schutzgruppe zu ersetzen. Als Schutzgruppe wird vorzugsweise eine Acylgruppe, z.B. die Acetyl-, Propionyl-, Butyryl-, Benzoyl- oder eine substituierte Benzoylgruppe, bzw. eine Silylgruppe, insbesondere die Trimethylsilylgruppe, bzw. die Tetrahydropyranylgruppe eingesetzt.

Die Spaltung des 7-Hydroxy-7,15-cyclobutan-Derivats, gegebenenfalls nach Substitution des Wasserstoffs der 7-Hydroxylgruppe durch eine Schutzgruppe, in Gegenwart eines Tritium- bzw. Deuteriumdonators erfolgt durch Basenzusatz. Dabei können die verschiedensten Basen eingesetzt werden, beispielsweise OR** oder SR", wobei R für H, ^H bzw. ^h₁ Alkyl oder substi-

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t.uiertes Alkyl, Aryl oder substituiertes Aryl steht, stickstoffhaltige Basen, Carbanionen, Hydridionen,_sbasische Ionenaustauscher. Die Umsetzung der 7-Hydroxy-7,15-cyolobutanDerivate bzw. der 7-Acyloxy-7,15-cyclobutan-Derivate gelingt im allgemeinen bereits mit katalytischen Mengen von Basen, was für basenempfindliche Verbindungen von besonderem Vorteil ist.

Die Verbindung mit Tritiumdonator-Eigenschaften kann vorteilhaft gleichzeitig als Lösungsmittel, gegebenenfalls bereits für die photochemische Umsetzung, und in deprotonierter Form als Base für die Spaltung eingesetzt werden.

Sowohl für die photochemische Umsetzung zum 7-Hydroxy-7,15-cyclobutan-Derivat als auch für die Spaltung spielt die Temperatur nur eine untergeordnete Rolle und kann in einem sehr weiten Bereich variiert v/erden. So ist' die photochemische Reaktion bei -60 ⁰C ebenso wie bei +50 ⁰C durchführbar, wobei diese angegebenen Temperaturen noch keineswegs die Grenzwerte des Temperaturbereiches, in dem die Reaktion erfolgreich verläuft, darstellen. Das gleiche gilt für die Spaltung zum markierten Gibberellin-(7)-aldehyd.

Die Aufarbeitung der Reaktionsprodukte erfolgt nach den üblichen Methoden, beispielsweise durch Säulenchromatographie unter Verwendung von organischen Lösungsmitteln.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist allgemein anwendbar. Alkaliempfindliche Strukturmerkmale werden nicht verändert. Die Markierung am Kohlenstoffatom 15 ist bei nahezu allen von natürlichen Gibberellinen und ihren Derivaten abgeleiteten Gibberellin-(7)-aldehyden möglich. Dadurch werden markierte Gibberellin-(7)-aldehyde zugänglich, die bisher auf anderem Wege nicht hergestellt werden konnten. Auch für die Darstellung von doppelt markierten Gibberellin-(7)-aldehyden ist das erfindungsgemäße Verfahren g-eeignet. Beispielsweise gewinnt man auf diese Weise /"17-¹⁴G, 15-³H7-Gibberellin-A₃-(7)-aldehyd aus /'i7-^1/fQ/-Gibberellin-A₃-(7)-aldehyd und /⁷I-³H, 15-%/-Gibberellin-A₅-(7)-aldehyd aus /"1-%7-Gibb er ellin-

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A_c-(7)-aldehyd. Auch substituierte Gibber ellin-Derivate sind darstellbar, wie z.B. £ 0-Gluoose/-0(3)-ß-I>rGlucopyranosyl-/⁵15-³H/-gibberellin-A₃-(7)-aldehyd aus /¹⁴C-GlUCOSeZ-OO)-B-D-Glucopyranosyl-gibberellin-Ao-(7)-aldehyd.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten markierten Gibberellin-(7)-aldehyde besitzen als Ausgangsstoffe für die Gewinnung markierter natürlicher Gibberelline und ihrer Derivate Bedeutung. Die Markierung befindet sich an einer Position, an welcher biochemische Veränderungen, z.B. bei Biosynthesestudien oder Untersuchungen zum Metabolismus, selten beobachtet werden. Weitere Vorteile sind die stabile Markierung, die mit einer hohen spezifischen Radioaktivität erreichbar ist, und ihre leichte Nachweisbar k-eit.

Die als Zwischenprodukte auftretenden 7-Hydroxy-7,15-cyclobutan-Derivate bzw. deren acetylieite Vertreter stellen eine neue Gruppe von Phytohormonanaloga dar, welche modifizierte wachstumsregulatorisehe Wirkungen besitzen.

Nachfolgende Beispiele erläutern die Erfindung, wobei die darin angegebenen speziellen Bedingungen die Erfindung nicht einschränken und die Eeaktionsbedingungen auch auf die Herstellung anderer Verbindungen anwendbar sind.

Ausführungsbeispiele

Beis|>iel_1

330,4 mg (1 mMol) Gibberellin-A-5(7)-aldehyd (Ia) werden in 15 ml abs. Benzol und 15 nil Essigsäuremethylester gelöst und in einem ^uarzkolben unter Argon 19 Stunden mit einem quecksilber hochdruckbrenner (THU 5OO der Firma THELTA Elektroapparate, Zella-Mehlis) im Abstand von 6 cm unter Fönkühlung bestrahlt. Danach wird die Lösung i. Vak. eingeengt und der Bückstand an 20 g Kieselgel (Woelm) chromatographiert. Elution mit Chloroform/Essigsäureäthylester 8:2 v/v liefert 63 mg unumgesetztes Gibberellin-Ao-(7)-aldehyd (Ia). Anschließend

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werden mit Chloroform/Essigsäureäthylester 1:1 ν/ν 217 mg = 81 % d.Th. ent-3a,7^,1.O,13-Tetrahydroxy-7,15-cyclo-2O-norgibberella-1 ,le-dien-ISJ-säiire-I^IO-lacton (I"b) erhalten (Ausbeute bezogen auf umgesetztes Ia). Das amorphe Isomerengemisch Ib hat folgende spektroskopische Daten: IR (Nu^ol): 3400 (br.) und 1755 tt-Lacton-CO) \ MS: m/e 330 (M⁺).

217 mg Ib werden mit 10 ml einer Natriummethylatlösung (bereitet aus 10 ml CKLO-% und 15 mg Naj spez. Eadioaktivität von CHnO^H = 0,5 mCi/mMol) bei Raumtemperatur versetzt. Nach 10 Min. wird 1 ml Eisessig zugegeben und i. Vak. eingeengt. Nachfolgende chromatographische Reinigung an 15 g Kieselgql (Woelm) liefert mit Chloroform/Essigsäureäthylester 8:2 v/v 134,5 mg (62 % d.Th.) ³ ^

/"15-³H7-Gibberellin-A₃-(7)-aldehyd (Ic): amorph; focj^ +119,2° (c = 0,58, Äthanol)? IR (CHClO: \> _v 3610 (OH), 2820, 2725 und 1725 (Aldehyd), 1775 (f-Lacton-CO), 1665 (=CH₂) und 1635 cm""¹ (-CH=CH-) j MS: m/e 330 (M⁺) j 100 MHz-NMR: δ 1,20 (s, 18-H₃), 2,79 (dd, J = 10,5 und J¹ = 2,5 Hz, 6-H), 3,22 (d, J = 10,5 Hz, 5-H), 4,17 (d, J = 3,5 Hz, 3-H)₁ 5,00 und 5,29 (m, 17-H₂), 5,91 (dd, J = 9,5 und J· = 3,5 Hz, 2-H)₁ 6,33 (d, J = 9,5 Hz, 1-H) und 9,81 ppm (d, J = 2,5 Hz, 7-H). Die spezifische Radioaktivität beträgt 0,4-3 mCi/mMol.

Beisp_iel_2

Eine Lösung von 414,5 mg (1 mMol) 0(3),O(13)-Diacetylgibberellin-Ao-(7)-aldehyd (Ha) in 40 ml abs. Benzol wird 25 Stunden in einem Quarzkolben unter Stickstoff (Fönkühlung) bestrahlt (THU >00 der Firma THELTA Elektroapparate, Zella-Mehlis). Man engt danach i.. Yak. ein und chromatographiert den Rückstand an 30 g Kieselgel (Woelm.). Die Fraktionen 24 - 28 mit einem Gradienten von n-Hexan/Chloroform 357 v/v liefern 80 mg 0(3),0(i3)-Diacetylgibberellin-Ao-(7)-aldehyd (Ha) zurück. Mit dem gleichen Gradienten erhält man beim Zusammenfassen der Fraktionen 30 - 55 305 mg = 91 % d.Th. enfc-3ct, 13-Diacetoxy-7f,10-dihydroxy-7,15-cyclo-2O-norgibberella-1,16-dien-19-säure-19,10-lacton (lib) (Ausbeute bezogen auf umgesetztes Ha). Durch mehrfaches Umkristallisieren aus

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Chlorof orm/n-Hexan kann das 7ß-Epimere von Hb rein isoliert werden. Die physikalischen und spektroskopischen Daten von ent-3oC,13-Diacetoxy-7ß, 10-dihydr oxy-7,15-cyclo-20-norgibber el.la-1,16-dien-19-säure-19,10-lacton sind: Schmp. 217-220 ⁰C (Nadeln aus Chlorof orm/n-Hexan); /OiJ^ +122,2° (c = 0,45, Äthanol); MS: m/e 414 (M⁺ bzw. M~) j IE (CHCIo): v> _v 3610 (OH), 1778 ty-Lacton-CO), 1740 (Ester-CO), 1668 (^C=CH₂) und 1260 cm"¹

(Acetyl)\ 100 MHz-NMR-Spektrum: δ 3

2 ,10 und 2,14 zwei Acetyle, 3,03 (d, J = 7 Hz, 5-H), 4,68 (unschafes Dublett, J = 7 Hz, 7-H), 4,86 (d, J = 2,25 Hz, 17-H), 5,24 (d, J = 2,75 Hz, 17-H), 5,36 (d, J = 3,5 Hz, 3-H), 5,87 (dd, J = 9,5 Hz und J¹ = 3,5 Hz, 2-H), 6,41 (d, J = 9,5 Hz,1-H).

Analoge photochemische Umsetzungen von 0(3),O(13)-Diacetylgibberellin-Ao-(7-)-aläehyd (Ha) wurden auch in anderen Lösungsmitteln, wie z.B. Toluol, Essigsäureäthylester, Tetrahydrofuran, Dioxan, Methylenchlorid, Methanol, tert. Butanol durchgeführt. Die erzielten Ausbeuten des 7-Hydroxy-7,15-cyclobutan-Derivats Hb, bezogen auf umgesetzte Aldehydverbindung, liegen zwischen 80 und 92 ^.

Zu 414,5 mg (1 mMol) Hb, gelöst in 3 ml THF, gibt man 0,1 ml (5,55 mMol) ^H₂O (spez. Radioaktivität 3 mCi/mMol). Nach 10 Min. fügt man bei Raumtemperatur 20 mg Lithiunimethylat zu, läßt 15 Min. reagieren und bricht danach die Reaktion durch Zugabe von 0,5 ml Eisessig ab. Dann wird eingeengt und der Rückstand mit 4 ml abs. Pyridin und 4 ml Acetanhydrid versetzt. Nach 20 Min. engt man erneut ein und chromatographiert den Rückstand an 30 g Kieselgel (Y/oelm). Bei Elution mit Chloroform/n-Hexan 6:4 v/v erhält man 265 mg = 64 % d.Th. /15--%/-O(3),O(13)-Diacetylgibberellin-Ay(7)-aldehyd (lic) mit einer spezifischen Radioaktivität von 1,34 mCi/mMol} Schmp.: 161 - 163 ⁰C (aus Äther/n-Hexan)\ A/Jp +205,5° (c = 0,51, abs. Dioxan) \ IR (CHCl..): O 2820, 2725 und 1725 (Aldehyd),

J IUoLa.

1775 (f-Lacton-CO), 1740 (Ester-CO), 1665 (-C=CH₂) und 1255 (Acetat)j MS: m/e 414 (M⁺). . ·

Die analoge Umsetzung von 414,5 mg Hb in 3 ml THF mit 0,1. ml

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H₂O (99,9 %ige Reinheit) und 20 rag Lithiummethylat liefert nach Acetylierung 257 mg = 62 % d.Th /15-²H/-0(3),0(13)-Diacetylgibberellin-Ao-r(7)-aldehyd (X): Schmp.: 160 - 164 ⁰C (aus Äther/n-Hexan)j /q/_D +204,1° (c = 0,46, abs. Dioxan); MS: m/e 415 (M⁺). Entacetylierung von 143 mg X mit 3,5 ml einer 0,2 nNatriummethylatlösung (4 Stunden, Raumtemperatur) liefert nach chromatographischer Aufarbeitung 78 mg =68 % d.Th« /"15-²H/-Gibberellin-A₃-(7)-aldehyd: amorph? /bj^ +119,0° (c = 0,60, Äthanol); MS: m/e 331 (M⁺).

Eine Lösung von 41^,5 mg (1 mMol) 0(3),O(13)-Diacetylgibberellin-Ao-(7)-aläehyd (Ha) in 60 ml Chloroform wird im Quarzkolben i. Yak. eingeengt. Der zurückbleibende Substanzfilm wird 70 Stdn. unter Rotation und Argon mit UV-Licht bestrahlt (Fönkühlungj THU 500 der Firma THSLTA Elektroappnrate, Zella-Mehlis). Danach wird das erhaltene Photoprodukt an 30 g Kieselgel (Woelm) chromatographiert. Die Fraktionen 22 - 27 mit einem Gradienten von n-Hexan/Chloroforin 3:7 v/v liefern 120 mg O(3),O(13)-Diacetylgibberellin-A₃-(7)-aldehyd (Ha) zurück. Mit dem gleichen Gradienten erhält man beim Zusammenfassen der Fraktionen 30 - 55 236 mg = 80 % d.Th. ent-3a,13-Diacetoxy-7J,10-dihydroxy-7,15-cyclo-20-norgibberelia-1,16-dien-19-säure-19,1O-lacton (Hb) (Ausbeute bezogen auf umgesetztes Ha)

Zu 414,5 mg ent-3oi,13-Diacetoxy-7ß,1O-dihydroxy-7,15-cyclo-2O-norgibberella-1,16-dien-19-säure-19,10-lacton in 4 ml Pyridin gibt man 4 ml Acetanhydrid. Man läßt 1 Std. bei Kaumtemperatur stehen und engt i. Yak. ein. Der Rückstand wird an 30 g Kieselgel (Woelm) chromatographiert. Mit n-Hexan/ Chloroform 6:4 v/v erhält man 389 = 85 % d.Th. ent-3o4,7ß,13-Triacetoxy-10-hydroxy-7,15-cyclo-20-norgibberella-1,16-dien-19-säure-19,1O-lacton: Schmp.: 229 - 231 ⁰C (aus Äther), /o5/jp+158,0⁰ (o = 0,63, Äthanol) j MS: m/e 456 (M⁺) j IE (CHCl-,): ν? 1778 Of-Lacton-CO), 1740 (Ester-CO), 1670 P-C=CH₂) und 1260 cm" ' (Acetyl).

204 77 0 - ίο -

Zu 228 mg (0,5 jriMol) ent- 3<x, 7ß 113-Tr iac et oxy-10-hydr oxy-7»15-cyclo-2O-norgibberella-1,lö-dien-^-säure-^jiO-lacton gibt man 5 ml abs. THF und 0,05 ml HpO (spez. Radioaktivität = 3 mCi/mMol). Man fügt portionsweise innerhalb 1 Std. 112,2 mg (1 BiMoI) alkoholfreies Kalium-tert.butylat zu, rührt eine weiteieStd. und fügt danach 0,3 ml Eisessig zu. Nach Einengen i. Vak. und Zugabe von 2 ml Pyridin und 2 ml Acetanhydrid werden nach Aufarbeitung (vgl. Beispiel 2) 153 mg = 67 % d.Th. / i5-³H/-O(3),O(13)-Diacetyl-gibberellin-A₃-(7)-aldehyd (lic) erhalten (spezifische Eadioaktivität = 1,5 mCi/mMol).

Entacetylierung von 153 mg lic mit 3,7 ml einer 0,2 nNatriummethylatlösung liefert nach Chromatographie entsprechend Beispiel 1 85 mg = 70 % d.Th. /"15-³H/-Gibberellin-A₃-(7)-aldehyd (Ic)(spez. Radioaktivität = 1,48 mCi/mMol).

Beisp_ieljj;

Eine Lösung von 41,5 mg (0,1 mMol). 0(3),O(13)-Diacetylgibberellin-A₃-(7)-aldehyd (Ha) in 2 ml abs. THF wird mit ^ ( iä /)

0,05 ml -^H₂O versetzt (spez. Radioaktivität = 3 mCi/mMol) und 80 Stdn. in einem Pyrexkolben mit UV-Licht bestrahlt (Fönkühlung; THU 500 der Firma THELTA EIektrοapparate, Zella-Mehlis). Danach wird i. Vak. eingeengt, in Äther aufgenommen und mehrfach mit Wasser ausgeschüttelt. Der Rückstand der getrockneten und eingeengten Ätherphase wird an 2 g Kieselgel (Woelm) chromatographiert. Man erhält unter den gleichen Elutionsbedingungen wie im Beispiel 2 17»4- mg = 42 % d.Th. /"15-³H/-O(3) ,O(13)-Diacetylgibberellin-A₃-(7)-aldehyd (lic) (spez. Radioaktivität = 0,11 mCi/mMol) und 20,7 mg = 50 % d.Th. ent-3ot, 13-Diacetoxy-7£ , 10-dihydr oxy-7,15-cyclo-2O-norgibberella-1,16-dien-19-säure-19,1O-lacton (lib).

5 mg (1 mMol) O(3)-Acetylgibberellin-A₁-(7)-aldehyd (IEIa) werden in 40 ml Toluol unter Stickstoff in einem Quarzkolben 26 Stdn. bei 25 ⁰C bestrahlt (THU 500 der Firma THELTA

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Elektroapparate, Zella-Mehlis). Nach dem Einengen i. Vak. wird der Rückstand an 25 S Kieselgel (Woelm) chromatographiert, Mit Ώ-Hexan/Chloroform ' 2:8 v/v erhält man 63 mg O(3)-Acetylgibberellin-A,,-(7)-aldehyd zurück. Mit Chloroform eluiert man anschließend 271 mg = 87 % des Isomerengemisches ent-3oc-Acetoxy-7 ,lOj^-trihydroxy^j^-cyclo^O-norgibberella-16-en-19-säure-19,1O-lacton (IHb): IR (CHCl₃): v>_max 3610 (OH), 1780 (f-Lacton-CO), 174-0 (Ester-CO), 1665 (>C=CH₂) und 1260 cm"¹ (Acetyl); MS: m/e 374- (M⁺).

Zu 271 mg IHb, gelöst in 2 ml Methanol, gibt man 0,5 ml ·%₂0 (spez. Radioaktivität = 3 mCi/mMol) und I50 mg wasserfreies Natriumacetat und läßt 1 1/2 Wochen bei Raumtemperatur stehen. Danach wird die Mischung eingeengt, Äther zugefügt und die Ätherpbase mehrfach mit Wasser ausgeschüttelt. Trocknung der Ätherlösung mit Natriumsulfat und Einengen i. Vak. liefert einen Rückstand, der mit 4 ml Pyridin und 4 ml Acetanhydrid versetzt wird. Nach 10 Min. wird i. Vak. wiederum eingeengt und der Rückstand an 20 g Kieselgel (Woelm) chromatographiert. Mit n-Hexan/Chloroform 2:8 v/v erhält man 184 mg - 68 % d.Th. amorphen /15-³H/-O(3)-Acetylgibberellin-A₁-(7)-aldehyd (HIc): IR (CHCl₃): ^_max 3610 (OH), 2725, 2820 und 1725 (Aldehyd), 1775 (y-Lacton-CO), 1740 (Ester-CO), 1665 OC=CH₂), 1255cm"¹ (Acetat); MS: m/e 374 (M⁺ bzw. M"). Die spezifische Radioaktivität beträgt 0,23 mCi/mliol).

Entacetylierung von 153 mg IHc mit 2 ml einer 0,2 nNatriummethylatlösung liefert nach Chromatographie 99 mg = 73 % d.Th.

/"15-³H7-Gibbereliin-A₁-(7)-aldehyd: amorph; /cfi^ +62,8 (c = o,42, Äthanol); MS: m/e 332 (M⁺). Die spezifische Radioaktivität beträgt 0,20 mCi/mMol.

Beisp_iel__6

35,6 mg (0,1 mMol) O(3)-Acetylgibberellin-A₄-(7)-aldehyd (IVa) werden in 5 ml Methylenchlorid unter Argon in einem yuarzkolben mit einem ^uecksilberhochdruckbrenner (THU 5OO der Firma THELTA Elektroapparate, Zella-Mehlis) 25 Stunden bestrahlt.

2 O A 7 7 O - 12 -

Die Temperatur wird während der photocheinischen Reaktion zwischen minus 30 ⁰C und minus 60 ⁰C gehalten. Anschließend wird die Lösung i.Vak. eingeengt und der Rückstand an 2,5 S Kieselgel (Woelm) chromatographiert. ülution mit n-Hexan/ Chloroform 4:6 v/v liefert 7»2 mg unumgesetzten O(3)-Acetylgibberellin-A₄-(7)-aldehyd (IVa). Mit n-Hexan/Chloforom 3:7 v/v erhält man 17»5 mg = 61 % d.Th. (bezogen auf umgesetztes IVa) ent-3oc-Acetoxy-7^»10-"dihydroxy-7,15-cyclo-20-nofgibberella-16-en-19-säure-19,10-lacton (IVb): MS: m/e 358 (M⁺); IE (CHCIo): >> ν 3610 (OH), 1780 (v>-Lacton-CO), 1740 (Ester-CO) und 1260 cm (Acetyl).

17»9 i°g IVb (0,05 mMol) werden zu einer auf 50 ⁰C erwärmten tritiierten Natriumphenolatlösung gegeben /"dargestellt aus 1 g C₆H₅O-^H (spez. Radioaktivität = 12yuCi/mMol) und y mg Na/. Nach 3 Stunden wird die Reaktion durch Zugabe von 0,2 ml Eisessig abgebrochen. Nachfolgende zweimalige Chromatographie an 2,5 g Kieselgel (Woelm) ist erforderlich, um das Phenol vom Gibberellin abzutrennen. Elution mit n-Hexan/ Chloroform 2:8 v/v liefert 8,6 mg = 54 % d.Th. amorphen /"15-³H/-Gibberellin-A,-(7)-aldehyd: IE (CHCl.): v* 36IO

τ* j max

(OH), 2725, 2820 und 1725 (Aldehyd) und 1775 (^-Lacton-CO); HS: m/e 316 (M⁺). Die spezifische Radioaktivität beträgt 10/tOi/mMol.

Beisp_iel_2

314,4 mg (1 mMol) Gibberellin-A₅-(7)-aldehyd (Va) werden in 50 ml tert. Butanol gelöst und danach 28 Stunden in einem Quarzkolben zwischen 30 - 50 ⁰C mit UV-Licht bestrahlt (THU 5OO der Firma THELTA Elektroapparate). Nach dem Einengen i. Vak. wird der Rückstand an 25 g Kieselgel (Woelm) chromato graphiert. Mit n-Hexan/Chloroform 1:9 v/v eluiert man 40 mg Gibberellin-Ac-(7)-aldehyd (Va). Anschließend erhält man bei Elution mit Chloroform 195 mg = 71 % d..Th. ent-7^, 10,13-

19|10-lacton (Vb) (Ausbeuteberechnung bezogen auf umgesetztes

2 0Λ77 0 -

Va): IR (CHOI-): V> _ 3600 - 3610(OH), 1770 (f-Lacton-CO) und 1660 cm, OC=^CH₂)j MS:, m/e 314 (M⁺). ,

195 ing Vb in 20 ml abs. THF werden unter Argon bei -78 ⁰C mit zwei Äquivalenten Lithiumdiisopropylamid in 20 ml abs. THF metalliert (Darstellung von Lithiumdiisopropylamid aus Diisopropylamin und Butyllithium ). Danach gibt man 1 ml ~Ή₂0 (spez. Eadiοaktivität = 3 mCi/mMol) zu und läßt die Mischung auf Raumtemperatur erwärmen. Durch Zugabe von 1 ml Eisessig wird die Reaktion abgebrochen . Anschließend wird die Mischung eingeengt, mit Äther versetzt und die ätherische Lösung mehrfach mit Wasser ausgeschüttelt, getrocknet, eingeengt und der Rückstand an 15 g Kieselgel (Woelm) chromatographiert. Elution mit n-Hexan/Chloroform 1:9 v/v liefert 123 mg = 63 % d.Th. amorphes /15-%/-Gibberellin-Ac-(7)-aldehyd (Vc): IR (CHCl₃): v»_max 3600 (OH), 2725', 2820 und 1725 (Aldehyd) und 1775 (γ-Lacton-CO)j MS: m/e 314 (M⁺). Die spezifische Radioaktivität von Vc beträgt 1,4 mCi/mMol.

Beisp_iel__8

31,4 mg (0,1 mMol) Gibberellin-A₇-(7)-aldehyd (VIa) werden ohne Lösungsmittel in Kristallforia in einem Quarzkolben 80 Stdn. unter Fönkühlung und Rotieren mit UV-Licht bestrahlt (THU 500 der Firma THELTA Elektroapparate). Danach wird das Substanzgemisch an 1,5 g Kieselgel (Woelm) chromatographiert. Mit n-Hexan/Chloroform 1:9 v/v erhält man 3»6 mg nichtumgesetztes VIa. Mit Chloroform werden 17 mg = 61 % d.Th. amorphes ent-3o6,7£,1O-Trihydroxy-7,15-cyclo-2O-norgibberella-1,16-dien-19-säure-19»1O-lacton (VIb) eluiert (Ausbeuteberechnung bezogen auf umgesetztes Via): IR (CHCl^): \> _ „ 3610 (OH),

λ 5 max.

. 1775 (f-Lacton-CO) und 1660 cm"' CC=CH₂); MS: m/e 314 (M⁺). 17 mg VIb werden in 2 ml Methanol geIosr und mrc U,1 ml Ai.,0 versetzt (spez. KaaioaJccivita-c von -⁵H₂O = 3 mCi/mMol) . Diese Mischung wird durch Anionenaustauscher (Dov/ex, OH-Form) gegeben. Chromatographie des nach dem Einengen erhaltenen Rückstands an 1 g Kieselgel (Woelm) liefert mit n-Hexan/ Chloroform 1:9 v/v 8,8 mg = 52 % d.Th. /i5-³H7-Gibberellin-

204770 -14-

A₇-(7)-aldehy<a (VIc): Schmp.: 183*- 187 ⁰C; IE(CHCl₃): y_mQV 3610 (OH), 2720, 2820 und 1725 (Aldehyd), 1775 ty-Lacton-CO) und I665 cm"' (>C=CH₂); MS: m/e 314 (M⁺). Die spezifische Radioaktivität von YIc beträgt 20/*Ci/mMol.

Beisp_iel_2

Eine Lösung von 34,8 mg (0,1 mMol) Gibberellin-A₈-(7)-aldehyd (VIIa) in 6 ml THF wird 60 Stunden in einem Pyrexkolben mit UV-Licht bestrahlt (THU 500 der Firma THELTA Elektroapparate). Man engt danach i. Vak. ein und chromatographiert den Rückstand an 4 g Kieselgel (Woelm). Mit einem Gradienten von Chloroform/Essigsäureäihylester 4:6 v/v erhält man 16,2 mg unumgesetzten Gibberellin-Ag-(7)-aldehyd. Weitere Elution mit Chloroform/Essigsäureäthylester 2:8 v/v liefert 15,3 nig = 82 % d.Th. amorphes ent-2ri,3oi,7£,10,13-Pentahydroxy-7,15-cyclo-20-norgibberella-1,16-dien-19-säure-19»1O-lacton (VIIb) (Ausbeuteberechnung bezogen auf umgesetztes VIIa): IR (Nujol): \> 3400 br. (OH) und 1755 (jf-Lacton-CO) ; MS: m/e 348 (M*).

15 ing VIIb werden mit einer tritiierten Lithium-n-propylmercaptid-Lösung /dargestellt aus 1 ml n-C-JinS- H (spezifische Radioaktivität 43 ^Ci/mMol) und 0,1 ml Butyllithium in η-Hexan (Gehalt 3,2 mg C^HgLi)./ versetzt. Nach 1 Std. gibt man 0,1 ml Eisessig zu und engt i. Vak. ein. Nachfolgende Chromatographie an 1 g Kieselgel/V/oelm) liefert mit Chloroform/Essigsäureäthylester 4:6 v/v 8,1 mg = 54 % d.Th. amorphen /"15-%/-Gibberellin-A₈-(7)-aldehyd (VIIc) (spez. Radioaktivität 30/iCi/mMol): IR (Nujol): n> _v 3400 br. (OH), 1755

_i max ,

(^-Lacton-CO) und 1720 cm ' (Aldehyd) \ MS: m/e 348 (M⁺).

Beisp_iel_10

In einem Quarzkolben werden zu 3 mg (0,01 mMol) Gibberellin-A_Q-(7)-aldehyd (Villa), gelöst in 1 ml tritiiertem tert. Butanol (spez. Radioaktivität von C^HqO-^H = 34 kCi/mMol)·,

20Λ770

3 mg Kalium-tert.butylat gegeben. Danach wird die Lösung 23 Stdn unter Fönkühlung mit ultraviolettem Licht bestrahlt (THU 500 der Firma THELTA Elektroapparate). Anschließend fügt man 0,1mi Eisessig zu und engt i. Vak. ein. Nachfolgende Chromatographie an 0,5 6 Kieselgel (Woelm) liefert mit n~Hexan/Chloroform 1i1 v/v 1,7 mg = 57 % d.Th. amorphen /"15-%/-Gibberellin-AQ-(7)-aldehyd (VIIIc) (spez. Radioaktivität = 28 /) IE (CHCl.): v> 2820, 2725 und 1725 (Aldehyd) und 1775

j I. . ,

(>[-Lacton-CO); MS: m/e 300 (M⁺).

Beisp_iel_11 ,

Eine Lösung von 3,2 mg (0,01 mMol)

aldehyd (IXa) in 1 ml Essigsäureäthylester wird unter Argon im Quarzkolben mit einem Quecksilberhochdruckbrenner (THU 500 der Firma THELTA Elektroapparate, Zella-Mehlis) 32 Stdn. bestrahlt (Fönkühlung). Anschließend engt man i. YaIc. ein und erhält nach dünnschichtchromatographischer Trennung an KieseHgel (Merck) 0,7 mg Gibberellin-A₁₂-(7)-aldehyd (IXa) und 2,2 mg = 83 % d. Th. £nt-7f-Hydroxy-7,15-cyclo-gibberella-16-en-19-säure (IXb) (Ausbeuteberechnung bezogen auf umgesetztes IXa): MS: m/e 316 (M⁺).

Zu 2,2 mg IXb gibt man 0,1 ml einer tritiierten Natriummethylatlösung (bereitet aus CH^O--^H, spez. Radioaktivität 37 ^Ci/mMol und 1 mg Na). Nach 20 Min. beendet man die Reaktion durch Zugabe von 0,1 ml Eisessig und engt anschließend i. Vak. ein. Nachfolgende Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Merck) liefert 1,3 mg = 59 % d.Th. /"15-³H/-Gibberellin-A_1ij-(7)-aldehyd (IXc) (spez. Radioaktivität 35 /^i/mMol): IR (CHCl₃): <>_max 2725 (CHO), 17IO br. (>C=0) und 1658 cm"¹ (^C=CH₂); MS: m/e 316 (M⁺).

CU

nu>Ji u'''

-R4

Ια-YMt	Δ1	R1	Ib -1	/Hb	R3	ic-Ynrc
Verbindung	Δ1	H	R2	ßOHjcCH .	R4
I		H	H	(5CH3C(O)O5OCH	OH
I		H2	H	(5CH3C(O)O5OCH	CH3-C(O)O
m	Δ2	H2	H2	(5CH3C(O)O5OiH	OM ,
rc	Δ1	H2	H2	H	H
Y	•	H	H	ßOHjOCH	OH
YL		H2	H	ßOHjOCH	H
W		H2	(3OH; cCH	H2	OH
νπτ	H2	H

V /

DJE

02Γ

Q2

D2T

Claims (11)

1. Erfindungsanspruch

   1. Verfahren zur Herstellung von markierten Gibberellinaldehyden, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gibberellin-(7)-aldehyd unter dem Einfluß von ultravioletter Strahlung, gegebenenfalls nach Isolierung eines entstehenden 7-Hydroxy-7,15-cyclobutan-Derivats, in Gegenwart von Tritium- bzw. Deuteriumdonatoren zum am Kohlenstoffatom 15 des ent-Gibberellan-Grundgerüsts markierten Gibberellin-(7)-aldehyd umgesetzt wird.
2. 2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß die photochemische Umsetzung des Gibberellin-(7)-aldehyds gegebenenfalls in einem Lösungsmittel bzw. einem Lösungsmittelgemisch oder in Suspension durchgeführt wird.
3. 3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das entstandene 7-Hydroxy-7,15-cyclobutan-Derivat, gegebenenfalls nach Substitution des Wasserstoffs der 7-Hydroxylgruppe durch eine Schutzgruppe, in Gegenwart von Tritium- bzw. Deuteriumdonatoren, mit Basenzusatz zum am Kohlenstoffatom 15 markierten Gibberellin-(7)-aldehyd gespalten wird.
4. 4. Verfahren nach Punkt 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß als Gibberellin-(7)-aldehyd Gibbereilin-A,p(7)-aldehyd, gegebenenfalls mit vollständig oder partiell geschützten Hydroxylgruppen, eingesetzt wird.
5. 5. Verfahren nach Punkt 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß als Gibberellin-(7)-aldehyd Gibberellin-Ao-(7)-aldehyd, gegebenenfalls mit vollständig oder partiell geschützten Hydroxylgruppen, eingesetzt wird.
6. 6. Verfahren nach Punkt 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß als Gibberellin-(7)-aldehyd Gibberellin-A_/f-(7)-aldehyd, gegebenenfalls mit geschützter Hydroxylgruppe, eingesetzt wird.

   20 A 77 O -¹⁷~
7. 7. Verfahren nach Punkt 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß als Gibberellin-(7)-aldehyd Gibberellin-A,--(7)-aldehyd, gegebenenfalls mit geschützter Hydroxylgruppe, eingesetzt wird.
8. 8. Verfahren nach Punkt 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß als Gibberellin-(7)-aldehyd Gibberellin-Ar,-(7)-aldehyd, gegebenenfalls mit geschützter Hydroxylgruppe, eingesetzt wird.
9. 9. Verfahren nach Punkt 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß als Gibberellin-(7)-aldehyd Gibberellin-A₈-(7)-aldehyd, gegebenenfalls mit vollständig oder partiell geschützten Hydroxylgruppen, eingesetzt wird.
10. 10. Verfahren nach-Punkt 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß als Gibberellin-(7)-aldehyd Gibberellin-An-(7)-aldehyd
    eingesetzt v/ird.
11. 11. Verfahren nach Punkt 1-3» dadurch gekennzeichnet, daß als Gibberellin-(7)-aldehyd Gibberellin-A₁₂-(7)-aldehyd eingesetzt wird