DD123188B1 - Verfahren zur Gewinnung von optisch aktiven α-Aminosäuren aus Racematen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung optisch aktiver α-Aminosäuren durch Racematspaltung chemisch synthetisierter D,L-Aminosäuregemische.

Aminosäuren der L-Konfiguration sind Zwischenprodukte des tierischen und pflanzlichen Stoffwachseis sowie Bausteine natürlich vorkommender Einweiflstoffe und physiologisch wichtiger Verbindungen. D-Aminosäuren sind z.B. Bestandteile von Antibiotika. Proteinogene und nichtproteinogene optisch aktive Aminosäuren werden deshalb in der pharmazeutischen Industrie, der der biochemischen Forschung, der Medizin und in anderen Bereichen in größeren Mengen ständig benötigt. Zur Gewinnung von L-Aminosäuren sind drei allgemeine Verfahrensrichtungen bekannt. Die erste Richtung bedient sich der Isolierung aus biologischem Material, wenn eine Aminosäure in einzelnen Proteinen in großer Menge vorkommt. Die zweite Richtung benutzt die Eigenschaft gewisser Mikroorganismen zur Produktion bestimmter L-Aminosäuren. Die dritte Richtung bedient sich der chemischen Synthese racemischer Gemische von Aminosäuren und anschließender Racematspaltung in L- und D-Aminosäuren. Die Verfahren der Racematspaltung umfassen physikalischchemische, chemische und biochemische Methoden (J.P. Greenstein, M. Winitz; Chemistry of the amino acids: J. Wiley & Sons Inc. Hew York/London 1961, VoI I-III) . Die letzteren bedienen sich zunehmend stereospezifisch wirkender Enzyme, die aus tierischem oder pflanzlichem Material isloiert werden. Sie werden entweder in Lösung oder an einem festen wasserunlöslichen Träger gebunden im batch- oder Säulenverfahren eingesetzt. Dabei wirken diese Enzyme auf geeignete Derivate des Aminosäuregemisches. Die L-Verbindungen (oder gelegentlich auch D-Verbindungen) dienen dabei als Substrate. Als Enzyme sind z.B. eingesetzt worden: L-Aminosäureoxydase, D-Aminosäureoxydase, Leucinaminopeptidase, Trypsin, Chymotrypsin, Papain u.a.

Wegen breiter Substratspezifität bei strenger Stereoelektivität und hoher Substratumsatzgeschwindigkeit hat sich Aminoacyiase E.C. 3.5.1.14 zur Spaltung von Na-Acyl-D,L-Aminosäuren als besonders geeignet erwiesen. Der Vorteil immobilisierter Enzyme ist ihre leichte Abtrennbarkeit aus dem Reaktionsansatz und damit ihre

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Wiederverwendbarkeit und ihr Einsatz in batch- und Säulenreaktoren, ihre relativ hohe TemperatürStabilität sowie ihre erhöhte Resistenz gegenüber inaktivierenden Agentien. Hochaktive immobilisierte Acylase wird durch adsorptive bzw. ionogene Bindung an Ionenaustauscher erhalten (T. Tosa, T. Mori, N. Fuse, I. Chibata: Enzymol. 31, 214 (1966); Enzymol. 32, 153 (1967); Agr. Biol. Chem. 33, 1047 (1969)). Der Nachteil dieser Art Immobilisierung besteht darin, daß die Enzymaktivität durch Substrat- und Pufferlösung allmählich eluiert wird und damit die Einsatzdauer des festphasengebundenen Enzyms begrenzt ist.

Zur Zeit sind nur wenige spezielle Verfahren zur kovalenten Trägerfixierung der Acylase oder ihre Einschluß in ein polymeres Netzwerk bekannt, die ein hochaktives immobilisiertes Enzym liefern (T. Sato, T. Mori, T. Tosa, I. Chibata; Arch. Bio-chem. Biophysics 147, 738 (1971), T. Barth, H. Maskova; Collection Czechoslov. Chem. Commun. 36, 2398 (1971), T. Mori, T. Sato, T. Tosa, I. Chibata; Enzymol. 43 213 (1972), H. Maäkova, T. Barth, B. Jirovsky, I. Rychlik; Collection Czechoslov. Chem. Commun. 38, 943 (1973), H. H. Weetall, C. C. Detar; Biotechn. Bioengeneering 16, 1537 (1974)). Nach einigen routinemäßig zur Immobilisierung von Enzymen benutzten Verfahren gelang es überhaupt nicht, Aminoacylase in nennenswerter Aktivität an einen Träger zu binden (T. Sato, T. Mori, T. Tosa, I. Chibata; Arch. Biochem. Biophysics 147, 788 (1971), Ch. Flemming, A. Gabert, P. Roth, H. Wand; Actabiol. med. german. 31, 449 (1973), Ch. Flemming, A. Gabert, H. Wand; Acta biol. med. german. 32, 135 (1974). Es war nicht möglich, die gut eingeführte Methode der Fixierung an Bromcyan-aktivierte polymere Kohlenhydrate, die als Träger gute Gebrauchseigenschaften für immobilisierte Enzyme gewährleisten, erfolgreich zu gestalten.

Zweck der Erfindung ist die Gewinnung optisch aktiver α-Aminosäuren durch Spaltung von chemisch synthetisierten Racematen nach einem einheitlichen ökonomischen Verfahren, das sowohl im Laboratoriumsmaßstab ohne größeren Aufwand und Schwierigkeiten durchführbar ist, als auch die Möglichkeit einer großtechnischen Anwendung beinhaltet.

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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem Aminoacylase tierischer oder pflanzlicher Herkunft nach einer einfach durchführbaren Methode kovalent mit hoher enzymatischer Aktivität an einen wasserunlöslichen Träger gebunden wird und zur Racematspaltung von N-Acyl-Derivaten von D,L-Aminosäuren eingesetzt werden kann. Erfindungsgeraäß werden Enzyme, die folgende Reaktion katalysieren:

Na-Acyl-D,L-Aminosäure + H₂O —» L-a-Arainosäure + Acyl-OH + Na-Acyl-D-Aminosäure

aus biologischem Material soweit angereichert, bis störende Fremdaktivitäten abgetrennt sind. Die Enzympräparation wird nach bekannten Verfahren kovalent an Bromcyan-aktivierten polymeren Kohlenhydratträger (z.B. Agarose) gebunden, wobei jedoch das Enzym in Gegenwart einer geeigneten Konzentration eines Substrates an den Träger gekuppelt wird. Hierbei zeigt sich, daß ein Substrat der L-Konfiguration wirksamer ist als ein racemisches Substrat oder eine Verbindung, die anstelle der L-Aminosäure im Substrat die entsprechende D-Aminosäure enthält. Auf diese Weise wird die Aktivität der immobilisierten Aminoacylase gegenüber einem Standardkupplungsansatz ohne Anwesenheit eines geeigneten Substrates um das Mehrfache erhöht. Das erhaltene Enzymgel wird mit einer Lösung der Na-Acyl-D,L-Aminosäuren, die zusätzlich radioaktiv oder Stabilisotop markiert sein können,- im batch- oder Säulenverfahren zur Reaktion gebracht. Die Reaktionslösung wird nach Abtrennung vom aktiven trägergebundenen Enzym zur Isolisierung der gewünschten L-Aminosäure nach bekannten Verfahren aufgearbeitet. Die abgetrennte Na-Acyl-D-Aminosäure wird chemisch hydrolysiert und anschließend in bekannter Weise die D-Aminosäure isoliert. Durch die erfindungsgemäße Lösung ist iaan in der Lage, Aminoacylase mit hoher Aktivitätsausbeute kovalent an den für viele Zwecke der Immobilisierung routinemäßig leicht herstellbaren Bromcyan-aktivierten Kohlenhydratträger zu binden. Da die breite Substratspezifität der Aminoacylase durch diese Art der Immobilisierung nicht eingeschränkt worden ist, kann eine ganze Reihe von optisch aktiven α-Aminosäuren (sowohl proteinogene als auch nichtproteinogene und nichtnatürliche α-Aminosäuren)

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aus den Να-Acy!.derivaten der Raceraate insbesondere beim Säulenverfahren in vorteilhafter Prozeßführung und hoher Ausbeute gewonnen werden. Dabei kann wegen der hohen Stabilität am Träger das immobilisierte Enzym mehrfach und über einen längeren Zeitraum eingesetzt werden. Das wenig aufwendige Immobilisierungsverfahren erlaubt eine kurzfristige Präparation, die lange Lagerfähigkeit des trägerfixierten Enzyms im Kühlschrank und der nur langsame Aktivitätsabfall während des Säulenbetriebes erlauben eine universelle Verwendung zur Racematspaltung. Beim Säulenverfahren kann durch geeignete Durchlaufgeschwindigkeit oder mehrfaches Filtrieren der Reaktionslösung über die Aminoacylasesäule auch bei Na-Acy!aminosäuren, die mit geringer Geschwindigkeit hydrolysiert werden, eine vollständige Spaltung der Racemate erreicht werden.

Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Als Enzymquelle dient z.B. Schweineniere. Aus einem Homogenat wird nach bekannten Verfahren (S. M. Birnbaum, L. Levintow, R. B. Kingsley, J. P. Greenstein; J. Biol. Chemistry 194, 455 (1952)) die Aminoacylaseaktivität angereichert und durch Lyophilisation ein Trockenpulver hergestellt, das im Kühlschrank mehrere Jahre aktiv bleibt. Zur Immobilisierung wird diese Präparation in 0,1 molarem Phosphatpuffer, pH-Wert 7 bis 8 gelöst und in Gegenwart bestimmter Konzentrationen (z.B. 10"**' bis 10~³ molar) einer geeigneten Na-Acylaminosäure (z.B. Chloracetyl-L-leucin) mit dem nach üblichem Verfahren (R. Axen, J. Porath, S. Ernback; Nature 214, 1302 (1967)) Bromcyan-aktivierten Träger (z.B. Sepharose-4B ^& ) versetzt und eine geeignete Zeit zur Kupplung im Kühlschrank belassen. Anschließend wird das Enzymgel mit einer Reihe von Puffern verschiedener Ionenstärke und pH-Wert gewaschen und in Phosphatpuffer von neutralem pH-Wert unter Zusatz von Konservierungsmitteln suspendiert. Das immobilisierte Enzym enthält die Hauptmenge der zur Kupplung eingesetzten Aminoacylaseaktivität. Die immobilisierte Aminoacylase wird in eine geeignet dimensionierte temperierbare Säule gefüllt. Eine Lösung von Chloracetyl-D,L-leucin optimaler Konzentration, die auf einen pH-Wert von 7 bis 9 eingestellt wurde, läßt man bei einer Temperatur zwischen 35 und 60 oq mit

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einer bestimmten Geschwindigkeit, die durch die kinetischen Parameter der Substratspaltung bedingt ist, durch die Säule fließen. Das Eluat enthält L-Leucin, Chloracetat und Chloracetyl-D-Leucin und wird nach bekannten Ionenaustauscherprozeduren wie folgt aufgearbeitet: Das Eluat wird über einen stark sauren Kationenaustauscher in der H+-Forra filtriert, wobei die Aminosäure gebunden wird und die sauren Bestandteile, Chloressigsäure und Chloracetyl-D-leucin im Eluat erscheinen.

Die Aminosäure wird anschließend mit 1-molar wäßrigem Ammoniak eluiert und aus dem Konzentrationsrückstand in reiner Form kristallisiert. Wurde die Prozeßführung so gehalten, daß eine vollständige Spaltung von Chloracetyl-L-leucin erfolgt ist, läßt sich aus dem wie oben beschriebenen abgetrennten Cloracetyl· D-leucin nach Hydrolyse und bekannter Aufarbeitung D-Leucin gewinnen.

Claims (3)

189454 Erfindungsanspruch

1. Verfahren zur Gewinnung von optisch aktiven L-oc-Aminosäuren und D-<x -Aminosäuren durch Racematspaltung der Acylderivate entsprechender D,L-α-Aminosäuren mittels enzymatischer Katalyse unter Verwendung immobilisierter Aminoac.ylase gekennzeichnet dadurch, daß die Aminoacylase in Gegenwart eines Substrats der allgemeinen Formel I :

0 R¹
И (

I R-C-KH-GH-COOH

in der R=H oder Niedrigalkyl oder Halogenalkyl und R¹ die Seitenkette einer natürlichen Aminosäure bedeuten können, das in einer Konzentration zwischen 10" bis 10 molar vorlag, !covalent an den Träger gebunden wurde.

2. Verfahren nach Anspruch 1., gekennzeichnet dadurch, daß ein Broracyan-aktiviertes polymeres Kohlenhydrat als Träger verwendet wird.

3· Verfahren nach Anspruch 1., gekennzeichnet dadurch, daß es sich bei Substraten der allgemeinen Formel I um Acylderivate von L-с* -Aminosäuren handelt, die durch Aminoacylase selbst gespalten werden können.