DD123188B1 - Process for obtaining optically active α-amino acids from racemates - Google Patents
Process for obtaining optically active α-amino acids from racematesInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung optisch aktiver α-Aminosäuren durch Racematspaltung chemisch synthetisierter D,L-Aminosäuregemische.The invention relates to a method for obtaining optically active α-amino acids by resolution of chemically synthesized D, L-amino acid mixtures.
Aminosäuren der L-Konfiguration sind Zwischenprodukte des tierischen und pflanzlichen Stoffwachseis sowie Bausteine natürlich vorkommender Einweiflstoffe und physiologisch wichtiger Verbindungen. D-Aminosäuren sind z.B. Bestandteile von Antibiotika. Proteinogene und nichtproteinogene optisch aktive Aminosäuren werden deshalb in der pharmazeutischen Industrie, der der biochemischen Forschung, der Medizin und in anderen Bereichen in größeren Mengen ständig benötigt. Zur Gewinnung von L-Aminosäuren sind drei allgemeine Verfahrensrichtungen bekannt. Die erste Richtung bedient sich der Isolierung aus biologischem Material, wenn eine Aminosäure in einzelnen Proteinen in großer Menge vorkommt. Die zweite Richtung benutzt die Eigenschaft gewisser Mikroorganismen zur Produktion bestimmter L-Aminosäuren. Die dritte Richtung bedient sich der chemischen Synthese racemischer Gemische von Aminosäuren und anschließender Racematspaltung in L- und D-Aminosäuren. Die Verfahren der Racematspaltung umfassen physikalischchemische, chemische und biochemische Methoden (J.P. Greenstein, M. Winitz; Chemistry of the amino acids: J. Wiley & Sons Inc. Hew York/London 1961, VoI I-III) . Die letzteren bedienen sich zunehmend stereospezifisch wirkender Enzyme, die aus tierischem oder pflanzlichem Material isloiert werden. Sie werden entweder in Lösung oder an einem festen wasserunlöslichen Träger gebunden im batch- oder Säulenverfahren eingesetzt. Dabei wirken diese Enzyme auf geeignete Derivate des Aminosäuregemisches. Die L-Verbindungen (oder gelegentlich auch D-Verbindungen) dienen dabei als Substrate. Als Enzyme sind z.B. eingesetzt worden: L-Aminosäureoxydase, D-Aminosäureoxydase, Leucinaminopeptidase, Trypsin, Chymotrypsin, Papain u.a.Amino acids of the L-configuration are intermediates of the animal and vegetable substance waxes as well as building blocks of naturally occurring einweiflstoffe and physiologically important compounds. D-amino acids are e.g. Ingredients of antibiotics. Proteinogenic and nonproteinogenic optically active amino acids are therefore constantly needed in large quantities in the pharmaceutical industry, biochemical research, medicine and other fields. To obtain L-amino acids, three general directions of the method are known. The first direction uses isolation from biological material when an amino acid occurs abundantly in individual proteins. The second direction uses the property of certain microorganisms to produce certain L-amino acids. The third direction involves the chemical synthesis of racemic mixtures of amino acids and subsequent resolution in L and D amino acids. The methods of resolution include physicochemical, chemical and biochemical methods (J.P. Greenstein, M. Winitz, Chemistry of the Amino Acids: J. Wiley & Sons Inc. Hew York / London 1961, VoI I-III). The latter increasingly use stereospecific enzymes that are isolated from animal or plant material. They are used either in solution or bound to a solid water-insoluble carrier in a batch or column process. These enzymes act on suitable derivatives of the amino acid mixture. The L compounds (or occasionally D compounds) serve as substrates. As enzymes are e.g. L-amino acid oxidase, D-amino acid oxidase, leucine aminopeptidase, trypsin, chymotrypsin, papain and the like have been used.
Wegen breiter Substratspezifität bei strenger Stereoelektivität und hoher Substratumsatzgeschwindigkeit hat sich Aminoacyiase E.C. 3.5.1.14 zur Spaltung von Na-Acyl-D,L-Aminosäuren als besonders geeignet erwiesen. Der Vorteil immobilisierter Enzyme ist ihre leichte Abtrennbarkeit aus dem Reaktionsansatz und damit ihreBecause of broad substrate specificity with strict stereochemical selectivity and high substrate turnover rate, aminoacyiase E.C. 3.5.1.14 proved to be particularly suitable for the cleavage of Na-acyl-D, L-amino acids. The advantage of immobilized enzymes is their easy separability from the reaction mixture and thus their
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Wiederverwendbarkeit und ihr Einsatz in batch- und Säulenreaktoren, ihre relativ hohe TemperatürStabilität sowie ihre erhöhte Resistenz gegenüber inaktivierenden Agentien. Hochaktive immobilisierte Acylase wird durch adsorptive bzw. ionogene Bindung an Ionenaustauscher erhalten (T. Tosa, T. Mori, N. Fuse, I. Chibata: Enzymol. 31, 214 (1966); Enzymol. 32, 153 (1967); Agr. Biol. Chem. 33, 1047 (1969)). Der Nachteil dieser Art Immobilisierung besteht darin, daß die Enzymaktivität durch Substrat- und Pufferlösung allmählich eluiert wird und damit die Einsatzdauer des festphasengebundenen Enzyms begrenzt ist.Reusability and use in batch and column reactors, their relatively high temperature stability as well as their increased resistance to inactivating agents. Highly active immobilized acylase is obtained by adsorptive or ionogenic binding to ion exchangers (T. Tosa, T. Mori, N. Fuse, I. Chibata: Enzymol., 31, 214 (1966); Enzymol., 32, 153 (1967); Biol. Chem. 33, 1047 (1969)). The disadvantage of this type of immobilization is that the enzyme activity is gradually eluted by substrate and buffer solution, thus limiting the useful life of the solid phase-bound enzyme.
Zur Zeit sind nur wenige spezielle Verfahren zur kovalenten Trägerfixierung der Acylase oder ihre Einschluß in ein polymeres Netzwerk bekannt, die ein hochaktives immobilisiertes Enzym liefern (T. Sato, T. Mori, T. Tosa, I. Chibata; Arch. Bio-chem. Biophysics 147, 738 (1971), T. Barth, H. Maskova; Collection Czechoslov. Chem. Commun. 36, 2398 (1971), T. Mori, T. Sato, T. Tosa, I. Chibata; Enzymol. 43 213 (1972), H. Maäkova, T. Barth, B. Jirovsky, I. Rychlik; Collection Czechoslov. Chem. Commun. 38, 943 (1973), H. H. Weetall, C. C. Detar; Biotechn. Bioengeneering 16, 1537 (1974)). Nach einigen routinemäßig zur Immobilisierung von Enzymen benutzten Verfahren gelang es überhaupt nicht, Aminoacylase in nennenswerter Aktivität an einen Träger zu binden (T. Sato, T. Mori, T. Tosa, I. Chibata; Arch. Biochem. Biophysics 147, 788 (1971), Ch. Flemming, A. Gabert, P. Roth, H. Wand; Actabiol. med. german. 31, 449 (1973), Ch. Flemming, A. Gabert, H. Wand; Acta biol. med. german. 32, 135 (1974). Es war nicht möglich, die gut eingeführte Methode der Fixierung an Bromcyan-aktivierte polymere Kohlenhydrate, die als Träger gute Gebrauchseigenschaften für immobilisierte Enzyme gewährleisten, erfolgreich zu gestalten.At present, only a few specific methods for the covalent support fixation of the acylase or their inclusion in a polymeric network are known which provide a highly active immobilized enzyme (T. Sato, T. Mori, T. Tosa, I. Chibata, Arch. Bio-chem. Biophysics 147, 738 (1971), T. Barth, H. Maskova, Collection Czechoslov, Chem., Commun., 36, 2398 (1971), T. Mori, T. Sato, T. Tosa, I. Chibata, Enzymol., 43, 213 (1972), H. Maekova, T. Barth, B. Jirovsky, I. Rychlik, Collection Czechoslov, Chem., Commun., 38, 943 (1973), HH Weetall, CC Detar; Biotechn. Bioengeneering 16, 1537 (1974)) , According to some methods routinely used for the immobilization of enzymes, it has not been possible at all to bind aminoacylase in any appreciable activity to a support (T. Sato, T. Mori, T. Tosa, I. Chibata, Arch. Biochem., Biophysics 147, 788 (1971 Flemming, A. Gabert, P. Roth, H. Wall, Actabiol, German, 31, 449 (1973), Ch. Flemming, A. Gabert, H. Wand, Acta biol. 32, 135 (1974) It has not been possible to make the well-established method of fixation to cyanogen bromide-activated polymeric carbohydrates, which as carriers provide good performance properties for immobilized enzymes, successful.
Zweck der Erfindung ist die Gewinnung optisch aktiver α-Aminosäuren durch Spaltung von chemisch synthetisierten Racematen nach einem einheitlichen ökonomischen Verfahren, das sowohl im Laboratoriumsmaßstab ohne größeren Aufwand und Schwierigkeiten durchführbar ist, als auch die Möglichkeit einer großtechnischen Anwendung beinhaltet.The purpose of the invention is the production of optically active α-amino acids by cleavage of chemically synthesized racemates according to a uniform economic method that is feasible both on a laboratory scale without much effort and difficulty, as well as the possibility of large-scale application includes.
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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem Aminoacylase tierischer oder pflanzlicher Herkunft nach einer einfach durchführbaren Methode kovalent mit hoher enzymatischer Aktivität an einen wasserunlöslichen Träger gebunden wird und zur Racematspaltung von N-Acyl-Derivaten von D,L-Aminosäuren eingesetzt werden kann. Erfindungsgeraäß werden Enzyme, die folgende Reaktion katalysieren:The invention has for its object to develop a method in which aminoacylase of animal or vegetable origin is covalently bound by a simple method with high enzymatic activity to a water-insoluble carrier and the resolution of N-acyl derivatives of D, L-amino acids can be used. Erfindungsgeraäß be enzymes that catalyze the following reaction:
Na-Acyl-D,L-Aminosäure + H2O —» L-a-Arainosäure + Acyl-OH + Na-Acyl-D-AminosäureNa-acyl-D, L-amino acid + H 2 O - »La-araic acid + acyl-OH + Na-acyl-D-amino acid
aus biologischem Material soweit angereichert, bis störende Fremdaktivitäten abgetrennt sind. Die Enzympräparation wird nach bekannten Verfahren kovalent an Bromcyan-aktivierten polymeren Kohlenhydratträger (z.B. Agarose) gebunden, wobei jedoch das Enzym in Gegenwart einer geeigneten Konzentration eines Substrates an den Träger gekuppelt wird. Hierbei zeigt sich, daß ein Substrat der L-Konfiguration wirksamer ist als ein racemisches Substrat oder eine Verbindung, die anstelle der L-Aminosäure im Substrat die entsprechende D-Aminosäure enthält. Auf diese Weise wird die Aktivität der immobilisierten Aminoacylase gegenüber einem Standardkupplungsansatz ohne Anwesenheit eines geeigneten Substrates um das Mehrfache erhöht. Das erhaltene Enzymgel wird mit einer Lösung der Na-Acyl-D,L-Aminosäuren, die zusätzlich radioaktiv oder Stabilisotop markiert sein können,- im batch- oder Säulenverfahren zur Reaktion gebracht. Die Reaktionslösung wird nach Abtrennung vom aktiven trägergebundenen Enzym zur Isolisierung der gewünschten L-Aminosäure nach bekannten Verfahren aufgearbeitet. Die abgetrennte Na-Acyl-D-Aminosäure wird chemisch hydrolysiert und anschließend in bekannter Weise die D-Aminosäure isoliert. Durch die erfindungsgemäße Lösung ist iaan in der Lage, Aminoacylase mit hoher Aktivitätsausbeute kovalent an den für viele Zwecke der Immobilisierung routinemäßig leicht herstellbaren Bromcyan-aktivierten Kohlenhydratträger zu binden. Da die breite Substratspezifität der Aminoacylase durch diese Art der Immobilisierung nicht eingeschränkt worden ist, kann eine ganze Reihe von optisch aktiven α-Aminosäuren (sowohl proteinogene als auch nichtproteinogene und nichtnatürliche α-Aminosäuren)from biological material enriched until disturbing foreign activities are separated. The enzyme preparation is covalently bound to cyanogen bromide activated polymeric carbohydrate supports (eg, agarose) by known methods, but the enzyme is coupled to the support in the presence of a suitable concentration of a substrate. This shows that a substrate of the L-configuration is more effective than a racemic substrate or a compound containing the corresponding D-amino acid instead of the L-amino acid in the substrate. In this way, the activity of the immobilized aminoacylase is increased many times over a standard coupling approach without the presence of a suitable substrate. The resulting enzyme gel is reacted with a solution of the Na-acyl-D, L-amino acids, which may additionally be radioactively or stabilisotop labeled, in a batch or column process. The reaction solution is worked up after separation from the active carrier-bound enzyme to isolate the desired L-amino acid by known methods. The separated Na-acyl-D-amino acid is chemically hydrolyzed and then isolated in a known manner, the D-amino acid. By means of the solution according to the invention, iaan is able to covalently bind aminoacylase with high activity yield to the cyanogen bromide-activated carbohydrate carrier which is routinely easy to prepare for many purposes of immobilization. Since the broad substrate specificity of the aminoacylase has not been limited by this type of immobilization, a whole series of optically active α-amino acids (both proteinogenic and non-proteinogenic and unnatural α-amino acids) can be used.
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aus den Να-Acy!.derivaten der Raceraate insbesondere beim Säulenverfahren in vorteilhafter Prozeßführung und hoher Ausbeute gewonnen werden. Dabei kann wegen der hohen Stabilität am Träger das immobilisierte Enzym mehrfach und über einen längeren Zeitraum eingesetzt werden. Das wenig aufwendige Immobilisierungsverfahren erlaubt eine kurzfristige Präparation, die lange Lagerfähigkeit des trägerfixierten Enzyms im Kühlschrank und der nur langsame Aktivitätsabfall während des Säulenbetriebes erlauben eine universelle Verwendung zur Racematspaltung. Beim Säulenverfahren kann durch geeignete Durchlaufgeschwindigkeit oder mehrfaches Filtrieren der Reaktionslösung über die Aminoacylasesäule auch bei Na-Acy!aminosäuren, die mit geringer Geschwindigkeit hydrolysiert werden, eine vollständige Spaltung der Racemate erreicht werden.be obtained from the Να-Acy!. derivatives of Raceraate in particular in the column method in advantageous process control and high yield. In this case, because of the high stability on the carrier, the immobilized enzyme can be used several times and over a longer period of time. The low-cost immobilization allows a short-term preparation, the long shelf life of the carrier-fixed enzyme in the refrigerator and the slow drop in activity during column operation allow universal use for racemate resolution. In the column method can be achieved by suitable flow rate or multiple filtration of the reaction solution via the Aminoacylasesäule also Na-Acy! Amino acids, which are hydrolyzed at low speed, a complete cleavage of the racemates.
Die Erfindung soll nachstehend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.The invention will be explained in more detail below using an exemplary embodiment.
Als Enzymquelle dient z.B. Schweineniere. Aus einem Homogenat wird nach bekannten Verfahren (S. M. Birnbaum, L. Levintow, R. B. Kingsley, J. P. Greenstein; J. Biol. Chemistry 194, 455 (1952)) die Aminoacylaseaktivität angereichert und durch Lyophilisation ein Trockenpulver hergestellt, das im Kühlschrank mehrere Jahre aktiv bleibt. Zur Immobilisierung wird diese Präparation in 0,1 molarem Phosphatpuffer, pH-Wert 7 bis 8 gelöst und in Gegenwart bestimmter Konzentrationen (z.B. 10"**' bis 10~3 molar) einer geeigneten Na-Acylaminosäure (z.B. Chloracetyl-L-leucin) mit dem nach üblichem Verfahren (R. Axen, J. Porath, S. Ernback; Nature 214, 1302 (1967)) Bromcyan-aktivierten Träger (z.B. Sepharose-4B & ) versetzt und eine geeignete Zeit zur Kupplung im Kühlschrank belassen. Anschließend wird das Enzymgel mit einer Reihe von Puffern verschiedener Ionenstärke und pH-Wert gewaschen und in Phosphatpuffer von neutralem pH-Wert unter Zusatz von Konservierungsmitteln suspendiert. Das immobilisierte Enzym enthält die Hauptmenge der zur Kupplung eingesetzten Aminoacylaseaktivität. Die immobilisierte Aminoacylase wird in eine geeignet dimensionierte temperierbare Säule gefüllt. Eine Lösung von Chloracetyl-D,L-leucin optimaler Konzentration, die auf einen pH-Wert von 7 bis 9 eingestellt wurde, läßt man bei einer Temperatur zwischen 35 und 60 oq mitThe enzyme source used is, for example, pig kidney. From a homogenate, aminoacylase activity is enriched by known methods (SM Birnbaum, L. Levintow, RB Kingsley, JP Greenstein, J. Biol. Chemistry 194, 455 (1952)), and a dry powder is prepared by lyophilization which remains active in the refrigerator for several years , For immobilization, this preparation is dissolved in 0.1 molar phosphate buffer, pH 7 to 8 and in the presence of certain concentrations (for example 10 "... To 10 -3 molar) of a suitable Na-acylamino acid (eg chloroacetyl-L-leucine). cyanogen bromide activated carrier (eg Sepharose-4B & ) by the usual method (R. Axen, J. Porath, S. Ernback, Nature 214, 1302 (1967)) and allowing a suitable time for coupling in the refrigerator The enzyme gel is washed with a series of buffers of different ionic strength and pH and suspended in phosphate buffer of neutral pH with the addition of preservatives The immobilized enzyme contains the majority of the aminoacylase activity used for coupling The immobilized aminoacylase is transformed into a suitably sized temperature-controllable column A solution of chloroacetyl-D, L-leucine of optimum concentration, adjusted to a pH of 7 to 9, is left at a temperature between 35 and 60 oq
1 89 4541 89 454
einer bestimmten Geschwindigkeit, die durch die kinetischen Parameter der Substratspaltung bedingt ist, durch die Säule fließen. Das Eluat enthält L-Leucin, Chloracetat und Chloracetyl-D-Leucin und wird nach bekannten Ionenaustauscherprozeduren wie folgt aufgearbeitet: Das Eluat wird über einen stark sauren Kationenaustauscher in der H+-Forra filtriert, wobei die Aminosäure gebunden wird und die sauren Bestandteile, Chloressigsäure und Chloracetyl-D-leucin im Eluat erscheinen.flow through the column at a certain rate due to the kinetic parameters of substrate cleavage. The eluate contains L-leucine, chloroacetate and chloroacetyl-D-leucine and is worked up according to known ion exchange procedures as follows: The eluate is filtered through a strongly acidic cation exchanger in the H + -forra to bind the amino acid and the acidic components, chloroacetic acid and Chloroacetyl-D-leucine appear in the eluate.
Die Aminosäure wird anschließend mit 1-molar wäßrigem Ammoniak eluiert und aus dem Konzentrationsrückstand in reiner Form kristallisiert. Wurde die Prozeßführung so gehalten, daß eine vollständige Spaltung von Chloracetyl-L-leucin erfolgt ist, läßt sich aus dem wie oben beschriebenen abgetrennten Cloracetyl· D-leucin nach Hydrolyse und bekannter Aufarbeitung D-Leucin gewinnen.The amino acid is then eluted with 1 molar aqueous ammonia and crystallized from the concentration residue in pure form. Was the process control held so that a complete cleavage of chloroacetyl-L-leucine is carried out, can be obtained from the separated as described above Cloracetyl · D-leucine after hydrolysis and known workup D-leucine.
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