CZ9900770A3 - Způsob přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin a souprava pro tuto přípravu - Google Patents

Způsob přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin a souprava pro tuto přípravu Download PDF

Info

Publication number
CZ9900770A3
CZ9900770A3 CZ1999770A CZ77099A CZ9900770A3 CZ 9900770 A3 CZ9900770 A3 CZ 9900770A3 CZ 1999770 A CZ1999770 A CZ 1999770A CZ 77099 A CZ77099 A CZ 77099A CZ 9900770 A3 CZ9900770 A3 CZ 9900770A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
amino acids
water
ion exchanger
analysis
kit
Prior art date
Application number
CZ1999770A
Other languages
English (en)
Inventor
Petr Ing. Drsc. Hušek
Original Assignee
Petr Ing. Drsc. Hušek
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Petr Ing. Drsc. Hušek filed Critical Petr Ing. Drsc. Hušek
Priority to CZ1999770A priority Critical patent/CZ9900770A3/cs
Priority to JP2000060532A priority patent/JP2000310626A/ja
Priority to EP00104786A priority patent/EP1033576A3/en
Publication of CZ9900770A3 publication Critical patent/CZ9900770A3/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)

Description

Způsob přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin a souprava pro tuto přípravu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu velmi rychlé přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin v přírodních materiálech, zejména v tělních tekutinách, plynovou chromatografií a soupravy činidel a pomůcek vhodných pro tuto přípravu.
Dosavadní stav techniky
Stanovení jednotlivých členů řady dvaceti proteinových aminokyselin stálo v popředí zájmu analytiků druhé poloviny dvacátého století a zájem o stále lepší, rychlou a účinnou metodu nepolevuje ani v současnosti.
Používané metody tohoto stanovení souvisejí s chronologií dostupných technik. Na počátku padesátých let to byla chromatografie nativních aminokyselin na iontoměničích, kdy byly aminokyseliny po separaci vystaveny působení ninhydrinu a detekovány fotometricky. Tento postup byl brzy automatizován a automatizován'© analyzátory aminokyselin (AAA) jsou na trhu nabízeny již téměř půl století. Pro zvýšení citlivosti stanovení je možno použít namísto ninhydrinu například fluorescein nebo o-ftalaldehyd a detekovat fluorometrií, což zvyšuje dolní mez stanovitelnosti o 2 až 3 řády. Toto použití jednoúčelových analyzátorů aminokyselin je ještě i dnes časté a populární, protože je dostatečně robustní a vhodné zejména pro stanovení fyziologických aminokyselin (pochopitelně po deproteinaci séra či plasmy). Podstatnou nevýhodou této metody je doba trváni jedné analýzy, která se pohybuje okolo 3 hodin.
Jako alternativní přístup dominovala v Šedesátých a sedmdesátých letech rychle se rozvíjející technika plynové «· · » · · f · · · »
B * »··· · · · ♦ · »· t «
-2·· *· • · · · · » · · · · • · ··· ♦ ·· » · · k ·· ·· chromatografie a od osmdesátých let až dodnes separačně účinnější varianta, kapilární chromatografie, která umožňuje analyzovat profil aminokyselin v řádu minut, zpravidla do 20 minut. Výraznou předností této metody je i její vysoká citlivost, která se při použití universálního detektoru pohybuje v oblasti pikomolů, při použití selektivních detektorů pak v oblasti ještě o 2 až 3 řády nižší. Analýza pomocí plynové chromatografie vyžaduje vždy provedení derivatizace, tj . přeměny molekuly na neiontovou těkavou formu odpařitelnou v horkém nástřiku přístroje. V průběhu tří dekád byly publikovány stovky postupů, jak směs proteinových aminokyselin účinně chemicky modifikovat. Vesměs se vždy vycházelo z bezvodého prostředí (suchého odparku), používala se kombinace více reaktivních činidel v oddělených krocích a reakční smés bylo nutno zahřívat, často dokonce nad 100 universální silylační činidla se tohoto druhu příliš neosvědčila a proto byla opuštěna. Pracné a zdlouhavé derivatizace aminokyselin byly největší nevýhodou stanovení aminokyselin pomocí plynové chromatografie.
Před deseti lety objevil původce tohoto vynálezu reakční podmínky, za kterých je možno použít jako univerzální derivatizační činidla estery kyseliny chlormravenčí, které jsou současně s alkylací aminoskupin a fenolických skupin schopny esterifikovat i karboxyl. Reakce nevyžadovala bezvodé prostředí, nutná však byla přítomnost pyridinu a alkoholu odpovídajícího alkoholickému zbytku shora uvedeného esteru. Vlastní derivatizace se pak z časového hlediska stala časově zanedbatelnou záležitostí.
Problémem ovšem stále zůstává pokud možno jednoduchá a časově nenáročná deproteinizace výchozího materiálu, bez které nelze, úspěšné stanovení chromatografickými technikami uskutečnit.
pak její plynová °C. Dnes nejpopulárnější pro chemickou modifikaci
S nástupem vysoceúčinné kapalinové chromatografie
-300 0000
0 • 00 00 • 0 0 0 «0 · 0000 0 0 0
0· 0 0 0 0
0 00 ·*
0 0 0 0
0 0 0 ·
0 000 000 0 · · 00 0· ♦· (HPLC) v sedmdesátých létech se zájem analytiků přesunul do této oblasti. Zjednodušené představy o snadné separaci a UV-detekci nativních aminokyselin se však nenaplnily. Pro detekci se po čase osvědčil zejména detektor fluorimetrický a elektrochemický a protože aminokyseliny v nativní formě nefluoreskují (s výjimkou tryptofanu) ani nejsou elektropozitivní, je třeba jejich molekuly rovněž chemicky modifikovat, tj. vhodným činidlem (reakcí) vnést do jejich molekuly příslušný fluoro- Či elektrofor. V zásadě je možno chemickou modifikaci provést před separací aminokyselin nebo po separaci. V prvém případě se separují již derivatizované formy, ve druhém případě pak nativní aminokyseliny, které se pak na výstupu z kolony derivatizují rychle reagujícími činidly. Z technických důvodů se používá zejména předseparačni modifikace a separace se provádí na náplňových kolonách s oktadecyl-modifikovaným silikagelem za použití gradientově eluce. V takovýchto případech trvá analýza profilu proteinových aminokyselin ve většině případů kolem 60 minut, což je doba značně delší než při stanovení plynovou chromatografií. Pro tento způsob stanovení jsou k dispozici i komerčně dostupné plně automatizované systémy od předních světových výrobců (Waters, HP, Varian, Merck apod.).
Určité přednosti techniky HPLC zmíněné výše se ovšem mohou projevit pouze v případě nefyziologických vzorků, protože při stanoveních fyziologických aminokyselin v tělních tekutinách (například v plazmě) je naprosto nezbytná deproteinizace vzorku. Jakékoli zbytkové proteiny totiž mohou způsobit ucpání analytické kolony v separačním procesu, který probíhá za vysokých tlaků.
Další problémy souvisejí s volbou derivatizačních činidel při použití techniky HPLC. K dispozici je řada různých derivatizačních činidel a desítky derivatizačních postupů. Většinu derivatizací je sice možno provádět ve vodném prostředí a i vlastní derivatizace je velmi rychlá a
-4fefe fefefefe fefe · • · · · · • fefefe fefe • · fefefe* * · fe fefe fe · · · fefe « fefe • fe fefe fe fefefefe fe fefefe* • · fefefe fefefe • · fe fe fefe fefe pohybuje se obvykle v řádu několika minut, nevýhodou je ovšem značná labilita derivatizovaných forem při použití některých činidel, skutečnost, že některá činidla nereagují se všemi aminokyselinami, technické problémy spojené s nutností odstranit v některých případech všechny stopy použitého činidla před vlastním stanovením apod. Toto vše je popsáno v desítkách publikací a bližší diskuse o tomto problému se vymyká z rámce popisu dosavadního stavu techniky.
Pro úplnost je. třeba se ještě zmínit o technice elektroforézy v kapiláře, na níž se soustředil zájem v devadesátých letech. V oblasti analýzy celého spektra proteinových aminokyselin je to však spíše módní záležitost a publikované postupy dosud zpravidla nejdou za rámec pokusů separace chemických standardů. Své uplatnění a atraktivitu nachází tato metoda v současné době zejména v oblasti analýzy biopolymerů, proteinů a oligo-nukleotidů, její další rozvoj, a to i v oblasti stanovení profilu aminokyselin v různých druzích materiálu, je však možno očekávat.
Jak vyplývá z předchozího popisu dosavadního stavu techniky, nejsou nevýhody spojené s aplikací modernějších analytických metod, konkrétně plynové chromatografie a vysokotlaké kapalinové chromatografie, spojeny s vlastním stanovením, ale spíše s přípravou vzorku pro toto stanovení. Výsledkem je, že derivatizačně náročné postupy, které až dosud vesměs vyžadovala plynová chromatografie, a naopak separačně a detekčně problematická stanovení pomocí HPLC nepředstavují žádoucí alternativy, takže mnohá pracoviště si ponechávají v záloze a někdy dávají i předost zastaralé a pomalé metodě AAA.
Podstata vynálezu
Shora zmíněné nevýhody řeší způsob podle vynálezu, konkrétně způsob přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin v
-5AA AAAA ·· A • · • · A A • ·AAAA • · » ♦ · A • A ·
A A ·
AAA A • · A ♦ • A ·· • A AA • A A A • A A · A AAA AAA
A A • A AA přírodních materiálech, zejména v tělních tekutinách, plynovou chromatografií, spočívající v tom, že se výchozí materiál aplikuje na sloupec iontoměniče stálého v alkalickém prostředí, sloupec se promyje směsí vody a rozpouštědla mísitelného s vodou, zachycené aminokyseliny se vytěsní promytím sloupce níže definovanou eluční/reakční směsí, aminokyseliny obsažené v eluátu se derivatizují přidáním alkyl-chlorformiátu s 1 - 4 atomy uhlíku v alkylové skupině, reakční směs se vytřepe rozpouštědlem nemísitelným s vodou a organická fáze se, po případném promytí zředěnou kyselinou, s výhodou kyselinou chlorovodíkovou, používá k nástřiku do chromátografického přístroje.
Podstatným znakem způsobu podle vynálezu je možnost vyhnout se nutnosti provádění deproteinace a odpařování eluátu před vlastní derivatizací, tedy bez dvou kroků, které stanovení podstatně prodlužovaly a prakticky znemožňovaly jeho automatizaci. Při práci způsobem podle vynálezu totiž proteiny obsažené ve výchozím materiálu sloupečkem iontoměniče z větší části bud’ přímo protečou při nanášení materiálu na iontoměnič nebo jsou ze sloupečku vymyty při následujícím promývání. Odpařování eluátu není nutno provádět vůbec.
Při prověřování jinak standardně prováděné deproteinace bylo zjištěno, že nej lepších výsledků při současně nej jednodušším provedení se dosahuje v případě, že se materiál, například plazma, aplikuje na sloupec iontoměniče při zachování původního neutrálního pH, tj . bez jakékoli úpravy, a to buď bez ředění nebo po neředění v objemovém poměru až 1 : 1 vodným roztokem redukčního činidla, například Na2S2O5, dithiothreitolu nebo dithioerythtritolu. Posledně zmíněná dvě činidla se používají vždy, pokud se stanovuje homocystein. Tento vodný roztok může dále obsahovat interní standard, s výhodou norvalin. Pro porovnání lze uvést, že při analýzách- prováděných technikou HPLC se jako
-644 4 4· 4444 44 44
4 4 4 4 · · · 4 * • 4 4 4 4 4 4 · ·'· · • 4 4444 »4 4 4 4 444 444 *4 deproteinační činidla používají obvykle kyselina sulfosalicylová, kyselina trichloroctová a acetonitril. Výsledky dosažené při práci způsobem podle vynálezu, tedy bez deproteinace, se shodují s výsledky dosahovanými při deproteinaci pomocí kyseliny sulfosalicylové. Výsledky dosahované při použití kyseliny trichloroctové vykazují značnou variabilitu, zejména při vyšších finálních koncentracích (10 %) a acetonitril vykazuje nižší hodnoty pro lysin a ornithin.
Vzhledem k alkalitě elučního a reakčního média, jak bude ještě diskutováno dále, jsou materiály na bázi silikageiu méně vhodné pro limitovaný rozsah jejich použití v oblasti pH 2 - 8. Jako vhodná matrice pro navázané sulfhydrylové skupiny, které jsou vlastním měničovým agens, se ukázala být klasická styren-divinylbenzenová matrice s příčným sítěním 2, 4 nebo 8 %. Jde tedy o klasické měniče typu Dowex nebo AG 50W. Vyšší sítění je prospěšné, protože snižuje objem nabobtnání materiálu (typ x2 zvyšuje objem téměř desetinásobně, typ x8 pouze trojnásobně). Vyšší inkorporace divinylbenzenu však zvyšuje aromaticitu materiálu což má za následek, že zpětný výtěžek aromatických aminokyselin (fenylalaninu, tyrosinu, tryptophanu) klesá u typu x8 až na cca 60 %. Tento nedostatek se dá při práci způsobem podle vynálezu odstranit tím, že následná derivatizace se provádí v přímnosti ionexového lože (po jeho vytěsnění do reakční nádoby, kde se derivatizace provádí), přičemž výtěžky derivatizace tím nejsou nepříznivě ovlivněny. Z materiálů x2 a x4 je možno všechny aminokyseliny 'získat klasickou eluci, nicméně i v jejich případě lze derivatizaci provádět v přítomnosti ionexového lože.
Kapacita iontoměniče typu 50W . je značná, přibližně 5,2 pekv/mg. Experimentálně bylo ověřeno, že pro 100 μΐ séra (obsah kompetitivně působících Na+ kationtů je 15 pmol) postačuje přibližně l,5násobek kapacity měniče, tedy 4 00 0 • i »
0··
0 0··0
0 0
0
-7»0 0000
0 0
0»0 0 0 0
0 0 0
00
00 0 0 0 0
0 0 0
000 000 • 0
00 mg, což objemově (po nabobtnání) odpovídá přibližně 12, 20 a 35 μΐ ionexového lože typů x8, x4 resp. x2 (zrnění buď 100/200 nebo 200/400 mesh).
Po nanesení iontoměnice dojde proteinů, přičemž zmíněno výše, se odstraní iontoměnice. Toto promývání vzorku výchozího materiálu na sloupec k zachycení aminokyselin a částečně i zachycená část proteinů, jak již bylo následným promytím sloupce se může v podstatě provádět jakýmkoli rozpouštědlem mísitelným s vodou, například isopropanolem, acetonitrilem či acetonem, s výhodou se však k tomuto účelu používá kombinace svým složením co nejbližší elučnímu/reakčnímu prostředí popisovanému dále. Proto se s výhodou používá směs vody a přímého či rozvětveného alkanolu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové skupině, zejména směs vody a ethanolu v objemovém poměru 2 : 1, nebo vody a propanolu v objemovém poměru 3:1.
Zachycené aminokyseliny se ze sloupce vymývají vhodným elučním činidlem, které s výhodou může sloužit i jako reakční prostředí pro následující derivatisační reakci s esterem kyseliny chlormravenčí. Jako toto reakční prostředí se obvykle používá směs vody nebo až 6% vodného roztoku .chloridu sodného, přímého nebo rozvětveného alkanolu s 1 až 4 atomy uhlíku a pyridinové báze. Objemový poměr vodné složky k alkanolu se pohybuje od 1 : 1 do 5 : 1, výhodně od 1,5 : 1 do 4 : 1, a koncentrace pyridinové báze v tomto vodně-alkoholickém prostředí se pohybuje mezi 5 a 15 % obj. Výhodnými pyridinovými bázemi jsou zejména samotný pyridin a jeho methylderiváty (pikoliny), nejvýhodněji samotný pyridin.
Zmíněné eluční/reakční protředí není schopno vytěsnit z lože iontoměnice bázické aminokyseliny, tj. lysin, ornithin, histidin a arginin. S překvapením bylo zjištěno a experimentálně ověřeno, že přidáním 0,1 až 3 % hmot. hydroxidu nebo uhličitanu alkalického kovu, s výhodou přibližně 1 % hmot. hydroxidu sodného, do vodné složky je
0·
0 0 · • 0 0 0 • 0*0 >00
0 ♦ · ··
-8•0 0000
0
0 «
0 0 0
0 0000 0 0 0
0 · ·
0 0 0 0 0
0 0
00 možno tyto aminokyseliny z lože iontoměniče vytěsnit, přičemž tento přídavek zásady nejenže reakci s chlormravenčanem nebrání, ale poskytuje vyšší výtěžek bazických aminokyselin a také kyseliny glutamové. V případě kyseliny glutamové jako shora uvedená zásada lépe vyhovuje hydroxid alkalického kovu.
Derivatizace se provádí buď v eluátu získaném vymytím sloupce výše uvedeným elučním činidlem, nebo přímo ve směsi elučního/reakčního činidla s ionexem, po vytěsnění této směsi do reakční nádoby pro derivatizaci.
Derivatizace se provádí ve shora uvedeném prostředí přidáním alkylesteru kyseliny chlormravenčí s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové skupině. Výtečných výsledků se dosahuje při použití ethyl-chlorformiátu nebo propyl-chlorformiátu, který se přidává ve dvou podílech s odstupem asi 1 minuty. Reakční činidlo se obvykle přidává ve směsi s organickým rozpouštědlem, například s acetonitrileni, nebo se směsí rozpouštědel, přičemž s výhodou je jedním z těchto rozpouštědel rozpouštědlo používané k následující extrakci. Zvlášť výhodných výsledků se dosahuje se směsí acetonitril - dichlormethan - ethyl-chlorformiát v poměru 3:3:2 nebo směsí acetonitril - dichlormethan - propyl-chlorformiát v poměru 1 : 1 : 1. Derivatizace se obvykle provádí při teplotě místnosti.
Derivatizóvané aminokyseliny se z vodného reakčního prostředí vytřepou do rozpouštědla nemísitelného s vodou, zejména do chlorovaného uhlovodíku, s výhodou do dichlormethanu nebo chloroformu, nebo terč.butylmethyletheru, popřípadě ve směs s dichlormethanem v poměru 2 : 1, které může obsahovat malé množství chlormravenčanu používaného k derivatizaci. Osvědčuje se zejména dichlormethan s obsahem cca 2 % ethyl-chlorformiátu nebo propyl-chlorformiátu. Po protřepání vodné a organické vrstvy se organická vrstva oddělí, pyridin a zbytek alkoholu se z ní popřípadě odstraní vytřepáním vodným roztokem kyseliny, s výhodou kyseliny φφ ·· φ φ φ φ « φ φ « • φφφ ΦΦΦ φ φ φφ ·
-9φφ φφφφ φφ φ • φ φ • φφφ φ · ··· φ « φ φφ · φ φ φ φ • φ φ φ φ φφ φφ chlorovodíkové a organická fáze se aplikuje do chromatografického přístroje, zpravidla po přidání malého množství bezvodého síranu sodného, který slouží k odstranění zbytků vody přítomných v organickém rozpouštědle.
Jako analytických kolon je možno použít kapilár z taveného křemene o průměru 0,18 až 0,32 mm a délce 5 až 15 m, nejlépe se středně polární fází typu 1701. Rychlost teplotní programace 25 až 40 °C/min. umožňuje získat profil aminokyselin v tělních tekutinách v době kratší než 8 minut. Pro stanovení profilu aminokyselin v moči je možno použít kolony s běžnými druhy silikonových fází (typ 1, 5, 35 apod.), kdy připojením krátké předkolony š polární fází se dosáhne optimální separace.
Jak již bylo uvedeno výše, je kapacita používaných iontoměničů typu Dowex vysoká. Komerčně dostupné kolonky plněné iontoměničovými materiály jiného typu mívají množství náplně 30 a více mg, přičemž pro přípravu vzorku podle vynálezu by postačovalo 4 - 5 mg iontoměniče typu Dowex.
několika sekundách, laboratorních pipet
V souladu s vynálezem byl nalezen způsob, který řeší vytvoření sloupečku žádaného iontoměniče in sítu, a to v K tomuto účelu lze použít špičky s filtry, které se dodávají s různě velkými objemy prostoru pod filtrem, obvykle od 12 do 50 mikrolitrů a více. Pomocí špičky a aplikátoru s pístem (tzv. setter) se provede nasátí mokré kaše iontoměniče do prostoru pod filtrem, jímž je tedy přesně určen objem vzniklého lože iontoměniče. Stejným postupem se přes vzniklé lože on-line nasaje analyzovaná tělní tekutina (obvykle 50 až 100 μΐ plazmy nebo séra nebo 100 až 200 μΐ moče, s norvalinem jako standardem), promývací roztok (například 200 μΐ směsi vody a alkoholu v poměru 2 : 1) a dalším povytažením pístu se lože měniče prosuší nasávaným vzduchem. Obsah setteru se vylije a poté se přes lože měniče nasaje eluční/reakční medium (cca 200 až 300 μΐ podle druhu a objemu měniče). Po vytlačení
0000 ·· «0
0 0
000
0 • 0 0 • 0 · 0 • · ···« · · 0 ·· 0 • 0
0'
000
-100 0 · • 0 0 0· 0
4 0 0 • 0 00 ·· eluátu do reakční nádobky se pak provede shora popsaná derivatizace chlormravenčanem.
I v případě, že by se z lože měniče nepodařilo vytěsnit veškeré množství zachycených aminokyselin, což se může stát v případě aromatických' aminokyselin, zejména při použití styren-divinylbenzenových měničů s 8% příčným zesítěním, jak je zmiňováno výše, lze snadno postupovat tak, že se do reakční nádobky vytlačí i lože měniče a derivatizace se provede v jeho přítomnosti, přičemž výtěžky derivatizace nejsou nijak podstatně ovlivněny. Z hlediska zpětného výtěžku aromatických aminokyselin může být derivatizace za přítomnosti lože měniče výhodná.
Z výše uvedeného popisu je zřejmé, že příprava vzorků způsobem podle vynálezu je nesmírně jednoduchá, probíhá on-iine systémem, umožňuje i zcela novou a dosud nepoužívanou přípravu lože iontoměniče o přesně definovaném objemu a.co do rychlosti zpracování vzorku, rychlosti analýzy a materiálových nákladů nemá v současné době konkurenci. Celý profil aminokyselin je od okamžiku obdržení vzorku možno získat za 15 až 20 minut. Reprodukovatelnost popisovaného stanovení a dobrá shoda s výsledky stanovení aminokyselin klasickým AAA systémem potvrzují mimořádnou výhodnost tohoto nového způsobu stanovení profilu aminokyselin, zejména v tělních tekutinách.
Je pochopitelné, že vzhledem k jednoduchosti. celé přípravy vzorku, včetně používaného zařízení, nebudou zřejmě problémy s automatizací celého procesu.
Předmětem vynálezu je rovněž souprava pro přípravu vzorků k stanovení aminokyselin, která sestává z nádobky obsahující kaši iontoměniče, špičku s filtrem, aplikátor s pístem, aplikační, promývací a eluční medium, derivatizační činidlo, extrakční rozpouštědlo a popřípadě i chromatografickou kolonu s náplní vhodnou pro toto stanovení.
• · · • · · » • φ·♦·· · • · · ·· ·
-11Podle charakteru analyzovaného vzorku může tato souprava s výhodou obsahovat i roztoky příslušných standardů. Vhodné jsou například následující standardy pracovně označované I, II a III:
I: 17 základních proteinových aminokyselin běžně obsažených v proteinových hydrolyzátech.
II: Asparagin, glutamin a tryptophan.
III: Doplňkové aminokyseliny vyskytující se v moči, které nepatří mezi základní proteinové aminokyseliny.
Obvyklou součástí soupravy je rovněž návod k použití.
Je pochopitelné, že namísto nádobky s kaší iontoměniče ač+nirkv flIťKArn onnnrsvP <? Λ b f· Q “i 1*7 předem vyvořeným ložem iontoměniče, nejlépe vhodně uzavřenou tak, aby se zabránilo vysychání lože iontoměniče nebo/a jeho vysypání. Tato souprava může být sestavena pro stanovení různého počtu vzorků, popřípadě pro různé druhy vzorků.
Vynález ilustrují následující příklady provedení, jimiž se však rozsah vynálezu v žádném směru neomezuje. Všechna potřebná rozpouštědla a činidla používaná v příkladech byla získána od firmy Sigma-Aldrich-Fluka, Praha.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Vzorek krevního séra (plasmy) byl smísen v poměru 5 : 1 s roztokem interního standardu. (Jako interní standard byl použit norvalin (NVAL) ve formě roztoku o koncentraci 1 pmol/l v O,1M kyselině chlorovodíkové s přídavkem 0,5 % dithiosiřičitanu sodného.)
Vytvoření sloupce sorbentů ve špičce s filtrem a izolace analytů ze séra byly provedeny on-line způsobem ····
9
9
9 9
9 9 • V
-1299 9 • · · • 9 9 9 • 9 9999 • 9 9
9 *·
9 9 9
9 9 9
999 999
9
99 následovně:
Špička s filtrem, o objemu prostoru pod filtrem 50 μΐ, byla nasazena na hubici špičky s pístem (setteru) o objemu 1,25 ml. Ponořením špičky do suspenze iontoměniče v O,1M kyselině chlorovodíkové a posunutím pístu o několik milimetrů byla špička naplněna sorbentem. Jako sorbent byl použít měnič kationtů na bázi kopolymeru styren-divinylbenzen s příčným sítěním 2 % (AG 50Wx2 v BioTech-kvalitě od firmy BíoRad (USA)). Do polyethylenové zkumavky o objemu 1,5 ml bylo vneseno 150 μΐ výše popsané směsi séra s interním standardem a tato tekutina byla jemným a postupným posunem pístu protažena ložem sorbentu (tento proces vyžaduje cca 1-3 minuty). Po penetraci ložem byl z jiné zkumavky nasát stejný objem promývacího roztoku. (Jako promývací roztok byla použita směs vody a ethanolu v objemovém poměru 2 : 1.) Dalším posunutím pístu bylo lože iontoměniče prosušeno nasátým vzduchem. Setter byl poté vyprázdněn.
Do jiné zkumavky bylo odměřeno 250 μΐ elučního/reakčního prostředí. (Jako eluční/reakční prostředí byla použita směs 1% hydroxidu sodného ve fyziologickém roztoku, ethanolu a pyridinu v poměru 7 : 4 : ,1.) Nasátím bylo toto prostředí protaženo ložem sorbentu směrem vzhůru, takže proniklo přes filtr do prostoru setteru pod pístem. Po penetraci elučního/reakčního prostředí ložem byl ještě přisát vzduch, který uvolnil poslední zbytky tohoto prostředí do setteru.
Eluční/reakční prostředí bylo ze setteru přeneseno do polypropylenové zkumavky o objemu 2 ml a byla k němu, pro provedení derivatizace, přidána směs ethyl-chlorformiát - dichlormethan - acetonitril (v poměru 2 : 3 : 3) , ve dvou dávkách, z nichž každá měla objem 25 μΐ, s odstupem asi 1 minuty. Po každém přidání byla zkumavka třepána po dobu 3 až 5 sekund .na vortexové třepačce. Po druhém přidání činidla a minutové prodlevě, bylo přidáno 150 μΐ extrakčního prostředí. (Jako extrakční prostředí byl použit dichlormethan •9 9999
99
9 9999 · 9 9 9 9 «99 *99 • · 9 * · · * byly promíseny opět . Po oddělení spodní pipety se špičkou
9
9
9
-13s obsahem 2 % ethyl-chlorformiátu.) Fáze vortexovou třepačkou po dobu 3-5 sekund organické fáze byla pomocí laboratorní odsáta horní vodně-alkoholická fáze a po přidání 150 μΐ 1M vodného roztoku kyseliny chlorovodíkové (sloužícího k odstranění pyridinu a zbytků alkoholu z organického rozpouštědla) a protřepání byla horní vodná fáze, vykazující pH nižší než 1, odtažena. Organická fáze byla vyčeřena přidáním malého množství bezvodého síranu sodného a 2 - 3 μΐ vyčeřeného roztoku byly aplikovány do plynového chromatografu.
Pro analýzu derivatizovaných forem aminokyselin byl použit plynový chromatograf Shimadzu GC 14A s plamenoionizačním detektorem a vodíkem jako nosným plynem kapilární kolony. Analýza byla prováděna v teplotním rozmezí 90 až 290 °C s poměrně rychlou teplotní programací 25 °C/min, takže analýza trvala celkem asi 9 minut. Tlak nosného plynu (vodík) na vstupu byl 30 kPa. Pro separaci byla použita fáze typu BPX5 v koloně o délce 12 m a vnitřním průměru 0,32 mm. Připojením předkolony s fází BPX70 (l,2m x 0,32 mm) bylo dosaženo optimální separace analytů. Oby typy kolon byly dodány firmou SGE (Austrálie)
Byly získány následující výsledky (jedná se o průměrné hodnoty z 8 měření sérových aminokyselin zdravých osob; statistické zpracování bylo provedeno podle Horná (J. Horn; J. Amer. Statistic Assoc., sv. 78· (1983), str. 930)):
Pl (nmol/ml) C.V. P. (nmol/ml) C.V.
GLY 402 2,8 SER 205 8,2
ALA 545 3,7 HYP 11 15,7
ABA 17 5,0 ASN 71 .4,3
VAL 251 3,7 GLN 599 4,3
LEU 141 6,3 CYS .4 · 12,2
·· «Φ·· φφφ · · φ • · φ φ φ φ φ φ φ Φφφφ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ· φ ·· ··
-14φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ
pL (nmol/ml) C.V. (nmol/ml) C.V.
ILE 66 4,5 PHE 79 . 5,3
MET 37 7,9 TYR 60 6,9
PRO 206 3,2 TRP 49 6,8
ASP 53 5,0 ORN 138 7,8
GLU 181 9,2 LYS 214 6,1
THR 170 5,0 HIS 84 11,4
Legenda k tabulce: PL = Pivotova polosuma (střední hodnota) C.V. = variační koeficient
Příklad 2
Na vzorku stejné plasmy jako v příkladu 1 byl opakován postup podle příkladu 1, s tím rozdílem, že pro stanovení zpětného výtěžku aminokyselin byly do výchozí směsi vzorku plasmy a interního standardu přidány standardy jednotlivých aminokyselin v množství 200 nmol na ml.
Byly získány následující výsledky (jedná se o průměrné hodnoty z 8 měření; statistické zpracování bylo provedeno podle Horná):
(nmol/ /ml) C.V. zpětný výtěžek (%) (nmol·/ /ml) C.V. zpětný výtěžek (%)
GLY 611 1,5 105 (101-108) SER 451 8,7 122 (104-140)
ALA 752 1,9 102 (91-113) HYP 212 4,3 101 (95-107)
ABA 219 4,2 101 (94-108) ASN 270 5,3 99 (92-106)
VAL 464 5,5 106 (80-131) GLN 808 4,2 103 (84-122)
LEU 335 4,5 97 (78-115) CYS 221 5,8 108 (102-114)
ILE 254 4,6 94 (84-104) PHE 282 6,4 101 (86-117)
MET 238 2,7 100 (95-106) TYR 248 4,3 93 (84-103)
·· to*·· ·· · • * » • · to to • · ««to· · • to· toto · to· • to *· *· · • to * «•to «· • to toto ··
Pl (nmol/ /ml) C.V. zpětný výtěžek (%) PL (nmol/ /ml) C.V. zpětný výtěžek (%)
PRO 421 7,0 109 (82-136) TRP 250 8,3 101 (88-114)
ASP 247 5,9 97 (90-104) ORN 339 5,1 97 (94-99)
GLU 368 6,7 96 (81-111) LYS 404 4,4 94 (85-103)
THR 397 8,9 111 (87-135) HIS 282 4,0 100 (86-113)
Legenda k tabulce: PL = Pivotova polosuma (střední hodnota) C.V. = variační koeficient
Jak vyplývá z výsledků, kvantita stanovení je potvrzena hodnotami zpětného výtěžku a metoda tedy poskytuje reprodukovatelné hodnoty.
Příklad 3
Bylo provedeno srovnání přípravy vzorku prováděné způsobem podle vynálezu a přípravy vzorku využívající klasické eluce aminokyselin amoniakem.
Jako vzorek byla použita moč, která byla smísena s roztokem interního standardu, popsaným v příkladu 1, v poměru 10 : 1. Další postup byl při práci způsobem podle vynálezu stejný jako v příkladu 1.
Při způsobu využívajícím elucí amoniakem bylo vytvoření sloupce iontoměniče, nanesení vzorku a promytí provedeno stejně jako v příkladu 1. Jako eluční prostředí bylo poté použito 200 μί. 2M vodného roztoku amoniaku. Toto množství elučního prostředí bylo nasátím protaženo ložem sorbentu směrem vzhůru, takže proniklo do prostoru setteru pod pístem. Po penetraci elučního prostředí ložem byl ještě přisát vzduch, který uvolnil poslední zbytky tohoto prostředí do setteru. Eluát byl poté odpařen do sucha při .80 °C pod proudem dusíku. Odparek byl derivatizován jako v příkladu 1 a další postup pak již byl stejný jako v příkladu 1.
AA ····
AA A • A A
A AAA
A A AAAA
AAA
A« A
A A A
A · A
A A A ·
A A A A
AA AA
AA A·
A · A A
A AA A
AAA ··· A A
AA AA
-16Při analýze derivatizovaných forem aminokyselin na plynovém chromatografu byly použity tytéž analytické podmínky jako v příkladu 1.
Byly získány následující výsledky (jedná se o průměrné hodnoty z 10 měření; statistické zpracování bylo provedeno podle Horná):
eluce amoniakem (nmol/ml) způsob podle vynálezu (nmol/ml)
ld Lh C.V. C.V.
GLY 743 711 775 3,1 765 751 780 3,3
ALA 152 148 157 3,5 145 142 148 2,8
ABA 6 5 6 1-1 v. 5 5 6 5,6
VAL 28 27 29 3,5 26 25 27 5,4
BAIB 140 138 143 4,7 128 125 131 4,7
LEU 26 24 28 7,4 24 23 25 6,3
ILE 22 16 27 27,7 17 15 19 14,7
MET 17 16 19 8,2 14 13 15 9
PRO 4 3 5 18 4 3 5 31,8
ASP 9 7 12 28 5 4 6 24,6
GLU 39 37 . 41 5,4 32 30 33 13,8
THR 82 78 85 6,4 77 74 79 7,4
SER 210 194 226 5,7 221 203 238 9,9
HYP — — 11 10 12 17,4
ASN 32 29 35 8,5 32 30 34 7,1
GLN 253 227 280 10 303 277 328 10,2
CYS 18 16 20 12,4 33 31 35 7,1
CYS2 21 18 24 10,6 12 10 13 13,2
PHE 37 35 38 4,1 40 38 42 6,9
TYR 74 70 79 5,7 73 70 77 7,3
TRP 44 41 47 6,6 42 39 45 8
ORN 2B 20 26 11,7 23 21 . 25 14,5
φφ φ »» φφφφ
Φ Φ Φ Φ
Φ Φ Φ Φ « ΦΦΦ »>· • Φ
ΦΦ «Φ
-17* · φ •Φφφφ φ • φ • 9 Φ • Φ Φ
Φ Φ Φ
Φ Φ Φ Φ • Φ ·
eluce amoniakem (nmol/ml) způsob podle vynálezu (nmol/ml)
Lo Lf C.V. Lo Lh C.V.
LYS 103 98 109 6,1 96 93 98 6,1
HIS 504 479 532 5,8 514 506 522 3,7
Legenda k tabulce: PL = Pivotova polosuma (střední hodnota)
Ld = dolní mez Lh = horní mez C.V. = variační koeficient
Z výsledků vyplývá,' že eluce elučním/reakčním prostředím podle vynálezu je stejně účinná jako eluce amoniakem, přitom však při práci způsobem podle vynálezu není potřeba provádět odpaření eluátu.
Příklad 4
Na vzorku moči bylo provedeno srovnání, jakého zpětného výtěžku se dosáhne při přidání standardů aminokyselin v množství 200 nmol/ml do výchozí směsi vzorku moči a interního standardu, při přípravě vzorku prováděné způsobem podle vynálezu a přípravě vzorku využívající klasické eluce aminokyselin amoniakem.
Příprava vzorků způsobem podle vynálezu a způsobem využívajícím eluce amoniakem byla prováděna jak je popsáno v příkladu 3.
Byly získány následující výsledky (jedná se o průměrné hodnoty z 10 měření; statistické zpracování bylo provedeno podle Horná):
• · · • fefefe « · fefefefe • fe * • fe * • fe fefe • · fe fefefefe fefe · fefefefe • · fefe fefefe fefefe • fefefe fe · fefe fe* fefe fefe ·* fefefefe
eluce amoniakem (nmol/ml) způsob podle vynálezu (nmol/ml)
C.V. zpětný výtěžek (%) C.V. zpětný výtěžek <%)
GLY 963 2,6 96 (75-118) 939 5,6 101 (87-116)
ALA 352 . 3,5 100 (98-103) 346 3,7 100 (97-103)
ABA 200 3,1 97 (95-99) 204 2,9 99 (97-101)
VAL 209 2 91 (88-93) 222 3,2 97 (95-99)
BATB 327 4,8 98 (94-102) 337 4,4 105 (94-116)
LEU 213 4,3 95 (86-103) 227 4,6 101 (97-105)
ILE 211 5,4 94 (89-99) 220 4,4 100 (97-104)
MET 212 4,1 98 (95-101) 220 3,8 104 (100-107)
PRO 197 2 97 (94-99) 195 4,7 96 (93-98)
ASP 217 6,3 105 (99-110) 209 3,6 101 (99-103)
GLU 243 5,3 105 (97-112) 245 7,6 105 (100-110)
THR 294 4,9 106 (98-115) 275 6 100 (92-108)
SER 431 4,3 110 (106-1141 427 5,4 107 (99-114)
HYP 166 12,7 83 (63-103) 201 6, 6 95 (91-99)
ASN 229 9,4 99 (94-104) 224 10,6 96 (86-105)
GLN 483 7,1 ' 104 (96-111) 491 8,3 96 (85-107)
CYS 203 9,3 94 (82-106) 251 5,8 109 (101-117)
CYS2 213 5,7 97 (89-105) 209 7,8 98 (92-104)
PHE 229 5 97 (91-102) 249 5,9 105 (96-113)
TYR 265 5,1 98 (90-105) 290 6,2 110 (102-118)
TRP 236 7,5 98 (94-102) 248 5,6 102 (97-107)
ORN 242 6,7 109 (102-116) 237 7 107 (103-112)
LYS 325 3,2 112 (103-121) 296 6,1 101 (96-105)
HIS 724 3,4 106 (97-115) 718 3,7 101 (88-114)
Legenda k tabulce: PL = Pivotova polosuma (střední hodnota) C.V, = variační koeficient
Jak vyplývá z výsledu, při práci způsobem podle ·· 444«
44 • · · 44 4 · · · ·
4*4« 44 4 4 · 4 · • · «··· · 4 4 4 4 444 4··
4 «··« · · «« « 44 ·· ·· ··
-19vynálezu je zpětný výtěžek srovnatelný, a často i lepší, než při použití eluce amoniakem.
Příklad 5
Na vzorku krevní plasmy 'bylo provedeno srovnání přípravy vzorku prováděné způsobem podle vynálezu bez deproteinace a přípravy vzorku prováděné stejným způsobem, ale s chemickou deproteinaci.
Při práci způsobem podle vynálezu byl použit stejný postup jako v příkladu 1.
Pro srovnání byly použity tři způsoby deproteinace, a to pomocí kyseliny sulfosalicylové (SSA), pomocí kyseliny trichloroctové (TCA) a pomocí směsi acetonitrilu a ethanolu v poměru 2 : 1 (ORG). Vzorek plasmy byl nejprve smísen s roztokem interního standardu, popsaným v příkladu 1, v poměru 5:1. Podle typu použitého deproteinačního činidla byl poté vzorek smísen s 6% SSA v poměru 1 : 1, s 6% TCA v poměru : 1 nebo s výše uvedenou směsí acetonitrilu a ethanolu v poměru 1 : 3. Po promísení byla směs centrifugována a supernatant byl dále zpracováván stejně jako vzorek, u kterého deproteinace prováděna nebyla, postupem popsaným v příkladu 1.
Byly získány následující výsledky (jedná se o průměrné hodnoty z 12 měření; statistické zpracování bylo provedeno podle Horná):
bez deproteinace SSA TCA ORG
GLY 290 (286-293) 288 (282-293) 259 (238-280) 261 (251-270)
ALA 421 (415-427) 422 (417-427) 380 (357-402) 393 (365-421)
ABA 23 (22-24) 23 (20-26) 22 (21-22) 22 (21-23)
LEU 165 (162-168) 164 (162-166) 162 (158-165) 163 (155-170)
ILE 74 (72-75) 70 (67-72) 71 (69-72) 73 (72-73)
-20· · *♦ **« ** ·♦ ·· · · · · ♦ ···· · · * · · · * * · ···· * · · · · ·*· ··· ····♦·· · · «· a ·· *· ·· ·*
bez deproteinace SSA TCA ORG
MET 30 (29-30) 32 (31-33) 31 (30-31) 30 (29-30)
PRO 209 (207-211) 207 (204-210) 212 (208-215) 206 (197-214)
ASP 18 (17-19) 16 (15-17) 16 (14-17) 19 (18-20)
GLU 40 (38-41) 35 (25-44) 35 (29-40) 35 (30-39)
THR 176 (170-181) 166 (161-171) 153 (145-161) 177 (168-186)
SER 142 (136-147) 133 (129-136) 129 (121-137) 136 (122-150)
HYP 14 (13-14) 12 (11-12) 13 (12-13) —
ASN 34 (32-35) ' 34 (33-35) 31 (27-34) 31 (28-33)
GLN 540 (495-584) 588 (561-615) 553 (514-592) . 569 (554-584)
CYS2 41 (39-42) 41 (39-42) 45 (41-49) 30 (21-39)
PHE 58 (56-60) 58 (56-59) 63 (59-66) 60 (57-63)
TYR 62 (59-64) 62 (58-66) 63 (59-67) 63 (59-67)
TRP 48 (46-49) 44 (41-47) 45 (42-48) 50 (43-56)
ORN 60 (58-61) 68 (62-73) 64 (60-67) 46 (43-49)
LYS 179 (172-185) 200 (178-222) 184 (162-205) 118 (108-127)
HIS 84 (78-89) 89 (82-96) 90 (85-95) 82 (73-91)
Legenda k tabulce:
SSA: deproteinace pomocí kyseliny sulfosalicylové
TCA: deproteinace pomocí kyseliny trichloroctové
ORG: deproteinace pomocí směsi acetonitrilu a ethanolu v poměru 2 : 1
Jak vyplývá z výsledků, způsob podle vynálezu zamezuje rozdílům ve výsledcích způsobeným použitím různých deproteinačních činidel. Vynecháním stupně deproteinace se přitom však pochopitelně zjednodušuje postup a zkracuje čas analýzy.
Příklad 6
Na vzorku krevní plasmy byla analýza aminokyselin způsobem podle vynálezu za použití plynové chromatografie, prováděná jak je popsáno v příkladu 1, srovnána s analýzou a · ·· ···· ♦ · ·· aaa · · · aaa· aa·· · · a · · · · a a aaae a · · · · ··· ··· aaa····*· • a · ·· ·· ·· ··
-21prováděnou na automatizovaném analyzátoru aminokyselin s detekcí ninhydrinem (IEC, byl použit analyzátor tuzemské provenience MIKROTECHNA za použití postupu, který popsali Hans J. Bremer a kol.: Disturbances of amino acid metabolism: clinical chemistry and diagnosis; Organ & Schwarzenberg, Baltimore-Mnichov, 1981).
Byly získány následující výsledky (výsledky jsou uvedeny v nmol/ml; statistické zpracování bylo provedeno podle Horná):
PL 270,0 230,5 530,5 471,5 29,0 20,0 316,5 281,5
LD 265,8 194,9 515,8 406,6 24,8 . 7,4 272,5 254,3
LH 274,2 266,1 545,2 536,4 33,2 32,6 360,5 308,7
GLY ALA ABA VAL
'GCÁ vÍEČ/4 GC- . —.-S2S3SÍ5Sff;· ' JEČ- ^(30:-:-:-
297 222 645 453 28 ' í y 330 275
270 264 529 487 32 16 307 315
271 218 534 456 25 ' 23 327 288
257 2391 511 505 30 19 288 280
269 235 527 468 30 . 23l 306 270
PL 167,5 152,5 77,5 75,5 44,5 39,0 197,0 165,0
LD 119,3 104,3 54,5 44,1 38,2 30,6 37,9 160,8
LH 215,7 200,7 100,5 106,9 50,8 47,4 356,1 169,2
LEU ILE MET PRO
'IEC·/-'·- GC - -IEC gc':! jlEC GC IEC 'GC
156 132 62 67 41 37 235 164
224 173 72 87 46 43 241 186
159 164 81 83 47 39 159 166
151 141 83 70 43 41 151 164
179 143 90 68 44 31 228 165
-22·· · • 9 9 * 9 9 9
9 9999
9 9
9
9999
9 9
9 9
9 9 9 « · 9 9
99
99
9 9 9
9 9 9
999 999 • ·
99
PL 175,0 163,5 117,5 91,0 33,5 17,0 147,5 142,0
LD 145,7 136,3 94,5 70,1 10,5 4,4 91,0 116,9
LH 204,3 190,7 140,5 111,9 56,5 29,6 204,0 167,1
THR SER t ASP gllT
ΒΕΟίφ N<'Wí:XvwZ<v.‘.‘.s-,mXvč ;gc IEC , GC , IEC GC IEC - GC
209 Í46 123 81 43 14 114 136
179 165 119 107 35 14 163 128
182 170 123 96 39 24 161 148
168 157 112 86 28 18 152 137
159, 179 99 94 19 20 134 157
PL 622,5 _ 575,0 28,0 23,5 76,5 74,0 104,0 97,S
LD 5.66,0 453,5 23,8 17,2 61,8 69,8 91,4 82,8
LH 679,0 696,5 32,2 29,8 91,2 78,2 116,6 112,2
GLN ®EC GO; 739 493 (CYS)2 5Α·Λ*Λν.·,···Λ·,·.'.·<Μ»!>*<Λ*ννιν*ΜΑ·Α«ΑΛΑΑνί· ksIEC^oGC L, 44 23 PHE ' IEG < ' 84 fcď A\rt<λ» Λλ 83 TYR 7ÍEC 82 W >.‘A‘ WAVW GCJl 94
636 563 29 25 73 74 107 101
636 604 21 31 76 73 106 107
609 546 27 22 80 66 108 91
596 624 27 20 66 75 101 96
PL 57,5 87,0 58,0 185,0 153,5 118,0 105,0(
LD 34,5 74,4 37,1 159,9 130,5 101,2 59,9
LH 80,5 99,6 78,9 210,1 176,5 134,8 152,1
TRP ORN LYS HIS
Βίρββ» fffijHSrajiSMšůs L JEC ; ^GC JEC~ '<kGC' IEC GC::·/
63 81 53 198 159 114 92
52 89 78 182 167 122 118
57 100 57 191 158 127 112
67 84 51 170 144 114 95
41 90 63 179 148 115 117
·* 0000
-23«· * • · · • · · · • 0 0000 0 0 0 ·
0 0
0 0 0 0 0 0 0
0 0 0
0· 00
0· • 0 0 0
0 0 ·
000 000 0 0 • 0 00
Legenda k tabulkám:
PL: Pivotova polosuma (střední hodnota)
LD: dolní mez LH: horní mez
IEC: stanovení na automatizovaném analyzátoru aminokyselin GC: stanovení způsobem podle vynálezu za použití plynové chromatografie
Srovnání způsobu podle vynálezu s klasickým stanovením na automatizovaném analyzátoru aminokyselin prokázalo, že nový postup poskytuje stejně validní (hodnověrné) výsledky, přičemž však nový postup podstatně zrychluje a. zlevňuje stanovení.
Příklad 7 ·
Vzorek krevní plasmy byl zpracován jako v příkladu 1, s tím rozdílem, že jako sorbent byl použit měnič kationtů na bázi kopolymeru styren-divinylbenzen s příčným sítěním 8 % (AG 50Wx8 v BioTech-kvalítě od firmy BioRad (USA)), byla použita špička s filtrem o objemu prostoru pod filtrem 12 μΐ a po eluci elučním/reakčním prostředí bylo toto prostředí i s 'iontoměničem vytlačeno do zkumavky, kde byla poté provedena derivatizace přímo za přítomnosti iontoměniče.
Množství jednotlivých použitých prostředí a činidel byla následující:
objem směsi séra s interním standardem: 100 μΐ objem promývacího roztoku: 100 μΐ objem elučního/reakčního prostředí: 200 μΐ objem derivatizačního činidla: 2 x 20 μΐ objem extrakčního prostředí: 120 μΐ objem 1M vodného roztoku HCI sloužícího k odstranění pyridinu a zbytků alkoholu z organického rozpouštědla: 100 μΐ.
Získané výsledky se od -výsledků získaných v příkladu 1 statisticky významně nelišily.

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin v přírodních materiálech, zejména v tělních tekutinách, plynovou chromatografií, vyznačující se tím, že se výchozí materiál, popřípadě spolu se -standardem, nanese na sloupec iontoměniče stálého v alkalickém prostředí, sloupec se promyje směsí vody a organického rozpouštědla misitelného s vodou, zachycené aminokyseliny se . vytěsní promytím sloupce směsí vody nebo až 6% vodného roztoku chloridu sodného, s obsahem 0,1 až 3 % hmot. hydroxidu nebo uhličitanu alkalického kovu, alkanolu s 1 až 4 atomy uhlíku a pyridinové báze, aminokyseliny obsažené v eluátu se derivatizují přidáním alkyl-chlorformiátu s 1 až 4 atomy uhlíku v alkylové skupině, reakční směs se vytřepe organickým rozpouštědlem nemísitelným s vodou a použije se k nástřiku do chromatografického přístroje.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako iontoměnič použije styren-divínylbenzenový měnič typu Dowex nebo AG 50W.
  3. 3. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se t i m, že se jako rozpouštědlo mísitelné s vodou k promývání sloupce iontoměniče použije přímý nebo rozvětvený alkanol s 1 až 4 atomy uhlíku, s výhodou ethanol či propanol.
    4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyzná č u jící s e tím, že se jako hydroxid nebo uhličitan alkalického kovu použije hydroxid nebo uhličitan sodný, s výhodou hydroxid sodný. 5. Způsob podle nároků 1 až 4, vyzná č u jící s e tím, že se jako alkyl-chlorformiát použije
    ethyl-chlorformiát nebo propyl-chlorformiát.
    0« 0*00
    -250* 0
    0 0
    0 0 0
    0 0000
    0 0 «
    0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00 00
    00 «0 0 0 0 ·
    0 0 0 0
    00* ·*· 0 0
    00 00
  4. 6. Způsob podle nároků laž 5, vyznačující se t í m, že se jako organické rozpouštědlo nemísitelné s vodou použije chlorované uhlovodíkové rozpouštědlo, s výhodou dichlormethan nebo chloroform, nebo tec.butylmethylether.
  5. 7. Způsob podle nároků 1 až 6, vyznačující se t i m, že se fáze organického rozpouštědla nemísitelného s vodou před nástřikem do chromatografické kolony promyje zředěnou anorganickou kyselinou, s výhodou kyselinou chlorovodíkovou.
  6. 8. Způsob podle nároků 1 až 7, vyznačující se t i m, že se derivatizace provádí ve směsi eluátu a iontoměniče.
  7. 9. Souprava k přípravě vzorků podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje nádobku s hustou suspenzí iontoměniče, špičku s filtrem, aplikátor s pístem, aplikační, promývací a eluční medium, derivatizační činidlo a extrakční rozpouštědlo.
  8. 10. Souprava podle nároku 9, vyznačující se t i m, že namísto nádobky s hustou suspenzí iontoměniče a špičky s filtrem obsahuje špičku s filtrem s již vytvořeným ložem iontoměniče.
  9. 11. Souprava podle nároků 9 a 10, vyznačuj í c i se t í m, že dále obsahuje standard nebo standardy podle charakteru analyzovaného vzorku.
  10. 12. Souprava podle nároků 9 až 11, vyznačující se t i m, že dále obsahuje kapilární křemennou chromatografíckou kolonu s chemicky vázanou fází vhodnou pro stanovení aminokyselin.
CZ1999770A 1999-03-04 1999-03-04 Způsob přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin a souprava pro tuto přípravu CZ9900770A3 (cs)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ1999770A CZ9900770A3 (cs) 1999-03-04 1999-03-04 Způsob přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin a souprava pro tuto přípravu
JP2000060532A JP2000310626A (ja) 1999-03-04 2000-03-06 アミノ酸分析用サンプルの調製方法及びそれを分析するためのキット
EP00104786A EP1033576A3 (en) 1999-03-04 2000-03-06 Method of preparing sample for amino acid analysis and kit for analyzing the same

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ1999770A CZ9900770A3 (cs) 1999-03-04 1999-03-04 Způsob přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin a souprava pro tuto přípravu

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ9900770A3 true CZ9900770A3 (cs) 2000-10-11

Family

ID=5462224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ1999770A CZ9900770A3 (cs) 1999-03-04 1999-03-04 Způsob přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin a souprava pro tuto přípravu

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP1033576A3 (cs)
JP (1) JP2000310626A (cs)
CZ (1) CZ9900770A3 (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100600900B1 (ko) * 2001-05-03 2006-07-13 재단법인 서울의과학연구소 Ｇｃ／ｍｓ에 의한 유기산과 아미노산, 글라이신류의동시분석법
CN101010584B (zh) * 2004-08-30 2012-07-04 财团法人杂贺技术研究所 利用固相萃取柱的有机化学物质的分析方法及其分析装置
DE102006040444A1 (de) * 2006-08-29 2008-03-13 Forschungszentrum Jülich GmbH Verfahren zur Probenvorbereitung für die quantitative Analyse von Aminosäuren enthaltenden Proben
JP6359365B2 (ja) * 2014-07-09 2018-07-18 国立研究開発法人産業技術総合研究所 アミノ酸のアミノ基及びカルボキシル基を対象としたプレカラム誘導体化ｌｃ−ｍｓ分析法
US9891199B2 (en) 2014-08-12 2018-02-13 Aisti Science Co., Ltd. Pre-analysis treatment device usable for amino acid, organic acid, and glucide and pre-analysis treatment method
CN108333287B (zh) * 2018-01-29 2020-03-03 山东省食品药品检验研究院 一种羚羊角粉的定量检测方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3686118A (en) * 1971-01-11 1972-08-22 Durrum Chem Corp Chromatographic method
DE3717211A1 (de) * 1987-05-22 1988-12-01 Diagen Inst Molekularbio Vorrichtung und verfahren zur trennung und reinigung von molekuelen

Also Published As

Publication number Publication date
JP2000310626A (ja) 2000-11-07
EP1033576A2 (en) 2000-09-06
EP1033576A3 (en) 2002-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jemal High‐throughput quantitative bioanalysis by LC/MS/MS
Bhatt et al. A rapid and sensitive liquid chromatography–tandem mass spectrometry (LC‐MS/MS) method for the estimation of amlodipine in human plasma
CN106959349B (zh) 一种微柱富集进样方法
Nakamoto et al. Monolithic silica spin column extraction and simultaneous derivatization of amphetamines and 3, 4-methylenedioxyamphetamines in human urine for gas chromatographic-mass spectrometric detection
Gorynski et al. Development of SPME method for concomitant sample preparation of rocuronium bromide and tranexamic acid in plasma
CA2457778A1 (en) Method and apparatus for sample preparation using solid phase microextraction
Bekaert et al. A validated ultra-high performance liquid chromatography coupled to high resolution mass spectrometry analysis for the simultaneous quantification of the three known boar taint compounds
AU2002327994A1 (en) Method and apparatus for sample preparation using solid phase microextraction
CN106814150B (zh) 一种同位素稀释超高效液相色谱质谱联用测定维生素k1的方法
Yilmaz et al. Determination of carvedilol in human plasma by gas chromatography-mass spectrometry method
Shiea et al. Rapid quantification of acetaminophen in plasma using solid‐phase microextraction coupled with thermal desorption electrospray ionization mass spectrometry
CZ9900770A3 (cs) Způsob přípravy vzorků pro analýzu aminokyselin a souprava pro tuto přípravu
JP4907334B2 (ja) 微量質量分析法
Lee et al. Determination of tricyclic antidepressants in human plasma using pipette tip solid‐phase extraction and gas chromatography–mass spectrometry
CN111624274A (zh) 一种血清中全氟及多氟化合物的高通量快速检测方法
Wang et al. Simultaneous determination of ten macrolides drugs in feeds by high performance liquid chromatography with evaporation light scattering detection
CN113804806A (zh) 燕窝中氨基酸的超高效液相色谱-串联质谱测定方法
Wu et al. Simultaneous enrichment and analysis of tobacco alkaloids by microextraction coupled with mass spectrometry using a poly (N-isopropyl-acrylamide-co-divinyl-benzene-co-N, N'-methylene diacrylamide) monolithic column
Huang et al. One step and highly sensitive headspace solid-phase microextraction sample preparation approach for the analysis of methamphetamine and amphetamine in human urine
Hefnawy et al. Rapid and sensitive LC-MS/MS method for the enantioanalysis of verapamil in rat plasma using superficially porous silica isopropyl-cyclofructan 6 chiral stationary phase after SPE: Application to a stereoselective pharmacokinetic study
CN104931609B (zh) 一种中空纤维膜液相微萃取液相色谱联用的装置及其多糖组分在线定量分析方法
Bai et al. Characterization and evaluation of two-dimensional microfluidic chip-HPLC coupled to tandem mass spectrometry for quantitative analysis of 7-aminoflunitrazepam in human urine
Dawson et al. A rapid and sensitive high-performance liquid chromatography-electrospray ionization-triple quadrupole mass spectrometry method for the quantitation of oxycodone in human plasma
Zhang et al. Development of HPLC methods for the determination of cyadox and its main metabolites in goat tissues
EP4348269A1 (en) Method to determine glyphosate and aminomethylphosphonic acid in a sample

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic