JP2000310626A - アミノ酸分析用サンプルの調製方法及びそれを分析するためのキット - Google Patents
アミノ酸分析用サンプルの調製方法及びそれを分析するためのキットInfo
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Abstract
(57)【要約】
【課題】ガスクロマトグラフィによるフリーアミノ酸液
体サンプル、特に体液、の分析のためのサンプル処理方
法の提供。 【解決手段】特定の溶液中のアミノ酸を、混合された内
部標準とともに、カチオンベッドに直接装填する。ベッ
ドを水系有機（水と混和性）溶媒で洗浄し、捕獲された
アミノ酸を、塩化／水酸化（又は炭酸）ナトリウム水、
１〜４個の炭素原子を有するアルカノール、及びピリジ
ンタイプの塩基を含む媒体で置換する。アルキル部分に
１乃至４個の炭素原子を有するクロロぎ酸アルキルで、
溶出液中のアミノ酸を直接処理して、誘導体化し、水と
混和性でない有機溶媒中に移した後、ガスクロマトグラ
フィで分析することにより、上記課題を解決する。
体サンプル、特に体液、の分析のためのサンプル処理方
法の提供。 【解決手段】特定の溶液中のアミノ酸を、混合された内
部標準とともに、カチオンベッドに直接装填する。ベッ
ドを水系有機（水と混和性）溶媒で洗浄し、捕獲された
アミノ酸を、塩化／水酸化（又は炭酸）ナトリウム水、
１〜４個の炭素原子を有するアルカノール、及びピリジ
ンタイプの塩基を含む媒体で置換する。アルキル部分に
１乃至４個の炭素原子を有するクロロぎ酸アルキルで、
溶出液中のアミノ酸を直接処理して、誘導体化し、水と
混和性でない有機溶媒中に移した後、ガスクロマトグラ
フィで分析することにより、上記課題を解決する。
Description
【０００１】発明の背景 本発明は、体液などの複雑な混合物中のフリーアミノ酸
を分析する方法と、それを分析するための装置に関す
る。
を分析する方法と、それを分析するための装置に関す
る。
【０００２】必須アミノ酸と呼ばれる２０種の異なるア
ミノ酸から成る天然タンパク質の極端な複雑さは、その
分析を非常に難しくする。一般的に、２０種又はそれ以
上の成分を有する複雑な混合物の成分の個々の定量は、
分析化学における大きな課題である。２０世紀後半、迅
速、有効且つ信頼性のあるアミノ酸分析方法に対する関
心は低下していない。
ミノ酸から成る天然タンパク質の極端な複雑さは、その
分析を非常に難しくする。一般的に、２０種又はそれ以
上の成分を有する複雑な混合物の成分の個々の定量は、
分析化学における大きな課題である。２０世紀後半、迅
速、有効且つ信頼性のあるアミノ酸分析方法に対する関
心は低下していない。
【０００３】分析化学における機器開発の異なる段階で
使用される方法は次のように続いた。１９５０年代、フ
リーアミノ酸は、低圧液体クロマトカラムを用いるイオ
ン交換によって異なるマトリックスから抽出された。抽
出後、フリーアミノ酸はニンヒドリンで誘導体化され、
光度検出（photometric detection）によって分析され
た。この手順はすぐに自動化され、アミノ酸アナライザ
（ＡＡＡ）はそれ以来商業的に利用可能である。更なる
開発において、この方法の感度は、光度測定の代わりに
蛍光測定を用いることによって２〜３倍に向上された。
この目的のために、誘導体化試薬としてニンヒドリンの
代わりにフルオレセイン又はo−フタルアルデヒドが使
用された。これらの機器の使用は、その耐久性のために
普及している。この方法には２つの主要な不利益があ
る。第１に、生体サンプルについては除タンパクステッ
プを含む面倒なサンプル調製手順が必要とされる。第２
には、分析に必要とされる時間が極めて長い、即ち、２
〜３時間を要する。
使用される方法は次のように続いた。１９５０年代、フ
リーアミノ酸は、低圧液体クロマトカラムを用いるイオ
ン交換によって異なるマトリックスから抽出された。抽
出後、フリーアミノ酸はニンヒドリンで誘導体化され、
光度検出（photometric detection）によって分析され
た。この手順はすぐに自動化され、アミノ酸アナライザ
（ＡＡＡ）はそれ以来商業的に利用可能である。更なる
開発において、この方法の感度は、光度測定の代わりに
蛍光測定を用いることによって２〜３倍に向上された。
この目的のために、誘導体化試薬としてニンヒドリンの
代わりにフルオレセイン又はo−フタルアルデヒドが使
用された。これらの機器の使用は、その耐久性のために
普及している。この方法には２つの主要な不利益があ
る。第１に、生体サンプルについては除タンパクステッ
プを含む面倒なサンプル調製手順が必要とされる。第２
には、分析に必要とされる時間が極めて長い、即ち、２
〜３時間を要する。
【０００４】１９８０年代、ガスクロマトグラフィ（Ｇ
Ｃ）に基づく新しい方法は、３０分よりも短い時間でア
ミノ酸の分析を可能にした。一般的なＧＣ検出器、炎イ
オン化検出器（ＦＩＤ）の優れた感度は、ピコモルオー
ダーの検出限界を保証した。ＧＣで使用される更に特殊
な検出器は検出限界をフェムトモルヘ下げた。ＧＣ分析
は誘導体化を必要とするが、ＡＡＡ機器のように検出の
目的ではなく、むしろアミノ酸をＧＣで分析可能な揮発
性化合物に変換するためである。ここ３０年間、タンパ
ク質アミノ酸の有効な化学処理のために何百という手順
が開発された。これらの手順の多くは、非水系媒体及び
高温（１００℃よりも高い）で実行される多数のステッ
プを必要とする。これらの方法の多くは、手が込んでい
て時間がかかるために断念された。
Ｃ）に基づく新しい方法は、３０分よりも短い時間でア
ミノ酸の分析を可能にした。一般的なＧＣ検出器、炎イ
オン化検出器（ＦＩＤ）の優れた感度は、ピコモルオー
ダーの検出限界を保証した。ＧＣで使用される更に特殊
な検出器は検出限界をフェムトモルヘ下げた。ＧＣ分析
は誘導体化を必要とするが、ＡＡＡ機器のように検出の
目的ではなく、むしろアミノ酸をＧＣで分析可能な揮発
性化合物に変換するためである。ここ３０年間、タンパ
ク質アミノ酸の有効な化学処理のために何百という手順
が開発された。これらの手順の多くは、非水系媒体及び
高温（１００℃よりも高い）で実行される多数のステッ
プを必要とする。これらの方法の多くは、手が込んでい
て時間がかかるために断念された。
【０００５】しかしながら、本発明の発明者は約１０年
前、アミノ酸を含む広範な化合物のＧＣ分析用の新しい
普遍的な誘導体化試薬としてクロロぎ酸エステルが使用
できることを発見した。アミノ酸の場合、アミノ基はア
ルキル化され、カルボキシル基は同時にエステル化され
る。反応媒体は水系であり、手順は迅速である。この方
法では、アミノ酸ＧＣ分析用のサンプル調製のための全
体の手順の中で、誘導体化は無視できるステップになっ
た。
前、アミノ酸を含む広範な化合物のＧＣ分析用の新しい
普遍的な誘導体化試薬としてクロロぎ酸エステルが使用
できることを発見した。アミノ酸の場合、アミノ基はア
ルキル化され、カルボキシル基は同時にエステル化され
る。反応媒体は水系であり、手順は迅速である。この方
法では、アミノ酸ＧＣ分析用のサンプル調製のための全
体の手順の中で、誘導体化は無視できるステップになっ
た。
【０００６】ＧＣの限界をはるかに超える広い適応性を
有する１９７０年代の高性能液体クロマトグラフィ（Ｈ
ＰＬＣ）の始まりでは、アミノ酸分析においても注目は
この新しい技法へ向けられた。不運なことに、ＨＰＬＣ
で使用される最も一般的な検出器−ＵＶ光検出器は、ア
ミノ酸検出に使用することができない。アミノ酸をＵＶ
光度測定、蛍光分析、又は電気化学法のいずれかによっ
て検出可能にするために、誘導体化が再度必要とされ
る。アミノ酸分子の修飾は、クロマトグラフィ分離の前
に、あるいは後分離ステップとして、のいずれかで達成
できる。実践によって、前分離誘導体化がより適切であ
ることが示された。分離は、傾斜溶離を用いてオクタデ
シル変性シリカカラムで実行される。完全なアミノ酸プ
ロファイルは６０分で得られるであろう。
有する１９７０年代の高性能液体クロマトグラフィ（Ｈ
ＰＬＣ）の始まりでは、アミノ酸分析においても注目は
この新しい技法へ向けられた。不運なことに、ＨＰＬＣ
で使用される最も一般的な検出器−ＵＶ光検出器は、ア
ミノ酸検出に使用することができない。アミノ酸をＵＶ
光度測定、蛍光分析、又は電気化学法のいずれかによっ
て検出可能にするために、誘導体化が再度必要とされ
る。アミノ酸分子の修飾は、クロマトグラフィ分離の前
に、あるいは後分離ステップとして、のいずれかで達成
できる。実践によって、前分離誘導体化がより適切であ
ることが示された。分離は、傾斜溶離を用いてオクタデ
シル変性シリカカラムで実行される。完全なアミノ酸プ
ロファイルは６０分で得られるであろう。
【０００７】種々の誘導体化試薬及び手順は、アミノ酸
のＨＰＬＣ分析のために調査された。これらの手順の多
くは水系媒体で短時間（数分以内）で実行できるが、考
慮すべき不利益がある。幾つかの誘導体は十分に安定で
はなく、クロマトグラフィ分析の間に分解し、その結果
再現性が悪くなる。普遍的な誘導体化試薬は存在せず、
幾つかのアミノ酸については適切な試薬は確認されてい
ない。同時に、微量の汚染物は誘導体化反応を妨害する
であろう。
のＨＰＬＣ分析のために調査された。これらの手順の多
くは水系媒体で短時間（数分以内）で実行できるが、考
慮すべき不利益がある。幾つかの誘導体は十分に安定で
はなく、クロマトグラフィ分析の間に分解し、その結果
再現性が悪くなる。普遍的な誘導体化試薬は存在せず、
幾つかのアミノ酸については適切な試薬は確認されてい
ない。同時に、微量の汚染物は誘導体化反応を妨害する
であろう。
【０００８】アミノ酸のＨＰＬＣ分析のための普遍的に
適用可能な手順は存在しない。ＨＰＬＣは、非生理的サ
ンプル中のアミノ酸の決定には有用であると証明され
る。これに対して生理液の場合には、その複雑な性質及
び高いタンパク含量のために、時間のかかる除タンパク
質ステップが必要とされる。それにもかかわらず、ＨＰ
ＬＣに基づいてアミノ酸分析のために設計された完全自
動化機器は、種々の製造元から市販されている。
適用可能な手順は存在しない。ＨＰＬＣは、非生理的サ
ンプル中のアミノ酸の決定には有用であると証明され
る。これに対して生理液の場合には、その複雑な性質及
び高いタンパク含量のために、時間のかかる除タンパク
質ステップが必要とされる。それにもかかわらず、ＨＰ
ＬＣに基づいてアミノ酸分析のために設計された完全自
動化機器は、種々の製造元から市販されている。
【０００９】最後に、１９９０年代に開発されたごく最
近の分離技法であるキャピラリゾーン電気泳動法（ＣＺ
Ｅ）も、アミノ酸分析のために調査された。現在、ＨＰ
ＬＣと同じ誘導体化反応が適用されるが、研究は、純粋
な標準物から成る単純なサンプルを超えてはいない。ア
ミノ酸分析の分野における更なる開発が期待されるはず
である。
近の分離技法であるキャピラリゾーン電気泳動法（ＣＺ
Ｅ）も、アミノ酸分析のために調査された。現在、ＨＰ
ＬＣと同じ誘導体化反応が適用されるが、研究は、純粋
な標準物から成る単純なサンプルを超えてはいない。ア
ミノ酸分析の分野における更なる開発が期待されるはず
である。
【００１０】結論として、アミノ酸分析のためにＧＣ又
はＨＰＬＣを用いることの欠点は、その分析というより
はむしろサンプル調製に関連する困難にある。ＧＣ及び
ＨＰＬＣのためのこれらの面倒なサンプル調製手順、並
びにＨＰＬＣの場合の検出の難しさによって、末端ユー
ザはこれらの技法を採用するのを断念している。これら
の理由のために、イオン交換に基づく伝統的で耐久性の
あるアミノ酸分析機器は、その長い分析時間にもかかわ
らず最も普及している。
はＨＰＬＣを用いることの欠点は、その分析というより
はむしろサンプル調製に関連する困難にある。ＧＣ及び
ＨＰＬＣのためのこれらの面倒なサンプル調製手順、並
びにＨＰＬＣの場合の検出の難しさによって、末端ユー
ザはこれらの技法を採用するのを断念している。これら
の理由のために、イオン交換に基づく伝統的で耐久性の
あるアミノ酸分析機器は、その長い分析時間にもかかわ
らず最も普及している。
【００１１】発明の要旨 本発明の１つの態様は、液体サンプルに含まれる少なく
とも１つのタイプのフリーアミノ酸を分析する方法に関
する。その方法によると、タンパク質がもしあればそれ
が保持されるのを回避しながら、フリーアミノ酸をイオ
ン交換樹脂に保持するために、液体はイオン交換され
る。樹脂を溶離媒体で処理することによってアミノ酸は
イオン交換樹脂から解放され、その後は、アミノ酸は溶
出液に含まれる。溶出液に含まれるアミノ酸は誘導体化
試薬を溶出液に添加することによって誘導体化され、こ
こで溶離媒体は、誘導体化反応媒体としての役割も果た
す。得られたアミノ酸誘導体はクロマトグラフィ分析に
よって分離される。
とも１つのタイプのフリーアミノ酸を分析する方法に関
する。その方法によると、タンパク質がもしあればそれ
が保持されるのを回避しながら、フリーアミノ酸をイオ
ン交換樹脂に保持するために、液体はイオン交換され
る。樹脂を溶離媒体で処理することによってアミノ酸は
イオン交換樹脂から解放され、その後は、アミノ酸は溶
出液に含まれる。溶出液に含まれるアミノ酸は誘導体化
試薬を溶出液に添加することによって誘導体化され、こ
こで溶離媒体は、誘導体化反応媒体としての役割も果た
す。得られたアミノ酸誘導体はクロマトグラフィ分析に
よって分離される。
【００１２】本発明のもう１つの態様は、液体サンプル
に含まれる少なくとも１つのタイプのフリーアミノ酸を
分析する際に使用するためのキットに関する。キットに
は、液体サンプルと接触したときにアミノ酸を捕獲する
ためにイオン交換樹脂で充填された吸着剤カートリッジ
と、アミノ酸をイオン交換樹脂から解放するための溶離
媒体と、解放されたアミノ酸を誘導体化するための誘導
体化剤と、が含まれ、溶離媒体は誘導体化の反応媒体で
ある。キットには更に、内部キャビティと、キャビティ
末端部の開口と、キャビティ内に配置された多孔性バリ
ヤと、を有する吸着剤カートリッジが含まれてもよい。
また更に、キットには、洗浄媒体と、抽出媒体と、クロ
マトカラムと、アミノ酸標準物と、定量測定で使用され
る内部標準溶液と、が含まれてもよい。
に含まれる少なくとも１つのタイプのフリーアミノ酸を
分析する際に使用するためのキットに関する。キットに
は、液体サンプルと接触したときにアミノ酸を捕獲する
ためにイオン交換樹脂で充填された吸着剤カートリッジ
と、アミノ酸をイオン交換樹脂から解放するための溶離
媒体と、解放されたアミノ酸を誘導体化するための誘導
体化剤と、が含まれ、溶離媒体は誘導体化の反応媒体で
ある。キットには更に、内部キャビティと、キャビティ
末端部の開口と、キャビティ内に配置された多孔性バリ
ヤと、を有する吸着剤カートリッジが含まれてもよい。
また更に、キットには、洗浄媒体と、抽出媒体と、クロ
マトカラムと、アミノ酸標準物と、定量測定で使用され
る内部標準溶液と、が含まれてもよい。
【００１３】発明の実施例の詳細な説明 本発明の種々の態様はここで更に詳細に議論されるであ
ろう。以下の説明の最初に、当業者は本発明の有利な結
果をそのまま達成しながらここに説明される発明を変更
できることは理解されるべきである。従って、以下の説
明は、当業者へ向けた広い教えの開示として理解される
べきであり、本発明への制限としてではない。
ろう。以下の説明の最初に、当業者は本発明の有利な結
果をそのまま達成しながらここに説明される発明を変更
できることは理解されるべきである。従って、以下の説
明は、当業者へ向けた広い教えの開示として理解される
べきであり、本発明への制限としてではない。
【００１４】本発明の１つの態様は、液体サンプル中の
フリーアミノ酸を分析することに関する。除タンパク処
理されていない血清、尿、又はアミノ酸を含む他の混合
物のような複雑な生体液は、分析用に容易に準備できる
であろう。本来のｐＨで前処理なしのオリジナル状態の
生体サンプル、もしくはメタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ
2Ｓ2Ｏ5）水溶液又はジチオトレイトールで希釈された
後の生体サンプルは、アミノ酸分離及びその後の誘導体
化のためにイオン交換が施される。希釈は血清ホモシス
テイン分析で必要とされ、希釈率は１：１（ｖ／ｖ）と
同程度でよい。
フリーアミノ酸を分析することに関する。除タンパク処
理されていない血清、尿、又はアミノ酸を含む他の混合
物のような複雑な生体液は、分析用に容易に準備できる
であろう。本来のｐＨで前処理なしのオリジナル状態の
生体サンプル、もしくはメタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ
2Ｓ2Ｏ5）水溶液又はジチオトレイトールで希釈された
後の生体サンプルは、アミノ酸分離及びその後の誘導体
化のためにイオン交換が施される。希釈は血清ホモシス
テイン分析で必要とされ、希釈率は１：１（ｖ／ｖ）と
同程度でよい。
【００１５】アミノ酸を保持するための吸着剤材料の選
択は、塩基条件下での吸着剤材料の化学的安定性に依存
する。シリカゲルベースの吸着剤は、その適応性が一般
的に２〜８のｐＨ範囲に制限されるのであまり適切でな
いようである。２，４又は８％の架橋を有するスチレン
−ジビニルベンゼン共重合体ベースの吸着剤は、塩基性
媒体中でより耐性がある。架橋度が高くなると粒子の膨
潤は低下するが、同時に、フェニルアラニン、チロシ
ン、及びトリプトファンなどの芳香族アミノ酸に対する
樹脂の保持容量は増大する。この理由のため、抽出ステ
ップで芳香族アミノ酸の回収が悪くなる（８％架橋樹脂
では６０％へ下がる）ので、その使用は推奨されない。
択は、塩基条件下での吸着剤材料の化学的安定性に依存
する。シリカゲルベースの吸着剤は、その適応性が一般
的に２〜８のｐＨ範囲に制限されるのであまり適切でな
いようである。２，４又は８％の架橋を有するスチレン
−ジビニルベンゼン共重合体ベースの吸着剤は、塩基性
媒体中でより耐性がある。架橋度が高くなると粒子の膨
潤は低下するが、同時に、フェニルアラニン、チロシ
ン、及びトリプトファンなどの芳香族アミノ酸に対する
樹脂の保持容量は増大する。この理由のため、抽出ステ
ップで芳香族アミノ酸の回収が悪くなる（８％架橋樹脂
では６０％へ下がる）ので、その使用は推奨されない。
【００１６】しかしながら、この不利益は、次の誘導体
化反応をイオン交換吸着剤樹脂の存在下で実行すること
によって克服できる。都合良く、アミノ酸がイオン交換
吸着剤によって捕獲された後、吸着剤は誘導体化反応の
ために反応容器へ移される。誘導体化反応は、イオン交
換吸着剤の存在下で実行される。反応の結果は、反応媒
体中の樹脂の存在によって否定的な影響を受けない。
化反応をイオン交換吸着剤樹脂の存在下で実行すること
によって克服できる。都合良く、アミノ酸がイオン交換
吸着剤によって捕獲された後、吸着剤は誘導体化反応の
ために反応容器へ移される。誘導体化反応は、イオン交
換吸着剤の存在下で実行される。反応の結果は、反応媒
体中の樹脂の存在によって否定的な影響を受けない。
【００１７】カチオン交換樹脂のイオン交換容量は、明
確な結果のために注意深く考慮されるべきである。ダウ
エックス５０Ｗタイプの樹脂は、５．２μeq／mgのイオ
ン交換容量を有する。実験データは、１００μｌの血清
サンプルでは必要とされるイオン交換樹脂の体積は樹脂
のタイプに依存することを示した。１００μｌの血清は
アミノ酸の他に１５μmolのＮａ+も含み、これは樹脂の
イオン交換位置を競う。このイオン量は、１．２〜１．
５倍のイオン交換容量、即ち４〜５mgの樹脂を必要とす
る。それぞれのタイプのイオン交換樹脂の膨潤度を考慮
に入れると、１００／２００及び２００／４００メッシ
ュサイズの両方について、必要な体積は、８，４、及び
２％の架橋樹脂でそれぞれ１２，２０、及び３５μｌで
ある。ダウエックスタイプのイオン交換体の容量は高
い。他の種類のイオン交換材料で充填された市販のカラ
ムは３０ミリグラム以上の充填物と共に届けられ、本発
明によればたった４〜５mgのダウエックス５０Ｗ交換体
で十分なので、これは不必要に高い。
確な結果のために注意深く考慮されるべきである。ダウ
エックス５０Ｗタイプの樹脂は、５．２μeq／mgのイオ
ン交換容量を有する。実験データは、１００μｌの血清
サンプルでは必要とされるイオン交換樹脂の体積は樹脂
のタイプに依存することを示した。１００μｌの血清は
アミノ酸の他に１５μmolのＮａ+も含み、これは樹脂の
イオン交換位置を競う。このイオン量は、１．２〜１．
５倍のイオン交換容量、即ち４〜５mgの樹脂を必要とす
る。それぞれのタイプのイオン交換樹脂の膨潤度を考慮
に入れると、１００／２００及び２００／４００メッシ
ュサイズの両方について、必要な体積は、８，４、及び
２％の架橋樹脂でそれぞれ１２，２０、及び３５μｌで
ある。ダウエックスタイプのイオン交換体の容量は高
い。他の種類のイオン交換材料で充填された市販のカラ
ムは３０ミリグラム以上の充填物と共に届けられ、本発
明によればたった４〜５mgのダウエックス５０Ｗ交換体
で十分なので、これは不必要に高い。
【００１８】このように少量の樹脂ベッド（吸着床）を
数秒以内にその場で調製する際、本発明の好ましい実施
例は吸着剤カートリッジを使用する。吸着剤カートリッ
ジは、次第に細くなったチップを有する長尺内部キャビ
ティと、チップ末端部の開口と、を有する。多孔性バリ
ヤはキャビティ内に配置され、バリヤと、キャビティ壁
と、チップ末端部の開口と、の間の吸着剤体積を画定す
る。吸着剤は吸着剤体積内に配置され、分析されるべき
液体は開口を通って吸着剤内ヘ吸い込まれる。
数秒以内にその場で調製する際、本発明の好ましい実施
例は吸着剤カートリッジを使用する。吸着剤カートリッ
ジは、次第に細くなったチップを有する長尺内部キャビ
ティと、チップ末端部の開口と、を有する。多孔性バリ
ヤはキャビティ内に配置され、バリヤと、キャビティ壁
と、チップ末端部の開口と、の間の吸着剤体積を画定す
る。吸着剤は吸着剤体積内に配置され、分析されるべき
液体は開口を通って吸着剤内ヘ吸い込まれる。
【００１９】吸着剤カートリッジは、多孔性バリヤとし
てＰＥフィルタが装備された実験室用ピペットチップを
用いて形成することができ、フィルタ下の異なる体積
（通常１２μｌ以上）で利用可能である。ピストンを有
するもう１つのチップ（いわゆるセッタ又はステッパ）
をピペットチップへ接続することによって、適切な溶媒
中の樹脂スラリは、体積が吸着剤で充填されるまでフィ
ルタ下の自由空間（吸着剤体積）内ヘ吸い込まれること
ができ、これにより、正確に画定された体積の交換体ベ
ッドが形成される。溶媒はＰＥフィルタを通って吸い込
まれるが、吸着剤は吸着剤体積中に留まる。好ましく
は、イオン交換樹脂及びグリセロール−水１：１から成
るスラリが使用されるべきである。
てＰＥフィルタが装備された実験室用ピペットチップを
用いて形成することができ、フィルタ下の異なる体積
（通常１２μｌ以上）で利用可能である。ピストンを有
するもう１つのチップ（いわゆるセッタ又はステッパ）
をピペットチップへ接続することによって、適切な溶媒
中の樹脂スラリは、体積が吸着剤で充填されるまでフィ
ルタ下の自由空間（吸着剤体積）内ヘ吸い込まれること
ができ、これにより、正確に画定された体積の交換体ベ
ッドが形成される。溶媒はＰＥフィルタを通って吸い込
まれるが、吸着剤は吸着剤体積中に留まる。好ましく
は、イオン交換樹脂及びグリセロール−水１：１から成
るスラリが使用されるべきである。
【００２０】次に、フリーアミノ酸を含む液体サンプル
は同じ方法で吸着剤体積内ヘ吸入され、樹脂と相互作用
を起こす。サンプル液が吸着剤を通過すると、アミノ酸
はいくらかのタンパク質及びサンプルの他の成分と共に
樹脂に捕獲され、液体サンプル中の他の成分はバリヤを
通過する。例えば、体液（５０乃至１００μｌの血漿又
は血清、もしくは内部標準として使用されるノルバリン
溶液で希釈された１００乃至２００μｌの尿）（後に洗
浄溶液が続く）は、セッタのピストンを上方へゆっくり
動かすことによってベッドを通って吸い込まれる。カチ
オン交換樹脂によって保持されないサンプル成分は吸い
込まれてなくなる。次の洗浄の間、吸着剤層の粒子間の
空間に捕獲された多くのタンパク質及びサンプル成分
は、除去及び洗浄される。洗浄溶媒混合物は、イソプロ
パノール、アセトニトリル、又はアセトンなどの水と混
和性の有機溶媒を含み、好ましくは、２００μｌの水：
ｎ−プロパノール２：１（ｖ／ｖ）である。その後、吸
着剤カートリッジ内に空気を吸い込むことによって、ほ
とんどの洗浄液はイオン交換ベッドから除去される。セ
ッタの内容物は廃棄され、溶離媒体（イオン交換体のタ
イプ及び体積によって約２００乃至３００μｌの溶媒混
合物）は交換体ベッドを通って吸い込まれる。
は同じ方法で吸着剤体積内ヘ吸入され、樹脂と相互作用
を起こす。サンプル液が吸着剤を通過すると、アミノ酸
はいくらかのタンパク質及びサンプルの他の成分と共に
樹脂に捕獲され、液体サンプル中の他の成分はバリヤを
通過する。例えば、体液（５０乃至１００μｌの血漿又
は血清、もしくは内部標準として使用されるノルバリン
溶液で希釈された１００乃至２００μｌの尿）（後に洗
浄溶液が続く）は、セッタのピストンを上方へゆっくり
動かすことによってベッドを通って吸い込まれる。カチ
オン交換樹脂によって保持されないサンプル成分は吸い
込まれてなくなる。次の洗浄の間、吸着剤層の粒子間の
空間に捕獲された多くのタンパク質及びサンプル成分
は、除去及び洗浄される。洗浄溶媒混合物は、イソプロ
パノール、アセトニトリル、又はアセトンなどの水と混
和性の有機溶媒を含み、好ましくは、２００μｌの水：
ｎ−プロパノール２：１（ｖ／ｖ）である。その後、吸
着剤カートリッジ内に空気を吸い込むことによって、ほ
とんどの洗浄液はイオン交換ベッドから除去される。セ
ッタの内容物は廃棄され、溶離媒体（イオン交換体のタ
イプ及び体積によって約２００乃至３００μｌの溶媒混
合物）は交換体ベッドを通って吸い込まれる。
【００２１】吸着剤に保持されたアミノ酸は、次の誘導
体化ステップで反応媒体としての役割も果たす抽出溶媒
混合物を用いて、吸着剤カートリッジから抽出される。
別の方法においては、交換体ベッドは溶離媒体と共に反
応容器中へ押し出され、誘導体化の収率に否定的な影響
を与えることなく、樹脂の存在下で誘導体化が実行され
る。サンプルマトリックスからアミノ酸を分離するため
に８％架橋のイオン交換体が用いられ、芳香族アミノ酸
がより強力に樹脂に保持される場合には、後者の手順が
有利に使用できる。
体化ステップで反応媒体としての役割も果たす抽出溶媒
混合物を用いて、吸着剤カートリッジから抽出される。
別の方法においては、交換体ベッドは溶離媒体と共に反
応容器中へ押し出され、誘導体化の収率に否定的な影響
を与えることなく、樹脂の存在下で誘導体化が実行され
る。サンプルマトリックスからアミノ酸を分離するため
に８％架橋のイオン交換体が用いられ、芳香族アミノ酸
がより強力に樹脂に保持される場合には、後者の手順が
有利に使用できる。
【００２２】抽出溶媒／反応媒体は、水又は塩類溶液
（０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液）、直鎖又は分枝鎖アル
カノ−ル、及び塩基の混合物である。１〜４個の炭素原
子を有するアルカノールが使用できる。適切な塩基は、
ピリジン、又はピコリンと呼ばれるそのメチル誘導体で
ある。この抽出溶媒混合物は、リシン、オルニチン、ヒ
スチジン、及びアルギニン等の塩基性アミノ酸をイオン
交換樹脂から解放するほどは強くない。従って、０．１
〜３％（ｗ／ｗ）のアルカリ金属の水酸化物又は炭酸塩
のような強塩基を添加すると、それらを解放することが
できる。塩基の添加は、次の誘導体化反応を妨害しな
い。それは、塩基性アミノ酸と同様に、グルタミン酸の
収率も高める。後者は、より高い収率のために炭酸塩よ
りも水酸化物を好む。結論としては、抽出溶媒／反応媒
体として、塩類溶液中に１％ＮａＯＨを含む混合溶液
は、ｎ−プロパノール：３−ピコリン（５：１、ｖ／
ｖ）の混合物と混合されるべきである。この溶液は、Ｎ
ａＯＨ溶液を有機溶媒混合物と３：２（ｖ／ｖ）の比率
で混合することによって、毎日調製されるべきである。
抽出溶媒／反応媒体の最終的な組成は、ＮａＯＨ塩類溶
液：ｎ−プロパノール：３−ピコリン９：５：１（ｖ／
ｖ／ｖ）であろう。
（０．１５ＭのＮａＣｌ水溶液）、直鎖又は分枝鎖アル
カノ−ル、及び塩基の混合物である。１〜４個の炭素原
子を有するアルカノールが使用できる。適切な塩基は、
ピリジン、又はピコリンと呼ばれるそのメチル誘導体で
ある。この抽出溶媒混合物は、リシン、オルニチン、ヒ
スチジン、及びアルギニン等の塩基性アミノ酸をイオン
交換樹脂から解放するほどは強くない。従って、０．１
〜３％（ｗ／ｗ）のアルカリ金属の水酸化物又は炭酸塩
のような強塩基を添加すると、それらを解放することが
できる。塩基の添加は、次の誘導体化反応を妨害しな
い。それは、塩基性アミノ酸と同様に、グルタミン酸の
収率も高める。後者は、より高い収率のために炭酸塩よ
りも水酸化物を好む。結論としては、抽出溶媒／反応媒
体として、塩類溶液中に１％ＮａＯＨを含む混合溶液
は、ｎ−プロパノール：３−ピコリン（５：１、ｖ／
ｖ）の混合物と混合されるべきである。この溶液は、Ｎ
ａＯＨ溶液を有機溶媒混合物と３：２（ｖ／ｖ）の比率
で混合することによって、毎日調製されるべきである。
抽出溶媒／反応媒体の最終的な組成は、ＮａＯＨ塩類溶
液：ｎ−プロパノール：３−ピコリン９：５：１（ｖ／
ｖ／ｖ）であろう。
【００２３】抽出液は誘導体化のために反応容器へ移さ
れる。ＧＣを使用するために、アミノ酸は、揮発性誘導
体へ化学的に変換されなければならない。誘導体化反応
は、アミノ酸分子中のアミノ基のアルキル化及びカルボ
キシル基のエステル化反応を同時に行わせることに基づ
く。クロロぎ酸のアルキルエステルは誘導体化試薬とし
て使用される。アルキル鎖は、１〜４個の炭素原子を有
するのが有利である。クロロぎ酸エチル、プロピル、及
びイソブチルが好ましい。試薬は、最短でも１分の間隔
で分割して添加されるべきである。
れる。ＧＣを使用するために、アミノ酸は、揮発性誘導
体へ化学的に変換されなければならない。誘導体化反応
は、アミノ酸分子中のアミノ基のアルキル化及びカルボ
キシル基のエステル化反応を同時に行わせることに基づ
く。クロロぎ酸のアルキルエステルは誘導体化試薬とし
て使用される。アルキル鎖は、１〜４個の炭素原子を有
するのが有利である。クロロぎ酸エチル、プロピル、及
びイソブチルが好ましい。試薬は、最短でも１分の間隔
で分割して添加されるべきである。
【００２４】アミノ酸は、前記のようにイオン交換樹脂
から水系溶媒混合物中に抽出される。反対に、誘導体化
試薬は、イソオクタン及びクロロホルム、ジクロロメタ
ン及びアセトニトリル、又はイソオクタン及びジクロロ
エタンのような非水系溶媒混合物中に混合される。得ら
れるアミノ酸誘導体はこの有機溶媒混合物中に濃縮さ
れ、ただ１つの最終サンプル調製ステップの後に容易に
分析できる。誘導体化のために好ましい混合物には、
３：３：２の比率のアセトニトリル−ジクロロメタン−
クロロぎ酸プロピル、３：３：２の比率のアセトニトリ
ル−ジクロロメタン−クロロぎ酸エチル、及び１：１：
１の比率のアセトニトリル−ジクロロメタン−クロロぎ
酸プロピル、が含まれる。誘導体化は一般的に室温で実
行される。トルエン、tert−ブチルメチルエーテル、あ
るいは後者とジクロロメタンの混合物のように、他の有
機溶媒が抽出媒体として使用されてもよい。
から水系溶媒混合物中に抽出される。反対に、誘導体化
試薬は、イソオクタン及びクロロホルム、ジクロロメタ
ン及びアセトニトリル、又はイソオクタン及びジクロロ
エタンのような非水系溶媒混合物中に混合される。得ら
れるアミノ酸誘導体はこの有機溶媒混合物中に濃縮さ
れ、ただ１つの最終サンプル調製ステップの後に容易に
分析できる。誘導体化のために好ましい混合物には、
３：３：２の比率のアセトニトリル−ジクロロメタン−
クロロぎ酸プロピル、３：３：２の比率のアセトニトリ
ル−ジクロロメタン−クロロぎ酸エチル、及び１：１：
１の比率のアセトニトリル−ジクロロメタン−クロロぎ
酸プロピル、が含まれる。誘導体化は一般的に室温で実
行される。トルエン、tert−ブチルメチルエーテル、あ
るいは後者とジクロロメタンの混合物のように、他の有
機溶媒が抽出媒体として使用されてもよい。
【００２５】アミノ酸のアルキル化−エステル化及び誘
導体の有機相への共抽出は、水系−非水系の界面で進行
する。アミノ酸抽出物と誘導体化試薬の相互作用は、勢
いよく混合することによって高められる。試薬は２つ又
は３つの連続部分で添加されるのが有利である。それぞ
れの試薬添加の間には、強力な混合が必要とされる。第
２の試薬添加は最初の添加の２分後に続くべきである。
第３の添加は第２の添加の１分後に続けばよい。反応は
室温で進行する。好ましくは、次の最適な手順が使用さ
れるべきである。試薬の最初の添加は５０μｌのイソオ
クタン：クロロぎ酸プロピル５：１（ｖ／ｖ）であり、
次に１分間隔でそれぞれ２〜３秒長さの２回の強力な混
合ステップが行われた後、１００μｌのジクロロメタ
ン：イソオクタン：クロロぎ酸プロピル２４：１６：１
（ｖ／ｖ／ｖ）混合物の第２の添加が行われ、次に２〜
３秒間混合される。
導体の有機相への共抽出は、水系−非水系の界面で進行
する。アミノ酸抽出物と誘導体化試薬の相互作用は、勢
いよく混合することによって高められる。試薬は２つ又
は３つの連続部分で添加されるのが有利である。それぞ
れの試薬添加の間には、強力な混合が必要とされる。第
２の試薬添加は最初の添加の２分後に続くべきである。
第３の添加は第２の添加の１分後に続けばよい。反応は
室温で進行する。好ましくは、次の最適な手順が使用さ
れるべきである。試薬の最初の添加は５０μｌのイソオ
クタン：クロロぎ酸プロピル５：１（ｖ／ｖ）であり、
次に１分間隔でそれぞれ２〜３秒長さの２回の強力な混
合ステップが行われた後、１００μｌのジクロロメタ
ン：イソオクタン：クロロぎ酸プロピル２４：１６：１
（ｖ／ｖ／ｖ）混合物の第２の添加が行われ、次に２〜
３秒間混合される。
【００２６】ピリジンはアミノ酸誘導体と共に有機相へ
抽出される。それはガスクロマトグラフィ分析を妨害
し、１ＭのＨＣｌ溶液で抽出することによって除去でき
る。１００μｌのこの溶液は、試薬との最後の混合の３
０秒後に添加されるべきである。この操作の間、水相に
おけるプロパノール及びピリジンの共抽出のために有機
相の体積は減少する。残りの有機相はアミノ酸誘導体を
含み、ＧＣによって容易に分析することができる。得ら
れた有機相は残存水分のために濁っているかもしれな
い。水系ＨＣｌ相を除去した後、それはいくらかのドラ
イ硫酸ナトリウムを添加することによって乾燥できる。
抽出される。それはガスクロマトグラフィ分析を妨害
し、１ＭのＨＣｌ溶液で抽出することによって除去でき
る。１００μｌのこの溶液は、試薬との最後の混合の３
０秒後に添加されるべきである。この操作の間、水相に
おけるプロパノール及びピリジンの共抽出のために有機
相の体積は減少する。残りの有機相はアミノ酸誘導体を
含み、ＧＣによって容易に分析することができる。得ら
れた有機相は残存水分のために濁っているかもしれな
い。水系ＨＣｌ相を除去した後、それはいくらかのドラ
イ硫酸ナトリウムを添加することによって乾燥できる。
【００２７】有機アリコートはガスクロマトグラフィ
（ＧＣ）によって分析されるが、それに限定されない。
分析は、内径０．１８〜０．３２mm及び長さ５〜１５ｍ
の中極性フューズドシリカキャピラリカラム（medium p
olarity fused silica capillary column)で実行され
た。有利に、内径０．２５mm、長さ１０〜１２ｍ、及び
膜厚０．２５μｍを有するゼブロンアミノ酸カラム(Zeb
ron Amino Acid column)を使用できる。２５〜４０℃／
分の速度の温度プログラミングは、８分より短い時間で
全ての必須アミノ酸を溶離することを保証する。
（ＧＣ）によって分析されるが、それに限定されない。
分析は、内径０．１８〜０．３２mm及び長さ５〜１５ｍ
の中極性フューズドシリカキャピラリカラム（medium p
olarity fused silica capillary column)で実行され
た。有利に、内径０．２５mm、長さ１０〜１２ｍ、及び
膜厚０．２５μｍを有するゼブロンアミノ酸カラム(Zeb
ron Amino Acid column)を使用できる。２５〜４０℃／
分の速度の温度プログラミングは、８分より短い時間で
全ての必須アミノ酸を溶離することを保証する。
【００２８】本発明の主要な利点の１つには、サンプル
調製手順及び調製サンプルの分析の速さ及び簡単さが含
まれる。他の手順で誘導体化の前に必要とされる時間の
かかる除タンパク質及びサンプル蒸発は回避される。完
全なアミノ酸プロファイルは、ガスクロマトグラフィを
用いて非常に短時間で決定される。この手順は、液体の
調合、液体のシリンジへの吸い込み、液体の混合、及び
非混和性の２つの相の分離のように、連続した簡単な実
験操作である。
調製手順及び調製サンプルの分析の速さ及び簡単さが含
まれる。他の手順で誘導体化の前に必要とされる時間の
かかる除タンパク質及びサンプル蒸発は回避される。完
全なアミノ酸プロファイルは、ガスクロマトグラフィを
用いて非常に短時間で決定される。この手順は、液体の
調合、液体のシリンジへの吸い込み、液体の混合、及び
非混和性の２つの相の分離のように、連続した簡単な実
験操作である。
【００２９】もう１つの主要な利点は、それが基づく優
れた誘導体化反応である。この反応はどのアミノ酸へも
適用可能であり、誘導体は、通常の普遍的なＧＣ検出器
（ＦＩＤ）で容易に検出される。反応は室温で実行さ
れ、１つのステップで進行し、それは迅速であり、誘導
体化ステップの最後に誘導体は有機相に容易に抽出され
る。この相は分析のためにＧＣへ注入される。適切な貯
蔵条件が与えられれば、分析は後で実行されてもよい。
れた誘導体化反応である。この反応はどのアミノ酸へも
適用可能であり、誘導体は、通常の普遍的なＧＣ検出器
（ＦＩＤ）で容易に検出される。反応は室温で実行さ
れ、１つのステップで進行し、それは迅速であり、誘導
体化ステップの最後に誘導体は有機相に容易に抽出され
る。この相は分析のためにＧＣへ注入される。適切な貯
蔵条件が与えられれば、分析は後で実行されてもよい。
【００３０】更に、この調製及び分析プロセスは、体
液、タンパク質の水解物、発酵ブイヨンなどの広い範囲
のサンプルへ適用されることができる。現存の古典的な
ＡＡＡプロファイルとの比較研究によって、本発明に従
って得られたアミノ酸プロファイルの良好な再現性及び
精度が示された。
液、タンパク質の水解物、発酵ブイヨンなどの広い範囲
のサンプルへ適用されることができる。現存の古典的な
ＡＡＡプロファイルとの比較研究によって、本発明に従
って得られたアミノ酸プロファイルの良好な再現性及び
精度が示された。
【００３１】本発明のもう１つの態様は液体中のフリー
アミノ酸を分析する装置及びキットを提供することに関
し、上記で議論したような有利な方法を使用する。装置
は、最小限の手動操作で、クロマトグラフィ分析用のア
ミノ酸を含むアミノ酸サンプルを調製する。装置は、ク
ロマトグラフィ、好ましくはＧＣを含むのが有利であ
る。キットは、アミノ酸を分離するためのツールと、洗
浄、抽出及び誘導体化のための試薬と、を含むのが有利
である。上記で議論した吸着剤カートリッジは、サンプ
ル液からアミノ酸を分離するための好ましいツールとし
て使用されるが、これに限定されない。洗浄、抽出及び
誘導体化のための試薬は、好ましくは、上記で議論した
ものから選択される。誘導体化したアミノ酸をプロファ
イルするためのカラムも含むことができる。カラムはガ
スクロマトグラフィで使用するためのものが有利であ
り、好ましくはアミノ酸ゼブロンフューズドシリカキャ
ピラリカラム（Amino Acid Zebron fused silica capil
lary column）である。更に、アミノ酸標準物及び内部
標準溶液が更に含まれ、サンプル中に存在するアミノ酸
の同定及び定量を可能にできる。好ましくは、次の標準
溶液が提供される。
アミノ酸を分析する装置及びキットを提供することに関
し、上記で議論したような有利な方法を使用する。装置
は、最小限の手動操作で、クロマトグラフィ分析用のア
ミノ酸を含むアミノ酸サンプルを調製する。装置は、ク
ロマトグラフィ、好ましくはＧＣを含むのが有利であ
る。キットは、アミノ酸を分離するためのツールと、洗
浄、抽出及び誘導体化のための試薬と、を含むのが有利
である。上記で議論した吸着剤カートリッジは、サンプ
ル液からアミノ酸を分離するための好ましいツールとし
て使用されるが、これに限定されない。洗浄、抽出及び
誘導体化のための試薬は、好ましくは、上記で議論した
ものから選択される。誘導体化したアミノ酸をプロファ
イルするためのカラムも含むことができる。カラムはガ
スクロマトグラフィで使用するためのものが有利であ
り、好ましくはアミノ酸ゼブロンフューズドシリカキャ
ピラリカラム（Amino Acid Zebron fused silica capil
lary column）である。更に、アミノ酸標準物及び内部
標準溶液が更に含まれ、サンプル中に存在するアミノ酸
の同定及び定量を可能にできる。好ましくは、次の標準
溶液が提供される。
【００３２】I． ０．１ＭＨＣｌに溶解したタンパク
質水解物中に一般的な１７種の必須アミノ酸 II． 中性溶液に溶解したアスパラギン、グルタミン及
びトリプトファン III． 尿中に一般的に見られる必須でないアミノ酸
質水解物中に一般的な１７種の必須アミノ酸 II． 中性溶液に溶解したアスパラギン、グルタミン及
びトリプトファン III． 尿中に一般的に見られる必須でないアミノ酸
【００３３】アミノ酸分析キットの構成品は、アミノ酸
を含む複雑な混合物のための簡単、迅速、及び再現性の
あるサンプル調製を可能にする。キットは、サンプル調
製及びサンプル分析の方法に関して，上記で議論した全
ての利点を提供する。また、キットは、特に、吸着剤カ
ートリッジに関する利点を有する。複雑なサンプル中の
アミノ酸の分離のために使用される吸着剤カートリッジ
は、最少量の吸着剤材料を保持する市販のピペットチッ
プから成る。これらのカートリッジは費用効果が高く、
その使用は、サンプル調製の次のステップにおいて試薬
及び廃棄物の更なる節約を保証する。
を含む複雑な混合物のための簡単、迅速、及び再現性の
あるサンプル調製を可能にする。キットは、サンプル調
製及びサンプル分析の方法に関して，上記で議論した全
ての利点を提供する。また、キットは、特に、吸着剤カ
ートリッジに関する利点を有する。複雑なサンプル中の
アミノ酸の分離のために使用される吸着剤カートリッジ
は、最少量の吸着剤材料を保持する市販のピペットチッ
プから成る。これらのカートリッジは費用効果が高く、
その使用は、サンプル調製の次のステップにおいて試薬
及び廃棄物の更なる節約を保証する。
【００３４】本発明の種々の特徴は次の例に関して更に
議論されるであろう。これは本発明の説明を意図したも
のであり、本発明の範囲を制限するものではない。以下
の例で使用される必要な溶媒及び試薬は、シグマ−アル
ドリッチ−フルカから得られた。
議論されるであろう。これは本発明の説明を意図したも
のであり、本発明の範囲を制限するものではない。以下
の例で使用される必要な溶媒及び試薬は、シグマ−アル
ドリッチ−フルカから得られた。
【００３５】実施例１ １００μｌの血清サンプルは、２：１の比率で内部標準
溶液で希釈される。０．２％シュウ酸カリウム（Ｋ2Ｃ2
Ｏ4）＋０．５％メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ
2Ｏ5）溶液にノルバリンを４００μmol／ｌの濃度に溶
かしたものを、内部標準として使用できる。血清サンプ
ルは、吸着剤カートリッジに吸い込まれる。吸着剤カー
トリッジは、セッタ、プランジャ付き小体積シリンジヘ
取り付けられる。プランジャをゆっくり引き戻すことに
よって、吸着剤カートリッジと液体で接続されたセッタ
体積中に減圧が生じる。サンプルカートリッジは、バイ
オテクグレードのバイオラッドＡＧ５０Ｗｘ２カチオン
交換樹脂（１００／２００メッシュ）で充填される。血
清サンプルのアミノ酸成分は、イオン交換樹脂に保持さ
れる。次のステップでは、２００μｌの洗浄溶液が吸着
剤ベッドを通過される。全ての液体がセッタ体積に捕集
されるまでピストンはゆっくりと引き戻される。液体は
廃棄される。次に、アミノ酸は、２００μｌの抽出溶媒
／反応媒体で吸着剤ベッドから抽出される。全ての抽出
溶媒が吸着剤ベッドから排出されて、セッタ体積に溜ま
るまで、ピストンはゆっくりとした動きで引き出されな
ければならない。抽出物は反応バイアルへ移される。次
に、抽出アルキル化溶液は、それぞれ５０μｌの３つの
部分にわけて反応バイアルへ添加される。それぞれの添
加の後には、約３秒間の激しい混合が必要とされる。３
回目の添加（渦状攪拌が後に行われる）の１分後に、１
００μｌの１ＭＨＣｌ溶液が添加され、１０から１５秒
間渦状にかき混ぜる。アミノ酸誘導体を含む有機層は、
ガスクロマトグラフへ注入される。完全なプロファイル
は８分間より短い時間で得られるであろう。
溶液で希釈される。０．２％シュウ酸カリウム（Ｋ2Ｃ2
Ｏ4）＋０．５％メタ重亜硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ
2Ｏ5）溶液にノルバリンを４００μmol／ｌの濃度に溶
かしたものを、内部標準として使用できる。血清サンプ
ルは、吸着剤カートリッジに吸い込まれる。吸着剤カー
トリッジは、セッタ、プランジャ付き小体積シリンジヘ
取り付けられる。プランジャをゆっくり引き戻すことに
よって、吸着剤カートリッジと液体で接続されたセッタ
体積中に減圧が生じる。サンプルカートリッジは、バイ
オテクグレードのバイオラッドＡＧ５０Ｗｘ２カチオン
交換樹脂（１００／２００メッシュ）で充填される。血
清サンプルのアミノ酸成分は、イオン交換樹脂に保持さ
れる。次のステップでは、２００μｌの洗浄溶液が吸着
剤ベッドを通過される。全ての液体がセッタ体積に捕集
されるまでピストンはゆっくりと引き戻される。液体は
廃棄される。次に、アミノ酸は、２００μｌの抽出溶媒
／反応媒体で吸着剤ベッドから抽出される。全ての抽出
溶媒が吸着剤ベッドから排出されて、セッタ体積に溜ま
るまで、ピストンはゆっくりとした動きで引き出されな
ければならない。抽出物は反応バイアルへ移される。次
に、抽出アルキル化溶液は、それぞれ５０μｌの３つの
部分にわけて反応バイアルへ添加される。それぞれの添
加の後には、約３秒間の激しい混合が必要とされる。３
回目の添加（渦状攪拌が後に行われる）の１分後に、１
００μｌの１ＭＨＣｌ溶液が添加され、１０から１５秒
間渦状にかき混ぜる。アミノ酸誘導体を含む有機層は、
ガスクロマトグラフへ注入される。完全なプロファイル
は８分間より短い時間で得られるであろう。
【００３６】以下の表は、同じ血清ブレンドの８回の測
定から得られた結果を要約する。ホーン（J. Horn; J.
Amer. Statistic Assoc., vol. 78 (1983)）に従って統
計的な評価が成された。
定から得られた結果を要約する。ホーン（J. Horn; J.
Amer. Statistic Assoc., vol. 78 (1983)）に従って統
計的な評価が成された。
【００３７】
【表１】
【００３８】実施例２ 例１のように希釈された血清は、回収、即ち測定の再現
性及び精度を調査するために、それぞれ２００nmol/mL
の濃度を有するアミノ酸標準物が加えられた。
性及び精度を調査するために、それぞれ２００nmol/mL
の濃度を有するアミノ酸標準物が加えられた。
【００３９】得られた結果は次の表に示される（８回分
析の平均値、ホーンによる）。
析の平均値、ホーンによる）。
【００４０】
【表２】
【００４１】実施例３ 血漿サンプルは例１に記載されたように本発明に従って
ガスクロマトグラフィを用いる分析が行われ、ニンヒド
リン検出による自動アミノ酸アナライザ（ＩＥＣ、チェ
コ共和国のミクロテクナにより製造されるアナライザ、
ハンス, J. ブレマーらによる「アミノ酸代謝の妨害、
臨床化学及び診断、アーガン＆シュバルツェンベルグ、
バルチモア−ミュンヘン、1981」に記載された手順を用
いる）で得られた結果と比較された。
ガスクロマトグラフィを用いる分析が行われ、ニンヒド
リン検出による自動アミノ酸アナライザ（ＩＥＣ、チェ
コ共和国のミクロテクナにより製造されるアナライザ、
ハンス, J. ブレマーらによる「アミノ酸代謝の妨害、
臨床化学及び診断、アーガン＆シュバルツェンベルグ、
バルチモア−ミュンヘン、1981」に記載された手順を用
いる）で得られた結果と比較された。
【００４２】次の結果が得られた（nmol/ml、ホーンに
従う統計的評価）。
従う統計的評価）。
【００４３】
【表３】
【００４４】
【表４】
【００４５】
【表５】
【００４６】
【表６】
【００４７】
【表７】
【００４８】本発明に従う方法で達成された結果と従来
の自動アミノ酸アナライザによる結果との比較によっ
て、新しい手順は、全体の分析時間及びコストを大幅に
減少させながら、同等に有効なデータを与えることが示
された。
の自動アミノ酸アナライザによる結果との比較によっ
て、新しい手順は、全体の分析時間及びコストを大幅に
減少させながら、同等に有効なデータを与えることが示
された。
【００４９】本発明はある好ましい実施例に関して説明
されたが、当業者には明らかである他の実施例も本発明
の範囲内にある。例えば、当業者には容易に明らかであ
るけれども、各実施例のある特徴を他の実施例と結合す
ることができる。従って、本発明の範囲は、特許請求の
範囲によってのみ定義されるように意図される。
されたが、当業者には明らかである他の実施例も本発明
の範囲内にある。例えば、当業者には容易に明らかであ
るけれども、各実施例のある特徴を他の実施例と結合す
ることができる。従って、本発明の範囲は、特許請求の
範囲によってのみ定義されるように意図される。
【図１】吸着剤カートリッジの略図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｋ 30/50 30/50 33/68 33/68
Claims (32)
- 【請求項１】 流体サンプルに含まれる少なくとも１つ
のタイプのフリーアミノ酸を分析する方法であって、 タンパク質をできるだけ除去しながら、液体サンプルに
含まれるフリーアミノ酸をイオン交換樹脂に保持し、 溶離媒体でアミノ酸をイオン交換樹脂から解放し、これ
によりアミノ酸は溶出液に含まれ、 誘導体化試薬を溶出液へ添加することによってアミノ酸
を誘導体化し、溶離媒体は誘導体化の反応媒体であり、 ガスクロマトグラフィによって、誘導体化の結果得られ
た混合物からアミノ酸誘導体を分離する、ことを含む方
法。 - 【請求項２】 誘導体化が、誘導体化剤によるアミノ酸
のアミノ基のアルキル化及びカルボキシル基のエステル
化である請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 アミノ酸の解放及び誘導体化が、樹脂の
存在下で同時に実行できる請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 溶離媒体が、水と混和性の塩基性溶媒で
ある請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 抽出溶媒は水と混和性であるが、誘導体
化試薬は非水系溶媒中に添加され、アミノ酸誘導体は非
水系相に抽出される請求項４に記載の方法。 - 【請求項６】 アルキル化／エステル化試薬が、クロロ
ぎ酸アルキルを含む請求項２に記載の方法。 - 【請求項７】 アルキル化試薬が、アルキル部分に１〜
４個の炭素原子を含むクロロぎ酸アルキルを含む請求項
６に記載の方法。 - 【請求項８】 アルキル化試薬が、クロロぎ酸エチル、
クロロぎ酸プロピル、又はクロロぎ酸イソブチルを含む
請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 アルキル化が、イオン交換樹脂の存在下
で実行される請求項２に記載の方法。 - 【請求項１０】 イオン交換が、スチレン−ジビニルベ
ンゼンカチオン交換体で実行される請求項１に記載の方
法。 - 【請求項１１】 アミノ酸を保持するイオン交換樹脂
が、水と混和性のアルカノールを含む溶媒で洗浄される
請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 水と混和性のアルカノールが、エタノ
ール又はプロパノールを含む請求項１０に記載の方法。 - 【請求項１３】 イオン交換ステップが、 キャビティ末端部の開口と、キャビティ壁と、キャビテ
ィ内に配置された多孔性バリヤと、の間に画定された吸
着剤カートリッジの内部キャビティ内にイオン交換樹脂
を配置し、 流体がイオン交換樹脂と接触し、流体中のフリーアミノ
酸が樹脂によって捕獲されるように、開口を通って流体
をキャビティ内に吸い込む、 ことを含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項１４】 イオン交換樹脂が、溶媒中に懸濁され
た樹脂スラリを開口を通って吸い込むことによって、キ
ャビティ内に配置される請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１５】 多孔性バリヤのための材料が、バリヤ
によって流体はそこを通過できるが樹脂の通過は防止さ
れるように選択される請求項１３に記載の方法。 - 【請求項１６】 キャビティ内の多孔性バリヤの位置
が、吸着剤カートリッジの内部キャビティ内に配置され
る樹脂の体積を画定する請求項１５に記載の方法。 - 【請求項１７】 多孔性バリヤが、樹脂の体積が変えら
れるように再配置することができる請求項１５に記載の
方法。 - 【請求項１８】 クロマトグラフィを用いてアミノ酸誘
導体を分析することを更に含む請求項１に記載の方法。 - 【請求項１９】 分析が、ガスクロマトグラフィを使用
する請求項１８に記載の方法。 - 【請求項２０】 サンプルが、生体液である請求項１に
記載の方法。 - 【請求項２１】 流体に含まれる少なくとも１つの種類
のフリーアミノ酸を分析する際に使用するためのキット
であって、 流体と接触するときにアミノ酸を捕獲するためのイオン
交換樹脂と、 アミノ酸をイオン交換樹脂から解放するための溶離媒体
と、 解放されたアミノ酸を誘導体化するための誘導体化剤
と、 を備え、溶離媒体は誘導体化の反応媒体であるキット。 - 【請求項２２】 内部キャビティと、キャビティ末端部
の開口と、キャビティ内に配置された多孔性バリヤと、
を有する吸着剤カートリッジを更に含む請求項２１に記
載のキット。 - 【請求項２３】 イオン交換樹脂が、スラリの形である
請求項２２に記載のキット。 - 【請求項２４】 イオン交換樹脂が、吸着剤カートリッ
ジのキャビティ内に装填される請求項２２に記載のキッ
ト。 - 【請求項２５】 吸着剤カートリッジが、フィルタの付
いたピペットチップを含む請求項２２に記載のキット。 - 【請求項２６】 ピストンの付いたステッパを更に含む
請求項２３に記載のキット。 - 【請求項２７】 アミノ酸が捕獲された後にイオン交換
樹脂を洗浄するための洗浄媒体を更に含む請求項２１に
記載のキット。 - 【請求項２８】 溶離媒体が、水と混和性の塩基性溶媒
である請求項２１に記載のキット。 - 【請求項２９】 誘導体化の結果の混合物からアミノ酸
誘導体を抽出するための抽出媒体を更に含む請求項２１
に記載のキット。 - 【請求項３０】 誘導体化されたアミノ酸をプロファイ
ルするためのクロマトカラムを更に含む請求項２１に記
載のキット。 - 【請求項３１】 カラムはフューズドシリカキャピラリ
カラムを含む請求項３０に記載のキット。 - 【請求項３２】 アミノ酸の同定及び定量のためのアミ
ノ酸標準物及び／又は内部標準溶液を更に含む請求項２
１に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
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