CZ92697A3 - Novel estrenes intended for inducing hypothalamus effects - Google Patents

Description

Oblast techniky

Reference k příbuzným přihláškám ' ^Λ I

Tato přihláška je pokračováním sér. č. 08/127,980, podaným 28. 9. 1993, které je pokračováním U.S. patentové přihlášky, sér. č. 07/903,525, podané 24. 6. 1991, která je pokračováním U.S. patentové přihlášky sér. č. 07/707,862, podané 31. 5. 1991, která je pokračováním U.S. patentové přihlášky sér. č. 07/638,743, podané 7. 1. 1991, která je nyní opuštěna.

Přihláška se také týká jiného pokračování U.S. patentové přihlášky sér. č. 07/903,525, U.S. patentové přihlášky sér. č. 08/077,140, podané 15. 6. 1993, a společně projednávané U.S. patentové přihlášky sér. č. 07/903,604, podané 24. 6. 1991 (pokračování U.S. patentové přihlášky sér. č. 07/708,936, podané 31. 5. 1991, která je pokračováním 07/638, 185, podané 7. 1. 1991 a nyní opuštěné) jménem Androstene Steroids as Neurochemical Initiators of Change in Human Hypothalamic Function and Related Pharmaceutical compositions and Methods; a společně projednávané 07/903,604, podané 24. 6. 1992, U.S. patentové přihlášky sér. č. 08/077,359. Uvedené U.S. patentové přihlášky jsou zde všechny uvedeny jako reference.

Konečně se předkládaná přihláška týká společně projednávané U.S. patentové přihlášky jménem Fragrance Compositions Containing Human Pheromones, podané 24. 3. 1992, U.S. sér. č. 07/856,435.

Předkládaný vynález se týká obecně nových sloučenin a způsobů ovlivnění změn funkce lidského hypothalamu, čímž dojde k určité změně chování a fyziologie způsobené hypothalamem u daného jedince. Konkrétněji se vynález týká použití určitých estrenových steroidů pro neurochemickou úpravu fyziologie a chováni.

Dosavadní stav techniky

Předkládaný vynález se týká určitých sloučenin, konkrétně estrenových steroidů a příbuzných sloučenin, které jsou popsány dále, a způsobů použití těchto sloučenin jako lidských semiochemikálií pro změnu funkce hypothalamu, a tím následné ovlivnění určitého chování a fyziologie, např. snížení úzkosti. Estrenové steroidy jsou 17B-estradiol (1,3,5(10)-estratrien-3,17fi-diol) a jsou charakteristické tím, že se jedná o fenoly 1,3,5(10) A-kruh a hydroxyderiváty nebo deriváty hydroxylů, jako je ether nebo ester, v pozici 3-. Byly popsány feromonové vlastnosti některých estrenových steroidů na některé savce. Michael R.P., a kol.: Nátuře (1968), 218, 746 označují estrogeny (zejména estradiol) jako feromonální atraktant pro samce opic rhesus. Parrot, R.F.: Hormones and Behavior (1976), ý, 207-215, popisuje, že injekce estradiol benzoátu vyvolává kopulační chování u krys s vyjmutými vaječníky; a byla popsána role množství estradiolu v krvi pro sexuální odezvu u samců (Phoenix, C.H.: Physiol. and Behavior (1976), 16, 305-310) a u samic (Phoenix, C.H.: Hormones and Behavior (1977), 8, 356-362) opic rhesus. Na druhou stranu neexistuje v literatuře shoda zda hrají a nebo nehrají feromony nějakou roli v reprodukčním chování a komunikaci mezi jedinci u savců (Beuchamp, G.K., a kol.: The Pheromone Concept in Mammalian Chemical Communication: A Critique, v: Mammalian Olfaction, Reproductive Processes, and Behavior, Doty, R.L., editor, Academie Press, 1976).

Provedení podstaty předkládaného vynálezu se týká nesystemického, nosního podáváni určitých estrenových steroidů, které ovlivňují konkrétní chování nebo fyziologickou reakci u lidí, např. snížení nepříznivého chování, nálady a charakterových vlastností. Konkrétně umožňuje nosní podávání kontakt s neuroreceptory slabě prozkoumané neuroendokrinní struktury, obecně známé jako vomeronosní orgán (VNO; také známý jako Jacobsonův orgán) jedním nebo více steroidy nebo prostředkem, který obsahuje steroid(y). Tento orgán je přístupný nosními dírkami většiny vyšších živočichů - od hadů po lidi, a byl spojen, kromě jiného, s feromonální citlivostí k určitým látkám (viz obecně Muller-Schwarze & Silverstein, Chemical signals, Plenům Press, New York (1980)). Axony neuroepitelu vomeronosního orgánu, umístěné supra palatiálně, tvoří vomeronosní nerv a mají přímé synaptické napojení na přístup k čichovému pohárku a nepřímý vstup odtamtud ke kortikomediálnímu amygdaloidnímu přednímu mozku a hypothalamickému jádru mozku. Distální axony zakončení jsou nervové neurony a mohou sloužit jako neurochemické receptory ve VNO. Stensaas, L.J., a kol.: J. Steroid Biochem. and Molec. Biol. (1991), 39, 553. Tento nerv má přímé synaptické spojení s hypothalamem.

Johnson, A., a kol. (J. Otolaryngology (1985), 14, 71-79) popisuje důkaz přítomnosti vomeronosního orgánu u většiny dospělých lidí, ale dovozuje, že tento orgán je pravděpodobně nefunkční. Opačné výsledky, které popisují, že VNO je funkční chemosensorický receptor, jsou uvedeny v pracech Stensaas, L., a kol., supra; a Moran, D.T., a kol., Garcia-Velasco, J. a M. Mondragon; Monti-Bloch, L. a B. Grosser - vše v J. Steroid Biochem. and Molec. Biol. (1991) 39.

Je jasné, že je žádoucí identifikovat a syntetizovat lidské semiochemikálie a feromony a vyvinout farmaceutické prostředky a způsoby použití vlivu na funkce hypothalamu. Tento vynález se týká neočekávaného objevu, že při nosním podávání určitých neurochemických ligandů lidem, konkrétně určitých estrenových steroidů a příbuzných sloučenin, nebo farmaceutických prostředků, které obsahují určité estrenové steroidy nebo příbuzné sloučeniny, dochází ke specifické vazbě k chemoreceptorům nosních neuroepitelních buněk a tato vazba vyvolává sérii neurofyziologických reakcí, které vedou ke změně funkce hypothalamu u jedince. Při vhodném podávání vede vliv těchto sloučenin na hypothalamus k ovlivnění funkce nervového systému a různé jevy, které souvisí s chováním nebo fyziologií, včetně, ale tímto výčtem nejsou nijak omezeny: úzkosti, premenstruačního stresu, strachu, agresivity, hladu, tlaku krve a jiných funkcí chování a fyziologie, které jsou normálně regulovány hypothalamem. Otto Appenzeller, The Autonomie Nervous System. An Introduction of basic and clinical concepts (1990); Korner, P.I. Central nervous control of autonomie cardiovascular function, a Levý, N.M. a Martin,

P.J. Neural control of the heart, obě v Handbook of Physiology; Část 2: Cardiovaskular System - the Heart, sv. I, Washington DC, 1979, American Physiological Society; Fishman, A.P., a kol., editoři, Handbook of Physiology. Část 3: Respirátory System, sv. II. Control of Breathing. Bethesda MD, 1986. American Physiological Society.

V některých případech je podáván jediný estrenový steroid nebo příbuzná sloučenina, v některých případech je podávána kombinace estřenových steroidů a/nebo příbuzných sloučenin.

Podstata vynálezu

Shrnutí vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu jsou nové steroidy, které jsou lidskými semiochemikáliemi nebo feromony a jsou vhodné pro nosní podávání.

Další předměty, výhody a nové vlastnosti předkládaného vynálezu budou částečně uvedeny dále v popisu a částečně budou odborníkům jasné z praktického provádění předkládaného vynálezu. Předměty předkládaného vynálezu jsou dosaženy steroidy obecného vzorce (I):

Řó Ř4 (i) kde R_x je vybráno ze skupiny sestávající nezbytně z jednoho nebo dvou vodíků, methylu, methylenu a jednoho nebo dvou halogenů; R₂ chybí nebo je vybráno ze skupiny sestávající nezbytně z vodíku a methylu; R₃ je vybráno ze skupiny sestávající nezbytně z ketoskupiny, hydroxylu, nižšího alkoxylu, nižšího acyloxylu, benzoylu, cypionylu, glukuronidu a sulfonylu; R₄ je vybráno ze skupiny sestávající nezbytně z vodíku, hydroxylu, nižšího alkoxylu, nižšího acyloxylu, ketoskupiny a halogenu; R₅ chybí nebo je vybráno ze skupiny sestávající nezbytně z vodíku, hydroxylu, nižšího alkoxylu a nižšího acyloxylu; R_€ je vodík nebo halogen; a a je nepovinně aromaticky nenasycený kruh A uvedeného steroidu, nebo b, c a d jsou každé nepovinně dvojitá vazba; a e, f, g, h, i a j jsou každé nepovinně dvojitá vazba. V tomto provedení je steroid s výhodou podáván ve formě farmaceutického prostředku, který obsahuje jeden nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů; za předpokladu, že:

(I) pokud je přítomno ”a, R₃ je hydroxyl a j, i, g” a h všechny chybí, pak (a) R₄ nesmí být vodík; nebo (b) pokud chybí ”e a f, R₄ nesmí být ketoskupina;

(II) pokud je přítomno a, R₃ je hydroxyl a j, i a g všechny chybí, h je přítomno, pak R.[ nesmí být methylen;

(III) pokud jsou přítomny a, h a i, (a) pak přinejmenším jedno z e nebo f je přítomno, (b) R_x je methylen nebo (c) R₃ není vodík;

(IV) pokud je přítomno b, R₃ je ketoskupina, g, h, i, j všechny chybí, R. je vodík, (a) pak R_x nesmí být jeden nebo dva vodíky pokud není přítomno f nebo (b) pokud je přítomno ”f pak Rj nesmí být methyl;

(V) pokud je přítomno b a j a R₃ je ketoskupina, pak musí být přítomno přinejmenším jedno z e nebo f nebo musí být R₃ methylen;

(VI) pokud je přítomno c, d chybí a R₃ je hydroxyl, pak (a) musí být přítomno přinejmenším jedno z e nebo ”f nebo (b) musí být R₃ methylen;

(VII) pokud je přítomno c a d” a R₃ je methoxyl, pak (a) musí být přítomno přinejmenším jedno z e nebo f nebo (b) musí být R₃ methylen;

(VIII) pokud je přítomno b, R₃ je hydroxyl a R₅ je vodík, pak (a) musí být přítomno přinejmenším jedno z e nebo f nebo (b) musí být R₂ methylen.

Preferovanou skupinou sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou ty, ve kterých je přítomno a a g, h nebo i jsou nepovinně dvojné vazby. Jiná preferovaná skupina obsahuje b”, c” nebo j jako dvojné vazby. Ještě jiná skupina obsahuje c a d jako dvojné vazby. Další skupina obsahuje R₂ jako methyl a e jako dvojnou vazbu.

Pojem nižší alkyl, nižší alkoxyl atd., zahrnuje uhlíkové řetězce délky 1 až 6 atomů uhlíku, s výhodou 1 až 4 atomů uhlíku. Halogen je I, Br, F a Cl.

Steroidy podle předkládaného vynálezu mění funkci hypothalamu a autonomní funkci u jedince. Ligand pro chemoreceptor umístěný na povrchu nosní neuroepitělní buňky je všude tam, kde je buňka součástí jiné tkáně než čichového epitelu; a ligand je podáván nosem jedince tak, že se váže specificky k chemoreceptoru, což vede ke změně funkce hypothalamu u jedince.

Všechna provedení této přihlášky se týkají a zahrnují funkční ekvivalenty steroidní struktury popsané v těchto provedeních a těch modifikovaných steroidů, které vykazují funkční ekvivalenci, ať se jedná o explicitně popsané modifikované steroidy.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 ilustruje syntézu l_z3,5(10),16-estratetraen-3-olu.

Obrázky 2A, 2b a 2C jsou grafickým vyjádřením elektrofyziologického účinku na potenciál receptoru při lokálním podání konkrétního steroidu do vomeronosního orgánu mužů (obr. 2A) a na čichový epitel (obr. 2C) . Obrázek 2B je grafickým porovnáním vlivu estrenu na potenciál VNO receptoru u mužů a žen.

Obrázek 3 je grafickým vyjádřením elektrofyziologického účinku na potenciál receptoru při lokálním podání konkrétního steroidu do vomeronosního orgánu mužů (obr. 3A) a žen (obr. 3B).

Obrázek 4 vyobrazuje různé autonomní reakce mužů na 1,3,5(10),16-estratetraen-3-yl acetát. A = potenciál receptoru vomeronosního epitelu; B = změna galvanické reakce kůže (kiloohmy); C = změna v teplotě kůže (stupně Celsia).

Obrázek 5 vyobrazuje srovnání změn v potenciálu VNO po vystavení methyletheru a acetátu 1,3,5(10),16-estratetraen3-olu.

Obrázek 5 vyobrazuje sexuální dimorfismus při lokální a autonomní reakci na stimulaci VNO vomeroferiny. Různé vomeroferiny (200 fmolů) a ředidlo jako kontrola byly podávány 30 mužům a 30 ženám (věk 20 až 45) popsaným způsobem. Sloupečky ukazují hlavní reakci populace.

Obrázky 6A a B: EVG reakce byly měřeny popsaným způsobem u mužů (A) a žen (B) .

Obrázky 6C a D: Elektrodermální aktivita byla měřena popsaným způsobem. Změny (měřené v χΩ) v reakci po dopravení vomeroferinů do VNO u každého subjektu jsou vyobrazeny u mužů (C) a žen (D).

Obrázky 6E a F: Alfa-kortikální aktivita byla měřena popsaným způsobem. Změny v reakci po dopravení vomeroferinů do VNO u mužů (E) a žen (F).

Obrázky 6G a H: Teplota kůže (skin temperature - ST) byla měřena popsaným způsobem. Změny v reakci po dopravení vomeroferinů do VNO u mužů (G) a žen (H).

A = 1,3,5(10),16-estratetraen-3-yl acetát

B = androsta-4,16-dien-3-on

C = 1,3,5(10),16-estratetraen-3-ol

D - 3-methoxy-estra-l,3,5(10),16-tetraen

E = androsta-4,16-dien-3a-ol

F = androsta-4,16-dien-3fi-ol

Obrázek 7 vyobrazuje elektrodfaktogram mužů a žen vyvolaný stimulací OE voňavými látkami a vomeroferiny A: 400 fmolů 1-carvonu a cineolu a 200 fmolů vomeroferinů A, B, C, D a F; a stereoizomer E byl aplikován zvlášť jako jednosekundový puls do OE 20 subjektů (mužů a žen) a každá EOG reakce byla zaznamenána popsaným způsobem. Voňavé látky stejně jako E a B vyvolaly znatelnou (p<0,01) lokální reakci. B: 400 fmolů 1-carvonu a cineolu nevyvolalo žádnou znatelnou EVG reakci po dopravení do VNO u mužů a žen.

Obrázek 8 vyobrazuje elektrofyziologický vliv následujících vomeroferinů na vomeronosní orgán u 20 žen:

G - androst-4-en-3-on

H = androsta-4,16-dien-3,6-dion

J = 10,17-dimethylgona-4,13(17)-dien-3-on

K = 1, 3, 5(10),16-estratetraen-3-ol-methylether

L = 1,3,5(10),16-estratetraen-3-yl-propionát

EVG - elektrovomeronasogram

GSR = galvánic skin response (galvanická reakce kůže) = elektrodermální aktivita (EDA)

ST = skin temperature (teplota kůže)

Obrázek 9 vyobrazuje elektrofyziologický vliv vomeroferinů na vomeronosní orgán u 20 mužů.

M = 1,3,5(10)-estratrien-3-ol

Obrázek 10 vyobrazuje syntézu estra-1,3,5,(10),6-tetraen3-olu a estra-4,16-dien-3-olu.

Obrázek	11	vyobrazuje syntézu	sloučenin	popsaných	v
příkladech Obrázek	16 12	až 19. ilustruje kroky syntézy	popsané v	příkladech	20
až 24. Obrázek	13	ilustruje kroky syntézy	popsané v	příkladech	25
až 28. Obrázek	14	ilustruje kroky syntézy	popsané v	příkladech	29
až 30. Obrázek	15	ilustruje kroky syntézy	popsané v	příkladech	31
až 36. Obrázek	16	ilustruje kroky syntézy	popsané v	příkladech	37
až 39. Obrázek	17	ilustruje kroky syntézy	popsané v	příkladech	40
až 46. Obrázek	18	ilustruje kroky syntézy	popsané v	příkladech	47
až 49. Obrázek	19	ilustruje kroky syntézy	popsané v	příkladech	50

až 51.

Obrázky 20A, 20B a 20C ilustrují EVG, GSR a ST data žen pro 13 estranů z tabulky 1.

Obrázky 21A, 21B a 21C ilustrují EVG, GSR a ST data mužů pro 13 estranů z tabulky 1.

Obrázky 22A a B až 34A a B ilustrují EEG data mužů (A) a žen (B) pro 13 estranů, vyobrazených v obrázku 20.

Podrobný popis vynálezu

I. Definice

Chováni je přechodný pocit. Typická negativní chování jsou pocity nervozity, citlivosti, studu, obavy, podrážděnosti, zloby, hněvu a podobně. Nálady jsou déletrvající pocity jako je vina, smutek, beznaděje, bezcennost, výčitky svědomí, trápení, neštěstí a podobně. Charakterové vlastnosti jsou trvalejší aspekty individuality jedince. Typické negativní charakterové vlastnosti jsou citlivost, lítostivost, sebeobviňování, tvrdohlavost, zášť, zahořklost, plachost, lenost a podobně.

Androstanové steroidy jsou alifatické polycyklické uhlovodíky charakteristické čtyřcyklickou strukturou, methylované v pozicích 10- a 13-.

steroid je podskupinou androstanů, pod čímž se běžně rozumí, že sloučenina má přinejmenším jednu dvojnou vazbu. Rozumí se, že pokud popsaná sloučenina není gonan, pak má 18- uhlíkovou skupinu. Ale v tomto dokumentu jsou za androstanové steroidy pokládány 18-nor-androstany. Navíc všechny deriváty, které mají popsané strukturní charakteristiky jsou také genericky označovány jako androstanové steroidy.

Následující struktura obecného vzorce (II):

steroidní

Adrostenový

ukazuje čtyřcyklickou steroidní strukturu společnou pro androstenové a estrenové steroidy. V popisu umístění skupin a substituentů je použit systém číslování uvedený v obecném vzorci (II).

Sexuálně dimorfní označuje rozdíl v účinku, nebo v reakci na, farmaceutického činidla na muže a ženy při použití téže látky.

Účinné množství léku je rozsah množství a/nebo koncentrace, která přináší žádaný fyziologický a/nebo psychologický účinek, při podání jedinci, který potřebuje lék. V předkládaném případě je potřebný jedinec takový, který potřebuje upravit nebo regulovat funkci hypothalamu, nebo jedinec, který potřebuje změnit fyziologické charakteristiky nebo charakteristiky chování normálně ovlivňované hypothalamem. Účinné množství daného léku se mění v závislosti na způsobu podávání. Například, pokud je steroid podáván jako roztok na povrch kůže jedince, účinná koncentrace je 1 až 100 pg/ml, s výhodou 10 až 50 gg/ml a nejvýhodněji 20 až 30 pg/ml. Pokud je steroid podáván přímo do VNO, účinné množství je 1 pg až 1 ng, s výhodou 10 pg až 50 pg. Pokud je steroid podáván do nosu jako mast, krém, aerosol a podobně, účinné množství je 100 pg až 100 mikorgramů, s výhodou 1 ng až 10 mikrogramů. Některé léky mohou být účinné při podávání nějakými způsoby, ale neúčinné při podáváni jinými způsoby.

Hypothalamus je část diencefalonu, který zahrnuje ventrální stěnu třetího ventriklu pod sulcus hypothalamu a zahrnuje struktury tvořící dno ventriklu, včetně optic chiasma, tuber cinereum, infundibulum a mammilliárních tělísek. Hypothalamus reguluje autonomní nervový systém a kontroluje některé fyziologické funkce a funkce chování jako je tzv. boj a bojové reakce, sexuální motivace, rovnováha vody, metabolismus cukrů a tuků, hlad, regulaci tělesné teploty, endokrinní sekreci a další. Hypothalamus je také zdroj vasopressinu, který reguluje tlak krve, a oxytocinu, který vyvolává stahy a laktaci. Všechny funkce hypothalamu lze potencionálně modulovat semiochemickou terapií popsanou v tomto dokumentu.

Ligandz tak jak se používá v tomto dokumentu, je molekula, která se chová jako chemický signál tak, že se specificky váže k molekule receptoru na povrchu receptorové buňky a tím vyvolá přenos signálu po povrchu buňky. Vazbu ligandů k chemosensorickým receptorům lze měřit. Chemosensorická tkáň, jako je vomeronosní neuroepitel nebo čichový neuroepitel, obsahuje mnoho neuroreceptorových buněk, přičemž každá má alespoň jeden povrchový receptor. Mnoho receptorových molekul má stejnou ligandovou specifitu. Proto, pokud je tkáň vystavena působení ligandu, na který je specifická (například vystavení VNO semiochemikálií), lze měřit celkovou změnu receptorového potenciálu buněčného povrchu.

Tak jak se používá v tomto dokumentu, nižší alkyl znamená rozvětvený nebo nerozvětvený nasycený uhlovodíkový řetězec z 1 až 4 uhlíků, jako je, například, methyl, ethyl, propyl, i.-butyl a podobně. Alkoxyl tak jak se používá v tomto dokumentu, má běžný význam a označuje skupinu -OR, ve které R je alkyl, který odpovídá již uvedené definici.

Feromon je látka, která umožňuje chemickými prostředky komunikovat mezi členy téhož druhu pomocí sekrece a nosní recepce. U savců jsou feromony obvykle detekovány vomeronosním orgánem v nose. Obecně, feromony ovlivňují rozvoj, reprodukci a příbuzné chování. Semiochemikálie je obecnější pojem, který zahrnuje feromony a popisuje látky z jakéhokoliv zdroje, které působí jako chemosensorni přenašeč, váží se ke konkrétnímu neuroepitelnímu receptoru a vyvolávají fyziologický účinek nebo účinek na chování. Vomeroferin je semiochemikálie, jejíž fyziologický účinek je zprostředkován vomeronosním orgánem.

Pikogram (pg) je 0,001 nanogramu (ng). ng je

0,001 mikrogramu (pg). pg je 0,001 mg.

II. Způsoby provedení vynálezu

A. Estreny použitelné v předkládaném vynálezu

Vynález je směrován na určité estrenové steroidy, které jsou strukturně příbuzné k estradioiu (také označovaný jako 1,3,5(10)-estratrien-3,17h-diol) . Steroidy této skupiny jsou charakterizovány aromatickým 1,3,5(10) A-cyklem a hydroxylem nebo hydroxylovým derivátem v pozici 3-.

Estreny jsou zejména vhodné pro použití podle předkládaného vynálezu včetně těch, ve kterých je nezávisle Rj = ketoskupina, β-hydroxyl, vodík; R₂ = methyl, vodík; (jak je vyobrazeno ve sloučenině obecného vzorce (I)).

Většina těchto steroidů a jejich glukuronidy, sulfáty, cypionáty a benzoáty jsou sloučeniny v dané problematice známé a komerčně dostupné, např. od Sigma Chemical Co., atd. Alkoxyderiváty a jejich syntézy jsou v dané problematice také známy a jsou popsány v U.S. patentu č. 2,984,677, který je zde uveden jako reference.

Tabulka 1 zahrnuje estreny, na které je zaměřen předkládaný vynález, ale tento výčet nijak neomezuje jeho rámec. Diagramy syntézy, které následují, popisují syntézu meziproduktů a substruktur pro přípravu těchto estrenů:

Tabulka 1 ESTRANY

	2	3	4
’ YL	.Yl	YL	.YL
• jA.	„Yl	„YL	YL
'A6.	„Yl	YL	YL
4 joY	„yl	„YL	yLI
5 Yl	.Yl	.YL	.yL
6 Y5 0 «ML	~yl	0 «X	„yL
7 .YL	.yl	YL	.yl
• Y «X	yl	YL	yL
* „Yl	„Yl	o/	„yL
w „Yl		„YL	YL
” -oSL.	„Yl	YL	yL
” „γ*5 i, ->*·	YL	-p-	„ YL «η Ο’Χ

Nové estrany

Estra-1,3, 5(10),6,16-pentaen-3-yl-acetát (acetát E4/N1) Estra-1,3,5(10),7-tetraen-3-ol (E9/N2)

3-hydroxy-estra-l,3,5(10),16-tetraen-6-on (E6/N1) 6-oxo-estra-l,3,5(10),16-tetraen-3-yl-acetát (acetát E6/N1) 17-methylen-estra-l,3,5,7,9-pentaen-3-ol (E10/N3)

Estra-1,3, 5(10),16-tetraen-3,6fi-diol (E12/N1) 6B-hydroxyestra-l,3,5 (10),16-tetraen-3-yl-acetát (acetát

E12/N1)

Estra-4,16-dien-3fi-ol (E3/N1)

17-methylen-6-oxoestra-l,3,5(10)-trien-3-yl-acetát (aceťát E6/N3)

Estra-4,9,16-trien-3-on (E5/N1)

Estra-1,3,5,7,9,16-hexaen-3-ol (E10/N1)

Estra-1,3,5(10),6-tetraen-3-ol (E4/n2)

3-methoxyestra-2,5(10),16-trien (E8/N1)

10-hydroxyestra-4,16-dien-3-on (E7/N1)

17-methylenestra-l,3,5(10),7-tetraen-3-ol (E9/N3)

Estra-5(10),16-dien-3a-ol (3a epimer Ell/Nl) 17-methylenestra-4-en-3-on (E1/N3)

Estra-1,3,5,7,9,16-hexaen-3-yl-acetát (acetát E10/N1) 17-methylgona-4,13(17)-dien-3fi-ol (E3/N4)

Estra-1, 3,5(10),7,16-pentaen-3-ol (E9/N1) 3-methoxy-17-methylenestra-2,5(10)-dřen (E8/N3) 17-methylenestra-4-en-3fi-ol (E3/N3)

17-methylenestra-l,3,5(10)-trien-3,6fi-diol (E12/N3)

Estra-1, 3, 5(10),7,16-pentaen-3-yl-acetát (acetát E9/N1) Estra-1,3,5(10),6,16-pentaen-3-ol (E4/N1)

17-methylenestra-l,3,5(10),7-tetraen-3-yl-acetát (acetát

E9/N3)

Syntézy substruktur

Dále jsou uvedeny příklady syntéz meziproduktů v daném řádku (El až E12) nebo sloupci (Nl až N4) tabulky 1.

Typ E

El:

MeO

E2:

H

MeO (Methylether E2)

HO

1. LÍ/NH3

2. HCI

1. L1/NH3

2. HCI

39%

H (El) (El)

HO

Komerčně dostupná substruktura, například, estron.

E3:

Η

James R. Bull a Jan Floor, J. Chem. Soc. Perkin I, 1977 (7), 724.

E4:

Komerčně dostupná substruktura, například, 6-dehydroestron.

V.I. Melnikova a K.K. Chimii, 1974, sv. 10, č. 5,

E6:

Pivnitskij, Zhurnal str. 1014-1019.

Organiceskoi

Her χ

CrO₃

AcO

AcO X (Acetát E2) (Acetát E6)

Steroids, 1991, sv. 56, str. 173.

E7:

θ'¹

MeO

(Ε8)

Η+

1.02 Λιν 2.ΝΗ4Ι _Γ

Michel Mauney a Jean Rigaudy, Bull. Soc. Chem., 1976, č

11-12, 2021.

E8:

MeO

MeO (MethyletherE2)

LÍZNH3

MeO

(E8)

	17
		L1/NH3
MeO^^^^			MeO'''
K.J. San,	R.H.	Blank,	R.H.
Holmbund, J.	Org.	Chem.,	1964

E9:

HO

Komerčně dostupná substruktura, jako je equilin. E10:

Komerčně dostupná substruktura, jako je equilenin. Eli:

A.N. Cherkasov, A.M. Ponomarev a K.K. Pivnitskii, Zhurnal

Organiceskoi Khimii, 1971, sv. 7, č. 5, str. 940-947.

E12:

a

Hidetoshi Takagi, Steroids, 1991, sv. 56

Keniehi Komatsu str. 173.

Itsuo Yoshisawa,

Typ N

Nl:

O

TsNHNH2'

N-NHTs n-BuLi -*=(Nl)

N2:

i.

2.

1964, 86, 2825.

2. Pilař Lupón, Frances C. Canals, Arsenio Ferrer, Albert Palomar a Juan-Julio Bonet,J.

Am. Chem. Soc.

Iglesias, Joan C Org. Chem. 1988

53, 2193-2198.

N3:

1. GUnther Drefahl, Kurt Ponold a Hans Schick, 1965, 98, 604.

2. Richard H. Peters, David F. Crows, Mitchell Wesley K.M. Chong a Masako Tanabe, J. Med. Chem., 1642.

Berichte,

A. Avery, 1989, 32,

N4:

1. Franz Sonheimer, O. Moncera, M. Viquiza a G. (1955) J. Am. Chem. Soc., 77, 4145.

2. William F. Johns, J. Org. Chem., 1961, 26, 4583

Methylestreny rosenkranz

Harold J. Nicholas, J. Org. Chem., 1958, 23, 1747.

Richard H. Peters, David F.

K.M. Chong a Masako Tanabe, J

Crows, Mitchell A. Avery, Wesley Med. Chem., 1989, 32, 1642.

M.B. Green a F. J. Zeelen, Tetrahedron Letters, 1982, sv. 23, č. 35, str. 3611-3614.

Syntetizovatelné sloučeniny proto zahrnují tyto uvedené spolu s těmi, které jsou od nich odvozené; tj. 17-methyl-Nl, 17fi-methyl-N2 nebo 14a-methyl-N4 v kombinaci s El, E2, E3, E5, E6, E7, E8, Eli nebo E12.

Haloestreny

G. Michael Blackburn, Brian F. Taylor a Andrew F. Worrall, Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals, 1986, sv. XXIII, č. 2, str. 197.

Syntetizovatelné sloučeniny proto zahrnují tyto uvedené spolu s těmi, které jsou od nich odvozené; tj. 17-fluor-Nl v kombinaci s El, E2, E3, E5, E6, E7, Eli nebo E12. Dále 17-jód-Nl v kombinaci s E2, E6 nebo E12.

B. Syntetické postupy

Obecné postupy pro syntetické reakce steroidů jsou odborníkům známé (viz, například, Fieser, L.F. a M. Fieser, Steroids, Reinhold, N.Y. 1959). Tam, kde je potřeba stanovit teplotu a čas reakce, lze toto stanovení provést běžnými postupy. Po přidání požadovaných reagencií je směs míchána pod inertní atmosférou a v hodinových intervalech jsou odebírány alikvotní podíly. Ty jsou analyzovány pomocí tenkovrstvé chromatografie, aby se ověřilo, zda vymizela výchozí látka, přičemž v tom momentě se začne se zpracováním reakční směsi. Pokud výchozí látka nevymizí do dvaceti čtyř hodin, reakční směs je zahřáta k varu pod zpětným chladičem a po hodinách se odebírají a analyzují alikvotní podíly dokud nedojde k vymizení výchozí látky. V tomto případě se reakční směs nechá před zpracováním vychladnout.

Alkoxy deriváty estrenů jsou připravovány z odpovídajících hydroxy steroidů tak, že se nechají reagovat s alkylačním činidlem jako je trimethyloxonimufluoroborát, triethyloxoniumfluoroborát nebo methylfluorsulfonát v Inertním chlorovaném rozpouštědle jako je methylenchlorid. Alternativně lze použít alkylační činidla jako jsou alkylhalogenidy, alkyltosyláty, alkylmesyláty a dialkylsulfáty spolu s bází jako je oxid stříbrný nebo oxid barnatý v polárním aprotickém rozpouštědle jako je například DMF, DMSO a hexamethylfosforamid. Alternativně lze použít bázi jako je K₂CO₃ v rozpouštědle jako je ethanol nebo aceton.

Čištění produktu se provádí chromatograficky a/nebo krystalizací, jak je odborníkům známo.

C. Farmaceutické prostředky a způsoby použití

Provedením vynálezu je způsob změny funkce hypothalamu u jedince. Dalším provedením je změna autonomní funkce u jedince. Tyto autonomní funkce zahrnují, ale nejsou tímto výčtem nijak omezeny, srdeční tep, rychlost dýchání, tvar mozkových vln (procenta alfa kortikální aktivity), tělesnou teplotu. Další provedení zahrnují, ale nejsou tímto výčtem nijak omezeny, způsoby zmírnění negativního chování, negativních nálad nebo negativních charakterových vlastností u jedince. Dalším provedením je způsob léčení premenstruačního stresu u žen. Všechna tato provedení jsou prováděna nesystemickým, nosním podáváním určitých estrenových steroidů a kombinací estrenových steroidů.

Konkrétní způsob podávání se liší od alternativních způsobů, jako je trávení nebo injekce, v několika důležitých bodech, zejména přímým kontaktem s VNO, kterého se dosahuje nosním podáváním steroidového ligandů. Ve způsobech podle předkládaného vynálezu je vhodný ligand podáván přímo k chemoreceptorům nosu a vomeronosního orgánu, bez tablet nebo jehel - tj. neinvasivně. Působení léku je způsobeno vazbou ligandů, popsaných v tomto dokumentu, ke konkrétním receptorům na povrchu neuroepitelních buněk v nose, s výhodou ve VNO. Tento způsob působení léku je přes nervový systém a ne přes oběhový systém - takto lze ovlivnit mozkové funkce bez problémů s překonáním hematocerebrální bariéry. Tyto způsoby léčení poskytují přímý prostředek pro ovlivnění hypothalamu přes nervový systém, protože mezi feromonovými receptory a hypothalamem je pouze jeden synaptický spoj. Protože citlivé nervy jsou adresovány do konkrétního místa v mozku, má tento způsob velmi specifický účinek, což výrazně snižuje nežádoucí vedlejší účinky.

Kontakt s VNO je duležirý, protože VNO je spojen s chemoreceptivně / feromonální funkcí. VNO sestává z páru slepých tubulárních dívertikulí, které se nalézají na podřízeném okraji nosní přepážky. VNO obsahuje neuroepitel, axony, které mají přímé synapse do amygdala a odtamtud do hypothalamu. Existence VNO byla prokázána u většiny obratlovců, včetně lidského embrya; ale u dospělých lidí se předpokládá, že je nevyvinutý (viz Johnson a kol., výše).

Aktivní sloučeniny popsané v tomto dokumentu nebo jejich sulfáty, cypionáty, benzoáty, propionáty, halogenované nebo glukuronované deriváty lze podávat přímo, ale s výhodou ve formě prostředků. Ty jsou připravovány v kapalné dávkovači formě jako, například, kapaliny, suspenze nebo podobně, s výhodou, v jednotkové dávkovači formě vhodné pro jediné podání přesné dávky. Kapalné dávky lze podávat jako nosní kapky nebo jako aerosol.

Alternativně se aktivní sloučenina připravuje jako krém nebo mast a aplikuje se povrchově do nosní dutiny. Jako další alternativa lze provést podávání pomocí kontrolovaného uvolňování těchto činidel uzavřením buď většího nebo mikroskopického množství do syntetických polymerů, jako je silikon, a přírodních polymerů, jako je želatina a celulosa. Rychlost uvolňování lze kontrolovat vhodnou volbou polymerního systému použitého pro kontrolu difuzní rychlosti (Langer, R.S. a Peppas, N.A., Biomaterials 2, 201, 1981). Přírodní polymery, jako je želatina a celulosa, se rozpouští v tkáni po dobu minut až hodin, zatímco silikon zůstává intaktní po dobu měsíců. Prostředky zahrnují běžné farmaceutické nosiče nebo excipienty a jeden nebo více aktivních estren(ů) obecného vzorce (I). Navíc může prostředek obsahovat další léky, nosiče, adjuvans, atd.

Nejjednodušším prostředkem komunikace lidskými feromony je inhalace přirozeně se vyskytujících feromonů přítomných v kůži jiného. Některé 16-androstenové steroidy, včetně 5a-androst-16-en-3a-olu a 5a-androst-16-en-3-onu, 4,16-androstadien-3-onu, 5a-androstadien-3fi-olu a někdy 5a-androstadien-3a-olu, se přirozeně vyskytují u lidí a mohou být přítomny na kůži. Očekávaná přirozená maximální koncentrace 16-androstenového steroidů na lidské kůži je 2 až 7 ng/cm². Během intimního kontaktu je očekáváno, že člověk je vystaven maximálně 700 ng přirozeně se vyskytujících steroidů. Protože tyto sloučeniny jsou relativně netěkavé, je očekáváno, že dokonce i během intimního kontaktu, člověk neinhaluje více než 0,7 pg přirozeně se vyskytujících steroidů z kůže jiného. Z inhalovaného množství pouze 1% dosáhne receptory vomeronosního orgánu. Očekávané maximální přirozené vystavení působení přirozeně se vyskytujících feromonů je 0,007 pg.

Množství podávané aktivní sloučeniny bude samozřejmě záviset na léčeném subjektu, prudkosti léčeného stavu, způsobu podávání, frekvenci podávání a posouzení lékaře. Ale jednotlivá dávka přinejmenším 10 pikogramů, dopravená přímo do vomeronosního orgánu, je účinná pro vyvolání autonomní odpovědi, při podávání do nosní dutiny je dávka 100 pikogramů až 100 mikrogramů, s výhodou 1 nanogram až 10 mikrogramů, ještě výhodněji 10 nanogramu až 1 mikrogram. Frekvence podávání je v rozmezí hodin až měsíců, s výhodou 8 krát denně až jednou denně, ještě výhodněji 1 až 3 krát denně. Masti, které obsahují jednu nebo více aktivních sloučenin a nepovinně farmaceutické adjuvans v nosiči, jako je, například, voda, fyziologický roztok, vodná dextrosa, glycerol, ethanol, a podobně, lze připravit za použití základu jako je, například vazelína, sádlo nebo lanolin.

Kapalné farmaceuticky podávatelné prostředky lze, například, připravit rozpuštěním, dispergováním, atd. aktivní sloučeniny jejíž definice již byla uvedena a nepovinně farmaceutického adjuvans v nosiči, jako je, například, voda, fyziologický roztok, vodná dextrosa, glycerol, ethanol, a podobně, do podoby roztoku nebo suspenze. Pokud je třeba, může podávaný farmaceutický prostředek také obsahovat malá množství nejedovatých pomocných složek jako jsou zvlhčovadla nebo emulgátory, pufry, a podobně, například, octan sodný, monolaurát sorbitanu, sodná sul octanu triethanolaminu, oleát triethanolaminu, atd. Způsoby přípravy takových dávkovačích forem jsou známy nebo budou odborníkům jasné, například, z Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15. vyd., 1975. V každém případě podávané prostředky obsahují určité množství jedné nebo více aktivní(ch) sloučenin(y) v množství, které je účinné pro zmírnění symptomů u léčeného subjektu.

Pro podávání aerosolu je aktivní složka s výhodou dodávána v jemně rozprášené formě spolu s povrchově aktivní látkou a hnací látkou. Typické procentuální zastoupení aktivní složky je 0,001 až 2% hmotnostní, s výhodou, 0,004 až 0,10% hmotnostních.

Povrchově aktivní látky musí být, ovšem, nejedovaté a, s výhodou, rozpustné v hnací látce. Příkladem takových látek jsou estery nebo částečné estery mastných kyselin, které sestávají z 6 až 22 atomů uhlíku, jako je kapronová, oktanová, laurová, palmitová, stearová, linoleová, olestearová a olejová kyselina s alifatickými polyhydroxyalkoholy nebo jejich cyklickými anhydridy jako je, například ethylenglykol, glycerol, erythritol, arabitol, mannitol, sorbitol a hexitolové anhydridy odvozené od sorbitolu (sorbitanové estery prodávané pod obchodním názvem Spans) a polyoxyethylenové a polyoxypropylenové deriváty těchto esterů. Lze použít směsné estery, jako jsou směsi přírodních glyceridů. Preferované povrchově aktivní látky jsou oleáty nebo sorbitan, např. ty prodávané pod obchodními názvy Arlacel C” (sorbitan seskvioleát), Spán 80 (sorbitan monooleát) a Spán 85 (sorbitan trioleát). Povrchově aktivní látky mohou tvořit 0,1-20% hmotnostních prostředku, s výhodou, 0,25-5% hmotnostních.

Zbytek prostředku je běžná hnací látka. Kapalné hnací látky jsou běžně za laboratorních podmínek plyny, a jsou stlačením zkapalněné. Mezi vhodné kapalné hnací látky patří nižší alkany, které sestávají až z pěti atomů uhlíku, jako je butan a propan; fluorované nebo fluorchlorované alkany, jaké jsou prodávány pod obchodním názvem Freon. Lze použít i směsi uvedených látek.

Pro tvorbu aerosolu je nádobka vybavená vhodným ventilem naplněna vhodnou hnací látkou, která obsahuje jemně rozprášenou aktivní složku a povrchově aktivní látku. Složky se tak uchovávají až do stisknutí ventilu pod zvýšeným tlakem.

Dalším způsobem podávání je povrchová aplikace prostředku z těkavé kapaliny na kůži, s výhodou na kůži obličeje, jedince. Prostředek obvykle obsahuje alkohol jako je ethanol nebo isopropanol. Do prostředku lze přidat i příjemně vonící látku.

D. Měření chování, nálady a charakterových vlastností.

Pocity spojené s chováním, náladou a charakterovými vlastnostmi se obecně měří dotazníkem. Například lze léčenému subjektu dát dotazníky obsahující adjektiva, která se týkají pocitů. Subjekt ohodnotí jeho nebo její pocity popsané adjektivy a ohodnotí jejich intenzitu číselnou hodnotou. Seskupení příbuzných adjektiv a statistická analýza hodnocení každého adjektiva subjektem poskytne základ pro měření různých pocitů.

Alternativně lze pocity měřit autonomními změnami, jako jsou ty použité v polygrafickém hodnocení (galvanická reakce kůže, tep a podobně). Cabanac, M., Annual Review of Physiology (1975), 37, 415; Hardy, J.D., Body Temperature Regulation,

Kapitola 59, str. 1417. V: Medical Physiology, sv. II, editor: V.B. Moutcastle (1980); Wolfram Bouscein, Electrodermal Activity (Plenům Press, 1992).

Navíc lze hodnotit neverbální skutečnosti jako je výraz tváře.

Příklady provedeni vynálezu

III. Příklady

Následující příklady jsou míněny jako ilustrace a nijak neomezují rámec vynálezu. Zkratky použité v příkladech jsou následující: aq. = vodný; RT = laboratorní teplota (room temperature); PE = petrolether (teplota varu 50°C až 70°C) ; IMF = Ν,Ν-dimethylformamid; DMSO = dimethylsulfoxid; THF = tetrahydroťuran.

Příklad 1

Syntéza estra-1,3,5(10),16-tetraen-3-olu strukturního vzorce (III)

Následující způsob syntézy je vyobrazen na obrázku 1:

Estron-p.-tolunensulfonylhydrazon strukturního vzorce (IV)

Estron strukturního vzorce (V) (270 g, 1,00 molu) a

p.-toluensulfonylhydrazid (232,8 g, 1,25 molu) v suchém methanolu (2,5 litru) byl zahříván k varu pod zpětným chladičem po dobu 20 hodin. Reakční směs byla přelita do Erlenmeyerovy baňky a ponechána vychladnout. Vyloučené krystaly byly odfiltrovány odsátím a promyty methanolem (300 ml) . Další podíly produktu byly získány postupným odpařováním filtrátu na 2000 ml, 800 ml a 400 ml, a ve všech případech ponecháním krystalizovat. Celkový výtěžek byl

433,5 g (99%).

1,3,5(10),16-estratetraen-3-ol strukturního vzorce (III): Estron-p.-tolunensulfonylhydrazon strukturního vzorce (IV) (219,0 g, 500 mmolů) v suchém tetrahydrofuranu (8,0 litru) byl ochlazen lázní sůl/led. Směs byla mechanicky míchána a oboustrannou jehlou bylo přidáno n-buthyllithium (800 ml 2,5 M roztoku v hexanu, 2.00 molu). Směs byla míchána za laboratorní teploty po dobu 3 dnů. Pak byl přidán led (250 g) a nasycený roztok chloridu amonného (500 ml). Fáze byly promíchány a pak ponechány usadit. Vodná fáze byla odsáta teflonovou trubicí a extrahována etherem (500 ml). Dvě organické fáze byly spojeny a postupně promyty nasyceným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (500 ml) a nasyceným roztokem chloridu sodného (500 ml) . Organické vrstvy byly vysušeny (MgSOJ a za sníženého tlaku odpařeny, čímž byl získán surový produkt. Ten byl přefiltrován přes sloupec 500 g silikagelu 60, 230 až 400 mesh, mobilní fází ethylacetát/hexan (25 : 75, 2,5 litru). Filtrát byl odpařen za sníženého tlaku, čímž byly získány krystaly. Produkt byl krystalizován ze směsi methanol (300 ml)/voda (75 ml) a promyt směsí methanol (80 ml)/voda (20 ml) . Další krystalizaci ze směsi ethylacetát/hexan (12,5 : 87,5) byl získán čistý produkt (88,9 g, 70%).

Příklad 2

Syntéza acylových derivátů 1,3,5(10),16-estratetraen-3-olu K 1, 3, 5(10),16-estratetraen-3-olu (254 mg, 1,00 molu) v etheru (10 ml) byl přidán anhydrid kyseliny octové (0,25 ml) (nebo anhydrid kyseliny propionové pro přípravu propionátu) a pyridin (0,25 ml) a vzniklá reakční směs byla míchána po dobu 16 hodin za laboratorní teploty. Reakční směs byla nalita na směs voda/led a extrahována etherem (2 x 20 ml) . Organické extrakty byly promyty vodou, nasyceným roztokem síranu měďnatého, vodou a nasyceným roztokem chloridu sodného, vysušeny (MgSOJ a za sníženého tlaku odpařeny, čímž byl získán surový produkt. Ten byl čištěn flash chromatografií na

17,5 g silikagelu 60 (230 až 400 mesh) mobilní fází 10% až

12% ethylacetát/hexan, čímž byl získán čistý produkt (192 mg, 65%) .

Příklad 3

Syntéza estra-4,16-dien-3-onu strukturního vzorce (VI)

K estra-1,3,5(10),16-tetraen-3-methyletheru (551,5 mg, 2,055 mmolu) v 8,6 ml bezvodého THF, 30 ml bezvodého amoniaku a 6,76 ml t.-butylalkoholu bylo přidáno lithium (0,24 g, 35 mmol) nakrájené na malé kousky. Reakční směs byla zahřívána k varu pod zpětným chladičem po dobu 4,5 hodiny pod argonovou atmosférou, pak byl přidán methanol (2,3 ml) a přes noc byl ponechán vypařit amoniak. Zbytek byl rozpuštěn ve 25 ml methanolu a byl okyselen pomocí 5 N HC1 na pH 1. Po zahřívání na olejové lázni na teplotu 55°C až 70°C po dobu 15 minut byla chladná směs rozdělena mezi 25 ml vody a 50 ml ethylacetátu a vodná fáze byla extrahována 25 ml ethylacetátu. Spojené organické extrakty byly promyty 25 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány. Odpařením rozpouštědla za sníženého tlaku bylo získáno 0,57 g olejovitého odparku, který byl čištěn flash chromatografií na silikagelu (mobilní fáze: 15% ethylacetát/hexan) a krystalizací z pentanu na krystaly (206,1 mg, 39%), které se podle TLC jeví jako jedna látka o teplotě tání 67°C až 71°C.

Příklad 4

Syntéza estra-2,5 (10),16-trien-3-methyletheru strukturního vzorce (VII)

K estra-1,3,5(10),16-tetraen-3-methyletheru (1,22 g,

4,54 mmolu) v 19 ml bezvodého THF, 14,99 g t.-butylalkoholu a 70 ml bezvodého amoniaku bylo přidáno lithium (0,53 g, 76 mmol) nakrájené na malé kousky. Po zahřívání k varu pod zpětným chladičem po dobu 6 hodin pod argonovou atmosférou byla reakce ukončena 5 ml methanolu a přes noc byl ponechán vypařit amoniak. Suspenze zbytku ve 100 ml vody byla dvakrát extrahována 100 ml ethylacetátu a spojené organické extrakty byly promyty nasyceným roztokem chloridu sodného a vysušeny síranem hořečnatým. Po odpaření rozpouštědla za sníženého tlaku následovala flash chromatografie na silikagelu mobilní fází 1% ethylacetát/hexan a krystalizace z absolutního ethanolu, čímž byly získány bílé krystaly (884,1 mg, 3,269 mmol, 72%), o teplotě tání 72°C až 73°C, které se podle TLC jeví jako jedna látka.

Příklad 5

Syntéza estra-5(10),16-dien-3-onu strukturního vzorce (VIII) Estra-2,5(10),16-trien-3-methylether strukturního vzorce (VII) (646,3 mg, 2,390 mmolu) rozpuštěný v 50 ml acetonu byl hydrolyzován 6 hodin za laboratorní teploty pomocí dihydrátu kyseliny šťavelové (0,84 g, 6,7 mmolu). Reakce byla ukončena 25 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a pak dvakrát extrahována 25 ml ethylacetátu. Spojené organické extrakty byly dvakrát promyty 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým, přefiltrovány a odpařeny za sníženého tlaku. Odparek byl krystalizován z hexanu na produkt (462,5 mg, 1,804 mmolu, 75%) o teplotě tání 112°C až 116°C.

Příklad 6

Syntéza estra-5(10),16-dien-3-olů strukturního vzorce (IX) Estra-5(10),16-dien-3-on strukturního vzorce (VIII) (301,1 mg, 1,174 mmolu) v 6 ml bezvodého etheru byl redukován po dobu 1 hodiny za laboratorní teploty pomocí tetrahydridohlinitanu litného (50,0 mg, 1,32 mmolu). Po ukončení reakce dekahydrátem síranu sodného (2,00 g) během 10 minut, byla vzniklá suspenze přefiltrována přes křemelinu a filtrační koláč byl čtyřikrát promyt 25 ml etheru. Spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku a čištěny flash chromatografií (silikagel, mobilní fáze 5% ethylacetát/hexan) s následnou preparativní TLC směsných frakcí. Polárnější produkt byl s určitými ztrátami krystalizován z vodného ethanolu na 4,8 mg pevné látky. Méně polární produkt byl krystalizován z vodného methanolu na bílé krystaly (59,5 mg) o teplotě tání 98°C až 100°C. Celkový výtěžek byl 64,3 mg (0,249 mmolu, 21%).

Příklad 7

Syntéza estra-4,9,16-trien-3-onu strukturního vzorce (X) Estra-5(10),16-dien-3-on strukturního vzorce (VIII) (0,38 g,

1,5 mmolu) v pyridinu (5,0 ml, 62 mmolu) byl ochlazen lázní sůl/led na -13°C a pak byl po malých částech přidán pyridinium bromid perbromid (1,58 g, 4,94 mmolu) tak, aby teplota nepřestoupila -4°C. Po 1 minutě intenzivního mícháni, byl přidán fenol (0,25 g, 2,7 mmolu) a reakce pokračovala po dobu dalších 24 hodin za laboratorní teploty. Pak byl přidán ethylacetát (50 ml) a reakční směs byla promyta 25 ml 1 N HCl, dvakrát 25 ml nasyceného roztoku síranu mědhatého, 25 ml 5% hydroxidu sodného a 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Po vysušení síranem hořečnatým, přefiltrování a odpaření za sníženého tlaku byl odparek rozpuštěn v 10 ml absolutního ethanolu, pak byl přidán granulovaný zinek (0,33 g, 5,0 mmolu) a vzniklá reakční směs byla zahřívána k varu pod zpětným chladičem po dobu 0,5 hodiny. Roztok byl odlit, pevný zbytek byl promyt 10 ml absolutního ethanolu a spojené roztoky byly odpařeny za sníženého tlaku. Vzniklá pryskyřice byla podrobena flash chromatografií na silikagelu mobilní fází 15% ethylacetát/hexan. Jednotlivé frakce byly odebrány, odpařeny a pak krystalizovány z hexanu na pevný produkt (117,5 mg, 0,4619 mmolu, 31%) o teplotě tání 87°C až 92°C.

Příklad 8

Syntéza estra-1,3,5(10),16-tetraen-6-on-3-acetátu strukturního vzorce (XI)

Oxid chromový (13,40 g, 0,1340 molu) byl suspendován ve 200 ml methylenchloridu a pak ochlazen na -10°C lázní led/sůl. Byl přidán 3,5-dimethylpyrazol (12,90 g, 0,1342 molu) a vzniklá směs byla míchána po dobu 20 minut. K reakční směsi byl přidán studený roztok estra-1,3,5(10),16-tetraen-3ylacetátu (4,00 g, 13,5 mmolu) ve 20 ml methylenchloridu a vzniklá reakční směs byla míchána po dobu 2 hodin během, kterých teplota nepřestoupila -8°C. Směs pak byla přefiltrována přes 200 g silikagelu tak, že produkt byl eluován methylenchloridem. Po spojení a odpaření správných frakcí byl surový produkt podroben flash chromatografií na silikagelu mobilní fází 15% ethylacetát/hexan. Odebráním správných frakcí a jejich odpařením za sníženého tlaku byla získána bílá pevná látka (0,92 g, 3,0 mmolu, 22%) o teplotě tání 87°C až 103°C.

Příklad 9

Syntéza estra-1,3,5(10),16-tetraen-3-ol-6-onu strukturního vzorce (XII)

Estra-1,3,5(10),16-tetraen-6-on-3-acetát (203,1 mg,

0,6543 mmolu) ve 30 ml methanolu byl hydrolyzován 1,5 ml 5% hmotnostních hydroxidu sodného po dobu 40 minut. Reakční směs byla odpařena za sníženého tlaku, rozpuštěna v 50 ml vody, neutralizována 1 N HC1 a třikrát extrahována 25 ml methylenchloridu. Spojené organické extrakty byly promyty 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým, přefiltrovány a odpařeny na bílou pevnou látku, která byla čištěna krystalizací ze směsi benzen/hexan a preparativní TLC, čímž byla získána bílá krystalická látka (52,8 mg, 0,197 mmolu, 30%) o teplotě tání 188°C až 191°C.

Příklad 10

Syntéza estra-1, 3, 5(10),16-tetraen-6a-ol-3-ylacetátu strukturního vzorce (XIII)

Estra-1,3,5(10),16-tetraen-6-on-3-acetát strukturního vzorce (XI) (421,4 mg, 1,358 mmolu), suspendovaný v 35 ml 95% ethanolu byl redukován pomocí tetrahydridoboritanu sodného (98,8 mg, 2,61 mmolu) po dobu 100 minut za laboratorní teploty. Po odpaření za sníženého tlaku byl odparek suspendován ve 25 ml vody, neutralizován 1 N HC1 a třikrát extrahován 25 ml methylenchloridu. Spojené organické extrakty byly promyty 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým, přefiltrovány a odpařeny. Vzniklá bílá pěna byla podrobena flash chromatografií na silikagelu mobilní fází 25% ethylacetát/hexan. Spojením frakcí a odpařením byla získána bílá pevná látka (0,12 g, 0,38 mmolu, 28%) o teplotě tání 209°C až 212°C.

Příklad 11

Syntéza estra-1,3,5(10),16-tetraen-3,6-diolu strukturního vzorce (XIV)

K suspenzi tetrahydridohlinitanu litného (LAH, 95%, 46,9 mg, 1,17 mmolu) v 5 ml bezvodého THF byl přidán po kapkách za míchání estra-1,3,5(10),16-tetraen-6-on-3-acetát strukturního vzorce (XI) v 5 ml bezvodého THF. Reakce byla míchána po dobu 50 minut, pak byl přidán další LAH (46,5 mg, 1,16 mmolu) a reakce byl míchána dalších 22 hodin. Po 4 h zahřívání k varu pod zpětným chladičem byla podle TLC ještě zjištěna výchozí látka. Reakce byla ukončena 0,5 ml vody + 0,5 ml 20% hmotnostních kyseliny sírové a odpařena za sníženého tlaku. Odparek byl čtyřikrát extrahován 10 ml horkého ethylacetátu a přefiltrován přes křemelinu. Spojené filtráty byly odpařeny a dvakrát čištěny flash chromatografií, čímž byl získán pevný produkt (0,05 g, 0,2 mmolu, 10%) o teplotě tání 150°C až 157°C.

Příklad 12

Syntéza estra-1,3,5(10),7-tetraen-3-olu strukturního vzorce (XV).

K suspenzi equilinu (100,2 mg, 0,3733 mmolu) ve 2 ml diethylenglykolu byl přidán hydrazin (59 μΐ, 1,9 mmolu) a hydroxid draselný (0,04 g, 0,7 mmolu). Směs byla míchána po dobu 2 h na olejové lázni o teplotě 200°C až 214°C a pak byla vychladlá reakční směs zředěna 10 ml vody, neutralizována 1 N HCl a třikrát extrahována 25 ml etheru. Spojené organické vrstvy byly promyty 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým, přefiltrovány, odpařeny a čištěny preparativní TLC (silikagel, 15% ethylacetát/hexan) čímž byla získána žlutá pryskyřice. Produkt byl dále odbarven aktivním uhlím a krystalizován z vodného ethanolu, čímž byly získány nahnědlé krystaly (13,2 mg, 51,9 μΜ, 14%) o teplotě tání 130°C až 134°C.

Příklad 13

Syntéza 20-homoestra-l,3,5(10),6,8,17-hexaen-3-olu strukturního vzorce (XVI)

Suspenze trifenylmethylfosfonium bromidu (671,0 mg, 1,878 mg) a t.-butoxidu draselného (212,1 mg, 1,890 mmolu) ve 2,1 ml bezvodého DMSO byla zahřívána na lázni o teplotě 76°C až 8 6°C pod argonovou atmosférou po dobu 1 h, pak byl přidán equilenin (100,1 mg, 0,3579 mmolu) ve 2,1 ml bezv. DMSO a zelený roztok byl míchán po dobu 1 hodiny. Po vychladnutí bylo přidáno 10 ml ledové 1 N HCl a vzniklá směs byla třikrát extrahována 10 ml etheru. Spojené organické extrakty byly promyty 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného + 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým, přefiltrovány přes křemelinu a odpařeny za sníženého tlaku. Získaný oranžový olej byl čištěn preparativní TLC (silikagel, 25% ethylacetát/hexan), čímž byl získán produkt (75,5 mg, 0,286 mmolu, 76%), který byl podle TLC jednotný, o teplotě tání 113°C až 121°C.

Příklad 14

Syntéza estra-1,3,5(10),6-tetraen-3-olu strukturního vzorce (XVII)

Estra-1,3,5(10),6-tetraen-3-ol-17-on (91,1 mg, 0,339 mmolu), hydrazin (54 μΐ, 1,7 mmolu) a hydroxid draselný (0,06 g) v 1,8 ml diethylenglykolu byly zahřívány po dobu 2 h na olejové lázni o teplotě 200°C pod argonovou atmosférou. Po vychladnutí na laboratorní teplotu bylo přidáno 10 ml vody a roztok byl okyselen pomocí 1 N HCl na pH = 2. Vzniklá suspenze byla třikrát extrahována 10 ml etheru a spojené organické vrstvy byly promyty 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým, přefiltrovány přes křemelinu a odpařeny za sníženého tlaku. Surový produkt byl čištěn preparativní TLC (silikagel, 25% ethylacetát/hexan) čímž byl získán produkt (5,9 mg, 23 gmolu, 7%), který byl podle TLC jednotný.

Příklad 15

Syntéza estra-4,16-dien-3-olu strukturního vzorce (XVIII)

K estra-4,16-dien-3-onu strukturního vzorce (VI) (87,2 mg,

0,340 mmolu) v 1,7 ml bezv. etheru byl přidán tetrahydridohlinitan litný (15,0 mg, 0,395 mmolu) a suspenze byla míchána po dobu 17 minut. Reakce byla pak prudce míchána po dobu 10 minut s 0,5 g dekahydrátu síranu sodného a přefiltrována přes křemelinu. Filtrační koláč byl třikrát promyt 10 ml etheru a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Preparativní TLC (5% ethylacetát/dichlormethan na silikagelu) byl získán surový produkt (50,0 mg) ve formě žluté pryskyřice. Tu lze rechromatografovat dokud není dostatečně čistá.

Příklad 16

Estra-4,16-dien-3-on strukturního vzorce (XIV)

Tato syntéza je vyobrazena na obrázku 11. 19-nor-testosteron strukturního vzorce (XIX) je komerčně dostupný, např. od Chemical Dynamics Corp. Je to výchozí látka pro deriváty 19-nor-16-androstenu. 19-nor-testosteron strukturního vzorce (XIX) byl převeden na acetát (Hartman, J.A., a kol., J. Am. Chem. Soc. (1956) 78: 5662) acetanhydridem a pyridinem (a). Roztok tohoto acetátu (4,8 g, 15,17 mmolu) v toluenu (10 ml) byl pyrolyzován (b) při 540°C (26,66 kPa, pomalý proud dusíku) ve skleněné trubici naplněné kusy křemene. Chromatografií surového pyrolyzátu (3,1 g) na silikagelu (150 g) mobilní fází CH₂C1₂ bylo získáno 1,1 g homogenního olejovitého ketonu strukturního vzorce (XIV); +57,9° (C 1) ((IV): teplota tání 71°C až 73°C) . IČ (CHC1₃) : 1660s, 1615m, 1585w. ¹H-NMR (90 MHz) : 0,84 (s, 3H); 5,82 (m, 2H); 5,87 (široký singlet, IH).

Příklad 17

Estr-16-en-3-on strukturního vzorce (XV)

Tato syntéza je vyobrazena na obrázku 11. 19-nor-testosteron byl redukován na 19-nor-5a-androstan-17-ol-3-on strukturního vzorce (XX) pomocí lithia a amoniaku (c) způsobem podle Villotti, R., a kol. (J. Am. Chem. Soc. (1960) 82: 5693).

Androsta-5a,17-diol-3-on strukturního vzorce (XX) byl převeden na acetát (Hartman, J.A., a kol., J. Tůn. Chem. Soc. (1956) 78: 5662) acetanhydridem a pyridinem (a) . Roztok 17B-acetoxy-5a-estran-3-onu (8,0 g, 25,1 mmolu) ve směsi kyselina octová/aceton 10 : 1 (22 ml) byl pyrolyzován (b) při 550°C (26,66 kPa, pomalý proud dusíku). Chromatografií surového produktu (5,4 g) na silikagelu (600 g) mobilní fází CH₂C1₂ a krystalizaci homogenních frakcí z petroletheru bylo získáno 3,13 g (48,3%) čistého ketonu strukturního vzorce (XV). Teplota tání 51°C až 54°C, [a] +72,8° (C 1,0). IČ (CHC1₃) : 1705s, 1585w. ¹H-NMR (90 MHz) : 0,79 (s, 3H) ; 5,71 (m, IH); 5,87 (m, IH).

Příklad 18

Estra-16-en-3a-ol strukturního vzorce (XVI)

Tato syntéza je vyobrazena na obrázku 11. L-selectrid (d, tri(sec.-butylhydridoboritan litný, 4 ml 1 M roztoku v THF, 4 mmoly) byl přidán po kapkách při 0°C k roztoku ketonu strukturního vzorce (XV) (800 mg, 3,10 mmolu) v suchém etheru (5 ml) . Po 1 h míchání při 0°C byla přidána voda (10 ml) . Borany byly oxidovány přidáním 10% vodného roztoku NaOH (5 ml) a 30% vodného roztoku H₂O₂ (3 ml) a mícháním po dobu 3 hodin za laboratorní teploty. Po zpracování (etherem) byl surový produkt (790 mg, směs látky strukturního vzorce (XVI) a látky strukturního vzorce (XXI) v poměru 9:1) chromatografován na silikagelu mobilní fází dichlormethanem, čímž bylo získáno 700 mg (87%) čistého alkoholu strukturního vzorce (XVI). Teplota tání 119°C až 120°C -> 123°C až 124°C (z petroletheru), [a]_D +40,6° (c = 1,0). IČ (CHC1₃) : 3640m,

3500br, 1585w. ^-NMR (90 MHz) : 0,78 (s, 3H) ; 4,09 (m, w_1/2 = 8, 1 H); 5,71 (m, IH).

Příklad 19

Estra-16-en-3p-ol strukturního vzorce (XXI)

Tato syntéza je vyobrazena na obrázku 11. Roztok ketonu strukturního vzorce (XV) (800 mg, 3,10 mmolu) v suchém etheru (5 ml) byl po kapkách přidán za laboratorní teploty do suspenze LiAlH< (38 mg, 1 mmol) v etheru (3 ml) (e) . Po 1 h byla reakční směs hydrolyzována 10% vodným roztokem H₂SO₄. Po zpracování (etherem) byl surový produkt (802 mg, směs látky strukturního vzorce (XXI) a látky strukturního vzorce (XVI) v poměru 9 : 1) chromatografován na silikagelu mobilní fází dichlormethanem. Malý podíl látky strukturního vzorce (XVI) (70 mg) byl vymyt první a pak následoval hlavní podíl látky strukturního vzorce (XXI) 705 mg (87%) . Teplota tání 113°C až 115, [a] +36,3° (c = 1,0). IČ (CHC1₃) : 3640m, 3500br, 1585w. ^JH-NMR (90 MHz): 0,78 (s, 3H) ; 3,60 (m, w_1/2 = 20, 1 H); 5,71 (m, ÍH) ; 5,87 (m, ÍH) .

Příklad 20

Alternativní syntéza estra-4,16-dien-3-onu strukturního vzorce (VI)

Estra-4,16-dien-3-onu strukturního vzorce (VI)

K estra-1, 3, 5(10),16-tetraen-3-methyletheru (551,5 mg,

2,055 mmolu) v 8,6 ml bezvodého THF, 30 ml bezvodého amoniaku 6,76 ml t.-butylalkoholu bylo přidáno lithium (0,24 g, 35 mmol) nakrájené na malé kousky. Reakční směs byla zahřívána k varu pod zpětným chladičem po dobu 4,5 hodiny pod argonovou atmosférou, pak byl přidán methanol (2,3 ml) a přes noc byl ponechán vypařit amoniak. Zbytek byl rozpuštěn ve 25 ml methanolu a byl okyselen pomocí 5 N HCl na pH 1. Po zahřívání na olejové lázni na teplotu 55°C až 70°C po dobu 15 minut byla chladná směs rozdělena mezi 25 ml vody a 50 ml ethylacetátu a vodná fáze byla extrahována 25 ml ethylacetátu. Spojené organické extrakty byly promyty 25 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány. Odpařením rozpouštědla za sníženého tlaku bylo získáno 0,57 g olejovitého odparku, který byl čištěn flash chromatografií na silikagelu (mobilní fáze: 15% ethylacetát/hexan) a krystalizaci z pentanu na krystaly (206,1 mg, 39%), které se podle TLC jeví jako jedna látka o teplotě tání 67°C až 71°C.

(NA-1993A-38, 42D)

Příklad 21

Estra-2, 5(10),16-trien-3-methylether strukturního vzorce (VII)

K estra-1,3,5(10),16-tetraen-3-methyletheru (1,22 g,

4,54 mmolu) v 19 ml bezvodého THF, 14,99 g t.-butylalkoholu a 70 ml bezvodého amoniaku bylo přidáno lithium (0,53 g, 76 mmol) nakrájené na malé kousky. Viz obrázek 12. Po zahřívání k varu pod zpětným chladičem po dobu 6 hodin pod argonovou atmosférou byla reakce ukončena 5 ml methanolu a přes noc byl ponechán vypařit amoniak. Suspenze zbytku ve 100 ml vody byla dvakrát extrahována 100 ml ethylacetátu a spojené organické extrakty byly promyty nasyceným roztokem chloridu sodného a vysušeny síranem hořečnatým. Po odpaření rozpouštědla za sníženého tlaku následovala flash chromatografie na silikagelu mobilní fází 1% ethylacetát/hexan a krystalizace z absolutního ethanolu, čímž byly získány bílé krystaly (884,1 mg, 3,269 mmol, 72%), o teplotě tání 72°C až 73°C, které se podle TLC jeví jako jedna látka.

(NA-1993A-74, 77A)

Příklad 22

Estra-5(10), 16-dien-3-on strukturního vzorce (VIII)

Estra-2, 5(10), 16-trien-3-methylether strukturního vzorce (VII) (646,3 mg, 2,390 mmolu) rozpuštěný v 50 ml acetonu byl hydrolyzován 6 hodin za laboratorní teploty pomocí dihydrátu kyseliny šťavelové (0,84 g, 6,7 mmolu). Viz obrázek 12. Reakce byla ukončena 25 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného a pak dvakrát extrahována 25 ml ethylacetátu. Spojené organické extrakty byly dvakrát promyty 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým, přefiltrovány a odpařeny za sníženého tlaku. Odparek byl krystalizován z hexanu na produkt (462,5 mg, 1,804 mmolu, 75%) o teplotě tání 112°C až 116°C.

(NA-1993A-78A)

Příklad 23

Estra-5(10) , 16-dien-3-oly strukturního vzorce (IX)

Estra-5(10),16-dien-3-on strukturního vzorce (VIII) (301,1 mg, 1,174 mmolu) v 6 ml bezvodého etheru byl redukován po dobu 1 hodiny za laboratorní teploty pomocí tetrahydridohlinitanu litného (50,0 mg, 1,32 mmolu). Po ukončení reakce dekahydrátem síranu sodného (2,00 g) během 10 minut, byla vzniklá suspenze přefiltrována přes křemelinu a filtrační koláč byl čtyřikrát promyt 25 ml etheru. Spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku a čištěny flash chromatografií (silikagel, mobilní fáze 5% ethylacetát/hexan) s následnou preparativní TLC směsných frakcí. Polárnější produkt byl s určitými ztrátami krystalizován z vodného ethanolu na 4,8 mg pevné látky. Méně polární produkt byl krystalizován z vodného methanolu na bílé krystaly (59,5 mg) o teplotě tání 98°C až 100°C. Celkový výtěžek byl 64,3 mg (0,249 mmolu, 21%).

(NA-1993A-80, 83A, 85A)

Příklad 24

Estra-4, 9,16-trien-3-on strukturního vzorce (X)

Estra-5(10),16-dien-3-on strukturního vzorce (VIII) (0,38 g,

1,5 mmolu) v pyridinu (5,0 ml, 62 mmolu) byl ochlazen lázní sůl/led na -13°C a pak byl po malých částech přidán pyridinium bromid perbromid (1,58 g, 4,94 mmolu) tak, aby teplota nepřestoupila -4°C. Po 1 minutě intenzivního míchání, byl přidán fenol (0,25 g, 2,7 mmolu) a reakce pokračovala po dobu dalších 24 hodin za laboratorní teploty. Viz obrázek 12. Pak byl přidán ethylacetát (50 ml) a reakční směs byla promyta 25 ml 1 N HCl, dvakrát 25 ml nasyceného roztoku síranu mědnatého, 25 ml 5% hydroxidu sodného a 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného. Po vysušení síranem hořečnatým, přefiltrování a odpaření za sníženého tlaku byl odparek rozpuštěn v 10 ml absolutního ethanolu, pak byl přidán granulovaný zinek (0,33 g, 5,0 mmolu) a vzniklá reakční směs byla zahřívána k varu pod zpětným chladičem po dobu 0,5 hodiny. Roztok byl odlit, pevný zbytek byl promyt 10 ml absolutního ethanolu a spojené roztoky byly odpařeny za sníženého tlaku. Vzniklá pryskyřice byla podrobena flash chromatografií na silikagelu mobilní fází

15% ethylacetát/hexan. Jednotlivé frakce byly odebrány, odpařeny a pak krystalizovány z hexanu na pevný produkt (117,5 mg, 0,4619 mmolu, 31%) o teplotě tání 87°C až 92°C. (NA-1993A-62, 65B)

Příklad 25

Estra-1,3,5(10),16-tetraen-6-on-3-acetát strukturního vzorce (XI)

Oxid chromový (13,40 g, 0,1340 molu) byl suspendován ve 200 ml methylenchloridu a pak ochlazen na -10°C lázní led/sůl. Byl přidán 3,5-dimethylpyrazol (12,90 g, 0,1342 molu) a vzniklá směs byla míchána po dobu 20 minut. Viz obrázek 13. K reakční směsi byl přidán studený roztok estra-1,3,5(10), 16tetraen-3-ylacetátu (4,00 g, 13,5 mmolu) ve 20 ml methylenchloridu a vzniklá reakční směs byla míchána po dobu 2 hodin během, kterých teplota nepřestoupila -8°C. Směs pak byla přefiltrována přes 200 g silikagelu tak, že produkt byl eluován methylenchloridem. Po spojení a odpaření správných frakcí byl surový produkt podroben flash chromatografií na silikagelu mobilní fází 15% ethylacetát/hexan. Odebráním správných frakcí a jejich odpařením za sníženého tlaku byla získána bílá pevná látka (0,92 g, 3,0 mmolu, 22%) o teplotě tání 87°C až 103°C.

(NA-1993B-39B)

Příklad 26

Estra-1,3,5(10),16-tetraen-3-ol-6-on strukturního vzorce (XII)

Estra-1,3,5(10),16-tetraen-6-on-3-acetát (203,1 mg,

0, 6543 mmolu) ve 30 ml methanolu byl hydrolyzován 1,5 ml 5% hmotnostních hydroxidu sodného po dobu 40 minut. Viz obrázek 13. Reakční směs byla odpařena za sníženého tlaku, rozpuštěna v 50 ml vody, neutralizována 1 N HCI a třikrát extrahována 25 ml methylenchloridu. Spojené organické extrakty byly promyty 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým, přefiltrovány a odpařeny na bílou pevnou látku, která byla čištěna krystalizaci ze směsi benzen/hexan a preparativní TLC, čímž byla získána bílá krystalická látka (52,8 mg, 0,197 mmolu, 30%) o teplotě tání 188°C až 191°C.

(NA-1993B-24, 27B)

Příklad 27

Estra-1,3,5(10),16-tetraen-6a-ol-3-ylacetát vzorce (XIII)

Estra-1,3,5(10),16-tetraen-6-on-3-acetát strukturního vzorce (XI) (421,4 mg, 1,358 mmolu), suspendovaný v 35 ml 95% ethanolu byl redukován pomocí tetrahydridoboritanu sodného (98,8 mg, 2,61 mmolu) po dobu 100 minut za laboratorní teploty. Viz obrázek 13. Po odpaření za sníženého tlaku byl odparek suspendován ve 25 ml vody, neutralizován 1 N HCI a třikrát extrahován 25 ml methylenchloridu. Spojené organické extrakty byly promyty 25 ml nasyceného sodného, vysušeny síranem hořečnatým, odpařeny. Vzniklá bílá pěna byla na silikagelu strukturního roztoku chloridu přefiltrovány a podrobena flash mobilní fází a odpařením byla chromatografií 25% ethylacetát/hexan. Spojením frakcí získána bílá pevná látka (0,12 g, 0,38 mmolu, 28%) o teplotě tání 209°C až 212°C.

(NA-1993B-42D)

Příklad 28

Estra-1,3,5(10),16-tetraen-3,6-diol strukturního vzorce (XIV)

K suspenzi tetrahydridohlinitanu litného (LAH, 95%, 46,9 mg, 1,17 mmolu) v 5 ml bezvodého THF byl přidán po kapkách za míchání estra-1,3,5(10),16-tetraen-6-on-3-acetát strukturního vzorce (XI) v 5 ml bezvodého THF. Viz obrázek 13. Reakce byla míchána po dobu 50 minut, pak byl přidán další LAH (46,5 mg, 1,16 mmolu) a reakce byl míchána dalších 22 hodin. Po 4 h zahřívání k varu pod zpětným chladičem byla podle TLC ještě zjištěna výchozí látka. Reakce byla ukončena 0,5 ml vody + 0,5 ml 20% hmotnostních kyseliny sírové a odpařena za sníženého tlaku. Odparek byl čtyřikrát extrahován 10 ml horkého ethylacetátu a přefiltrován přes křemelinu. Spojené filtráty byly odpařeny a dvakrát čištěny flash chromatografií, čímž byl získán pevný produkt (0,05 g, 0,2 mmolu, 10%) o teplotě tání 150°C až 157°C.

(NA-1993B-29, 32B)

Příklad 29

Estra-1,3,5(10),7-tetraen-3-olu strukturního vzorce (XV).

K suspenzi equilinu (100,2 mg, 0,3733 mmolu) ve 2 ml diethylenglykolu byl přidán hydrazin (59 μΐ, 1,9 mmolu) a hydroxid draselný (0,04 g, 0,7 mmolu). Viz obrázek 14. Směs byla míchána po dobu 2 h na olejové lázni o teplotě 200°C až 214 °C a pak byla vychladlá reakční směs zředěna 10 ml vody, neutralizována 1 N HCl a třikrát extrahována 25 ml etheru. Spojené organické vrstvy byly promyty 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým, přefiltrovány, odpařeny a čištěny preparativní TLC (silikagel, 15% ethylacetát/hexan) čímž byla získána žlutá pryskyřice. Produkt byl dále odbarven aktivním uhlím a krystalizován z vodného ethanolu, čímž byly získány nahnědlé krystaly (13,2 mg, 51,9 μΜ, 14%) o teplotě tání 130°C až 134°C. (NA-1993B-25C)

Příklad 30

20-homoestra-l,3,5(10),6,8,17-hexaen-3-ol strukturního vzorce (XVI)

Suspenze trifenylmethylfosfonium bromidu (671,0 mg, 1,878 mg) a t.-butoxidu draselného (212,1 mg, 1,890 mmolu) ve 2,1 ml bezvodého DMSO byla zahřívána na lázni o teplotě 76°C až 86°C pod argonovou atmosférou po dobu 1 h, pak byl přidán equilenin (100,1 mg, 0,3579 mmolu) ve 2,1 ml bezv. (viz obrázek 14) DMSO a zelený roztok byl míchán po dobu 1 hodiny. Po vychladnutí bylo přidáno 10 ml ledové 1 N HCl a vzniklá směs byla třikrát extrahována 10 ml etheru. Spojené organické extrakty byly promyty 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného + 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým, přefiltrovány přes křemelinu, odpařeny a čištěny.

Příklad 31

Estra-1,3, 5(10),6-tetraen-3-ol-17-(p.-toluensulfonyl)hydrazon strukturního vzorce (XXII)

Suspenze 6-dehydroestronu (538,0 mg, 2,004 mmolu) a p.-toluensulfonylhydrazidu (p.-TsNHNH₂, 466,6 mg, 2,506 mmolu) v bezvodém methanolu (5,4 ml) byla zahřívána k varu pod zpětným chladičem po dobu 25 hodin za nepřístupu vlhkosti. Viz obrázek 15. Po odpaření za sníženého tlaku byl odparek podroben flash chromatografií (50% ethylacetát/hexan na silikagelu) čímž byla získána téměř bílá pěna (942,5 mg), což představuje více než 100% výtěžek.

(NA1994A-295A)

Příklad 32

Estra-1,3, 5(10), 6,16-pentaen-3-ol strukturního vzorce (XXIII)

K ochlazenému (lázeň led/voda) roztoku surového estra-1,3,5(10),6-tetraen-3-ol-17-(p.-toluensulfonyl)hydrazonu strukturního vzorce (XXII) (942,5 mg, < 2,004 mmolu) v tetrahydrofuranu (THF) pod argonovou atmosférou bylo po kapkách za míchání během 7 minut přidáno n-butyllithium (2,5 M v hexanu, 3,2 ml, 8,0 mmolu). Viz obrázek 15. V míchání bylo pokračováno po dobu dalších 48 hodin, během kterých byla reakční směs ponechána postupně ohřát na laboratorní teplotu. Pak bylo přidáno 50 ml 1 N kyseliny chlorovodíkové a reakční směs byla třikrát extrahována 25 ml etheru. Spojené organické extrakty byly promyty 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány přes křemelinu. Filtrační koláč byl promyt 10 ml etheru a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Surový produkt byl čištěn flash chromatografií (20% ethylacetát/hexan na silikagelu) a preparativní TLC (20% ethylacetát/hexan na silikagelu GF, tloušťka 1000 μ), čímž byl získán bílý, krystalický film (134,5 mg, 0,5331 mmolu, 27%) podle TLC (20% ethylacetát/hexan na silikagelu, R_f 0,39) jednotný.

(NA-1994A-307A)

Příklad 33

Estra-1,3, 5(10),6,16-pentaen-3-ylacetát strukturního vzorce (XXIV)

Roztok estra-1,3,5 (10),6,16-pentaen-3-olu strukturního vzorce (XXIII) (97,9 mg, 0,388 mmolu) v bezv. pyridinu (1,3 ml, 16 mmolu) v anhydridu kyseliny octové (0,18 ml, 1,9 mmolu) byl míchán po dobu 24 hodin, pak byl přidán ethylacetát (15 ml) a směs byla třikrát promyta 5 ml podíly 1 N kyseliny chlorovodíkové + 5 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného + 5 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušena síranem hořečnatým a přefiltrována přes křemelinu. Viz obrázek 15. Filtrační koláč byl promyt 5 ml ethyíacetátu a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Preparativní TLC (10% ethylacetát/hexan na silikagelu GF, tloušťka 1000 μ) byla získána nažloutlá krystalická pevná látka (74,9 mg, 0,254 mmolu, 66%) podle TLC (10% ethylacetát/hexan na silikagelu, R_f 0,40) jednotná.

(NA-1994B-21B)

Příklad 34

Estra-1,3,5(10),7-tetraen-3-ol-17-(p.-toluensulfonyl)hydrazon strukturního vzorce (XXV)

Ekvilin (500,1 mg, 1,863 mmolu) a p.-TsNHNH₂ (433,7 mg, 2,329 mmolu) suspendovaný v bezvodém methanolu (5,0 ml) byl zahříván k varu pod zpětným chladičem po dobu 24 hodin za nepřístupu vlhkosti. Viz obrázek 15. Po odpaření za sníženého tlaku byl odparek podroben flash” chromatografií (35% ethylacetát/hexan na silikagelu) čímž byla získána bílá pěna (899,9 mg), což představovalo více než 100% výtěžek.

(NA-1994A-246B)

Příklad 35

Estra-1, 3, 5(10),7,16-pentaen-3-ol strukturního vzorce (XXVI)

K ochlazenému (lázeň led/voda) roztoku surového estra-1,3, 5(10),7-tetraen-3-ol-17-(p.-toluensulfonyl)hydrazonu strukturního vzorce (XXV) (899,9 mg, < 1,863 mmolu) v bezv.

THF (20 ml) pod argonovou atmosférou bylo po kapkách za míchání během 3 minut přidáno n-butyllithium (2,5 M v hexanu,

3,0 ml, 7,5 mmolu). Viz obrázek 15. V míchání bylo pokračováno po dobu dalších 48 hodin, během kterých byla reakční směs ponechána postupně ohřát na laboratorní teplotu. Reakční směs byla nalita do 50 ml 1 N kyseliny chlorovodíkové a reakční směs byla třikrát extrahována 25 ml etheru. Spojené organické extrakty byly promyty 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány přes křemelinu. Filtrační koláč byl promyt 10 ml etheru a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Surový produkt byl čištěn flash chromatografií (20% ethylacetát/hexan na silikagelu) a odbarven aktivním uhlím, čímž byla získána žlutá, krystalická pevná látka (274,8 mg, 1,089 mmolu, 58%). (NA-1994A-278A)

Příklad 36

Estra-1,3,5(10),7,16-pentaen-3-ylacetát strukturního vzorce (XXVII)

Roztok estra-1,3,5(10),7,16-pentaen-3-olu strukturního vzorce (XXVI) (192,1 mg, 0,7612 mmolu) v bezv. pyridinu (2,6 ml, 32 mmolu) v anhydridu kyseliny octové (0,36 ml, 3,8 mmolu) byl míchán po dobu 6 hodin, pak byl přidán ethylacetát (30 ml) . Směs byla třikrát promyta 10 ml podíly 1 N kyseliny chlorovodíkové + 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného + 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušena síranem hořečnatým a přefiltrována přes křemelinu. Viz obrázek 15. Filtrační koláč byl promyt 10 ml ethylacetátu a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Preparativní TLC (5% ethylacetát/hexan na silikagelu GF, tloušťka 1000 μ) a krystaiizaci z vodného ethanolu byly získány jemné bílé jehlice (78,6 mg, 0,267 mmolu, 35%) o teplotě tání 77°C až 80°C. TLC (4% ethylacetát/hexan na silikagelu) ukázala dvě skvrny o R_f 0,21 a 0,24.

(NA-1994A-286A)

Příklad 37

Estra-1,3,5(10),6,8-pentaen-3-ol-17-(p.-toluensulfonyl)hydrazon strukturního vzorce (XXVIII)

Ekvilenin (0,6559 g, 2,463 mmolu) a p.-TsNHNH₂ (573,7 mg, 3,080 mmolu) suspendovaný v bezvodém methanolu (8,2 ml) byl zahříván k varu pod zpětným chladičem po dobu 24 hodin za nepřístupu vlhkosti. Viz obrázek 16. Po ochlazení a odpaření za sníženého tlaku byla reakční směs podrobena flash chromatografií (35% až 40% ethylacetát/hexan na silikagelu) čímž byla získána látka o teplotě tání 95°C až 96°C. TLC (2%ethylacetát/hexan na silikagelu) ukázala produkt (R_f 0,1) obsahující stopy nečistoty na startu.

(NA-1994A-273B)

Příklad 38

Estra-1,3,5(10),6,8,16-hexaen-3-ol strukturního vzorce (XXIX)

K ochlazenému (lázeň led/voda) roztoku surového estra-1,3,5(10),6,8-pentaen-3-ol-17-(p.-toluensulfonyl)hydrazonu strukturního vzorce (XXVIII) (1,0887 g, < 2,463 mmolu) v bezv. THF (25 ml) pod argonovou atmosférou bylo po kapkách za míchání během 2 minut přidáno n-butyllithium (2,5 M v hexanu, 3,9 ml, 9,8 mmolu). Viz obrázek 16. V míchání bylo pokračováno po dobu dalších 3 dnů, během kterých byla reakční směs ponechána postupně ohřát na laboratorní teplotu. Bylo přidáno 50 ml ledové 1 N kyseliny chlorovodíkové a reakční směs byla třikrát extrahována 25 ml etheru. Spojené organické extrakty byly promyty 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány přes křemelinu. Filtrační koláč byl promyt 10 ml etheru a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Flash chromatografií (20% ethylacetát/hexan na silikagelu), krystalizací z vodného ethanolu a odbarvením aktivním uhlím byly získány nahnědlé šupiny (245,8 mg, 0,9819 mmolu, 40%) o teplotě tání 162°C až 163°C.

(NA-1994A-269A)

Příklad 39

Estra-1,3,5(10),6,8,16-hexaen-3-ylacetát strukturního vzorce (XXX)

Roztok estra-1,3,5(10),6,8,16-hexaen-3-olu strukturního vzorce (XXIX) (148,8 mg, 0,5944 mmolu) v bezv. pyridinu (2,0 ml, 25 mmolu) v anhydridu kyseliny octové (0,28 ml, 3,0 mmolu) byl míchán po dobu 6 hodin, pak byl přidán ethylacetát (20 ml). Viz obrázek 16. Směs byla třikrát promyta 10 ml podíly 1 N kyseliny chlorovodíkové + 10 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného + 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušena síranem sodným a přefiltrována. Filtrační koláč byl promyt 5 ml ethylacetátu a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Krystalizaci z 95% ethanolu byly získány leskle bílé šupiny (99,4 mg, 0,340 mmolu, 55%) o teplotě tání 77°C až 80°C.

ethylacetát/hexan na silikagelu) ukázala produkt obsahující stopy nečistoty na startu.

TLC (2% (R_f 0,1)

Příklad 40

17-methylenestra-l,3,5(10)-trien-3-ol strukturního vzorce (XXXI)

Suspenze trifenylmethylfosfonium bromidu (100,03 g, 0,28001 molu) a t.-butoxidu draselného (31,42 g, 0,2800 molu) v bezvodém dimethylsulfoxidu (DMSO, 320 ml) byla zahřívána na olejové lázni (68°C až 81°C) pod argonovou atmosférou po dobu 1 h, pak byl stříkačkou přidán estron (15,14 g, 55,99 mmolu) v bezv. DMSO (320 ml). Viz obrázek 17. V míchání bylo pokračováno po dobu lha reakce byla ponechána vychladnout. Reakční směs byla nalita do 800 ml ledové 1 N HCI a vzniklá směs byla třikrát extrahována 400 ml etheru. Spojené organické extrakty byly promyty 350 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného + 400 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem sodným a přefiltrovány přes kolonu silikagelu (200 až 40 mesh) velikosti 58 mm na výšku x 84 mm v průměru. Produkt byl vymýván dalším podílem etheru. Odpařením příslušných frakcí za sníženého tlaku a krystalizaci z vodného ethanolu byly získány velmi jemné bílé jehlice (11,47 g, 42,73 mmolu, 76%) o teplotě tání 134°C až 136°C, které jsou podle TLC homogenní (20% ethylacetát/hexan na silikagelu, R_f 0,45).

(NA-1994A-242B)

Příklad 41

17-methylenestra-l,3,5(10)-trien-3-ylacetát strukturního vzorce (XXXII)

Roztok 17-methylenestra-l,3,5(10)-trien-3-olu strukturního vzorce (XXXI) (5,84 g, 21,8 mmolu) v bezv. pyridinu (32 ml, 0,40 molu) v anhydridů kyseliny octové (9,7 ml, 0,10 molu) byl míchán po dobu 24 hodin, pak byl přidán ethylacetát (250 ml) . Viz obrázek 17. Směs byla třikrát promyta 100 ml podíly 1 N kyseliny chlorovodíkové + 100 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného + 100 ml nasyceného roztoku síranu měďnatého + 100 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušena síranem hořečnatým a přefiltrována přes křemelinu. Filtrační koláč byl promyt 25 ml ethylacetátu a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Krystalizaci z vodného ethanolu byly získány leskle bílé šupiny (5,84 g, 18,8 mmolu) o teplotě tání 77°C až 79°C.

(NA-1994A-248B)

Příklad 42

17-methylenestra-l,3,5(10)-trien-6-on-3-ylacetát strukturního vzorce (XXXIII)

K suspenzi oxidu chromového (6,19 g, 61,9 mmolu) ochlazené na -8°C (lázeň led/sůl) v methylenchloridu (100 ml) byl přidán 2,4-dimethylpyrazol (5,95 g, 61,9 mmolu). Viz obrázek 17. Po 20 minutách míchání byl přidán roztok 17-methylenestra1,3,5(10)-trien-3-ylacetátu strukturního vzorce (XXXII) (2,0001 g, 6,4428 mmolu) v 10 ml vychlazeného methylenchloridu během 2 minut tak, že teplota nepřestoupila -6^eC. V míchání bylo pokračováno po dobu dalších 2 hodin a směs pak byla přefiltrována přes kolonu 100 g silikagelu (200 až 400 mesh). Produkt byl eluován methylenchloridem. Po spojení a odpaření správných frakcí byl získán surový produkt, který byl dále čištěn krystalizací z vodného ethanolu, čímž byly získány lesklé téměř bílé krystaly (334,0 mg, 1,030 mmolu, 16%) o teplotě tání 91°C až 94°C. Pomocí TLC (25% ethylacetát/hexan na silikagelu) byl prokázán produkt (R_f 0,47) se dvěma malými nečistotami o R_f 0,30 a 0,39.

(NA-1994A-272A)

Příklad 43

17-methylenestra-l,3,5 (10)-trien-3,6B-diol strukturního vzorce (XXXIV)

K suspenzi tetrahydridohlinitanu litného (53,6 mg, 1,41 mmolu) v bezv. THF (3,0 ml) pod argonovou atmosférou ochlazené lázní suchý led/aceton byl během 8 minut přidán po kapkách za míchání 17-methylenestra-l,3,5(10)-trien-6-on-3ylacetát strukturního vzorce (XXXIII) (251,7 mg, 0,7758 mmolu) v bezv. THF (3,0 ml). Viz obrázek 17. Po 2 h míchání byla odstraněna lázeň a v míchání bylo pokračováno po dobu další hodiny. Reakce byla ukončena mícháním po dobu 1/2 hodiny s Glauberovou solí (1,78 g). Vzniklá reakční směs byla nalita na krátký sloupeček křemeliny a čtyřikrát extrahována 10 ml ethylacetátu. Následovala extrakce pěti 10 ml podíly horkého ethylacetátu a odpaření všech extraktů za sníženého tlaku na bezbarvý film. Preparativní TLC (40% ethylacetát/hexan na silikagelu GF, tloušťky 1000 μ) byla získána bílá pěna (15,3 mg, 53,8 ymolu, 7%). Pomocí TLC (40% ethylacetát/hexan na silikagelu) byl prokázán produkt (R_f 0,29) a malé nečistoty (R_f 0,37) .

(NA-1994A-283B) varu pod (5,0 ml,

Příklad 44

17-methylenestra-l,3,5(10)-trien-3-ylmethylether strukturního vzorce (XXXV)

K míchané suspenzi 17-methylenestra-l,3,5(10)-trien-3-olu (5,37 g, 20,0 mmolu) a uhličitanu draselného (50,82 g, 0,3678 molu) v 90% ethanolu (500 ml) zahřáté k zpětným chladičem byl přidán dimethylsulfát mmolu) . Po 1/2 hodině zahřívání k varu byl během 1 hodiny přidán další dimethylsulfát (36 ml, 0,38 molu, ve třech 12 ml podílech). Viz obrázek 17. Reakce byla zahřívána k varu po dobu další hodiny, pak bylo přidáno 360 ml vody a směs byla umístěna přes noc do lednice. Vzniklá suspenze byla přefiltrována a promyta 80 ml 60% methanolu podíly 5% (hmotnostních) hydroxidu sodného podíly vody. Odparek byl krystalizován z vodného methanolu, čímž byly získány bílé krystaly (3,88 g, 13,7 mmolu, 69%) o teplotě tání 59°C až 62°C. Pomocí TLC (20% ethylacetát/hexan na silikagelu) byl prokázán produkt (R_f 0,63) a stopové nečistoty o R_f 0,37 a na startu.

(NA1994A-274) + třemi 80 ml + třemi 80 ml

Příklad 45

17-methylenestra-2,5(10)-dien-3-ylmethyl ether strukturního vzorce (XXXVI) ml bezv. amoniaku bylo skrz KOH věž přivedeno do 250 ml vyžíhané tříhrdlé baňky, opatřené přívodním adaptérem, magnetickým míchadlem, zpětným chladičem na směs suchý led/aceton a skleněnou zabroušenou zátkou. Viz obrázek 17. Byl přidán roztok 17-methylenestra-l,3,5(10)-trien-3-ylmethyletheru strukturního vzorce (XXXV) (1,1297 g, 4,0001 mmolu) a t.-butylalkohol (13,21 g, 0,1782 molu) v suchém THF (17 ml) a lithium (0,47 g, 68 mmolu) nakrájené na malé kousky. Po 6 h zahřívání k varu pod zpětným chladičem byl přidán bezv. měthanol (6,6 ml) a suspenze byla míchána přes noc, čímž došlo k odpaření amoniaku. Byla přidána voda (100 ml) a suspenze byla třikrát extrahována 50 ml podíly methylenchloridu. Spojené organické extrakty byly promyty 100 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem sodným a přefiltrovány. Filtrační koláč byl promyt 25 ml methylenchloridu a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Výsledný světle žlutý olej byl krystalizován z vodného ethanolu, čímž byly získány lesklé bílé krystaly (815,0 mg, 2, 865 mmolu, 72%) o teplotě tání 77°C až 78°C, které jsou podle TLC homogenní (R_f 0,60, 10% ethylacetát/hexany na silikagelu).

(NA-1994A-257)

Příklad 46

17-methylenestr-4-en-3-on strukturního vzorce (XXXVII)

Konc. kyselina chlorovodíková (6,0 ml) a voda (6,0 ml) byly přidány k roztoku 17-methylenestra-2,5(10)-dien-3-ylmethyl etheru strukturního vzorce (XXXVI) (702,8 mg, 2,471 mmolu) v methanolu (6 ml) a acetonu (20 ml). Viz příklad 17. Po 1 h míchání byl opatrně přidán hydrogenuhličitan sodný (7,50 g). Směs byla odpařována za sníženého tlaku dokud neskončil vývoj pěny a pak byla přidána voda (50 ml). Směs byla třikrát extrahována 25 ml podíly methylenchloridu. Spojené organické extrakty byly promyty 50 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány přes křemelinu. Filtrační koláč byl promyt 10 ml methylenchloridu a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Produkt byl čištěn odbarvením aktivním uhlím, flash chromatografií (20% ethylacetát/hexan na silikagelu) a krystalizaci z vodného ethanolu, čímž byl získán bílý prášek (302,8 mg, 1,120 mmolu, 45%) o teplotě tání 83°C až 89°C.

(NA-1994A-271)

Příklad 47

17-methylenestr-4-en-3B-ol strukturního vzorce (XXXVIII)

Tri-t.-butoxyhydridohlinitan litný (766,6 mg, 3,015 mmolu) byl přidán k roztoku 17-methylenestr-4-en-3-onu strukturního vzorce (XXXVII) (203,7 mg, 0,7533 mmolu) v 10 ml bezv. etheru a reakční směs byla míchána po dobu 4 hodin. Viz obrázek 18. Pak byla přidána Glauberova sůl (3,80 g) a vzniklá suspenze byla míchána po dobu 1/2 hodiny. Směs byla přefiltrována přes křemelinu a filtrační koláč byl pětkrát promyt 10 ml podíly etheru. Spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku a pak podrobeny preparativní TLC (5% ethylacetát/methylenchlorid na silikagelu GF, tloušťky 1000 μ) , čímž byly získány bílé jehlice (60,2 mg, 0,221 mmolu, 29%), které jsou podle TLC (Rf 0,37, 5% ethylacetát/methylenchlorid na silikagelu) homogenní.

(NA-1994A-282)

Příklad 48

17-methylenestra-l,3,5(10),7-tetraen-3-ol strukturního vzorce (XXXIX)

Trifenylmethylfosfonium bromid (1,9967 g, 5,5892 mmolu) a t.-butoxid draselný (627,2 mg, 5,589 mmolu) suspendovaný v 6,1 ml bezv. DMSO byl zahříván na olejové lázni (71^eC až 83°C) pod argonovou atmosférou po dobu 1 h, pak byl stříkačkou přidán equilin (300,0 mg, 1,118 mmolu) v 6,1 ml bezv. DMSO. Viz obrázek 18. Po dalších 70 minutách míchání byla reakční směs nalita do 40 ml ledové vody a třikrát extrahována 25 ml podíly etheru. Spojené organické extrakty byly promyty 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány přes křemelinu. Filtrační koláč byl promyt 10 ml etheru a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Flash chromatografií (15% ethylacetát/hexan na silikagelu) a preparativní TLC (20% ethylacetát/hexan na silikagelu GF, tloušťky 1000 μ) byl získán zakalený bílý film (162,3 mg, 0,6093 mmolu, 54%).

(NA-1994A-258)

Příklad 49

17-methylenestra-l,3,5(10),7-tetraen-3-ylacetát strukturního vzorce (XL)

Trifenylmethylfosfonium bromid (3,33 g, 9,32 mmolu) a t.-butoxid draselný (1,05 g, 9,36 mmolu) suspendovaný v 10 ml bezv. DMSO byl za míchání zahříván na olejové lázni (77°C až 79°C) pod argonovou atmosférou po dobu 1 h, pak byl stříkačkou přidán equilin (500,0 mg, 1,863 mmolu) v 10 ml bezv. DMSO. Viz obrázek 18. Po další hodině míchání byla vychladlá reakční směs nalita do 50 ml ledové 1 N kyseliny chlorovodíkové a třikrát extrahována 25 ml podíly etheru. Spojené organické extrakty byly promyty 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány přes křemelinu. Filtrační koláč byl promyt 10 ml etheru a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Výsledný světle žlutý sirup byl rozpuštěn v bezv. pyridin (6,3 ml, 78 mmolu) pak byl přidán anhydrid kyseliny octové (0,88 ml, 9,3 mmolu) a reakční směs byla míchána po dobu 16 hodin. Reakční směs pak byla nalita do 100 ml 1 N kyseliny chlorovodíkově a třikrát extrahována 50 ml podíly etheru. Spojené organické extrakty byly promyty 100 ml nasyceného roztoku hydrogenuhličitanu sodného + 100 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány přes křemelinu. Filtrační koláč byl promyt 25 ml ethylacetátu a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Surový acetát byl podroben flash chormatografii (5% ethylacetát/hexan na silikagelu), čímž byla získána žlutá pryskyřice (494,7 mg, 1,604 mmolu, 86%) .

(NA-1994A-305)

Příklad 50

Estra-4,16-dien-10fi-ol-3-on strukturního vzorce (XLI)

K vychlazené (lázeň estra-4(10),16-dien-3-onu suchý led/aceton) suspenzi strukturního vzorce (XLII) (115,7 mg, 0,4513 mmolu) v chloroformu (3 ml) byla přidána m-chlorperoxybenzoová kyselina (MCPBA, 77,4%, 420,8 mg, 1,89 miliekvivalentu peroxykyseliny) suspendovaná v etheru (4,3 ml) a směs byla míchána po dobu 2 hodin. Viz obrázek 19. Reakce pak byla uložena na 18 hodin do lednice a pak byl přidán pentahydrát thiosíranu sodného [5% (hmotnostních), 25 g] . Po 5 minutách míchání byla reakční směs třikrát extrahována 10 ml podíly etheru. Spojené organické extrakty byly promyty 25 ml nasyceného hydrogenuhličitanu sodného + 25 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány přes křemelinu. Filtrační koláč byl promyt 10 ml etheru a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku.

Podle TLC bylo zjištěno, že meziprodukt 15B,ΙΟβ-epoxid podlehl částečné eliminaci. Eliminace byla dokončena zahříváním bílého krystalického odparku ve 20 g 5% (hmotnostních) hydroxidu draselného v bezvodém methanolu k varu pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny. Rekační směs byla nalita do 50 ml ledové vody a extrahována 50 ml etheru. Organické extrakty byly dvakrát promyty 50 ml podíly vody, vysušeny síranem sodným a přefiltrovány přes křemelinu. Filtrační koláč byl promyt 20 ml etheru a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Odparek byl podroben preparativní TLC (50% ethylacetát/hexan na silikagelu GF, tloušťka 1000 μ), čímž byla získána bezbarvá pryskyřice (19,7 mg, 72,3 μιηοΐη, 16%).

(NA-1993B-80)

Příklad 51

18-nor-17-methylenestra-4,13(17)-dien-3-ol strukturního vzorce (XLIII)

K ochlazenému (lázeň voda/led) roztoku 18-nor-17-methylenestra-4,13(17)-dien-3-onu strukturního vzorce (XLIV) (0,23 g, 0,90 mmolu) v bezv. methanolu (2,3 ml) byl přidán tetrahydridoboritan sodný (0,23 g, 6,1 mmolu) a reakční směs byla míchána po dobu 2 hodin. Viz obrázek 19. Rozpouštědlo bylo odpařeno za sníženého tlaku a k odparku bylo přidáno 10 ml vody. Směs pak byla třikrát extrahována 10 ml podíly methylenchloridu. Spojené organické extrakty byly promyty 10 ml nasyceného roztoku chloridu sodného, vysušeny síranem hořečnatým a přefiltrovány přes křemelinu. Filtrační koláč byl dvakrát promyt 5 ml methylenchloridu a spojené filtráty byly odpařeny za sníženého tlaku. Výsledná světle žlutá pevná látka byla čištěna preparativní TLC (5% ethylacetát/methylenchlorid na silikagelu GF, tloušťka 1000 μ), čímž byla získána žlutá pevná látka (53,6 mg, 0,207 mmolu, 23%), která byla podle TLC (5% ethylacetát/methylenchlorid na silikagelu; R_f 0,32) homogenní.

(NA-1993B-120)

Příklad 52

Elektrofyziologie estrenové stimulace lidského VNO a nosního epithelu

Pro zanamenání místních elektrických potenciálů z lidského vomeronosního orgánu (VNO) a z nosního epithelu (olfactory epithelium - OE) byla použita neinvazivní metoda. Lokální stimulace plynem byla provedena u obou nosních struktur v různých případech za použití speciálně navrženého katetru/elektrod připojených k multikanálovému systému podávání léku. Místní reakce VNO a OE prokázala korelaci s koncentrací ligandového stimulu.

Studie byla provedena na deseti klinicky normálních dobrovolnících - 2 mužích a 8 ženách, ve věku 18 až 85 let. Studie byly provedeny bez celkové nebo místní anesteze.

Katetr/elektrody byly navrženy tak, aby dopravily na místo stimul a zároveň zaznamenaly reakci. V případě zaznamenáváni VNO byla pravá nosní dírka otevřena nasoskopem (nasal specula) a vomeronosní otevření bylo lokalizováno blízko průniku předního ukončení radličné kosti a nosní přepážky. Katetr/elektroda byla opatrně zavedena do otevření VNO a konec elektrody byl umístěn v průsvitu orgánu 1 až 3 mm od otevření. Nasoskop pak byl vyjmut. V případě OE je procedura zaznamenání podobné, kromě toho, že katetr/elektroda je opatrně umístěna v laterální části střední nosní trubice v dosahu nosní slizníce.

Místní plynová stimulace byla provedena přes katetr/elektrodu. Konstantní proud čistého, nezapáchajícího, vlhkého vzduchu laboratorní teploty byl nepřetržitě proháněn kanálem stimulačního systému. Stimulační ligand byl naředěn v propylenglykolu, smíchán s vlhkým vzduchem a vypuštěn po dobu 1 až 2 sekund skrz katetr/elektrodu. Bylo předpokládáno, že toto podávání poskytlo 25 pg steroidního ligandu do nosní dutiny.

Výsledky této studie jsou uvedeny na obrázku 2. Reakce byla měřena v milivoltsekundách (mV x s). 1,3,5(10),16-estratetraen-3-ol vyvolal znatelně větší reakci VNO u mužů než jiné testované sloučeniny (Obr. 2A) . 1,3,5(10)-estratrien3,16a,17fi-triol také vyvolal silnou VNO reakci. Navíc je reakce VNO na tyto dva estreny sexuálně dimorfní - přibližně čtyřikrát silnější u mužů než u žen (Obr. 2B) . Naopak reakce OE je jak u mužů, tak u žen nízká ve srovnání s látkou se silným zápachem jako je cibule (Obr. 2C).

Příklad 53

Měření změny v receptorovém potenciálu neuroepithelu VNO v reakci na různé steroidy

Změna v receptorovém potanciálu v reakci na sedm různých ligandů byla měřena u 40 žen (Obr. 3A) a 40 mužů (Obr. 3B) . Každé osobě bylo podáno 60 pg každé ze sedmi látek jak je uvedeno v obrázcích. Látky byly podávány, každá zvlášť po dobu 1 sekundy, pomocí postupu popsaného v příkladu 20. Změny v potenciálu neuroepithelu VNO byly zaznamenány v čase a integrál změny potenciálu pro každou ze čtyřiceti osob byl zprůměrován. Výsledky jsou uvedeny v obrázku. Srovnání obrázků 3A a 3B ukazuje, že každý steroid je sexuálně dimorfní ve své aktivitě a některé ligandy jsou silnější pro muže zatímco některé jsou silnější pro ženy.

Příklad 54

Měření autonomních reakcí na stimulaci VNO estrenem

Monitorovány byly různé autonomní parametry při podávání 1,3, 5(10), 16-estratetraen-3-ylacetátu 40 mužům postupem popsaným v přikladu 20. Propylénglykol byl také podáván jako kontrola. Ligand byl podáván v 1 sekundových pulsech. Změna v autonomní funkci byla nejprve zaznamenána během 2 sekund a nejdéle do 45 sekund. Jak je vyobrazeno na obrázku 4, ve srovnání s propylenglykolovou kontrolou, estren vyvolal znatelnou změnu v integrovaném receptorovém potenciálu ve VNO (4A), galvanické reakce kůže (4B) a teplotě kůže (4C).

Příklad 55

Srovnání změny potenciálu receptoru vyvolaném dvěma estrenovými steroidy pikogramů každého steroidů a propylenglykolové kontroly bylo podáno mužům způsobem popsaným v příkladu 21. Jak je ukázáno na obrázku 5, 1,3,5(10),16-estratetraen-3-ol methylether vyvolal větší změnu v receptorovém potenciálu než 1,3,5(10),16-estratetraen-3-ylacetát.

Příklad 56

Psychofyziologický vliv estrenové stimulace VNO

Psychofyziologický vliv estrenové stimulace VNO byl měřen koordinovaným podáváním feromonu a vyhodnocením dotazníků pro osobu před a po podávání. Dotazník zahrnuje panel adjektiv použitý jako část standardního Derogatisova sexuálního průzkumu.

osob, všechny zcela zdravé, byly náhodně označeny 20 bylo podáváno placebo a 20 bylo podáváno 20 pikogramů 1,3, 5(10), 16-estratetraen-3-olu způsobem popsaným v příkladu 3. Osobám je předložen dotazník o 70 bodech, který vyhodnocuje pocity ihned po a 30 minut po podávání placeba nebo testované látky. 70 adjektiv dotazníku bylo náhodně seřazeno a následně pospojováno pro vyhodnocení jejich relevance k náladě, pocitům a charakteru.

Příklad 57

Elektrofyziologické studie

Byly provedeny následující elektrofyziologické studie na klinicky normálních lidských dobrovolníků obou pohlaví (30 mužů a 30 žen) ve věku 20 až 45 let. Nebyla použita žádná

Grosser, Β. electrical anesteze a ženy nebyly zahrnuty do testu v případě těhotenství.

Stimulační a záznamový systém sestává z multifunkční minisondy popsané v jiném dokumentu (Monti-Bloch, L. a

L. (1991) Effect of putative pheromones on the activity of the human vomeronasal organ and olfactory epithelium J, Steroid Biochem. Molec. Biol. 39: 573-582.). Záznamová elektroda je 0,3 mm stříbrná kulička připojená k malému (0,1 mm) stříbrnému drátu potaženém

Teflonem®, přičemž povrch elektrody byl upraven tak, aby vznikla mezivrstva chloridu stříbrného a pak byla pokryta želatinem. Vše bylo umístěno do Teflonového® katetru malého průměru (průměr = 5 mm) tak, že konec elektrody přesahoval maximálně o 2 mm. Teflonový® katetr byl 10 cm dlouhý a na konci byl prodloužen o multikanálový podávači systém, který dopravoval nepřerušovaný proud vzduchu, který nesl diksrétní pulsy chemosensoriského stimulantu. Proud vzduchu nejprve procházel do malé komůrky a pak byl bublán skrz roztok, který obsahoval buď vomeroferin nebo vonnou látku v ředidle nebo samotné ředidlo. Pro rychlé přesměrování proudu vzduchu z komůrky na trasu, která komůrku míjí byl používán solenoid. Tím jsou vytvářeny diskrétní pulsy stimulantu v proudu vzduchu. Druhá, vnější Teflonová® trubice o průměru 2 mm zakrývá sestavu katetr/elektroda a její konec je připojen k aspirátoru, který zaručuje nepřerušované sání 3 ml/s. Toto kocentrické uspořádání vnější sací trubice umožňovalo emitovanému chemosensorickému stimulantu, aby byl lokalizován v prostoru, který nazýváme minipole (o průměru = 1 mm), a zabraňovalo difusi látek do míst mimo zamýšlenou stimulaci nebo do dýchacího ústrojí. Celé stimulační a záznamové zařízení lze umístit buď na neurosensorický epithel ve VNO nebo na povrch nosního nebo dýchacího epithelu.

Elektro-vomeronosogram (EVG): Záznamy byly prováděny v tiché místnosti, kde osoby ležely naznak; multifunkční minisonda byla na začátku stabilizována v nosní dutině pomocí nosního refraktoru umístěného na vstupu do nosu. Referenční a zemnicí elektrody sestávaly ze stříbrných disků (8 mm) a obě byly umístěny na glabelle.

Vstup do VNO byl identifikován při prvním oddálení nosní stěny a vstupu. Pro umístěni konce Teflonového® katetru a sestavy záznamové elektrody do otevření VNO, kde byly stabilizovány v hloubce 1 mm ve vomeronosním průduchu, byla použita binokulární lupa s halogenovým osvětlením a šestinásobným zvětšením. Optimální umístění záznamové elektrody bylo signalizováno po testování na adekvátní depolarizaci pri reakci na testovanou látku.

Elektrické signály ze záznamové elektrody byly přenášeny do zesilovače stejnosměrného proudu, pak byly digitalizovány, zaznamenány počítačem a uloženy. Byla měřena amplituda signálů od píku k píku a plocha pod depolari začni vlnou byla integrována, zatímco bylo pokračováno v monitorování signálů jak na obrazovce počítače, tak na digitálním osciloskopu. Šumy vzniklé dýchacími pohyby byly odstraněny tréninkem osob v dýchání ústy s uzavřenou velofaryngelou.

Chemosensorické stimulanty: Testovací nosní látky jsou cineol a 1-karvon; vomeroferiny jsou A, B, C, E a F. (Vomeroferiny byly dodány Pherin Corporation, Menlo Park, California), vzorky vomeroferinů v koncentracích 25 až 800 fmolů byly podávány v nepřerušovaném proudu vzduchu po dobu 300 milisekund až 1 sekundy. Obvykle byly použity intervaly 3 až 5 minut po každé sérii krátkých testovacích pulsů. Všechny díly sestavy nesoucí testovací stimul byly vyrobeny z Teflonu®, skla nebo nerezové oceli a pečlivě vyčištěny a sterilizovány před každým použitím.

Elektro-olfaktogram (EOG): Pro nosní záznamy bylo použito stejné stimulace a záznamové multifunkční minisondy jako pro

VNO. Konec byl pomalu vkládán dokud nedošlo k dotyku elektrody s nosní sliznicí. Adekvátní umístění bylo signalizováno depolarizací v reakci na puls vonicí testované látky.

Aktivita vyvolaná v kůře mozkové byla indukována stimulací VNO pomocí vomeroferinů a nosní stimulace vonnými látkami dopravovanými ve 300 ms vzduchových pulsech. Byla zaznamenána pomocí standardních elektroencefalografických (EEG) elektrod umístěných na pozicích Cz-Al a Tz-Al mezinárodního systému 10120; zemnicí elektroda byla umístěna na mastoidní proces. Elektrodermální aktivita (EDA) byla zaznamenána pomocí standardních 8 mm stříbrných elektrod v kontaktu s kůží prstů přes vodivé gelové rozhraní. Teplota kůže (skin temperature ST) byla zaznamenána pomocí malé (1,0 mm) termistorové sondy umístěné v pravém uchu. Periferní arteriální puls (PAP) byl sledován plethysmografem připojeným ke konci prstu. Dýchací frekvence (RF) byla měřena měřidlem umístěným ve spodní části hrudi. Všechny elektrické signály byl zesíleny zesilovačem stejnosměrného proudu, digitalizovány (MP-100, Biopac Systems) a nepřetržitě sledovány pomocí počítače.

Statistické analýzy: EVG nebo EOG, změny od píku k píku a změny frekvence jiných parametrů byly měřeny a statisticky analyzovány. Význam výsledků byl stanoven buď pomocí párových t-testů nebo analýzou odchylky (ANOVA).

Vliv vomeroferinů na EVG: O každém z vomeroferinů bylo zjištěno, že vyvolává sexuálně dimorfní receptorový potenciál (Obr. 6A až B) . Záznamy EVG byly provedeny na 30 mužích a 30 ženách (věk 20 až 45) . Vomeroferiny byly zředěny a aplikovány jako 1 sekundové pulsy do VNO s intervaly £ minut mezi pulsy, osoby při dotazu uvedly, že necítí nebo jinak nevědomky nedetekují žádný z vomeroferinů. Toto zjištění bylo v souladu s výsledky již dříve publikovanými (Monti-Bloch, L. a Grosser, B. L. (1991) Effect of putative pheromones on the electrical activity of the human vomeronasal organ and olfactory epithelium” J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 39: 573-582.), které ukazují, že ani nosní ani vomeroferinové testovací stimuly dodané do VNO nejsou smysly detekovatelné v použitých koncentracích.

Obrázek 6A ukazuje průměrnou reakci mužů (věk 20 až 38) na ředidlo a ekvimolární množství (100 fmolů) pěti vomeroferinů (A, B, C, D a F) a na E, což je stereoizomer F. Profil reakce na každou z látek byl podobný u všech osob bez rozdílu věku a nedošlo k žádným znatelným rozdílům ať při použití t-testů nebo analýzou odchylky. Napříáklad A, C a D vyvolaly znatelné účinky (M₁₅ - 11,4 mV, SD =3,6 mV; M₇₆ = 6,4mV, SD 2,5 mV a M₈₄ = 15,1 mV, SD = 4,9 mV; p<0,01), které byly konzistentní ve všech jednotlivých případech.Jiné vomeroferiny depolarizovaly VNO-receptory v mnohem menším rozsahu, ale s konsistentními průměrnými reakčními amplitudami u každého jednotlivce. Vomeroferiny aktivní u mužů vyvolaly větší reakce než ředidlo (p<0,001). B, F a podobné koncentrace vonných látek vyvolaly znatelně nižší reakce u mužů ve VNO (Obr. 6A a obr. 7).

Podobný experimentální postup byl zvolen pro 30 žen (věk 20 až 45) . Mezi vomeroferiny vyvolal ve skupině nej znatelnější rozdíly (Obr. 6B) F (100 fmolů) . Zde A vyvolal malý efekt, který byl znatelně odlišný od F (p<0,01). ϋ obou populací osob měly receptorové reakce vyvolané aktivními vomeroferiny velké standardní odchylky (Obr. 6). Při studiu frekvenčního rozdělení efektů A a F u mužů a žen bylo získáno bimodální rozdělení. Význam tohoto pozorování byl studován.

E, stereoizomer F, nestimuluje VNO u žen, zatímco F ano (Obr. 6B). To ukazuje specifitu rozlišování vomeroferinů ve VNO. V tomto ohledu je zajímavé poznamenat, že zatímco F je vynikající vomeroferin, E vyvolává silnější nosní efekt než F (Obr. 6B a Obr. 7) .

Vliv vomeroferinů na EOG: Celkový potenciál receptorů z nosního epithelu (OE) byl zanamenán u 20 osob: 10 mužů a 10 žen. Na rozdíl od citlivosti VNO na vomeroferiny je OE méně citlivý na tyto látky. To je pravdou jak u mužů, tak u žen (Obr. 7A). Průměrná amplituda receptorového potenciálu je

2,3 mV až 0,78 mV. V této studii bylo B jediný vomeroferin, který měl znatelný účinek na OE (p<0,02). Při dotazu na pachové vjemy následující po každém stimulu, 16 osob neudalo žádný vjem, zatímco tři muži a jedna žena označily B jako nepříjemný zápach. Toto zjištění odhalilo, že při koncentracích použitých pro naši studii, není většina vomeroferinů účinná jako stimulant pro nosní receptory, ale mají jasný vliv na vomeronosní receptory.

Vlivy vonných látek na EVG a EOG: Na rozdíl od vomeroferinů, vonné látky 1-carvón a cineol vyvolaly pouze malou lokální reakci ve VNO (Obr. 7B). To je pravdou jak u mužů, tak u žen. Jak bylo očekáváno, tyto vonné látky vyvolaly silnou reakci jak u mužů, tak u žen (p<0,01) při místním podání do OE (Obr. 7A) . Ředidlo depolarizovalo nosní receptory v menším rozsahu než cineol a 1-carvon (p<0,01) a nevyvolalo žádnou nosní reakci.

Reflexní vlivy vomeroferinů: Studie byly prováděny pro stanovení reflexních reakcí centrálního nervového systému (CNS) na stimulaci vomeroferinem ve VNO. Sexuálně dimorfní lokální reakce vyvolané vomeroferiny (Obr. 6A a B) se odrazily v automatické reakci mužů a žen. U mužů (Obr. 6C) snížily A a C odpor kůže (elektrodermální aktivita EDA) (p<0,01, n = 30). U žen (Obr. 6B) vyvolaly F a B větší snížení EDA než A nebo C (p<0,01, n = 30).

Vomeroferiny A a C vyvolaly znatelné zvýšení teploty kůže (ST) (Obr. 6G) u 30 mužů (p<0,01); ale D vyvolalo znatelné snížení teploty (p<0,01). U 30 žen (Obr. 6H) vyvolalo B a F znatelné zvýšení teploty kůže (ST) (p<0,01) ve srovnání s A a C. U žen vyvolaly vomeroferiny změny v EDA a ST s větší standardní odchylkou než u mužů.

Aktivita vyvolaná v kůře mozkové byla zaznamenávána z Cz a

Tz u mužů a žen během aplikace vzduchových pulsů (300 ms až sekunda) obsahujících 200 fmolu vomeroferinů (Obr. 6G a H) do VNO. U mužů byla (Obr. 6E) znatelně zvýšena alfa aktivita v kůře mozkové s prodlevou 270 až 380 ms pomocí A, C a D. D a A vyvolaly nejsilnější efekt (p<0,01). Synchronizace EEG byla zachována po dobu 1,5 až 2,7 minut po aplikaci jediného pulsu aktivní látky. U žen (Obr. 6F) byl pomocí aplikace jediného pulsu (200 fmolu) B nebo F do VNO zvýšena alfa aktivita v kůře mozkové v závislosti na reakci nosních receptorů. Zjistili jsme charakteristické zvláštnosti v reakci lidského VNO a nosního epithelu, což nabízí názor, že se jedná o nezávislé funkční systémy se zvláštním připojením k CNS (Brookover, C. (1914) The nervus terminalis in adult man. J. Comp. Neurol. 24: 131-135.) Také existují předběžné důkazy pro to, že EVG není spojen s trigeminálním nociceptoreovými zakončeními, protože aplikací lokálního anestetika (2% lidokain) do dýchacího epithelu v nose nedochází k blokování ani zeslábnutí EVG (Monti-Bloch, L. a Grosser, B. L. (1991) Effect of putative pheromones on the electrical activity of the human vomeronasal organ and olfactory epithelium J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 39: 573-582.) a osoby neohlásily pocity bolesti jako následku jakékoliv stimulační procedury.

Další EVG, GSR, ST a EEG testy byly provedeny se 13 estrany u mužů a žen uvedené v tabulce 1 a na obrázku 20. Steroid E12/N1 vykázal nej lepší EEG-alfa aktivitu u mužů. Steroid E8/N1 vykázal nej lepší EEG-alfa aktivitu u mužů. Steroid E7/N1 vykázal nej lepší EEG-alfa aktivitu u žen. Navíc je třeba upozornit, že E7/N1 vykazuje vynikající reakci orgánu jak je ukázáno EVG daty jak u mužů (Obr. 21A), tak u žen (Obr. 20A) , ale existovaly rozdíly u CNS (vysoká EEG-alfa u žen, vysoká EEG-beta u mužů, obrázky 31A a B).

VNO receptory jsou jasně citlivější na vomeroferiny než na jakékoliv jiné testované vonné látky; opak platí pro nosní receptory. Ačkoliv OE mohou mít receptorová místa pro některé vomeroferiny, specifita reakce VNO je jasně jiná.

Sexuální rozdíly byly zaznamenány u specifit a účinků dvou skupin vomeroferinů, A, C a D; a B a F. To naznačuje možný sexuální dimorfismus, který se týká receptoru. Toto zjištění nabízí aktivaci složek autonomního nervového systému u dospělých lidí vomeroferinovou stimulací VNO.

Navíc, výsledky nabízejí, že stimulace VNO vomeroferiny vyvolá synchornizaci EEG (Obr. 6G a H) . Důkazy zde uvedené ukazují, že vomeronosní systém odpovídá různým chemosensorickým stimulům a že některé jsou schopné vyvolat autonomní reflexní aktivitu.

Průmyslová využitelnost

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou průmyslově využitelné jako lidské semiochemikálie pro změnu funkce hypothalamu, a tím následné ovlivnění určitého chování a fyziologie, např. snížení úzkosti.

Claims (10)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Steroidní sloučenina obecného vzorce (I):

Řó

d) , kde R₃ je vybráno ze skupiny sestávající nezbytně z jednoho nebo dvou vodíků, methylu, methylenu a jednoho nebo dvou halogenů; R₂ chybí nebo je vybráno ze skupiny sestávající nezbytně z vodíku a methylu; R₃ je vybráno ze skupiny sestávající nezbytně z ketoskupiny, hydroxylu, nižšího alkoxylu, nižšího acyloxylu, benzoylu, cypionylu, glukuronidu a sulfonylu; R₄ je vybráno ze skupiny sestávající nezbytně z vodíku, hydroxylu, nižšího alkoxylu, nižšího acyloxylu, ketoskupiny a halogenu; R₅ chybí nebo je vybráno ze skupiny sestávající nezbytně z vodíku, hydroxylu, nižšího alkoxylu a nižšího acyloxylu; R₆ je vodík nebo halogen; a a je nepovinně aromatický nenasycený kruh A uvedeného steroidů, nebo b, c a d jsou nepovinně každé dvojitá vazba; a ”e, f, g, h, i a j jsou nepovinně každé dvojitá vazba; za předpokladu, že pokud je přítomno a, R₃ je hydroxyl a j, i, g” a h všechny chybí, pak (a) R₄ nesmí být vodík; nebo (b) pokud chybí e a f, R₄ nesmí být ketoskupina; nebo pokud je přítomno a, R₃ je hydroxyl a ”j, i a g všechny chybí, h je přítomno, pak R_x nesmí být methylen; pokud jsou přítomny a, h” a i”, (a) pak přinejmenším jedno z e nebo f je přítomno, (b) R₃ je methylen nebo (c) R₃ není vodík; pokud je přítomno b, R₃ je ketoskupina, g, h, i, ”j všechny chybí, R₅ je vodík, (a) pak R₃ nesmí být jeden nebo dva vodíky pokud není přítomno f nebo (b) pokud je přítomno f pak R_x nesmí být methyl; pokud je přítomno b a j a R₃ je ketoskupina, pak musí být přítomno přinejmenším jedno z e nebo f nebo musí být R_x methylen; pokud je přítomno c, d chybí a R₃ je hydroxyl, pak (a) musí být přítomno přinejmenším jedno z ”e nebo f nebo (b) musí být R₃ methylen; pokud je přítomno c a d a R₃ je methoxyl, pak (a) musí být přítomno přinejmenším jedno z e nebo f nebo (b) R₃ musí být methylen; pokud je přítomno b, R₃ je hydroxyl a R₅ je vodík, pak (a) musí být přítomno přinejmenším jedno z e nebo f nebo (b) R-, musí být methylen.

2. Sloučenina podle nároku 1, ve které je přítomno a a g, h nebo i jsou nepovinně dvojné vazby.

3. Sloučenina podle nároku 1, ve které b je dvojná vazba.

4. Sloučenina podle nároku 1, ve které c a d jsou dvojné vazby.

5. Sloučenina podle nároku 1, ve které R₂ je methyl a e jeo dvojná vazba.

6. Sloučenina podle nároku 2, kterou je steroid vybraný ze skupiny sestávající z estra-1,3,5(10),6,16-pentaen-3-ylacetátu; estra-1,3,5(10),7-tetraen-3-olu; 17-methylenestra1,3,5,7,9-pentaen-3-olu; 17-methylenestra-6-oxoestra1,3,5(10) -trien-3-ylacetátu; estra-1,3, 5,7,9,16-hexaen-3-olu; estra-1,3,5(10),6-tetraen-3-olu; 17-methylenestra-l,3,5(10),7tetraen-3-olu; estra-1,3,5,7,9,16-hexaen-3-ylacetátu; estra1,3,5(10) , 7,16-pentaen-3-olu; 17-methylenestra-l,3,5 (10)trien-3,ββ-diolu; estra-1, 3, 5(10),7,16-pentaen-3-yl-acetátu; estra-1,3, 5(10), 6,16-pentaen-3-olu; a 17-methylenestra1,3,5(10) , 7-tetraen-3-ylacetátu.

7. Sloučenina podle nároku 3, kterou je steroid vybraný ze skupiny sestávající z estra-4,16-dien-3B-olu; 17-methylgona4,13(17)-dien-3B-olu; a 17-methylenestr-4-en-3B-olu.

8. Sloučenina podle nároku 4, kterou je steroid vybraný ze skupiny sestávající z 3-methoxyestra-2,5(10),16-trienu a 3-methoxy-17-methylenestra-2,5(10)dienu.

9. Sloučenina podle nároku 5, kterou je steroid vybraný ze skupiny sestávající z 3-hydroxyestra-l,3,5(10),16-tetraen6-onu; 6-oxoestra-l,3,5(10),16-tetraen-3-ylacetátu; estra1,3,5(10) , 16-tetraen-3,6fi-diolu; 6fi-hydroxyestra-l,3,5(10),16tetraen-3-ylacetátu; estra-4,9,16-trien-3-onu; 10-hydroxyestra-4,16-dien-3-onu; estra-5(10),16-dien-3a-olu; a estra5(10),16-dien-36-olu.

10. Sloučenina podle nároku 9, kterou je 10-hydroxyestra-4,16-dien-3-on. 11. Sloučenina podle nároku 8, kterou je 3-methoxyestra-2, 5(10) ,16-trien. 12. Sloučenina podle nároku 9, kterou je

estra-1,3,5(10),16-tetraen-3,δβ-diol.