CZ91194A3

CZ91194A3 - Stable aqueous enzymatic detergent and process for preparing thereof

Info

Publication number: CZ91194A3
Application number: CS94911A
Authority: CZ
Inventors: Den Bergh Carlo Johannes Van; Marja Ouwendijk; Howard Bruce Kaiserman
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1992-10-05
Publication date: 1994-12-15
Also published as: BR9206636A; HUT66846A; JPH07500128A; AU2591992A; CA2119362A1; ZA928013B; US5501820A; SK43094A3; MY129977A; HU9401099D0; NZ244694A; TR26159A; EP0608258A1; WO1993008253A1

Description

Stálý vodný enzymatický prací prostředek a způsob jeho výroby

Oblast techniky

Vynález se týká vodného enzymatického pracího prostředku, který obsahuje mutantní proteázové enzymy, vyznačující se zvýšenou enzymovou stabilitu.

Dosavadní stav techniky

Použití proteáz pro přípravu velmi účinných kapalných detergentů ztěžuje jejich omezená stabilita v roztoku. Dvěma ději, které limitují životnost proteáz ve vodných kapalných detergentech, jsou denaturace a autolýza (trávení sama sebe). Možnosti stabilisace enzymů ve vodných kapalných pracích prostředcích, které jsou problematickým prostředím *

pro uchování enzymové aktivity během skladování a distribuce, byla věnována značná pozornost.

Denaturaci proteáz lze snížit výběrem nejvhodnějších složekr, přidávaných při zpracování, jako aktivátorů, přísad a podobně, a výběrem podmínek, například hodnoty pH, tak aby bylo dosaženo dostatečné stability enzymu. Autolýza proteáz může být omezena přidáním inhibitoru proteáz, který se z vazby na enzym uvolní při rozpouštění během praní, čímž se obnoví proteolytická aktivita enzymu.

V oboru je známo působení různých proteázových inhibitorů; například americký patent US-A-4 261 868 (Unilever) se zabývá použitím boraxu a jak americký, US-A-4 243 546 (Drackett), tak britský patent GB-A-1 354 761 (Henkel), popisují použití karbocyklických kyselin jako inhibitorů proteáz. Známy jsou rovněž různé kombinace proteázových inhibitorů. Z amerických patentů se například patent US-A-4 305 837 (Procter & Gamble) zabývá kombinaci karbocyklických kyselin a jednoduchých alkoholů, patent US-A-4 404 115 (Unilever) kombinací boraxu a vícečetných alkoholů a patent US-A-4 537 707 (Procter & Gamble) kombinací boraxu a karboxylátů jako inhibitorů proteáz.

Známé jsou rovněž mutantní subtilisinové proteázy, modifikované substitucí v místě aminokyseliny. Americký patent US-A-4 760 025 (Genencor) si například nárokuje subtilisinové mutanty se substituovanými aminokyselinami v poloze 32, 155, 104, 222, 166, 64, 33, 169, 189, 217 nebo 157, které se liší od subtilisinů, přirozeně vytvářených mikroorganismem B. amvloliquefaciens. Mutantní proteáza, u níž je methionin v posici 222 nahrazen alaninem, vykazuje zvýšenou oxidační stabilitu v přítomnosti bělícího činidla.

Patent WO-A-89/06279 (Novo/Nordisk) popisuje subtilisinové mutanty se změněnými chemickými vlastnostmi. Ukazuje *

se zvláště, že subtilisinový mutant, pozměněný v poloze 195 anebo 222, vykazuje zvýšenou oxidační stabilitu v přítomnosti kyseliny peroctové. V článku Novo/Nordisku, uveřejněném v Biopapers Journal z roku 1990 na stranách 11-14, [ve sv. 10, dílu 5 (listopad/prosinec)], je doloženo, že komerčně dostupná proteáza Durazym je pozměněná proteáza Savinasa, u níž byl glycin v poloze 195 zaměněn za kyselinu glutamovou a methionin v poloze 222 za alanin.

Nyní bylo překvapivé zjištěno, že mutantní subtilisinové enzymy, pozměněné v poloze 195 a 222, jsou zvláště cenné pro přípravu stálých kapalných pracích prostředků. Jsou jednak mimořádně stabilní v nepřítomnosti bělícího činidla a dále jsou dobře slučitelné s dalšími enzymy, obsaženými v prostředku, jako s lipaázou nebo amylázou.

Patent WO-A-87/04461 (Amgen) se zabývá substitucí alternativních aminokyselin (tj. šeřinu, valinu, threoninu, cysteinu, glutaminu a isoleucinu) v sekvencích ASN, GLY nebo ASN-GLY (zvláště v poloze 218) u Bacillus subtilisins. Tyto mutace mají ve srovnání s přírodním enzymem zvyšovat stabilitu enzymu při vysokých teplotách nebo v širším rozmezí hodnot pH. Patent WO-A-88/08033 (Amgen) nárokuje mutace, měnící schopnost vázat vápník (nahrazením aminokyseliny s negativně nabitým zbytkem, jako je ASP nebo GLU) a případnou deleci nebo náhradu každého zbytku o sekvenci ASN-GLY, což zlepšuje stabilitu vůči pH a tepelnou stabilitu a zvyšuje specifickou aktivitu. V patentu je nárokováno, že v polohách 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 208 a 214 může dojít k záměně za negativně nabité aminokyseliny a ASN v sekvencích ASN-GLY může být nahražen SER, VAL, THR, CYS, GLU nebo ILE.

Tyto odkazy nepopisují prací prostředky, obsahující subtilisinové mutanty, které jsou předmětem nyní předkládaného vynálezu, nebo výhody, plynoucí z využití takových mutantů v jimi uvedených pracích prostředcích.

Patent WO-A-89/06279 (Novo/Nordisk) pojednává o subtilisinových mutantech, používaných v kapalných pracích prostředcích podle předkládaného vynálezu. Ačkoli v tabulce č. VI popisuje využití takových mutantů v pracích prostředcích, obsahujících bělící činidla, neobsahuje zmínku o využití těchto mutantů v pracích prostředcích, které žádná bělící činidla neobsahují. Naopak, kvalifikovaná osoba by neměla ani uvažovat o použití mutantů, u nichž oxidační výhodu, nebot obecně je proteoly nižší než u původního enzymu, neexistuje žádná zmínka o použití stálost neslibuje žádnou tická aktivita mutantů Následkem toho dosud těchto mutantů ve specifických pracích prostředcích a žádný objev, že mutantní enzymy budou mít vyšší stálost v takových přesně stanovených prostředcích.

Dále je známo, že lipáza bývá méně stálá v přítomnosti proteázy než bez ní; nyní však bylo překvapivé zjištěno, že mutantní subtilisinové enzymy podle tohoto vynálezu vykazují značně vyšší slučitelnost s enzymem lipázou než přirozené typy subtilisinových enzymů.

Konečně bylo také zjištěno, že mutantní subtilisinové enzymy podle tohoto vynálezu jsou výrazné slučitelnější s enzymem amylázou než přirozené subtilisinové enzymy.

Podstata vynálezu

Vynález se týká stálých vodných enzymatických pracích prostředků, které obsahují:

(a) přibližně 5 až 65 váhových % povrchově aktivní látky (surfaktantu);

(b) mutantní subtilisinový enzym se sekvencí aminokyselin změněnou nejméně v polohách 195 a 222 substitucí jiné aminokyseliny; tento enzym bude přidáván v dostatečném *

množství, aby se jeho aktivita pohybovala v rozmezí od 0,01 do 200 000 GU/g;

a tento prostředek zásadně nebude obsahovat bělící činidla, anebo bude obsahovat (c) další enzymy, zvolené ze skupiny, zahrnující lipázy, amylázy a celulázy.

Detergentně aktivní složky

Prostředek podle vynálezu obsahuje přibližné 5 až 65 váhových % (a) aniontové povrchově aktivní látky nebo (b) aniontové povrchově aktivní látky a jednoho nebo více detergentů, aktivních v takovém případě, že poměr váhy látek aniontových vůči neaniontovým je větší než 1:1.

Účinnou detergentní složkou, která není aniontovou povrchově aktivní látkou, muže být alkalický kov nebo alkanolaminové mýdlo nebo mastná kyselina s 10 až 24 uhlíkovými atomy, včetně polymerovaných mastných kyselin, nebo neiontová či kationtová sloučenina, syntetická detergentní látka amfoterni nebo s obojetným iontem, nebo směs kterýchkoliv z těchto látek.

citrátů kovů alkalických ^C8^-C22

Příkladem aniontových syntetických detergentů jsou soli včetně sodných, draselných, amoných a substituovaných amoných solí jako jsou mono-, di- a triethanolaminové soli ^c9~^c20 alkylbenzensulfonátů, ^c8^-c22 primárních nebo sekundárních alkansulfonátů, ^c8“^c24 olefinsulfonátů, sulfonovaných polykarboxylových kyselin, připravených sulfonací pyrolyzovaných produktů zemin, například podle patentu GB-A-1 082 179, alkylsulfátu, ^cg^-c24 alkylpolyglykolether-sulfátů, -karboxylátů a -fosfátů /obsahujících více než 10 molů ethylenoxidu/; další příklady jsou uvedeny v knize Schwartze, Perryho a Berche Povrchově aktivní látky a detergenty, sv. I a II. Kterýkoli vhodný aniontový pro* středek může být použit a uvedené příklady nejsou v žádném případě jejich celkovým výčtem.

Příkladem neiontových syntetických detergentů, použitelných podle vynálezu, jsou kondenzační produkty ethylenoxidu, propylenoxidu nebo butylenoxidu s C_g-C_igkarbonalkylfenoly, C_g-C_ig primárními nebo sekundárními alifatickými alkoholy, či s C_g-C_ig amidy mastných kyselin; další příklady neiontových látek zahrnují oxidy terciárních aminů s jedním alkylovým řetězcem C_g-C_ig a dvěma alkylovými řetězci CjL-Cg. Výše zmíněná kniha uvádí také další příklady neiontových látek.

Použity mohou být rovněž směsi různých neiontových látek, včetně směsí neiontových látek o nižším a vyšším stupni alkoxylace. Přednost se dává ethoxylovaným Ci2^-C15 alkoholům s 3-9 EO skupinami a zvláště s 5-7 EO skupinami.

Příkladem kationtových detergentů jsou kvarterní amonné látky jako alkyldimethylamonium halogenidy. Příkladem amfoterních detergentů nebo detergentů s obojetným iontem, použitelných podle vynálezu, jsou N-alkylaminokyseliny, sulfobetainy a kondenzační produkty mastných kyselin s proteinovými hydrolyzáty; vzhledem k jejich poměrně vysoké ceně jsou však většinou používány v kombinaci s aniontovým nebo neiontovým detergentem. Použity mohou být i směsi různých typů aktivních detergentu, přednost se dává směsím aniontových a neiontových detergentně aktivních složek. Použity mohou být i mýdla (ve formě jejich sodných, draselných a substituovaných draselných solí mastných kyselin), přednostně ve spojení s aniontovým nebo neiontovým syntetickým detergentem.

Mezi přípravky podle předkládaného vynálezu patří vodné kapalné detergenty, které mají homogenní fyzikální povahu, tj. mohou být tvořeny micelárním roztokem povrchově aktivní látky v souvislé vodné fázi, což je také označováno jako isotropní kapalina.

Dále se může jednat o strukturované látky v podobě fyzikálně heterogenních fází, tvořící rozptýlené lamelární kapénky v souvislé vodné fázi, které mohou například obsahovat polymer v tekutém stavu s hydrofilním základním řetězcem a alespoň jedním vedlejším hydrofobním řetězcem podle popisu v evropském patentu EP-A-346 995 (Unilever), uvedeným jako reference. Tyto roztoky jsou heterogenní a mohou obsahovat suspendované pevné částice, například nosných složek, jejichž druhy jsou uvedeny dále.

Nosné složky

Přípravky podle vynálezu dále obsahují nosnou složku.

Vhodné nosné složky zahrnují běžné alkalické detergentní složky, anorganické nebo organické, které se používají v množství přibližně od 0_f5 % do 50 % váhy prostředku, s výhodou od 3 % do asi 35 % váhy. Pokud se používají nestrukturované přípravky, vhodným množstvím nosné složky je 3 — 10 %, u strukturovaných přípravků je to 5 % až 35 % váhy.

Strukturovaným kapalným přípravkem se rozumí přípravek, ve kterém alespoň některá z detergentně účinných složek tvoří strukturovanou fázi. Zejména tato strukturovaná fáze je schopna suspendovat látku v podobě pevných částic.

Pokud se jedná o strukturovanou tekutinu, přípravek musí obsahovat dostatek lamelární fáze tvořená suspendovat pevné látky.

elektrolytu, aby mohla vzniknout povrchově aktivní látkou, schopná K výběru přesného typu a množství elektrolytu k uplatnění této schopnosti u dané povrchově aktivní látky se používá metodiky v tomto oboru velmi dobře známé. Využívá zvláštních technik, popsaných v mnoha citacích. Jedna z nich spočívá v měření vodivosti. Prokázání přítomnosti lamelární fáze se rovněž provádí dobře známou technikou, využívající například optické i elektronové mikroskopie nebo difrakce X-paprsků, doprovázené měřením vodivosti.

Termín elektrolyt označuje v tomto vynálezu kteroukoli ve vodě rozpustnou sůl. Množství elektrolytu by mělo být dostatečné, aby povrchově aktivní látka mohla vytvořit lamelární fázi, schopnou suspendovat pevnou látku. Prostředek s výhodou obsahuje alespoň 1 váh.%, lépe alespoň 5 váh.% a nejlépe alespoň 17 váhových % elektrolytu. Elektrolyt může být i nosnou detergentní složkou, příkladem je anorganická nosná složka tripolyfosforečnan sodný, nebo může být nefunkčním elektrolytem, jako je síran nebo chlorid sodný. Přednost se dává tomu, aby anorganická nosná složka zahrnovala celý elektrolyt nebo jeho část.

Strukturované přípravky mohou suspendovat částice pevných látek, avšak zvlášť výhodné jsou systémy, obsahující pevné látky už v podobě suspenze. Pevné látky mohou být nerozpuštěným elektrolytem, shodným s elektrolytem v roztoku, anebo odlišným, který je v daném elektrolytu saturován. Případně, nebo navíc mohou být i látkami v podstatě nerozpustnými samotnou vodou. Příkladem takových téměř nerozpustných látek jsou hlinitokřemičitanová nosná činidla a částice vápenatých abrasiv.

- K příkladům vhodných anorganických nosných složek s alkalickou detergentností, kterých lze použít ve strukturovaných i nestrukturovaných přípravcích, patří vodou rozpustné fosforečnany alkalických kovů, polyfosforečnany, boráty, křemičitany a uhličitany.

Příkladem vhodných solí jako organických nosných složek s alkalickou detergentností jsou: (1) ve vodě rozpustné aminopolykarboxyláty, například ethylendiamintetraacetát sodný a draselný, nitrilotriacetáty a N-{2-hydroxyethyl)nitrilodiacetáty; (2) vodou rozpustné soli kyseliny fytové, např. fytát sodný a draselný {ad patent US-A 379 942); (3) ve vodě rozpustné polyfosfonáty, zahrnující sodné, draselné a lithné soli kyseliny ethan-l-hydroxy-1,1-difosfonové, methylendifosfonové, ethylendifosfonové a sodné, draselné a lithné soli ethan-1,1,2-trifosfonové kyseliny. Dalšími příklady jsou soli alkalických kovů kyselin ethan-2-karboxy-1,1-difosfonové, hydroxymethandifosfonové, karboxyldifosfonové, ethan-l-hydroxy-l,l,2-trifosfonové, ethan-2-hydroxy- 1,1,2 - trifosfonové, propan - 1,1,3,3 - tetrafosfonové, propan-1,1,2,3-tetrafosfonové a propan-1,2,2,3-tetrafosfonové; (4) ve vodě rozpustné soli polykarboxylátových polymerů a kopolymerů, popsaných v americkém patentu US-A-3 308 067.

S úspěchem mohou být použita rovněž polykarboxylátová nosná činidla, včetně vodou rozpustných solí kyseliny mellitové, citrónové, kyseliny karboxymethyloxyjantarové a solí polymerů kyseliny itakonové a maleinové.

Použít lze také některé zeolity a hlinitokřemičitany. Jedním z hlinitokřemičitanů, který je vhodný pro použití v přípravcích podle vynálezu, je amorfní, vodou nerozpustná hydratovaná sloučenina, charakterizovaná výměnou kapacitou přibližně 50 mg ekv. CaCO₃/g pro ionty Mg⁺⁺ a velikostí částic přibližně mezi 0,01 a 5 mikrony. Tato iontově výměnná nosná složka je podrobněji popsána v patentu GB-A-1 470 250.

Další ve vodě nerozpustná, syntetická hlinitokřemičítá iontově výměná látka, která může být použita, je v přírodní podobě krystalická a má vzorec Na_z[(A10₂)y.(SiO₂) ]. xH₂O, kde z a y leží v rozmezí mezi 1,0 a 0,5 a x je celým číslem mezi 15 a 264; tato hlinitokřemičitá iontově výměnná látka se vyznačuje velikostí částic o průměru přibližně 0,1 až 100 mikronů, iontově výměnou kapacitou v bezvodém stavu vzhledem k vápníku minimálně 200 mg ekv. pronikavosti CaC0₃/g a rychlostí výměny vápníku alespoň 2 zrna (grains) /galon/minutu/gram. Tento syntetický hlinitokřemičitan je podrobněji popsán v patentu GB-A-1 429 143.

Mutantní subtilisinový enzym

Mutantní subtilisinové enzymy, použité v kapalném pracím prostředku podle vynálezu jsou popsány v patentu WO-A-89/06279 (Novo/Nordisk). Od přírodního subtilisinového enzymu se liší rozdílnými aminokyselinami v poloze 195 a 222. Zatímco přírodní enzym obsahuje v poloze 195 glycinový zbytek a v poloze 222 zbytek methioninu, u mutantního enzymu se dává přednost konfiguraci, mající v poloze 195 zbytek kyseliny glutamové a v poloze 222 zbytek alaninu. Enzym může samozřejmě vykazovat také další výhodné mutace.

Množství proteolytického enzymu, obsaženého v přípravku, se pohybuje v rozmezí od 0,01 do 200 000 GU/g, s výhodou od 1 do 100 000 GU/g a nejlépe od 1 000 do 50 000 GU/g vzhledem k finálnímu přípravku.

GU značí glycinovou jednotku, což je množství proteolytického enzymu, poskytující za standardních podmínek inkubace takové množství koncových NH₂ skupin, které odpovídá koncentraci glycinu 1 μg/ml.

Mutantní proteázy mohou být podle tohoto vynálezu použity ve směsi s dalšími proteolytickými enzymy. Další subtilisinové proteázy mohou být rostliného, živočišného nebo mikrobiálního původu. S výhodou jsou to mikrobiální enzymy, produkované kvasinkami, houbami, plísněmi a bakteriemi. Přednost se dává zvláště subtilisinovým proteázám bakteriálního typu, například kmene B. subtilis a B. licheniformis. Mezi vhodné, komerčně dostupné proteázy patří Alcalasa, Savinasa a Esperasa, které nabízí firma Novo/Nordisk; Maxatasa a Maxacal od firmy Gist-Brocades; Kazusasa od firmy Showa Denko; Subtilisin BPN' proteázy a další.

Proteolytické enzymy se obvykle přidávají ve formě koncentrovaných vodných roztoků. Dalšího zvýšení stability enzymu lze dosáhnout tím, že je při úpravě přidáván v podobě kašovité směsi enzymu v kapalném neiontovém detergentu, tak, jak je to popsáno v evropské patentové přihlášce číslo 91200677.2 a v patentové přihlášce USA pořadového čísla 681 025, uvedených zde jako citace.

Enzymová kašovitá směs obsahuje enzym v dispersní formě, například jako prášek nebo částice, suspendované v nevodné (neiontové) kapalné, povrchově aktivní látce, a zvláště v bezvodé. Enzymové částice mohou být sušeny rozprašováním nebo lyofilizovaný a například také drceny po rozprašování a před disperzí v neiontovém (bezvodém) kapalném detergentu. Případné mohou být drceny až po disperzi enzymu v neiontovém detergentu.

používaná k bezvodá, s

Množství enzymu v kašovité směsi se může pohybovat přibližně od 0,5 do 50 váhových %, například od 1 do 20 váhových %. Obvykle je enzymová kašovitá směs, výrobě přípravků podle tohoto vynálezu, téměř obsahem vody menším než 10 %, s výhodou menším než 5 % a někdy menším než 1 % (váhová %). Při použití kašovité technologie je možné využít téměř bezvodou, kapalnou, neiontovou, povrchově aktivní látku jako spojitou fázi kašovité směsi. Kapalné skupenství kašovité směsi umožňuje dokonalé promíchání enzymu ve výsledném kapalném detergentu a umožňuje rovněž snazší uvolnění enzymu po zředění tohoto kapalného detergentu ve vodě na praní.

Další enzymy

Přípravky podle vynálezu mohou kromě proteáz uvedených ve vynálezu obsahovat také další enzymy jako lipázy, amylázy a celulázy. V takovém případě se jejich množství pohybuje od 0,001 do 5 % přípravku.

Pokud přípravek obsahuje lipolytický enzym nebo lipázu, množství lipázy se pohybuje v širokém rozmezí, od 10 do 30 000 LU/g pracího prostředku, často například alespoň 100 LU/g, s výhodou pak v rozmezí od 200 do 5 000 LU/g. Lipázové jednotky jsou zde definovány jako v patentu EP-A-258 068 (Novo/Nordisk).

Použitá lipáza může být zvolena z širokého okruhu lipáz: zvláště z lipáz popsaných v patentech EP-A-214 761 (Novo/Nordisk), EP-A-258 068 (Novo/Nordisk) a EP-A-305 216 (Novo/Nordisk), s výhodou z lipáz, vykazujících imunologickou křížovou reaktivitu vůči protilátkám proti lipáze

-19z Thermomyces lanuginosus ATCC 22070; z lipáz, které jsou popsány v patentech EP-A-205 208 a EP-A-206 930 (Unilever); z lipáz, vykazujících imunologickou křížovou reaktivitu vůči protilátkám proti lípáze z Chromobacter viscosum var. lipolyticum NRRL B-3673 nebo proti lipáze z Alcaligenes PL-679, ATCC 31371 a FERM-P 3783; a také z lipáz, uvedených v patentech WO-A-87/00859 (Gist - Brocades) a EP-A-204 284 (Sapporo Breweries). Zvlášt vhodné jsou například lipázy, odpovídající komerčně dostupným lipázovým přípravkům, jako jsou: Novo/Nordisk Lipolasa, Amano lipolázy CE, Ρ, Β, AP, M-AP, AML a CES a Meito lipolázy MY-30, OF a PL a esteráza MM, Lipozym, SP 225, SP 285, lipáza Saiken, lipáza Enzeco, Toyo Jozo lipáza a Diosynth lipáza (obchodní značky).

Amylázy mohou být použity v množství, pohybujícím se v rozmezí přibližně od 1 do 100 MU (maltózových jednotek) na gram pracího prostředku [nebo 0,014-1,4 KNU/g (jednotky Novo)]. Přednost se dává amyláze, která je prodávána pod obchodní značkou Termamyl firmou Novo/Nordisk.

Celulázy mohou být použity v množství, pohybujícím se v rozmezí přibližně 0,3 až 35 CÉVU jednotek na gram pracího prostředku. Přednost se dává celuláze, která se prodává pod obchodní značkou Celluzyme firmou Novo/Nordisk.

K zisku kteréhokoliv z výše uvedených enzymů může být využito metod genetického inženýrství, t.j. extrakce vhodného genu a introdukce a exprese tohoto genu nebo jeho derivátu ve vhodném produkčním organismu.

Modifikované subtilisinové proteázy, které mohou být použity, jsou popsány v patentech EP-A-130 756 (Genentech),

EP-A-214 435 (Henkel), WO-A-87/04461 (Amgen), WO-A-87/05050 (Genex), EP-A-405 901 (Unilever) a EP-A-303 761 (Genetech).

Používané modifikované lipázové enzymy jsou popsány například v patentech WO-A-89/09263 (Gist - Brocades), ' EP-A-218 272 (Gist-Brocades), EP-A-258 068 (Novo/Nordisk),

EP-A-407 225 (Unilever) a EP-A-305 216 (Novo/Nordisk).

Stabilizační činidla

Je mimo rozsah tohoto vynálezu uvést soustavy, stabilizující enzymy. K tomuto účelu lze použít opatření, vysvětlená v přiznaných patentech podle výše uvedených čísel ve spojitosti se stabilizací enzymu (zde uvedených jako citace).

V nich mohou být obsaženy údaje, týkající se množství soustavy, která stabilizuje enzym, zvolené například z (a) stabilizační soustavy, která obsahuje vápník a mravenčan nebo octan, nebo (b) ze soustavy stabilizující enzym, která obsahuje vícečetný alkohol a boritan.

Například v přípravku podle patentu EP-A-080 223 (Unilever), uvedeného jako citace, může být použit vícečetný alkohol v množství 2-25 váhových %, jako třeba glycerol, > propylenglykol nebo jiný vícečetný alkohol, spolu s boritanem sodným nebo boraxem v množství 2-15 váhových %.

Jako doplněk nebo záměně mohou být použity, jako v přípravcích podle patentu EP-A-028 865 (Procter & Gamble), uvedeného jako citace, nízkomolekulární monokarboxyláty (v kyselé formě nebo jako soli), např. mravenčan nebo octan ·* (0,1-10 %), enzymu přístupné vápenaté ionty (0,1-1,0 mmol/kg) a nižší alkoholy jako ethanol nebo propylenglykol (do 20 %).

Zcela přijatelné může být i použití menších množství stabilizačních činidel než jaká se uvádějí ve výše jmenovaných patentech.

Volitelné složky

Přípravky, kterým se zde dává přednost, často obsahují kromě nezbytných výše popsaných přísad i řadu přísad volitelných, používaných pro jejich funkčnost v obecné rovině. Při uvádění vynalezených přípravků do formy pracích prostředků obsahujících enzymy je často potřebné použít fázový regulant. Tato složka vytváří spolu s vodou rozpustný matrix (základní hmotu) nárokovaného kapalného prostředku. Látky vhodné k fázové regulaci jsou dobře známé v technologii kapalných detergentů a patří k nim například hydrotropní látky jako soli alkylarylsulfonátů s více než třemi uhlíkovými atomy v alkylové skupině a sodné, draselné, amonné a ethanolaminové soli xylen-, toluen-, ethylbenzen-, kumen- a isopropylbenzensulfonových kyselin. Jako fázových regulantů lze použít i alkoholů, většinou v množství přibližně od 0,5 do 20 %; množství fázového regulantu v součtu s vodou se běžně pohybuje v rozmezí od 35 % do 65 %.

*

Přípravky, kterým se dává přednost, mohou obsahovat řadu dalších volitelných přísad, většinou v doplňkovém množství, nepřekračujícím přibližně 5 %. Příkladem takových doplňujících složek jsou polykyseliny, regulanty pěnivosti, kalidlci, antioxidační látky, baktericidní činidla, barviva, parfemační přísady, zjasňovače a podobně.

Úspěšné používání nárokovaných přípravků za různých podmínek použití může vyžadovat přítomnost látek, regulujících pěnivost. I když mohou být použity všechny látky regulující pěnivost detergentů, zde se dává přednost alkylovaným polysiloxanúm jako je dimethylpolysiloxan, které se běžně označují jako silikony. Ty jsou užívány v množství nepřevyšujícím 0,5 %, nejlépe v rozmezí 0,01 a 0,2 %.

Žádoucím může být také použití kalidel, která přispívají k vytvoření jednotného vzhledu koncentrovaných kapalných pracích prášků. Mezi vhodná zakalující činidla patří polystyren, obchodním názvem LYTRON 621, vyráběný firmou Monsanto Chemical Corporation. Tyto látky jsou většinou užívány v množství 0,3 % až 1,5 %.

Uváděné přípravky mohou rovněž obsahovat antioxidační látky o známém účinku, často látky odstraňující radikály, a to v obvykle používaném množství, tj. 0,001 % až 0,25 % celkového přípravku. Tyto antioxidanty bývají používány ve spojení s mastnou kyselinou.

Jinou volitelnou přísadou, která může být použita zvláště ve strukturovaných kapalinách, je polymer v tekutém stavu. Takový polymer obecně obsahuje hydrofobní základní řetězec (páteř) a jeden nebo více hydrofobních vedlejších řetězců, jak je popsáno v patentu EP-A-346 995 (Unilever) nebo v patentové přihlášce přijaté v USA s pořadovým číslem 664 513, uvedených zde jako citace. Tekutý polymer umožňuje, v případě potřeby, přidání většího množství povrchově aktivních látek nebo elektrolytu, než jaké by jinak bylo slučitelné se zachováním stability přípravku s nízkou viskozitou. Stejně tak v případě potřeby umožňuje přidání větších množství dalších přísad, které jinak silně ovlivňují stabilitu lamelárně dispersních přípravků.

V případě použití se tekutý polymer přidává v množství, které tvoří přibližně 0,1 až 5 % přípravku, lépe o,i až 2 % a nejlépe 0,5 až 1,5 % přípravku.

Hodnota pH výrobku

Hodnota pH tekutého pracího prostředku podle vynálezu může být zvolena v širokém rozmezí, přibližně od pH 7 do pH

12, tj. ve slabém alkalickém prostředí od pH 7,5 do 9,5 nebo v silněji alkalickém prostředí od pH 8,5 do 11,5; s výhodou od pH 8,5 do 11 a nejlépe od pH 9 do 10,5.

Příklady provedeni vynálezu

Následující příklady mají dokreslit vynález a usnadnit jeho pochopení, v žádném případě však nemají vynález omezovat.

V příkladech jsou použity následující zkratky:

LAS lineární C₁₂-alkylbenzensulfonová kyselina

LES laurylether(3E0)síran neion. činidlo ethoxylovaný C₁₂-C₁₅ alkohol

Příklady 1-7

Byly připraveny následující kapalné prací prostředky:

(ve váhových %)

	1	2	3	4	5	6	7
LAS	6,7	23,0	21,0	26,2	16,5	16,5	26,2
mýdlo	-	-	-	-	4,5	4,5	-
neion. činidlo	4,8	10,0	9,0	12,0	9,0	9,0	12,0
kys. citrónová, bezvodá	-	-	-	-	8,2	9,0	7,5
citrát Na . 2H₂O	3,5	16,5	10,4	10,0	-	-	-
zeolit·	20,0	-	-	-	18,8	18,8	-
perboritan Na . 4 H₂0	-	-	20,0	-	-	-	-
zkapalněný polymer	-	1	1	1	1	1	1
chlorid Ca . 2H₂O	-	-	-	-	-	-	0,2
triethanolamin	-	-	-	2	-	-	2
monoethanolamin	-	-	-	2	-	-	2
giycerol	-	-	-	-	2	-	5
borax . 10 H₂O	-	-	1,8	-	1,5	-	3,5
proteáza	0,7	1,5	1,0	1,5	1,5	1,5	1,5
lipáza	-	-	0,5	-	0,5	0,5	0,5
menší složky a voda			— do	100	4.

pH	8,5	8,5	9,5	9,3	8,5	8,5	9,5

Kapalné přípravky byly připraveny podle postupu, polymer

Použitou popsaného odpovídá proteázou patentem EP-A-346 995, a zkapalněný polymeru All podle téhož patentu, je 16,0 LDX Durazym (výrobek Novo/Nordisk), mutantní subtilisinová proteáza, obsahující zbytek kyseliny glutamové v poloze 195 a zbytek alaninu v poloze 222. Proteáza byla do kapalného přípravku přimíšena podle předchozího popisu. Jako lipáza byla použita Lipolasa 100L (výrobek Novo/Nordisk), která se získává klonováním lipázového genu z Humicola lanuqinosa a expresí tohoto genu v Asperqillus oryzae host.

Stabilita proteázy při skladování přípravku byla stanovena měřením enzymové aktivity v závislosti na době skladování při 37’C. Poločasy byly určeny na základě vynesení Ao/At proti času a za využití nelineární regresní analýzy. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce A (ve dnech při 37°C). Stabilita Lipolasy 100L v přípravcích 3 a 5-7 byla stanovena měřením její enzymové aktivity v závislosti na době skladování při 37’C. Výsledky uvedené v Tabulce B jsou vyjádřeny poločasem poklesu aktivity (ve dnech při 37’C).

Srovnávací příklady A-G

Pro srovnání byla skladovací stabilita měřena také u vzorků o složení shodném s příklady 1-7, které však jako proteázu obsahovaly přirozený subtilisinový enzym. Savinasa 16,0 LDX (výrobek Novo/Nordisk), přimíšená do kapalných přípravků, se proteolytickou aktivitou nelišila od výše použitého Durazymu. Poločasy poklesu aktivity byly stanoveny ve dnech při 37’C a výsledky uvádí tabulka A. Současně byla stanovena stabilita Lipolasy 100L (výrobku Novo/Nordisk) v přípravcích 3 a 5-7, která je jako poločas poklesu aktivity (ve dnech při 37’C) uvedena v Tabulce B.

Tabulka A

Poločas proteázové aktivity při 37’C (ve dnech):

složení podle příkladu	1 2	3	4	5	6	7
proteolytický enzym:
Durazym	6 30	7	20	»28¹)	60	»28
Savinasa	4 3	2	1	»28² >	8	2,5
zbytková aktivita po	28 dnech	skladování	byla 95	%
²) zbytková aktivita po	28 dnech	skladování	byla 76	%

Tyto výsledky ukazují, že poločas proteázové aktivity u pracího prostředku, který obsahuje mutantní proteázu, je vždy vyšší než v případě použití přirozené subtilisinové proteázy. U přípravku podle příkladu 3, který obsahuje bělící činidlo, nastává zlepšení s faktorem 3. V nepřítomnosti bělícího činidla (příklady 1-2 a 4-7) nastává v některých případech zlepšení s faktorem 10.

*

Tabulka B

Poločas lipázové aktivity při 37*C (ve dnech):

složení podle příkladu 3 proteolytický enzym:	5	6	7
Durazym	4,5	»28	28	3
Savinasa	1,0	17	2,5	0,5
Tyto výsledky	ukazují,	že poločas lipázové aktivity
pracího prostředku,	který obsahuje	mutantní	proteázu, je

vždy vyšší než v případě použití přirozené subtilisinové proteázy.

Příklady 8-10

Byly připraveny následující kapalné prací prostředky: (ve váhových %)

	8	9	10
LAS	10,0	27,3	10,0
LES	6,0	-	6,0
neion. činidlo . 9EO	8,0	12,0	8,0
ethanol	5,0	-	-
kys. citrónová, bezvodá	3,2	7,1	-
citrát Na . 2H₂O	-	-	7,0
zkapalněný polymer¹(33 %}	-	3,1	-
chlorid vápenatý	-	-	0,01
triethanolamin	-	-	2,0
monoethanolamin	-	0,05	2,0
sorbitol (70 %)	4,5	5,0	-
glycerol	2,7	5,0	-
NaOH (50 %)	-	16,6	-
xylensulfoná-t sodný	-	-	3,0
borax . 10 H₂O	4,0	8,0	-
proteáza	1,5	0,6	0,75
lipáza	0,5	1,1	-

Iuellů.L biUóAy cl VUQa — — —		UU 1UU *5
pH	7,2	8,7	10,1

kopolymer akrylátu sodného a laurylmetakrylátu, molekulová hmotnost 4 000 - 11 000 (Narlex DC-1 firmy National Starch).

Jako proteáza byl opět použit Durazym 16,0 LDX a jako lipáza Lipolasa 100L (výrobky Novo/Nordisk). Stabilita proteázy při skladování přípravku byla stanovena měřením enzymové aktivity v závislosti na době skladování při 37’C, jak bylo popsáno výše. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce C (ve dnech při 37°C). Skladovací stabilita Lipolasy 100L byla stanovena v přípravcích č. 7a 8 měřením lipázové aktivity v závislosti na době skladování při 37’C. Výsledky, vyjádřené poločasem poklesu aktivity ve dnech při 37’C, jsou uvedeny v Tabulce D.

Srovnávací příklady H-J

Pro srovnání byla skladovací stabilita měřena také u vzorků o složení shodném s příkladem 10, které vsak jako proteázu obsahovaly přirozený subtilisinový enzym. Savinasa 16,0 LDX (výrobek Novo/Nordisk), přimíšená do kapalných přípravků, se proteolytickou aktivitou nelišila od výše použitého Durazymu. Poločasy poklesu aktivity byly stanoveny ve dnech při 37’C a výsledky uvádí tabulka C. Současně byla stanovena stabilita Lipolasy 100L (výrobku Novo/Nordisk) ve srovnávacích přípravcích 8 a 9, která je jako poločas poklesu aktivity (ve dnech při 37’C) uvedena v Tabulce D.

Tabulka C fe

Poločas proteázové aktivity při 37’C (ve dnech):

složení podle příkladu 8 9 10 proteolytický enzym:

Durazym - - 8

Savinasa - - 5

Tyto výsledky ukazují, že poločas proteázové aktivity u pracích prostředků, které obsahují mutantní proteázu, je vyšší než v případě použití přirozené subtilisinové proteázy.

Tabulka D

Poločas lipázové aktivity při 37’C (ve dnech):

* složeni podle příkladu 8 9 proteolytický enzym:

Durazym 40 >90

Savinasa 29 49

Tyto výsledky ukazují, že poločas lipázové aktivity u pracích prostředků, které obsahují mutantní proteázu, je vždy vyšší než v případe použití přirozené subtilisinové proteázy.

. Příklad 11

Byl připraven následující kapalný prací prostředek: (ve váhových %) neion. povrchově aktivní činidlo¹2,0 citrát Na . 2H₂O 15,0 glycerol 4,0 borax 2,7 *

Carbopol 940 1,2

Clay (Laponite XLS) 0,002

NaOH (50 %) 2,0 uhličitan sodný 5,0 hydrogenuhličitan sodný 5,0 proteáza poskytující 14 GU/mg amyláza poskytující 38 MU/mg voda do 100 % pH 9,9 )

' PO-EO blokový kopolymer s C₆-C₁₀ alkylovou skupinou, který má molekulovou váhu přibližně 1 800, dostupný jako SLF-18

Jako proteáza byl použit Durazym 16,0 LDX a jako amyláza Termamyl (výrobky Novo/Nordisk). Stabilita amylázy při skladování přípravku byla stanovena měřením zbytkové amylázové aktivity po 21 dnech skladování při 3 7^aC. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce E.

Srovnávací příklad K

Pro srovnání byla skladovací stabilita měřena také u vzorku o složení shodném s příkladem 11, který však jako proteázu obsahoval přirozený subtilisinový enzym. Savinasa 16,0 LDX (výrobek Novo/Nordisk), přimíšená do kapalného přípravku, se proteolytickou aktivitou nelišila od dříve použitého Durazymu. Stabilita amylázy při skladování přípravku byla opět stanovena měřením zbytkové amylázové aktivity po 21 dnech skladování při 37“C. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce E.

Tabulka E

Procenta amylázové aktivity po 21 dnech při 37°C

Proteolytický enzym:

Durazym 73 ^j Savinasa 51

Tyto výsledky ukazuji, že poločas amylázové aktivity v pracím prostředku, který obsahuje mutantní proteázu, je vždy vyšší než za použití přirozené subtilisinové proteázy.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Stálý vodný enzymatický prací prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje:

(a) přibližně 5 až 65 váhových % povrchově aktivní látky (surfaktantu);

(b) mutantní subtilisinový enzym se sekvencí aminokyselin změněnou nejméně v polohách 195 a 222 substitucí jiné aminokyseliny; tento enzym bude přidáván v dostatečném množství, aby se jeho aktivita pohybovala v rozmezí od 0,01 do 200 000 GU/g;

a tento prostředek zásadně nebude obsahovat bělící činidla, anebo bude obsahovat (c) další enzymy, zvolené ze skupiny, zahrnující lipázy, amylázy a celulázy.
2. Stálý vodný enzymatický prací prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že v mutantním subtilisinovém enzymu byl methioninový zbytek v poloze 222 nahražen'alaninem.
3. Stálý vodný enzymatický prací prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že glycinový zbytek v poloze 195 byl nahražen kyselinou glutamovou.
4. Stálý vodný enzymatický prací prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že povrchově aktivní látkou je aniontová povrchově aktivní látka,
5. Stálý vodný enzymatický prací prostředek podle nároku 1,vyznačující se tím, že povrchově aktivní látkou je směs aniontové povrchově aktivní látky a jedné nebo více jiných detergentně účinných látek, o váhovém poměru aniontových k neaniontovým látkám vyšším než 1:1.
6. Stálý vodný enzymatický prací prostředek podle nároků 1-3, který se vyznačuje tím, že pokud se jedná o strukturovaný přípravek, obsahuje 5 až 35 » váhových % nosné složky.
7. Stálý vodný enzymatický prací prostředek podle nároků 1-3, který se vyznačuje tím, že pokud se jedná o nestrukturovaný přípravek, obsahuje 3 až 10 váhových % nosné složky.
8. Stálý vodný enzymatický prací prostředek podle nároků 1-7, který se vyznačuje tím, že dále obsahuje přibližně 0,1 až 5 % polymeru v tekutém stavu.
9. Stálý vodný enzymatický prací prostředek podle nároků 1-8, který se vyznačuje tím, že obsahuje lipázu v množství od 10 do 30 000 LU/g.
10. Stálý vodný enzymatický prací prostředek podle nároků 1-8, který se vyznačuje tím, že obsahuje amýlázu v množství od 1 do 100 MU/g.
11. Způsob výroby kapalného vodného enzymatického pracího prostředku podle nároku 1-10, vyznačujícího se tím, že proteolytický enzym se přidává ve formě kašovité směsi enzymu v kapalné neiontové povrchově aktivní látce.