HUT66846A

HUT66846A - Aqueous enzymatic detergent compositions

Info

Publication number: HUT66846A
Application number: HU9401099A
Authority: HU
Inventors: Den Bergh Carlo Johannes Van; Howard Bruce Kaiserman; Marja Ouwendijk
Original assignee: Unilever Nv
Priority date: 1991-10-16
Filing date: 1992-10-05
Publication date: 1995-01-30
Also published as: BR9206636A; JPH07500128A; AU2591992A; CA2119362A1; ZA928013B; US5501820A; SK43094A3; MY129977A; HU9401099D0; NZ244694A; TR26159A; EP0608258A1; CZ91194A3; WO1993008253A1

Description

KIVONAT

A találmány tárgya stabil, vizes enzimatikus detergens készítmény, amely a következőket tartalmazza:

a) 5-65 tömeg% felületaktív anyag,

b) egy mutáns szubtilizin enzim, amelyben az aminosav szekvencia legalább a 195 és 222 helyzetben meg van változtatva egy másik aminosav beépítésével, és ezen enzim mennyisége olyan, hogy az aktivitás érték 0,01-200000 GU/g legyen, a készítmény lényegében fehérítőszer mentes és/vagy c) komponensként egy további enzimet tartalmaz, amely lehet lipáz, amiláz vagy celluláz-típusú.

66846

KÖZZÉTÉTELI

Képviselő; PÉLDÁNY

DANUBIA SZABADALMI IRODA KFT

Budapest ·· ·· · · ·· * • ·· ·· ·· ·· • ···· · _φ J • · · · ·· ·· ····

Vizes, enzimatikus detergens készítmények

Unilever N.V., Rotterdam, Holandia

Feltalálók:

VAN DEN BERGH Carlo Johannes, Rotterdam,

KAISERMAN Howard Bruce, Guttenberg,

OUWENDIJK Marja, Hellevoetsluis,

Hollandia /

Nemzetközt bejelentés napja: 1992. 10. 05.

Elsőbbsége: 1991. 10. 16. (91202692.9) EP

Nemzetközi bejelentés száma: PCT/EP92/02296

Nemzetközi közzétételi szám: WO 93/08253

79151-2227 OE/Hoj • · ·

A találmány vizes, enzimatikus detergens készítményekre, közelebbről mutáns proteáz enzimeket tartalmazó vizes detergens készítményekre vonatkozik, amelyek megnövelt enzimstabilitással rendelkeznek.

A proteázok alkalmazása a nagy igénybevételnek kitett folyékony detergens készítményekben nehézkes, az enzimek oldatban mutatott korlátozott stabilitása miatt. A proteázok stabilitását két folyamat korlátozza a vizes folyékony készítményekben, ezek a denaturálódás és az autolízis (ön-emésztőés). A vizes, folyékony detergens készítményekben az enzimek stabilizálására számos kísérletet végeztek, mivel a folyékony közegben igen problematikus az enzimek aktivitását megtartani a tárolás és forgalmazás során.

A proteázok denaturálódását minimalizálni lehet a készítmény komponenseinek, így az adalékanyagoknak és vázanyagoknak, stb., valamint a pH érték optimális megválasztásával és így elfogadható enzimstabilitás érthető el. A proteázok ön-emésztődését proteáz inhibitorok adagolásával lehet minimalizálni. Az inhibitor az enzimből szabadul fel hígítás hatására a mosásnál és így a proteolítikus aktivitás megmarad.

A szakterületen különböző proteáz inhibitorok ismertek, így például az US-A 4 261 868 (Unilever) számú szabadalmi leírásban proteáz inihibítorként boraxot ismertetnek, míg az US-A 4 243 546 (Drackett) és a GB-A 1 354 761 (Henkel) számú szabadalmi leírásokban proteáz inhibitorként karbonsavakat ismertének. A szakterületen ezen proteáz inhibitorok különböző kombinációi szintén ismertek. Az US-A 4 305 837 (Procter &

• · · • · · · • · · · · ···· ·· · ·

-3Gamble) számú szabadalmi leírásban például a karbonsavakból és egyszerű alkoholokból álló kombinációt, az US-A 4 404 115 (Unilever) számú szabadalmi leírásban borax és poliolok kombinációit ismertetik proteáz inhibitorként. Az US-A 4 4 537 707 (Procter & Gamble) számú szabadalmi leírásban boraxból és karboxilátokból álló kombinációt ismertetnek proteáz inhibitorként.

Ismert továbbá a mutáns szubtilizin proteázok alkalmazása is, amelyben az aminosav helyeken vannak módosítások. így például az US-A 4 760 025 (Genencor) számú szabadalmi leírásban például olyan szubtilizin mutánsokat ismertetnek, amelyekben a 32, 155, 104, 222, 166, 64, 33, 169, 189, 217 vagy 157 aminosav helyeken történtek aminosav szubsztitúciók, és ezen mutánsok különböznek a természetben a B. amyloliquefaciens által termelt szubtilizinektől. A mutáns proteázról, amelyben a 222 helyzetben a metionin alaninnel van helyettesítve, kimutatták, hogy fokozott oxidációs stabilitással rendelkezik fehérítóanyag jelenlétében.

A WO-A 89/06279 (Novo/Nordisk) számú szabadalmi leírásban szubtilizin mutánsokat ismertetnek, amely módosított kémiai jellemzőkkel rendelkeznek. Különösen kimutatták, hogy a 195 és/vagy 222 helyzetben módosított szubtilizin megnövekedett oxidációs stabilitással rendelkezik perecetsav jelenlétében. Egy publikációból ismert az is, hogy a kereskedelmi forgalomban beszerezhető Durazym proteáz egy szerkesztett Savinase proteáz, amelyet úgy nyertek, hogy a 195 helyzetben lévő glicint glutaminsavra, és a 222 helyzetben lévő metionint alaninra cserélték a proteázban (Novo/Nordisk, Biopapers Journal, 10, 5, • · « · · • · · ·· • · · ·

-4november/deceinebr 1990, 11-14) .

Meglepetésszerűen azt tapasztaltuk, hogy a 195 és 222 helyzetben módosított mutáns szubtilizin enzimek kiemelekedően értékesek stabil, folyékony detergens készítmények kialakításánál. Először is, igen jó a stabilitásuk fehérítőszer jelenléte nélkül, másodszor, kifejezetten kompatibilisek bármely más, a készítményben jelenlévő enzimmel, így például a lipáz vagy amiláz enzimekkel.

A WO-A 87/04461 (Amgen) számú szabadalmi bejelentésben Bacillus subtilisinek helyettesítését ismertetik, amelyben az ASN, GLY vagy ASN-GLY szekvenciák (különösen a 218 helyzetben) különböző aminosavakkal (például szerin, valin, treonin, cisztein, glutam és izoleucin) vannak helyettesítve. Ezekről a mutánsokról azt állítják, hogy ezek enzimstabilitása magas hőmérsékleten széles pH tartományban nagyobb, mint a természetes típusú enzimé. A WO-A 88/08033 (Amgen) számú szabadalmi bejelentésben olyan mutánsokat ismertetnek, amelyek módosítják a kalcium-megkötő képességet (az aminosavat egy negatív töltésű csoporttal, így például ASP-vel vagy GLU-val helyettesítve) és amely mutánsokban adott esetben az ASN-GLY szekvencia valamely csoportja törölve van vagy helyettesítve van és ez egy jobb pH- és hőstabilitást, valamint nagyobb specifikus aktivitást eredményez. A leírás szerint a 41, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 208 és 214 helyek lehetnek helyettesítve negatív töltésű aminosavval és az ASN helyettesítve lehet valamely következő aminosavval: SER, VAL, THR, CYS, GLU vagy ILE.

A fenti hivatkozások egyikében sem ismertetnek azonban • · • · ·

-5olyan detergens kompozíciókat, amelyek szubtilizin mutánsokat tartalmaznak, valamint nem utalnak az ilyen mutánsok alkalmazásának előnyeire a detergens készítményeknél.

A WO-A 89/06279 (Novo/Nordisk) számú szabadalmi bejelentésben ismertetik a jelen találmány szerinti folyékony detergens készítményekben felhasználásra kerülő szubtilizin mutánsokat. Bár ezen mutánsok alkalamzására fehérítőt tartalmazó mosószerkészítmények esetében utalnak (VI táblázat), a leírás nem tartalmaz semmi kitanítást ezen mutánsok alkalmazására detergens készítményekben, amelyek semmiféle fehérítőszert nem tartalmaznak. Sőt, a szakember nem is szándékozna ilyen mutánsokat alkalmazni olyan helyeken, ahol az oxidációs stabilitás nemigen jelent előnyt mivel a mutáns proteolítikus aktivitása általában alacsonyabb mint a natív enzimé. Ennek következtében nincs kitanítás ezen mutánsok alkalmazására specifikus detergens készítményekben, továbbá nincs kitanítás vagy utalás arra, hogy ezen mutáns enzimek megnövekedett stabilitással rendelkeznének ezen specifikusan meghatározott készítményekben.

Továbbá, ismert az is, hogy a lipáz enzimek hajlamosak kisebb stabilitást mutatni proteázok jelenlétében mint proteázok nélkül. Megelepetésszerűen mi azt tapasztaltuk, hogy a mutáns szubtilizin enzimek a találmány szerinti készítményekben jelentős mértékben jobban kompatibilisek a lipáz enzimmel, mint a természetes-típusú szubtilizin enzim.

Végül, azt tapasztaltuk, hogy a találmány szerinti mutáns szubtilizin enzimek sokkal jobban kompatibilisek az amiláz enzimmel, mint a természetes típusú szubtilizin enzim.

• · · · • · · ·· ·· ····

-6A fentieknek megfelelően a találmány stabil, vizes, enzimatikus detergens készítményre vonatkozik, amely a következőket tartalmazza:

a) 5-65 tömeg% felületaktív anyag,

Detergens hatású anyagok

A találmány szerinti készítmények 5-65 tömeg% mennyiségben tartalmaznak a) anionos felületaktív anyagot vagy b) nem-anionos felületaktív anyagot és egy vagy több detergens hatású anyagot, ahol az anionos és nem anionos felületaktív anyagok tömegaránya nagyobb mint 1:1.

A detergens hatású, anionos felületakítv anyagtól eltérő anyagok lehetnek a következők például: alkálifém- vagy alkanol-amin szappanok vagy 10-24 szénatomos zsírsavak, beleértve a polimerizált zsírsavakat is, vagy lehetnek nemionos, kationos, ikerionos vagy amfoter jellegű szintetikus detergens anyagok vagy ezek bármelyikének keveréke.

Az anionos szintetikus detergensek közé tartoznak például a következő anyagok sói, beleértve a nátrium-, kálium-, ammónium- és szubsztituált ammóniumsókat, így például a mono-, di- és trietanol-amin-sókat is: 9-20 szénatomos alkil-benzol-szulfonátok, 8-22 szénatomos primer vagy szekunder alkán• · · · · · *4* ··«· ·· ·· ··«·

-7-szulfonátok, 8-24 szénatomos olefin-szulfonátok, szulfonozott polikarbonsavak, amelyeket alkáliföldfém-citrátok pirolizált termékeinek szulfonizálásával állítanak elő, mint például azt a GB-A 1082179 számú szabadalmi leírásban ismertetik, 8-22 szénatomos alkil-szulfátok, 8-24 szénatomos alkil-poliglikoléter-szulfátok, -karboxilátok és -foszfátok (legfeljebb 10 mól etilén-oxid tartalommal); továbbá alkalmazhatók a következő irodalmi helyeken ismertetett felületaktív anyagok is: Surface Active Agents and Detergents, (I. és II. kötet), szerző Schwartz, Perry és Berch. Bármilyen alkalmas anionos felületaktív anyag alkalmazható és a felsorolt példák semmiképpen sem tekinthetők korlátozónak.

A találmány szerinti készítményekben felhasználható nemionos felületaktív anyagok lehetnek például a következők: etilén-oxid, propilén-oxid és/vagy butilén-oxid 8-18 szénatomos alkil-fenolokkal, 8-18 szénatomos primer vagy szekunder alifás alkoholokkal, 8-18 szénatomos zsírsav amidokkal alkotott kondenzációs termékei, továbbá tercier aminoxidok, amelyek egy 8-18 szénatomos alkilláncot és két 1-3 szénatomos alkilláncot tartalmaznak. Az előző bekezdésben említett irodalmi helyen nemionos felületaktív anyagokat is ismertetnek.

A találmány szerinti készítméynekben különböző nemionos anyagok keveréke, így például a kisebb és nagyobb mértékben alkoxilezett nemionos anyagok keveréke is alkalmazható. Különösen előnyösek az etoxilezett 12-15 szénatomos zsírsav alkoholok, amelyek 3-9 EO-csoportot, különösen előnyösen 5-7 EO-csoportot tartalmaznak.

• 4

4 · • « «4 ·· ··· ·

-8Kationos detergensként például kvaterner ammóniumvegyületeket, így például alkil-dimetil-ammónium-halogenideket alkalmazhatunk. Amfoter vagy ikerionos deteregensként például N-alkil-aminosavakat, szulfo-betaineket, valamint zsírsavak és protein hidrolizátumok kondenzációs termékeit alkalmazhatjuk. Azonban, ezek relatíve magas költsége miatt általában anionos vagy nemionos felületaktív anyagokkal kombinálva kerülnek felhasználásra. Különböző típusú aktív detergensek keverékét is alkalmazhatjuk, így például különösen előnyösek az anionos és nem anionos detergensekből alkotott keverékek. Zsírsavakból nyert szappanok (nátrium, kálium és szubsztituált ammóniumsóik formájában) szintén alkalmazhatók, előnyösen anionos és/vagy nemionos szintetikus detergensekkel kombinálták.

A találmány szerinti készítmények között vannak olyan vizes, folyékony detregens készítmények is, amelyek homogén fizikai jellemzőkkel rendelkeznek, így például ezek tartalmazhatják a folyamatos vizes fázisban a felületaktív anyagok micelláris oldatát, ezek úgynevezett izotróp folyadékok.

Ugyanakkor tartalmazhatnak heterogén fizikai fázist is és lehetnek strukturáltak, így például tartalmazhatnak a folyamatos vizes fázisban lamelláris cseppekből álló diszperziót, így például tartalmazhatnak deflokkuláló polimert, amely hidrofil vázzal és legalább egy hidrofób oldallánccal rendelkezik, ilyet ismertetnek például az EP-A 345995 (Unilever) számú szabadalmi leírásban. Ezen utóbbi folyadékok heterogének és tartalmazhatnak szuszpendált szilárd részecskéket, így például vázanyagokét, például a következőkben « 4 « · « * • · · « · « ·*·« ·· «· »*··

-9ismertetett anyagok részecskéit.

Vázanyagok

A találmány szerinti készítmények továbbá tartalmazhatnak vázanyagot is. Az alkalmas vázanyagok közé tartoznak a szokásos alkálikus szervetlen vagy szerves detergens vázanyagok, amelyek mennyisége általában 0,5-50 tömeg%, előnyösen 3-35 tömeg% a készítmény tömegére számolva. Közelebbről, a nem strukturált készítmények esetében a vázanyagok előnyös mennyisége 3-10 tömeg% és a strukturált készítményekben az előnyös vázanyag mennyiség 5-35 tömeg%.

A strukturált folyékony készítmények alatt olyan készítményeket értünk, amelyben legalább néhány detergens anyag strukturált fázist alkot. Az ilyen strukturált anyag előnyösen képes a szilárd, szemcsés anyagokat szuszpendálni.

Közelebbről strukturált folyadékról van szó, a készítmény elegendő elektrolitot igényel ahhoz, hogy a lamelláris fázis felületaktív anyaggal kialakuljon és biztosítsa a szilárd anyag szuszpendálását. Az ehhez szükséges elektrolit típusának és mennyiségének megválasztása az adott felületaktív anyaghoz a szakember számára ismert módon történik, erre számos irodalom tartalmaz leírást. Az egyik ilyen módszer a vezetőképesség mérése. A lemelláris fázis kimutatására szolgáló módszerek szintén ismertek és ezt például optikai és elektronmikroszkópiával vagy röntgen diffrakcióval végezhetjük kiegészítve a vezetőképesség méréssel. ,

A találmány értelmében az elektrolit kifejezés valamilyen vízben oldható sót jelenthet. Az elektrolit mennyisége elegendő kell legyen ahhoz, hogy a lamelláris fázis a felületaktív • · • ·· • · · · · · • 4 ·· «· 4· · «4·

-10anyaggal kialakuljon és biztosítsa a szilárd anyag szuszpendálását. A találmány szerinti készítmény előnyösen elgalább 1 tömeg%, még előnyösebben legalább 5 tömeg%, különösen előnyösen legalább 17 tömeg% elektrolitot tartalmaz. Az elektrolit lehet egy detergens hatású vázanyag, így például egy szervetlen nátrium-tripolifoszfát vagy lehet egy nem funkcionális elektrolit, így például nátrium-szulfát vagy -klorid. A szervetlen vázanyag előnyösen az elektrolit egy részét vagy az egészet foglalja magában.

Az ilyen strukturált készítmények képesek a szilárd anyag részecskéket szuszpendálni, bár különösen előnyösek az olyan rendszerek, amelyekben a szilárd anyag ténylegesen a szuszpenzióban van. A szilárd anyag lehet nem feloldott elektrolit, amely azonos vagy más mint az oldatban lévő elektrolit, az oldat az elektrolitra nézve telített. Továbbá, vagy más esetekben, az anyagok lehetnek vízben lényegében oldhatatlanok. Az ilyen lényegében oldhatatlan anyagok közé tartoznak például az alumínium-szilikát vázanyagok és a kalcit részecskék.

A strukturált vagy nem strukturált készítményekben alkalmazható szervetlen alkálikus detergens vázanyagok lehetnek például a következők: vízben oldható alkálifém-foszfátok, polifoszfátok, borátok, szilikátok, valamint karbonátok. Közelebbről, ezen sók lehetnek például nártium- és kálium-trifoszfátok, pirofoszfátok, ortofoszfátok, hexametafoszfátok, tetraborátok, szilikátok és karbonátok.

Az alkalmazható szerves alkálikus detergens vázanyagsók lehetnek például a következők: 1) vízben oldható aminó-polikarboxilátok, például nátrium- vagy kálium-etilén-diamin- • ν ·· »· *· · • · » ·· ·· · ··«««· · • »·*·· ·«· ·««· ·· ·· ·«·«

-11-tetraacetátok, nitrilo-triacetátok vagy N-(2-hidroxi-etil)-nitrilo-diacetátok; 2) vízben oldható fitinsavsók, például nátrium- és kálium-fitátok (lásd US-A 2 379 942); 3) vízben oldható polifoszfátok, különösen az etán-l-hidroxi-1,1-difoszfonsav nátrium-, kálium- vagy lítium-sói, a metilén-difoszfonsav nátrium-, kálium- vagy lítium-sói, etilén-difoszfonsav nátrium-, kálium- vagy lítium-sói, valamint az etán-1,1,2-trifoszfonsav kálium- vagy lítium-sói. További példák az alkalmazható anyagokra: etán-2-karboxi-l,1-difoszfonsav, hidroxi-metán-difoszfonsav, karboxildifoszfonsav, etán-l-hidroxi-1,1,2-trifoszfonsav, etán-2-hidroxi-1,1,2-trifoszfonsav, propán-1,1,3,3-tetrafoszfonsav, propán-1,1,2,3-tetrafoszfonsav és propán-1,2,2,3-tetrafoszfonsav alkálifémsói; 4) polikarboxilát polimerek és kopolimerek vízben oldható sói (lásd US-A 3 308 067 számú szabadalmi leírás).

Továbbá, előnyösen lehet alkalmazni a polikarboxilát vázanyagokat, beleértve a mellitsav, citromsav vízben oldahtó sóit, valamint a karboxi-metil-oxi-borostyánkősav és az itakonsav és maleinsav polimerjeinek sóit is.

Alkalmazhatók továbbá bizonyos zeolitok vagy alumínium-szilikátok is. Ilyen alkalmazható alumínium-szilikát például egy amorf, vízben oldhatatlan hidratált vegyület, amely amorf anyagot az Mg⁺⁺-csere kapacitással lehet jellemezni, ennek értéke 50 mg ekvivalens CaCC>3/g és a részecskeátmérő 0,01-5 Mm közötti érték. Ilyen ioncserélő vázanyagot ismertetnek részletesen a GB-A 1470250 számú szabadalmi leírásban.

Egy másik, vízben oldhatatlan szintetikus alumínium-12-szilikát ioncserélő anyag, amelyet a találmány szerinti készítményeknél alkalmazni lehet, kristályos szerkezetű és a következő általános képlettel írható le:

Na_z[(A10₂)y.(SiO₂)].xH₂O, amely képletben z és y jelentése legalább 6, a z és y közötti mólarány 1-0,5 közötti érték és x jelentése 15-264 közötti szám. Ezen alumínium-szilikát ioncserélő anyag részecskemérete 0,1-100 μπι közötti érték a kalciumion-cserélő kapacitás, vízmentes alapra számolva legalább 200 mg CaCC>3 ekvivalens/g, és a kalcium ioncserélő sebesség vízmentes alapra számolva legalább 2 szemcse/gallon/perc/g. Ilyen szintetikus alumínium-szilikátokat ismertetnek részltesebben a GA-A 1429143 számú szabadalmi leírásban.

Mutáns szubtilizin enzim

A találmány szerinti folyékony detergens készítményekben felhasználásra kerülő mutáns szubtilizin enzimeket a

WO-A 89/06279 (Novo/Nordisk) számú szabadalmi bejelentésben ismertetik. Ezek abban különböznek a természetes szubtilizin enzimtől, hogy a 195 és 222 helyeken a natív enzimtől eltérő aminosavat tartalmaznak. A natív enzim a 195 helyzetben glicint és a 222 helyzetben metionint tartalmaz. Különösen előnyös mutáns enzim az, amely a 195 helyzetben glutaminsavat és a 222 helyzetben alanint tartalmaz. Természetesen más előnyös mutánsok is jelen lehetnek az enzimben.

A találmány szerinti készítményben a proteolitikus enzim mennyisége 0,01-200000 GU/g, előnyösen 1-100000 GU/g, különösen előnyösen 1000-50000 GU/g a készítmény végső tömegére számítva.

A GU jelentése egy glicin egység és egy olyan proteolitikus enzim mennyiséget jelent, amely standard . .··» i * · · • · · *· > ··»·

-13inkubációs körülmények között 1 Mmg/ml glicinnel ekvivalens terminális NH2~csoportot termel.

Természetesen a találmány értelmében a mutáns proteáz enzimeket más proteolitikus enzimmel kombinációban is lehet alkalmazni. A más szubtilizin proteáz enzim lehet növényi, állati vagy mikroorganizmus eredetű. Előnyösek ez utóbbi eredetűek, amelyek közé tartoznak az élesztők, gombák, penészgombák és baktériumok. Különösen előnyösek a bakteriális eredetű szubtilizin típusú proteázok, amelyeket például a B. subtilis és B. liceniformis törzsekből nyerünk. Ilyenek például a kereskedelmi forgalomban beszerezhető Alcalase, Savinase, Esperase nevű proteázok (mindegyik Novo/Nordisk A/S gyártmány), valamint a következő proteázok: Maxatase and Maxacal of GistBrocades; Kazusase of Showa Denko; Subtilisin BPN'.

A proteolitikus enzimeket általában koncentrált vizes oldatok formájában adagoljuk. Azonban, mint azt a függő 91200677.2 számú európai szabadalmi bejelentésben vagy a 681025 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben leírjuk, fokozottabb enzimstabilitást érhetünk el, ha az enzimet egy nemionos detergenssel, általában folyékony detergenssel készült zagy formájában adagoljuk.

Az enzim zagy az enzimet diszpergált formában tartalmazza, így például egy nemvizes (nemionos) folyékony felületaktív anyagban szuszpendált por vagy részecske tornájában, a felhasznált folyékony felületaktív anyag előnyösen vízmentes. Az enzim részecskék lehetnek porlasztva szárított vagy liofilizált részecskék vagy lehetnek a porlasztva szárítás után és a diszpergálás előtt őrölt szemcsék is, amelyeket azután a

például vízmentes, nemionos folyékony detergensben diszpergálunk. Az enzimet őrölhetjük a nemionos detergensben való diszpergálást követően is.

Az enzim mennyisége a zagyban például 0,5-50 tömeg%, például 1-20 tömeg%. Általában a találmány szerinti készítmény előállításánál felhasználásra kerülő enzim zagyok lényegében vízmentesek, a víztartalmuk kevesebb mint 10 tömeg%, előnyösen kevesebb mint 5 tömeg%, esetenként kevesebb mint 5 tömeg%. Az ilyen zagy-eljárás alkalmazásával lehetséges gyakorlatilag vízmentes, folyékony nemionos felületaktív anyagok alkalmazása, amely a zagy folyamatos fázisát képezi. A zagy folyékon állapota lehetővé teszi az enzim alapos elkeverését a végső, folyékony detergenssel, továbbá lehetővé teszi az enzim könnyű felszabadulását, miután a folyékony detergenst a mosófolyadékkal elkevertük.

Más enzimek

A találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak továbbá a proteáz enzimek mellett más egyéb enzimeket is, így például lipázokat, amilázokat és cellulázokat. Amennyiben ezek jelen vannak, mennyiségük 0,001-5 tömeg% a készítmény tömegére számolva.

Ha a találmány szerinti készítmény lipolitikus enzimet vagy lipázt tartalmaz, a lipáz mennyiségét széles határok között állapíthatjuk meg, így ez az érték lehet 10-30000 LU/g a detergens tömegére számolva, például gyakran legalább 100 LU/g, előnyösen 200-5000 LU/g. Ebben a vonatkozásban a lipáz egységeket az EP-A 258068 számú szabadalmi leírásban leírtak szerint definiáljuk.

-15A lipázt a lipázok igen széles köréből választhatjuk, különösen előnyösek a következő szabadalmi leírásokban ismertetett lipázok: EP-A 214761 (Novo/Nordisk), EP-A 258068 (Novo/Nordisk), és EP-A 305216 (Novo/Nordisk), valamint azon lipázok, amelyek immunológiai kereszt-reaktivitást mutatnak a Thermomyces lanuginosus ATCC 22070-ből származó lipázzal szembeni antiszérummal, továbbá előnyösek az EP-A 2052208 és EP-A 206930 számú szabadalmi leírásokban leírt lipázok, továbbá lipázok, amelyek immunológiai kereszt-reaktivitást mutatnak a Chromobacter viscosum var lipolyticum NRRL B-3673 törzsből származó vagy az Alcaligenes PL-679, ATCC 31371 és FERM-P 3783 törzsekből származó lipázokkal szembeni antiszérumokkal, továbbá előnyösen alkalmazhatók a WO-A 87/00859 (Gist Brocades) és az EP-A 204284 (Sapporo Breweries) számú szabadalmi leírásokban ismertetett lipázok. Különösen előnyösen alkalmazhatók a következő, kereskedelmi forgalomban beszerezhető lipáz készítmények: Novo/Nordisk Lipolase, CE, P, B, AP, M-AP, AML és CES Amano lipázok és MY-30, OF és PL Meito lipázok, valamint az MM észteráz, Lipozym, SP 225, SP 285, Saiken lipáz, Enzeco lipáz, Toyo Jozo lipáz és Diosynth lipáz (márkanevek).

Az amiláz például 1-100 MU (maltóz egység) per gramm detergens készítmény (vagy 0,014-1,4 KNU/g, Novo egység). Előnyös amiláz a Novo/Nordisk Termamyl márkanéven forgalomba hozott amiláz készítménye.

A cellulázt például 0,3-35 CEVU egység/g detergens készítmény mennyiségben alkalmazzuk. Előnyös a Novo/Nordisk Celluzyme márkanéven forgalomba hozott celluláz készítménye.

Bármely fentiek szerinti enzimet géntechnológiai úton is • · · · • · • · · ·

-16előállíthatjuk, így például a megfelelő gén extrakciójával, és a gén vagy származékának alkalmas termelő organizmusba való bevezetésével és expresszálásával.

Alkalmazható módosított szubtilizin proteázokat ismertetnek például a következő helyeken (EP-A-130 756 (Genentech), EP-A-214 435 (Henkel), WO-A 87/04461 (Amgen), WO-A 87/05050 (Genex), EP-A 405 901 (Unilever) és EP-A-303 761 (Genentech)), alkalmazható módosított lipáz enzimeket ismertetnek a következő irodalmi helyeken ((WO-A 89/09263 (Gist-Brocades), EP-A 218 272, EP-A 258 068 (Novo/Nordisk), EP-A 407 225 (Unilever) és EP-A 305 216 (Novo/Nordisk)).

Stabilizátorok

A találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak stabilizáló rendszereket is az enzimek számára, erre a célra lehetséges azokat az intézkedéseket alkalmazni, amelyek a fentiekben már említett szabadalmakban az enzimstabilizálással kapcsolatban leírnak.

így például alkalmazhatók a következő enzimstabilizáló rendszerek: a) enzimstabilizáló rendszer, amely kalciumot és formátot vagy acetátot tartalmaz és b) poliol- és borát-tartalmú enzimstabilizáló rendszer.

Az EP-A 080223 (Unilever) számú szabadalmi leírás szerinti készítményekben például 2-25 tömeg% poliolt, például glicerint vagy propilénglikolt vagy más egyéb poliolt alkalmaznak 2-15 tömeg% nátrium-boráttal vagy borax-szal.

Továbbá, alkalmazhatók például az EP-A 028865 (Procter & Gamble) számú szabadalmi leírásban ismertetett készítmények, amelyek alacsony molekulatömegű mono-karboxiIátokat (só vagy ···«

-17sav formában), így például formátot vagy acetátot tartalmaznak 0,1-10 tömeg% mennyiségben az enzim számára hozzáférhető kalciumionokkal (0,1-1 mmól/kg) és rövid szénláncú alkoholokkal, például etanollal vagy propilénglikollal (max. 20 tömeg%) együtt.

A fentieknél kisebb mennyiségű stabilizátorokat is lehet azonban alkalmazni, mint azt a hivatkozott leírásokban is kihangsúlyozzák.

Adott esetben alkalmazott komponensek

A fentiek szerinti lényeges alkotók mellett még az előnyös készítmények tartalmazhatnak különböző adalékokat is, amelyek az ilyen típusú készítmények esetében ismertek. Bár a találmány szerinti készítmények általában vizes, enzimtartalmú detergens készítmények, gyakran szükséges a fázisszabályozók alkalmazása. Ez a komponens a vízzel együtt egy oldószer mátrixot képez a találmány szerinti folyékony készítmények számára. Alkalmas fázisszabályozók az ismert, a folyékony detergens készítményekkel általában alkalmazott anyagok, így például ezek lehetnek hidrotópok, így például alkil-aril-szulfonátok, amelyek az alkilcsoportban max. 3 szénatomot tartalmaznak, így például lehet valamely xilol-, toluol-, etil-benzol-, kumén- és izopropil-benzol-szulfonsav nátrium, kálium, ammónium vagy etanol-aminsója. Fázisszabályozóként különböző alkoholokat is alkalmazhatunk. A fázisszabályozók mennyisége általában 0,5-20 tömeg%, a fázisszabályozó és a víz együttes mennyisége általában 35-65%.

A találmány szerinti előnyös készítmények tartalmazhatnak továbbá más egyéb, adott esetben felhasználható alkotókat is,

-18• · · * ·· ··· ···· · · ·· ···· ezek mennyisége általában 5 tömeg% alatti érték. Ilyen adalékok például a következők: polisavak, szappan szabályozók, opakizálók, antioxidánsok, baktericidek, festékek, illatanyagok, élénkítőszerek, stb.

A találmány szerinti készítmények különböző körülmények között való megfelelő alkalmazásához szükséges a szappan-szabályozók alkalmazása. Bár általában minden ismert detergens szappan-szabályozó alkalmazható, előnyösen alkilezett polisziloxánokat, így például dimetil-polisziloxánt (gyakran szilikonoknak is nevezik) alkalmazunk. A szilikonok mennyisége általában nem haladja meg a 0,5-5 tömeg% értéket, a mennyiségük előnyösen 0,01-0,2 tömeg% közötti érték.

Kívánatos lehet továbbá opakizálószerek alkalmazása is annak érdekében, hogy a koncentrált folyékony detergens készítménynek egységes megjelenést biztosítsunk. Ilyen opakizálók lehetnek például a következők: polisztirol, kereskedelmi nevén Lytron 621, amely Monsanto Chemical Corporation gyártmány. Az opakizáló anyag mennyisége általában 0,3-1,5 tömeg% közötti érték.

A találmány szerinti készítmények tartalmazhatnak továbbá ismert antioxidánsokat is, amelyek gyakran gyök-megkötő anyagok, ezek mennyisége megfelel a szokásos mennyiségeknek, így például lehet 0,001-0,25 tömeg% közötti érték a készítmény teljes tömegére számolva. Az antioxidánsokat általában a zsírsavakkal együtt adagoljuk. Egy másik adott esetben felhasználható adalékanyag a strukturált folyadékkészítmények esetében a deflokkuláló polimer. A deflokkuláló polimer általában egy hidrofób vázat tartlmaz egy vagy több hidrofób • · · · · · · • ····· ·· ♦ · · ·· ·· ···· oldallánccal, ilyet ismertetnek például az EP-A 346995 (Unilever) vagy a függő 664513 alapszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben. Ezek kivánt esetben lehetővé teszik nagy mennyiségű felületaktív anyag és/vagy elektrolit beépítését, amely egyébként szükséges lenne a stabil, kis viszkozitású termék előállításához, valamint lehetővé teszi kivánt esetben nagyobb mennyiségben más egyéb alkotók beépítését, amelyekkel szemben a lamelláris diszperzió igen stabilitás-érzékeny.

A deflokkuláló polimerek mennyisége általában 0,1-5 tömeg%, előnyösen 0,1-2 tömeg%, különösen előnyösen 0,5-1,5 tömeg% a készítmény tömegére számolva.

A termék pH-ja

A találmány szerinti folyékony detergens készítmények pH értéke széles határok között változhat, így például lehet 7-12 közötti pH érték, gyengén alkalikus tartományban a pH értéke 7,5-9,5 közötti érték, az erősebben alkalikus tartományban 8,5-11,5, előnyösen 8,5-11 közötti, különösen előnyösen 9-10,5 közötti érték.

A következő példákkal a találmányt kívánjuk közelebbről illusztrálni a korlátozás szándéka nélkül.

A példákban a következő rövidítéseket alkamazzuk:

LAS

LES

Nemionos lineáris 12 szénatomos alkil-benzolszulfonsav lauril-éter (3EO)-szulfát etoxilezett 12-15 szénatomos zsíralkohol

1-7. példák

A következő összetételű folyékony detergens készítményeket állítjuk elő (a megadott számértékek tömeg%-ot jelentenek):

	1	2	3	4	5	6	7
LAS	6,7	23	21	26,2	16,5	16,5	26,2
Szappan	-	-	-	-	4,5	4,5	-
Nemionos	4,8	10	9	12	9	9	12
Citromsav.Oaq	-	-	-	-	8,2	9	7,5
Na-citrát.2aq	3,5	16,5	10,4	10	-	-	-
Zeolit	20	-	-	-	18,8	18,8	-
Na-perborát.4aq	-	-	20	-	-	-	-
Deflokkuláló polimer	-	1	1	1	1	1	1
Kalcium-klorid.2aq	-	-	-	-	-	-	-
Trietanol-amin	-	-	-	2	-	-	2
Monoetanol-amin	-	-	-	2	-	-	2
Glicerin	-	-	-	-	2	-	5
Borax.lOaq	-	-	1,8	-	1,5	-	3,5
Proteáz	0,7	1,5	1,0	1,5	1,5	1,5	1,5
Lipáz	-	-	0,5	-	0,5	0,5	0,5
Egyéb adalékok és víz	100%-ig
PH	8,5	8,5	9,5	9,3	8,5	8,5	9,5

A folyékony készítményeket az EP-A 345995 számú szabadalmi leírásban leírtak szerint állítjuk elő, az alkalmazott deflokkuláló polimer megfelel az ott ismertetett All polimernek. Az alkalmazott proteáz 16.0 LDX Durazym (Novo/Nordisk), a mutáns szubtilizin proteáz a 195 helyzetben glütaminsavat és a 222 helyeztben alanint tartalmaz. A proteázt a folyékony készítménnyel keverjük el. Lipázként Lipolase 100L (Novo/Nordisk) készítményt alkalmazunk, ezt a Humicola lanuginosa törzsből származó lipáz gén klónozásával és a gén

-21Aspergillus oryzae gazdában való expresszálásával nyerjük.

A készítményekben a proteáz tárolási stabilitását a proteáz aktivitás tárolási idő függvényében való mérésével határozzuk meg, a tárolást 37°C hőmérsékleten végezzük. A felezési időt úgy határozzuk meg, hogy az Ao/At értéket az idő függvényében ábrázoljuk, majd nem lineáris regressziós analízist végzünk. A kapott eredményeket az A táblázatban foglaljuk össze (az értékeket napokban adjuk meg 37°C hőmérsékleten) . A lipoláz 100L tárolási stabilitását a 3. és 5-7. számú készítményekben szintén meghatároztuk oly módon, hogy mértük a lipáz aktivitást a tárolási idő függvényében 37°C hőmérsékleten. A stabilitási adatokat a B táblázatban foglaljuk össze és a felezési időben fejezzük ki (napok száma 37°C hőmérsékleten).

A-G összehasonlító példák

Az összehasonlítás érdekében mértük az 1-7. példák szerinti készítmények tárolási stabilitását, ezek azonban proteázként natív szubtilizin enzimet tartalmaztak. Savinase 16.9 LDX (Novo/Nordisk gyártmány) készítményt elkevertük a folyékony készítménnyel a Durazym enzim proteolitikus aktivitásával azonos mennyiségben. Ezután meghatároztuk a felezési időt (napokban 37°C hőmérsékleten), a kapott eredményeket az A táblázatban foglaljuk össze. A 3. és 5-7. készítmények esetén meghatároztuk a Lipolase 100L (Novo/Nordisk) tárolási stabilitását is, a stabilitás adatokat a B táblázatban foglaljuk össze és a felezési idővel fejezzük ki (napokban 37°-on).

·· · • ·· · • ·· ·

-22Ά táblázat

A proteáz aktivitás felezési ideje 37°-on (napok)

A példák szerinti

összetételek	1	2	3	4	5 6	7
Proteolitikus enzim:
Durazym	6	30	7	20	»28¹) 60	»28
Savinase	4	3	2	1	»28¹) 8	2,5

^x)

A maradék aktivitás 28 napos tárolási idő után 95%

A maradék aktivitás 28 napos tárolási idő után 76%.

A fenti eredményekből kitűnik, hogy a mutáns proteáz enzimet tartalmazó detergens készítményekben lévő proteáz felezési ideje minden esetben magasabb, mint a natív szubtilizin proteázt tartalmazó készítményeké. A 3. példa szerinti készítmény esetén, amely fehérítő rendszert tartalmaz, a javulás mértéke háromszoros. Fehérítő jelenléte nélkül (1-2. és 4-7. példák) a javulás mértéke esetenként tízszeres.

B táblázat

Lipáz aktivitás felezési ideje 37°-on (napok)

A példák szerinti

készítmények	3	5	6	7
Proteolitikus enzim:
Durazym	4,5	»28	28	3
Savinase	1,0	17	2,5	0,5

A fenti eredményekből kitűnik, hogy a lipáz aktivitás felezési ideje azon detergens készítméyneknél, amelyek mutáns proteázt tartalmaznak, minden esetben magasabb, mint a natív szubtilizin proteázt tartalmazó készítményeké.

8-10. példák

A következő összetételű folyékony detergens készítményeket állítjuk elő (a megadott számok t%-ot jelentenek) :

	8	9	10
LAS	10,0	27,3	10,0
LES	6,0	-	6,0
Nemionos.9E0	8,0	12,0	8,0
Etanol	5,0	-	-
Citromsav.Oaq	3,2	7,1	-
Na-citrát.2aq	-	-	7,0
Deflokkuláló polimer¹)(33%)	-	3,1	-
Kalcium-klorid	-	-	0,01
Trietanol-amin	-	-	2,0
Monoetanol-amin	-	0,05	2,0
Szorbit (70%)	4,5	5,0	-
Glicerin	2,7	5,0	-
NaOH (50%)	-	16,6	-
Nátrium-xilolszulfonát	-	-	3,0
Borax.lOaq	4,0	8,0	-
Proteáz	1,5	0,6	0,75
Lipáz	0,5	1,1	10,1
Egyéb adalékok és víz 100%-ig pH	7,2	8,7	10,1
^¹) nátrium-akrilátból és lauril-	-metakri1átbó1	nyert	kopolimer,

molekulatömege 4000-11000 közötti érték (Narlex DC-1 ex ······ · • · · « ·· ··· ·<··· ·· ·· ····

-24National Starch).

Proteázként 16.0 LDX Durazyn készítmény és lipázként Lipolase 100L készítményt alkalmaztunk (mindkettő Novo/Nordisk gyártmány). A készítményekben a proteáz tárolási stabilitását a proteáz aktivitás idő függvényében való mérésével határoztuk meg a fentiekben már leírtak szerint. A kapott eredményeket a C táblázatban foglaljuk össze (napokban 37°-on). A Lipolase 100L tárolási stabilitását a 8. és 9. készítményekben határoztuk meg. A tárolási stabiltást a lipáz aktivitás a tárolási idő függvényében való mérésével vizsgáltuk 37°-on. A kapott stabilitási adatokat a D táblázatban foglaljuk össze és a felezési idővel fejezzük ki (napokban 37°-on).

H-J összehasonlító példák

Összehasonlításként vizsgáltuk a 10. példa szerinti készítmények tárolási stabilitását, amelyek proteázként natív szubtilizin enzimet tartalmaztak. A Savinase 16.0 LDX készítményt elkevertük a folyékony készítményekkel, az enzim mennyisége olyan volt, hogy a Durazym enzimmel azonos proteolítikus aktivitást biztosítson. Meghatároztuk a felezési időt (napokban 37°-on) a kapott eredményeket a C táblázatban foglaljuk össze. A 8. és 9. összehasonlító készítményekben a Lipolase 100L tárolási stabilitását is meghatároztuk. A kapott eredményeket a D táblázatban foglaljuk össze, felezési időben fejezzük ki (napokban 37°-on).

« 4 ·· · · · · * · · ·· ··· ·· ·· ····

-25C táblázat

A proteáz aktivitás felezési ideje 37°-on napokban

A példa szerinti kész ítmények 8___________910

Proteolítikus enzim:

Durazym - -8

Savinase - -5

A kapott eredményekből kitűnik, hogy a mutáns proteázt tartalmazó detergens készítmények proteáz aktivitása minden esetben nagyobb, mint a natív szubtilizin proteázt tartalmazó készítményekben.

D táblázat

Lipáz aktivitás felezési ideje 37°-on napokban

A példa szerinti készítmények 89

Proteolítikus enzim:

Durazym 40>90

Savinase 2949

A kapott eredményekből kitűnik, hogy a mutáns proteázt tartalmazó detergens készítmények lipáz aktivitásának felezési ideje minden esetben nagyobb mint a natív szubtilizin proteázt tartalmazó készítményeké.

11. példa

A következő összetételű folyékony detergens készítményeket állítjuk elő (a megadott számok t%-ot jelentenek):

-2611

·«·«

Nemionos felületaktív anyag¹)

Na-citrát.2aq

15,0

Glicerin

Borax

Carbopol 940

Agyag (Laponite XLS)

NaOH (50%)

Nátrium-karbonát

Nátrium-hidrogén-karbonát

Proteáz

Amiláz

4,0

2,7

1,2

0,02

2,0

5,0

GU/g érték biztosításához

Mu/g érték biztosításához

Víz

100%-ig pH

!) PO-EO blokk kopolimer, amely 6-10 szénatomos alkilcsoportot tartalmaz, molekulatömege kb. 1800, beszerezhető SLF-18 márkanév alatt.

Proteázként 16.0 LDX Durazym készítményt, amilázként Termamyl készítményt alkalmaztunk (mindkettő Novo/Nordisk gyártmány). A készítményekben az amiláz tárolási stabilitását az amiláz megmaradó aktivitásának meghatározásával mértük 21 napos tárolási idő után 37°-on. A kapott eredményeket az E táblázatban foglaljuk össze.

K összehasonlító példa

Az összehasonlítás érdekében vizsgáltuk a 11. példa szerinti készítmény tárolási stabilitását, amely azonban natív * · · ··*··% X ··»··« V * *«*»· · «· •··4 ·· ·· ····

-27szubtilizin enzimet tartalmazott proteázként. A Savinase 16.0 LDX (Novo/Nordisk) készítményt elkevertük a folyékony készítménnyel, a felhasznált mennyiség olyan, hogy azonos proteolítikus aktivitást biztosítson, mint a Durazym enzim esetén. Az amiláz tárolási stabilitását szintén meghatároztuk az amiláz megmaradó aktivitásának mrésével 24 napos tárolási idő után 37°-on. A stabilitási adatokat az E táblázatban foglaljuk össze.

E táblázat %-os amiláz aktivitás 21 nap után 37°-on

Proteolítikus enzim:

Durazym 73

Savinase 51

A fenti adatokból kitűnik, hogy a mutáns proteáz enzimet tartalmazó detergens készítményben az amiláz aktivitás felezési ideje magasabb, mint a natív szubtilizin proteázt tartalmazó készítményben.

9. r’% l • ·· · · « , ···· ♦·* *··* »S·· * **

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Stabil, vizes enzimatikus detergens készítmény, azzal jellemezve, hogy a következőket tartalmazza:

a) 5-65 tömeg% felületaktív anyag,

b) egy mutáns szubtilizin enzim, amelyben az aminosav szekvencia legalább a 195 és 222 helyzetben meg van változtatva egy másik aminosav beépítésével, és ezen enzim mennyisége olyan, hogy az aktivitás érték 0,01-200000 GU/g legyen, a készítmény lényegében fehérítőszer mentes és/vagy c) komponensként egy további enzimet tartalmaz, amely lehet lipáz, amiláz vagy celluláz-típusú.
2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy a mutáns szubtilizin enzim a 222 helyzetben a metionin helyett alanint tartalmaz.
3. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy az enzim a 195 helyen a glicin helyett glutaminsavat tartalmaz.
4. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy felületaktív anyagként aninos felületaktív anyagot tartalmaz.
5. Az 1. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy felületaktív anyagként aninos felületaktív anyag és egy vagy több más egyéb detergens hatású anyag keverékét tartalmazza, az anionos és nemanionos anyagok tömegaránya nagyobb mint 1:1.
6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy ha a készítmény strukturált, az 5-35 *· 99 ««* * ·· · 9ti ·«·«·« _w • * · · · · « ··

0999 99 999999 tömeg% vázanyagot tartalmaz.
7. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy ha a készítmény nem strukturált, az 3-10 tömeg% vázanyagot tartalmaz.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy még 0,1-5 tömeg% mennyiségben deflokkuláló polimert is tartalmaz.
9. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 10-30000 LU/g mennyiségű lipázt tartalmaz.
10. Az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy 1-100 MU/g mennyiségű amilázt tartalmaz.
11. Eljárás az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti vizes, folyékony enzimatikus detergens készítmény előállítására azzal jellemezve, hogy a proteolítikus enzimet zagy formájában keverjük el a folyékony nemionos felületaktív anyaggal.