CZ7793A3

CZ7793A3 - Immunoregulating and neuroregulating pentapeptides, process of their preparation and pharmaceutical preparations based thereon

Info

Publication number: CZ7793A3
Application number: CZ9377A
Authority: CZ
Inventors: Gideon Goldstein; Tapan Audhya; George Heavner; Mohmed K Anwer
Original assignee: Immunobiology Res Inst Inc
Priority date: 1991-06-03
Filing date: 1992-05-28
Publication date: 1993-12-15
Also published as: IE921781A1; SK4093A3; FI930342A0; FI930342A; BR9205281A; NO930359L; JPH06501955A; MX9202643A; AU653838B2; TW222281B; NZ242993A; CN1068334A; HU9300278D0; ZA924023B; YU58392A; CA2088664A1; NO930359D0; WO1992021366A1; AU2012592A; US5215964A

Description

Vynález se obecně týká peptidů, které jsou užitečné při odstraňování symptomů stáří a při léčbě abnormalit imunitního a centrálního nervového systému.

Dosavadní stav techniky

Imunomodulační protein thymopoietin byl izolován z hovězího a humánního thyrou. Kromě toho byly chemicky syntetizovány malé peptidy, které napodobují biologickou účinnost thvmopoietinu (viz například US patent č. 4 505 853 a odpovídající Evropská patentová přihláška č. 146 266.

V současné době byla publikována celá řada článků a patentů, které se týkají takových proteinů a syntetických peptidů. V US patentu č. 4 196 646 je publikován pe.ntapeptid thymopentin, který je účinným místem thvmopoietinu a který má sekvenci Arg-Lys-Asp-Val-Tyr, jakož i peptidové látky, které na aminovém a/nebo karbcxylcvém konci tohoto pentapeptidu obsahují jako substituenty různé skupiny.

thymopoietinu je známo, že reguluje chclinergickou neuro muskulárni transmisi [G.Goldstein a W.H. Hoffman, J.Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 31: 453 až 459 (1968); G. Goldstein, Nátuře, 247: li až 14 (1974)]. Tento neuromuskulární účinek je způsoben vazbou thymopoietinu k nikotinovému acetvicholinovému receptorů, ligandem regulovanému iontovému kanálu neuromuskulárního spojení obratlovců a elektrického orgánu ryb [F. Revah a další, Proč. Nati. Acač. Sci. USA, 34: 3 477 až 3 481 (1987); K. Venkatasubramanian a další Proč. Nati.

Acad. Sci. USA, 83: 3 171 až 3 174 (1986)]. Thymopoietin je přítomen v mozku a tam jsou také přítomny receptory thymopoietinu (TPR), takže thymopoietin se téměř určité podílí na funkci mozku.

Nedávno byl thymopoietin identifikován jako antagonista změn vyvolaných stresem a bylo zjištěno, že vykazuje ochrannou účinnost proti stresu [V. Klusa a další, Regulátory Peptides, 27: 355 až 365 (1990)].

Stále však v tomto oboru zůstává potřeba nalézt další peptidy, které by mohly sloužit jako diagnostická a/nebo terapeutická činidla, užitečná při léčbě dysfunkcí imunitního systému savců, včetně dysfunkci, které jsou spojeny se stárnutím a různými psychickými stavy, jakož i peptidy, které by byly užitečné při léčbě poruch funkcí mozku.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je série nových pentapeptidů, které jsou schopny regulovat funkci buněk imunitního a centrálního nervového systému a které vykaagi neobvykle vysokou imunomodulační účinnost, ve srovnání se známými peptidy.

Podle jednoho aspektu jsou předmětem tohoto vynálezu nové pentapeptidy obecného vzorce

R¹-V-W-X-Y-Z-R² nebo jejich farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinami nebo bázemi, kde R^, V, W, X, Y a Z mají význam uvedený dále. Přítommnost prolinu (nebo prolinověho analogu) v poloze 4 (nebo Y) peptidů podle vynálezu uděluje těmto peptidům zvýšenou odolnost proti působeni enzymů,-ve srovnání se pentapeptidy s podobným složením, aminokyselin v polohách i až 3 a 5. Peptidy podle vynálezu jsou tedy při orálním podávání účinnější in vivo, ve srovnání s peptidy podle dosavadního stavu techniky.

Podle jiného aspektu jsou předmětem vynálezu způsoby výroby výše popsaných peptidů syntetickým postupem v roztoku, pevné fázi nebo enzymatickou syntézou.

Podle ještě dalšího aspektu jsou předmětem vynálezu farmaceutické přípravky obsahující 1 nebo více výše popsaných peptidů, v kombinaci s farmaceuticky vhodným nosičem.

Dalším aspektem vynálezu je způsob léčby různých poruch a nedostatků, které mají vztah k imunitnímu systému, zejména způsob odstraňování symptomů stárnutí, které jsou způsobeny smršťováním brzlíku v průběhu času a způsob léčby psychiatrických poruch, jako jsou stavy úzkosti a deprese. Tento způsob zahrnuje podávání účinného množství farmaceutického přípravku podle vynálezu postiženému subjektu.

Další aspekty a výhody tohoto vynálezu jsou popsány v následujícím podrobném popisu, který obsahuje příklady provedení vynálezu, jimž se v současné době dává přednost.

Přehled obrázků na výkrese

Na obr. 1 je znázorněn sloupcový graf ilustrující enzymatickou stabilitu thvmopentinu a acetyl-Arg-Pro-Asp-ProPhe-Nl·^ (peptid IRI-514) při expozici dvanáctníku v difuzní cele po dobu 0, 2 a 4 hodin, způsobem popsaným v příkladu 19.

Na obr, 2. je znázorněn účinek orálně Dodaného Deotidu

IRI-514 na odpověď neuromuskulární transmise, při prahové dávce 0,05 mg/kg, viz příklad 18.

Na obr. 3 jsou sumarizovány pokusy, při nichž se vyhodnocuje schopnost buněk zvířat ošetřených peptidem IRI-514 a placebem generovat tlumivé T-buňky {T-supresory), které jsou popsány v příkladu 19.

Na obr. 4 jsou ilustrovány účinky peptidu IRI-514 na behaviorální odpověď při úzkostném stavu vyvolaném sociálním stresem u krys (za použití srovnávacích zvířat ošetřených pouze vehikulem a kontrolních zvířat, která nebyla vystavena stresu), jak je to popsáno v příkladu 20.

Následuje podrobný popis vynálezu.

Jak již bylo uvedeno výše, jsou předmětem vynálezu peptidy, které jsou schopny regulovat a působit na imunitní a/nebo centrální nervový systém savců. U těchto pentapeptidů byla zjištěna biologická účinnost při neuromuskulárním stanovení, která se projevuje povzbuzováním anti-CD3-stimulovaného rozvoje tlumivých T-buněk, atenuací stresem vyvolaného zvýšení hladiny hormonů osy HPA (osy hypotalamus-podvěsek mozkový-nadledvina) a prevencí změn chování vyvolaných stresem. Tyto pentapeptidy jsou dále charakteristické překvapující účinností při orálním podávání, ve srovnání s jinými známými peptidy.

Předmětem tohoto vynálezu jsou nové pentapeptidy obecného vzorce r¹-V-w-x-y-z-r²

nebo nebo	jejich farmaceuticky bázemi, kde	vhodné	adiční	soli s kyselinami
R¹	představuje atom	vodíku	nebo ni	žší alkyl nebo
	alkanovl, vždv s 4 ¹ J	1 až 10	atomy	uhlíku,

V	představuje	Arg	/
w	představu]e	Pro	, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro,
Λ	představuj e	Asp	, Ser, Thr, Ala, Asn, Olu nebo Gin
v	představuje	Pro	, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro,
%	představuje ?he nebo Tyr, který je popřípadě substituován jedním nebo více atomy halogenu, nitroskupinami nebo hydroxyskupinami a
R²	představuje	skupinu OH nebo NR²R⁴,

• * 4 přičemž každý ze symbolu R a R** je nezávisle zvoien ze souboru zahrnujícího vodík, alkylskupiny nebo alkenylskupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, které jsou popřípadě substituovány arylskupinou nebo arylskupinou substituovanou halogenem nebo alkylskupinou nebo alkenylskupinou s přímým nebo rozvětvenými řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo R^J a R⁴ dohromady představují cyklickou methylenovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, přičemž popřípadě jeden ze symbolů V, W, X, Y a Z nebo větší počet těchto symbolů představuje D-aminokyseliny.

V tomto popisu jsou aminokyselinové složky peptidů a určitých látek, kterých se používá pro jejich přípravu, s ohledem na účelnost, identifikovány zkratkami. Většina troj písmenových zkratek aminokyselin je dobře známa. Jak již bylo ukázáno výše, všechny aminokyseliny ve shora uvedeném ' -τη a S ί mnrnή Ί má Vnnf i .^nrar i T - n - rmprp Vs ’ ~ ~ J * -- -- - — ----~--- - ----konkrétním peptidů může mít jedna nebo více aminokyselin konfiguraci D-isomeru.

Peptidy těchto vzorců, které v aminokyselinové poloze 2 nebo 4 obsahují Pro nebo jeho analog, se vyznačují zvýšenou stabilitou a odolností proti napadení endo- a exopeptidasani a enzymy typu trypsinu v zažívacijm traktu a séru. Tato zvýšená odolnost proti enzymatickému štěpení v intestinálním traktu činí tyto peptidy obzvláště vhodnými pro orální podávání a dodává jim překvapující účinnost, ve srovnání s jinými známými peptidy. Poněvadž jsou tyto peptidy výjimečně účinné při orálním podávání, zvláště dobře se hodí pro farmaceutické přípravky ve formě tablet.

Jedním přednostním pentapeptidem je acetyl-Arg-Pro-Asp?ro-Z-NH₂, kde symbol Z může představovat Tyr nebo popřípadě substituovaný Phe, V současné době se z těchto pentapeptídů dává největší přednost pentapeptidu acetyl-Arg-Pro-Asp-Pro?he-NH₂ [SEQ ID No:l] který je označován názvem IRI-514. Tento peptid vykazuje překvapující vysokou orální účinnost.

Z peptidů podle vynálezu, kt	erým	se	dáv	á obzvláštní
přednost, je možno uvést:
acetyl-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH₂	[ SEQ	ID	No:	1]
acetyl-Arg-Pro-Asp-Pro-Tyr-NH₂	[SEQ	ID	No:	2]
acetyl-Arg-Pro-Asn-?ro-Phe-NH₂	[SEQ	ID	No:	3 1
acetyl-Arg-Pro-Asn-Pro-Tyr-NH₂	[SEQ	ID	No:	4]
acetyl-Arg-Pro-Ala-?ro-Phe-NH₂	[SEQ	ID	No:	5]
acetyl-Arg-Pro-Ala-Pro-Tyr-NH₂	[SEQ	ID	No:	6j
acetyl-Arg-Pro-Glu-Pro-Tyr-NH₂	[SEQ	ID	No:	7]
acetyl-Arg-Pro-Ser-Pro-?he-NH₂	[SEQ	ID	No:	Sj
acetyl-Arg-?ro-Thr-?ro-Phe-NH₂	[SEQ	ID	No:	91
acetyl-Arg-Pro-Thr-Pro-Tyr-NIK	[SEQ	ID	No:	10 ]
acetyl-Arg-Prc-5er-?ro-Tyr-NH₂	[SEQ	ID	No:	11]
acetyl-Arg-Fro-Asp-Pro-pCIPhe-N	ή₂ [S	;eq	ID	No: 12]
dekanoyl-Arg-?ro-Asp-?ro-Phe-NH	:₂ [seq :	ID N	c: 12 ]
acetyl-Arg-?ro-Glu-?ro-?he-NH₂	[ SEQ	IV	1T_ . INU ,	i *T

butyryl-Arg-Pro-Asn-?ro-?he-h^TH₂ [SEQ ID No: 15].

Peptidy podle vynálezu jsou sice dobře uzpůsobeny pro orální léčbu, mohou se však také podávat jakýmkoliv jiným způsobem, například injekčně nebo tcpicky. Pro použití v topických přípravcích se v poloze 2* přednostně acetylskupona nahrazuje dekanoylskupincu, poněvadž její lipcfíiní vlastnosti ji činí zvláště vhodnou pro absorpci pokožkou.

Peptidy podle tohoto vynálezu je možno obecně připravovat známými postupy. Syntéza pclypeptidů podle tohoto vynálezu se může účelně provádět syntetickým postupem v pevné fázi, který popsal Merrifield v J. A. C. S. S5: 2 149 až 2 154 (1963). Tento postup je dobře znám a představuje obvyklou metodu výroby peptidů. Při syntéze polypeptidů v pevné fázi se postupně přidávají chráněné aminokyseliny k rostoucímu peptidovému řetězci, který je vázán kovalentní vazbou k částici pevné pryskyřice. Při tomto postupu se reakční činidla a vedlejší produkty odstraňují filtrací a tím se eliminuje nutnost čistit meziprodukty. Obecný princip této metody závisí na připojení první aminokyseliny řetězce k pevnému polymeru prostřednictvím kovalentní vazby.

Následující chráněné aminokyseliny se přidávají po jedné (stupňovitá strategie) nebo po blocích (segmentová strategie), dokud se nesloží celá požadovaná sekvence.

Nakonec se chráněný peptid oddělí od pevného pryskyřičného nosiče a chránící skupiny se odštěpí.

Jako pryskyřice pro připojování aminokyselin se může použit jakéhokoliv vhodného polymeru. Pryskyřice musí obsahovat funkční skupinu, k níž lze kovalenrní vazbou pevné připojit první chráněnou aminokyselinu. K tomuno účelu se hodí různé polymery jako je například celulóza, pclyvmylalkohcl, polymethylmetakrylát a polystyren. 7 vhodných chránících skupin, kterých se používá při takové syntéze, je možno uvést terč.butoxykarbonyl (Boc), benzyl (Bzl), terč.amylcxykarbonyl (Aoc), tosyl (Tes), o-bremfenylmethcxy8 karbonyl (3rZ), 2,6-dichlorbenzyl (Bzlci₂) a fenylmethoxykarbonyl (Z nebo CBZ). Další chránící skupiny jsou uvedeny v Merrifieldově publikaci citované výše nebo v publikaci J. F. W. McOmie, Protective Grcups in Organic Chemistry, Plenům Press, New York, 197 3 . Oba dva tyto texty jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Obecný postup výroby peptidů podle tohoto vynálezu zahrnuje nejprve připojení první chráněné aminokyseliny s karboxylovým koncem k pryskyřici. Po tomto připojení se pryskyřice odfiltruje, promyje a chránící skupina (účelně terc.butoxykarbonvlskupina) na α-aminoskupině aminokyseliny s karboxylovým koncem se odstraní. Odstranění této chránící skupiny musí samozřejmě proběhnout bez rozlomení vazby mezi aminokyselinou a pryskyřicí. Následující aminokyselina s chráněnou aminoskupinou a popřípadě chráněným postranním řetězcem se potom připojí k volné α-aminoskupiné aminokyseliny na pryskyřici. Toto připojení probíhá kondenzací, při níž se vytvoří amidová vazba mezi volnou karboxyskupinou druhé aminokyseliny a aminoskupinou první aminokyseliny vázané k pryskyřici. Sekvence těchto kroků se opakuje s následujícími aminokyselinami tak dlouho, dokud nejsou všechny amnokyseliny vázány k pryskyřici. Nakonec se chráéný peptid odštěpí od pryskyřice a zbaví chránících skupin, čímž se získá požadovaný peptidový produkt. Technologie štěpení, které se používá pro odděleni peptidů od pryskyřice a pro odstranění chránících skupin, závisí na volbě pryskyřice a chránících skupin. Obecně se jedná o technologie, které jsou v oboru syntézy peptidů obvyklé.

Alternativní technologie syntézy peptidů jsou popsány v publikaci Bodanszky a další, Peptide Synthesis, druhé vydání (John Wiley and Sons, 1976). Tak namříklad je možno syntetizovat peptidy podle tohoto vynálezu standardními roztokovými postupy syntézy peptidů, při nichž se kondenzují aminokyseliny bud po stupních nebo ve formě bloku nebo peptidových fragmentů, za použití chemických nebo enzymatických metod tvorby amidové vazby [viz například H. D. Jakubke, The Peptides, Analysis, Synthesis, 3iology, Academie Press (New York 1987, str. 103 až 165; J. D. Glass, stejná publikace, str. 167 až 184; a Evropský patent č. 0 324 659 A2, který popisuje enzymatické metody syntézy peptidů]. Tyto postupy syntézy v roztoku jsou dobře známé v tomto oboru.

Peptidy podle vynálezu je také možno vyrábět jinými technologiemi známými v tomto oboru, jako jsou například technologie genetického inženýrství [viz například Samfcrook a další v Molecular Cloning, A Labcratcry Manual, druhé vydáni, Cold Spring Harbor Laboratorv, Cold Spring Harbor, New York (1989) ].

Jako diagnostických a/nebo terapeutických činidel je podle vynálezu možno použít také adičních solí výše popsaných peptidů s kyselinami nebo bázemi. Jako neomezující příklady kyselin, které jsou schopny tvořit soli s těmito peptidy, je možno uvést anorganické kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíkevá, kyselina chlcristá, kyselina dusičná, kyselina thiokyanatá, kyselina sírová, kyselina fosforečná apod. Pro tvorbu soli podle vynálezu je také možno používat organických kyselin, například kyseliny mravenči, kyseliny octové, kyseliny propionové, kyseliny glykolové, kyseliny mléčné, kyseliny pyronroznové, kyseliny štavelové, kyseliny malonové, kyseliny jantarové, kyseliny maleinové, kyseliny fumarové, kyseliny citrónové, kyseliny sukcinamové, kyseliny antranilové, kyelinv skořicové, kyseliny naftale.nsulfonové, kvselir.v sulfanílevč oood.

Jako neomezující výčet bází, které jsou schopny vytvářet soli s těmito peptidy obsahujícími kyselé skupiny, je možno uvést anorganické báze, jako hydroxid sodný, hydroxid amonný, hydroxid draselný apod. Z organických bází, které se hodí pro toto použití, je například možno uvést mono-, di- a trialkyla arylaminy (například triethylamin, diisopropylamin, raethylamin, dimethylamin) a popřípadě substituované ethanolaminy (například ethanolamin a diethanolamin). Na uvedené organické báze se vynález přirozeně neomezuje.

Peptidy podle vynálezu a přípravky na jejich bázi překvapivě vykazují řadu regulačních účinků na imunitní a/nebo centrální nervový systém savců. Tak například je možno peptidů podle tohoto vynálezu používat k léčbě autoimunních poruch a stárnutí, jakož i jiných stavů, pro něž je charakteristické narušení imunitního systému.

Díky imunomodulačním vlastnostem jsou peptidy podle vynálezu terapeuticky užitečné při léčbě lidí a možná i zvířat, poněvadž jsou schopny vyvolávat změny imunitního systému savců.

Peptidy podle vynálezu mohou být také užitečné jako anxiolytická činidla. Tak například předběžné ošetření pacienta peptidem podle vynálezu múze snížit hladinu faktoru uvolňujícího kortikotropin (CRF), který je mediátcrem stresových reakcí. Peptidy podle vynálezu jsou tedy užitečné pro léčbu depresí a jiných poruch vyvolaných stresem.

Peptidů podle vynálezu je také možno používat pro zmenšení účinků stárnutí na imunitní systém. Jak se v průběhu stárnutí smršťuje thymus, snižuje se hladina thymopoietinu, což je polypeptid pocházející z thymu a v důsledku toho se úměrně zvyšuje stresem indukovaná hladina CRF, aarenokortikotropického hormonu (ACTH) a kortikosteroidů. Podávání peptidů podle vynálezu, které mmají podobnou biologickou účinnost, jako thymopoietin, může pomáhat snižovat vliv stárnutí na neúčinnost nebo špatnou funkci imunitního systému.

Předmětem vynálezu jsou také farmaceutické přípravky, které obsahují jeden nebo více výše popsaných peptidů nebo jejich adičních solí s kyselinami nebo bázemi. Tyto peptidy jejich adiční soli s kyselinami nebo bázemi nebo farmaceuti přípravky na bázi těchto látek lze obecně označit jako užitečné ve všech oblastech, v nichž dochází k problémům s buněčnou imunitou a zejména tam, kde je imunita nedcstatečn

Vynález se také týká způsobu léčby stavů, které jsou následkem narušení imunitního systému a/nebo nervového systému pacienta. Tento způsob se vyznačuje tím, že se pacientovi podává terapeuticky účinné množství alespoň jednoho peptidů nebo farmaceutického přípravku podle vynálezu. Pod pojmem terapteuticky účinné množství se rozumí množství, které účinně léčí výše uvedené poruchy.

Při výrobě farmaceutických přípravků podle vynálezu se peptidy podle vynálezu, které představuji účinnou složku, mísí na homogenní směs s farmaceuticky vhodnými nosiči. Pří tomto míšení se používá technologií, které jsou obvyklé ve farmaceutickém průmyslu. Nosič může nabývat různých podob, v závislosti na požadované formě podávání přípravku, která může být například orální, sublinguální, rektální, nasální nebo parenterální.

Při výrobě přípravků podle vynálezu v přednostní orální dávkovači formě se může používat jakýchkoliv obvyklých farmaceutických medii. Pro orální kapalné přípravky (například suspenze, elixíry a roztoky) se jako těchto médii může například používat vody. olejů, alkoholů, ochucovadel, konzervačních látek, barvících činidel apod. Pro výrobu pevných dávkovačích forem pro orální podávání (jako jsou například prášky, kapsle a tablety) se může používat nosičů, jako jsou škroby, cukry, ředidla, granulační činidla, mazadla, pojivá, bubřidla apod. Také se může používat forem s regulovaným uvolňováním. Díky snadnosti podávání, představují tablety a kapsle nejvýhodnéjší orální dávkovači jednotkovou formu a v tomto případě se přirozeně používá pevných farmaceutických nosičů. Tablety mohou být popřípadě opatřeny cukernými nebo enterickými povlaky. Potahování tablet se provádí standardními technologiemi.

U přípravků vhodných pro parenterální podávání bude ncsič obvykle obsahovat sterilní vodu, přestože se mohou přidávat i jiné přísady, například pro usnadnění rozpouštěni nebo jako konzervační činidla. Také je možno vyrábět injekční suspenze a v tomto případě se používá vhodných kapalných nosičů, suspenzních činidel apod.

Pentapeptidy podle vynálezu jsou obvykle účinné při parenterálním podání v množství nad asi 0,5 mg na kg tělesné hmotnosti, až do asi 10 mg na kg tělesné hmotnosti.

Peptidy podle vynálezu jsou účinnější při orálním podávání, než při parenterálním podávání. Je tomu tak pravděpodobně z toho důvodu, že se ze střev absorbují do proudu krve delší dobu, přibližně 6 až 8 hodin. V průběhu této absorpční periody se účinně absorbuje přibližně 30 % peptidů. Naproti tomu, je-li už léčivo v krvi, má krátký poločas životnosti, poněvadž se odstraňuje vylučováním v ledvinách. Peptidy podle dosavadního stavu techniky vykazovaly čistou absorpci přibližně 15 %. Peptidy podávané parenterálné se z těla odstraňuji rychleji, než peptidy podávané orálně.

Peptidy podle vynálezu jsou při orálním podání obvykle ucmne v množstvu od asi 0,02 do asi 10 mg/kg telesne hmotnosti, přednostně v množství asi l mg/kg tělesné hmotnosti. Tato úroveň účinnosti činí tyto peptidy obzvláště vhodnými pro farmaceutické přípravky pro orální podávání, jejichž jednotkové dávkovači forma má velikost tablet.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakte a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují. Pokud není uvedeno jinak, rozumí se v příkladech pod díly díly hmotnostní. V příkladech se používá následujících zkratek: TFA = kyselina trifluoroctové; HOAc = kyselina octová; CH₂C1 = methylenchlorid; CH^CN = acetonitril; DMF = dimethylformamid; NH^OAc = octan amonný; NH₄0H -- hydroxid amonný; n-PrOH = n-propanol; n-3uOH = n-butancl; Pyr = pyridin; DCC dicyklohexylkarbodiimid; H03t = 1-hydrcxybenzotriazol; DMA? dimethylaminopyridin; HF = fluorovodík; TCA = kyselina trichloroctová; BKA = benzhydrylaminová pryskyřice; p-M3HA = p-methylbenzhydrylaminová pryskyřice a MeOH = methanol. Jiných standardních zkratek se používá v souladu s běžnou praxí, viz například The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, sv. 1 a 2, vyd. E. Gross a J. Meienhofer, Academie Press (New York 1987) a IUPAC-IUB Comission on Biochemical Nomenclature, J. 3iol. Chem., 242: 6 4S9 až 6 497 (1970) a J. Biol. Chem. 250: 3 215 až 3 215 (1975). Symbolu Asx se používá pro označení přítomnosti Asn, který je po analýze detegován jako Asp.

Příklady Provedeni vynálezu klad 1

Syntéza' acetyl-Ar

Prc-Asp-Prc-Phe-NHj ID No: 1

Pentapeptid-amid se syntetizuje za použiti kondenzační techniky se symetrickým anhydridem s výjimkou argininu, kter se kondenzuje za použití postupu s DCC-HOBt podle standardních předpisů pro tuto kondenzaci (Std 1 cyklus, verze 1.40) v syntetizátoru peptidů Applied Biosystems AB1 430A. Syntéza se zahájí za použiti 0,45 mmol hydrochloridu p-rnethylbenzhydrylaminové pryskyřice (0,710 g, 0,64 mmol/g pryskyřice). N-terminální skupina Boc se odstraní pomocí programu end-NH2 (verze 1.40). Výsledný peptid se acetyluje acetanhvdridem (1,0 mi) v dichlormethanu (9 mi) s obsahem 4dimethylaminopyridinu (15 mg) po dobu 2 0 minut. Potom se pryskyřice promyje dimethylformamidem (5 x 10 ml) a dichlcrmethanem (5 x 10 ml) a nakonec se usuší ve vakuové sušárně při 40 °C (výtěžek je 1,073 g).

Peptid se odštěpí od pryskyřičného nosiče (1,07 g, 0,45 mmol) mícháním v kapalném fluorovodíku (10 ml), m-methylanisolu (1 ml) a dimethylsulfidu (l ml) po dobu 1 hodiny při 0 °C. POtom se nadbytek fluorovodíku odstraní za sníženého tlaku a směs pryskyřice s peptidem se extrahuje etherem (3 x 50 ml). Etherové extrakty se vyhodí. Uvolněný peptid se extrahuje 20¾ vodnou kyselinou octovou (3 x 33 ml). Po odstranění rozpouštědel za sníženého tlaku se zbytek rozpust ve vodě (40 ml) a lyofilizuje (výtěžek je 0,248 g). Tato pevná látka se rozpustí ve vodě (10 ml) a nechá projít sloupcem ionexové pryskyřice Amberlite IRA-63 v acetátové formě (60 g, 1,6 mekv./ml, délka kolony 18 cm, vnitřní průmě 2,73 cm ) ve vodě, průtokovou rychlostí 60 ml/h. vhodné frakce se spoji a lyofilizují (výtěžek je 0,240 g).

Surový peptid (0,240 g látky rozpuštěné ve 4 ml pufru A /viz dále/) se přečistí preparativní RP-KPLC za použiti kolony Vydac 218TP1022 (22 x 250 mm). Použije se následujících mobilních fází:

A = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové ve vodě

Β = 0,1% roztok kyseliny trifluoroctové ve směsi acetonitrilu a vody v objemovém poměru 4 : 1

Použije se lineárního gradientu od 5 do 23 % 3 v průběhu 30 minut, při průtokové rychlosti 14 ml/mín. Relevantní frakce se spoji a organická rozpouštědla se odstraní za sníženého tlaku. Vodný zbytek se lyofilizuje (výtěžek je 206 mg) .

Dále se provádí chromatografie na tenké vrstvě (TLC) za použití desek se silikagelem (5 x 10 cm, Merck F-254) za použití následujících rozpoustědlových systémů (poměr rozpouštědel je vyjádřen objemově):

Rf(l) = 0,17 (n-butanol:kyselina octová:voda, 4:1:1)

Rf ( 2 ) = 0,47 (n-butanol:kyselina octová: ethylacetát: voda , 1:1:1:1)

Rf ( 3 ) = 0,65 (n-butanol: kyselina octová : pyridin : voda ,

5:4:2:2).

Analýza aminokyselin (AAA):

Výtěžek [nalezeno (vypočteno)) je Arg 1,02 (1), Pro 1,93 (2), Asp 0,99 (1), Phe 1,02 (1), NH- 1,04 (1)

Hmotnostní spektrometrie za použití metody FA3, t.j. Fast Atom Bombardment (FAS-MS): [MH~j při m/z 67 2 a.m.u. (mol. hmotnost 671,76), kde MH^r představuje kladný hmotnostní ion, m/z představuje hmotnost/náboj a a.m.u. představuje atomární hmotnostní jednotky.

Příklad 2

Syntéza acetyl-Arg-?rD-Asp-Pro-Tyr-NH2 [3EQ iD No: 2j

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje zpuscnem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poloze 5 Phe nahradí Tyr Výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC: Rf (1) = 0,20, Rf(2) = 0,33,

AAA: Arg 1,06 (l), Pro 1,99 (2), NH₃ 1,19 (1)

FAB-MS: (MH’¹'] při m/z 63 3 a.m.u.

P ř í k 1

Rf (3) = 0,35

As? 1,03 (1), Tvr 0,92 (1) , (mol. hmotnost 587,76).

ad 3

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Asn-?ro-?he-NH₂ (SEC ID No: 3]

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poloze 3 Asp nahradí Asn Výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC: Rf (1)

0,22, Rf ( 2) = 0,56, Rf(3) = 0,72

AAA: Arg 1,02 NH₃ 1,95 (1) , Pro 1,57 (2) (2)

Asx 1,01 (1) , Phe 1,01 (1),

FAS-MS [MH'^r] při m/z 671 a.m.u (mol. hmotnost 670,78).

Příklad 4

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Asn-Pro-Tyr-NHj [SEQ ID No: 4)

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poloze 3 Asp nahradí Asn a v poloze 5 se Phe nahradí Tyr. Výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC:	Rf (	1) = c	b2,	Rf(2) - 0,	,36, Rf(3} = 0,83
AAA:	Arg	1,07	(i).	, Pro 1,93	(2) , ASX 1,04 (1) ,
	ΝΗβ	1,92	(2)
FA3-	MS:	[MH⁺]	při	m/z 637 a.	,m.u. (mol. hmotnes

Příklad 5

Syntéza acetyl-A.rg-?ro-Ala-Pro-Phe-NK₂ [SEQ ID No: 5j

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poloze 3 Asp nahradí Ala Výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC: Rf (1) = 0,13,	, Rf(2) = 0,49
AAA: Arg 0,98 (1)	, Pro 1,97 (2)
nh₃ 1,00 (1)
FAB-MS: [MH*j při	m/z 628 a.m.u

Rf (3) = 0,69

Ala 1,03 (1), Phe 1,02 (1) , (mol. hmotnost 62/,/0/.

Příklad 6

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Ala-?ro-Tyr-NH₂ [SEQ ID No: 6]

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poleze 3 Asp nahradí Ala a v poloze 5 se Phe nahradí Tyr. výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC: Rf (1) =	0,15, Rf(	2) = 0,32,	Rf (3 )	= 0,71
AAA: Arg 1,04	(1), Pro	1,56 (2),	Ala 0	,99 (1), Tyr 1,02 (1),
NH₃ 1,03	(1)
FAB-MS: [MH⁺]	při m/z	644 a.m.u.	(mol.	hmotnost 643,75).

Příklad 7

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Glu-Pro-Phe-NR- [STQ ID No: 14 j

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poloze 3 Asp nahradí Glu Výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC: Rf(l) = 0,26, Rf(2) = 0,58, Rf(3) = 0,74

AAA: Arg 0,97 (1), Pro 2,03 (2), Glu 1,01 (1), Phe 1,00 (1), NH₃ 1,02 (1)

FAB-MS: [ΜΗ⁺] při m/z 686 a.m.u. (mol. hmotnost 685,75).

Příklad 9

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Ser-Prc-Phe-Nl·^ ]SFQ ID No: oj

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poloze 3 Asp nahradí Ser Výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC: Rf(l) = 0,23, Rf(2) - 0,52, Rf(3) = 0,7S

AAA: Arg 1,01 (1), Pro 2,00 (2), Ser 0,62 (1), Phe 0,S9 (i),

ΝΚ_ί 1,15 (1)

FA3-MS: ΓΜΗ“] při m/z 644 a.m.u. (mol. hmotnost 643,7c;)

Příklad 10

Syntéza acetyl-Arg-?ro-Thr-?rc-?he-NH₂ [SEQ ID No: 91

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poloze 3 Asp nahradí Thr Výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC: Rf(l) = 0,13, Rf (2) = 0 (3) =

AAA: Arg 1,00 (1), Pro 2,00 (2), Thr 0,S2 (1), Phe 1,15 (1), NH₃ 1,19 (1)

FAB-MS: [MH~] při m/z 658 a.m.u. (mol. hmotnost 657,78).

Příklad

Syntéza acetyl-Arg-?ro-Thr-Fro-Tyr-NH₂

1 [SFQ ID Nc: 10)

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poloze 3 Asp nahradí Thr a v poloze 5 se Phe nahradí Tyr. Výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC: Rf (1) = 0,13, Rf ( 2) = 0,43, Rf(3) = 0,56

AAA: Arg 1,00 (1), Pro 2,00 (2) NH. 0,93 (1)

Thr 0,87 (1), Phe 1,00 (1),

FAB-ΜΞ [ΜΗ’) pří n/z 674 a.m.u. (mel, hmotnost 673,/S).

Příklad 12

Syntéza acetyl-Arg-?ro-Ser-?ro-Tyr-NH₂ [SFQ ID No: II j zuje způsobem! popsaným v poloze 3 Asp nahradí Výsledný peptid má

Tento pentapeptid-amid se synteti v příkladu 1, s tím rozdílen, že se Ser a v poloze 5 se Phe nahradí Tyr. následující vlastnosti:

TLC: Rf (1) = 0,29, Rf (2 ) = 0,65, Rf (3 ) = 0,S2

AAA: Arg 1,03 (1), Pro 1,95 (2) NH₃ 1,20 (1)

Ser 0,6 5 (1) , Ty:

FAB-ΜΞ: [MH*] při m/z 660 a.m.u. (mol. hmotnost 659,75)

Příklad 13

Syntéza acetyl-Arg-Prc-Asp-Prc-pClPhe-NH·, [SEQ ID No: 12)

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poloze 5 Phe nahradí

p-chlor-Phe.	Výsledný peptid má	následující vlastnosti:
TLC: Rf (1) =	0,19	, Rf(	2) = 0,	,49	, Rf (3 ) = 0,66
AAA: Are 1,00	(1)	, Pro	1,59 i	)2)	, Asp 0,97 (1), pdPhe 1,04 (1),
Nh\ 1,0 2	(1)
FAB-MS : ’ MH’ '	*jř· -i	Ti ' 2	06 a		u . (no¹ . hroor.mcs t 706.29 ).

Příklad 14

Syntéza butyryl-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH- ÍSFQ ID No: 151

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 1, s tím rozdílem, že se v poloze 3 Asp nahradí Asn. N-terminálni skupina Boc se odstraní pomocí programu end-Nl·^· N-terminální butvrylskupina se zavede kondenzací s kyselinou n-máselnou za použití diisopropylkarbodiimidu a HOBt.

Výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC: Rf (1) = 0,32

AAA: Arg 1,01 (1) NH₃ 1,98 (2)

FAB-MS: [MH⁺] při

Rf(2) = 0,65, Rf ( 3) = 0,34

Pro 1,98 (2), Asx 1,02 (1), Phe 1,00 m/z 699 a.m.u. (mol. hmotnost 698,83

Příklad 15

Syntéza dekanoyl-Arg-?rc-Asp-?ro-?he-NH₂ [SEQ ID Nc: 13j

Tento pentapeptid-amid se syntetizuje v podstatě způsobem popsaným v příkladu 1 s následujícími modifikacemi: Syntéza peptidů v pevné fázi se zahájí s 5 mmol benzhydrylaminové pryskyřice a po postupném zavedení aminokyselin se odstraní N-terminální skupina Boc. Výsledný produkt peptid-pryskyřice se nechá reagovat s kyselinou děkanovou v dimethylformamidu obsahujícím hydroxybenzotriazol a diisopropylkarbodimid.

Potom se pryskyřice promyje a vysuší (výtěžek je 11,17 g).

Peptid se odštěpí od pryskyřičného nosiče za použití kapalného fluorovodíku, způsobem popsaným v příkladu 1.

Surový peptid (1,3 g) se po výměně iontů přečistí preparativní

RP-HPLC, za použití stejných mobilních fází, jako v příkladu 1. Použitý gradient je 25 až 50 % 3 v průběhu 100 minut, při průtokové rychlosti 14 ml/min. Výrěžek čistého produkru je 1,19 g. Výsledný peptid má následující vlastnosti:

TLC: Rf (1} = 0	, 30,	, Rf(2) = 0,64, Rf(3)	= 0,32
AAA: Arg 1,39	(1),	, Pro 2,00 (2 ), Asp 0,	CG í -¹ 7hs * I Π { '
NH₂ 1,07	(1)
FA3-MS: ^r 1	-> >· Ί U J_ -l.	rc/z 785 a.m.u. (mol.	7 - í. “ ·
		Příklad	1 6

Syntéza v rcztokové fázi acetyl-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NPA [SEQ ID No: 1]

Tento pentapeptid-amid se také syntetizuje roztokovým postupem, který je popsán dále.

A. Boc-Pro-Phe-NH.

K rozteku Boc-?ro-OH (4,304 g, 20 mmol) v ethylacetátu (200 ml) se při -15 °C přidá N-methylmorfolin (2,2 ml, 20 mmol) a isobutylchlorformiát (2,6 ml, 20 mmol). Pc aktivační době 10 minut při -15 °C se přidá roztok HCl.?he-NH₂ (4,14 g, 20 mmol a N-methylmorfolinu (2,2 ml, 20 mmol) v dimethylformamidu (20 ml). Reakční smés se 30 minut míchá při -li

při	-15 °C
se	'Λ
se	rozloží
rě	vrstvy,

10% roztokem uhličitanu draselného (30 ml). Dvě které vzniknou, se převedou do dělící nálevky a organická vrstva se Dostupně oromyje 10% roztokem uhličitanu draselného (2 x 30 ml), nasyceným roztokem chloridu sodného (i x 30 ml),

IN kyselinou chlorovodíkovou (2 x 30 ml) a nasycceným roztokem chloridu sodného (2 x 30 ml). Organický roztok se vysuší bezvodým síranem sodným, přefiltruje a zkoncentruje v rotačním odpařováku za použiti rozvedeného vakua. Produkt se vysráží hexanem, odfiltruje a vysuší. Výtěžek je 6,795 g (teoretický výtěžek je 7,229 g, dosáhne se tedy 94 % teorie).

3. HCl.?ro-Phe-NH₂

K roztoku Boc-Pro-?he-NH₂, připraveného způsobem popsaným v odstavci A) (6,506 g, 13 mmol) v ethylacetátu (50 ml) a ledové kyselině octové (25 ml) se přidá 5N roztok chlorovodíku v ethylacetátu (20 ml) a anisol (2 ml). Roztok se 1 hodinu míchá a potom zkoncentruje v rotačním odpařováku. Hydrochloridová sůl dipeptidu se vysráží přídavkem etheru (200 ml). Pevná látka se odfiltruje a za vakua vysuší nad peletami hydroxidu draselného.

C. Boc-Asp(OBzl)-Pro-Phe-NH₂

Směsný anhydrid, vyrobený reakcí 3oc-Asp(OBzl) (5,32 g, 13 mmol), N-methylmorfolinu (1,98 ml, 13 mmol) a iscbutvlchlorformiátu (2,34 ml, 18 mmol) v ethylacetátu (200 ml) při -15 °C, se nechá reagovat s roztokem HC1.Pro-?he-NH₂ (připraveného způsobem posaným v odstavci B) a N-methylmorfolinu (1,98 ml, 18 mmol) v dimethylformamidu (40 ml).

Reakce se nechá probíhat 30 minut při -15 ^cC a 2 hodiny při teplotě místnosti. Reakční směs se zpracuje způsobem popsáními výše a získaný produkt se přesráží hexanem z ethylacetátu. Výtěžek je 9,76 g (teoretický výtěžek je 10,20 g, dosáhne se tedy 95,7 % teorie).

D. 3oc-?ro-Asp(OBzl)-?ro-?he-NH₂

Produkt Boc-Asp(OBzl)-Pro-Phe-NH₂, připraveny způsobem popsaným v odstavci C (9,067 g, 16 mmol) se zbaví chránících skupin za použití ethylacetátového chlorovodíku, způsobem popsaným v odstavci 3 a hydrocnloridová sůl tripeptidu se vvsráží etherem, odfiltruje a vysuší.

Směsný anhydrid, vyrobený reakcí Boc-Pro (3,44 g, 16 mmol), N-methylmorfolinu (1,76 ml, 16 mmol) a isobutylchlcrformiátu (2,OS ml, 15 mmol) v ethylacetátu (160 ml), se nechá reagovat s roztokem HCl.Asp(OBzl)-?rc-?he-NK₂ a Nmethvlmorfolinu (1,76 ml, 16 mmol) v dimethylformamidu (30 ml). Reakční podmínky a zpracování produktu jsou popsány výše. Produkt vvkrystaluje ze směsi eohylacetátu a hexanu. Výtěžek je 10,09 g (teoretický výtěžek je 10,62 g, dosáhne se tedy 95 % teorie).

E. Z-Arg-?ro-Asp(OBzl)-?ro-Phe-NH₂

Produkt Boc-Pro-Asp(OBzl)-?ro-?he-NH₂, připravený způsobem popsaným v odstavci D (9,96 g, 15 mmol) se zbaví chránících skupin za použití ethylacetátového chlorovodíku, způsobem popsaným v odstavci B a hvdrochloridové sůl tetrapeptidu se vysráží etherem, odfiltruje a vysuší.

K míchanému rozteku Z-Arg.HCl (5,17 g, 15 mmol) v dimethylformamidu (25 ml) se při 25 °C přidá roztok HCl.Pro-Asp(OBzl)-Pro-Phe-NH- a N-methylmorfolinu (1,65 ml, mmol) v dimethylformamidu (25 ml). K výslednému roztoku se přidá diethylkyanofosfonát (2,45 g, 15 mmol) a N-methylmorfolin (1,65 ml, 15 mmol) a směs se 4 hodiny míchá.

Reakční směs se rozloží přídavkem 10% vodné kyseliny octové (10 ml) a rozpouštědla se odpaří v rotačním odpařeváku za sníženého tlaku. Výsledná pevná látka se trituruje s 10% roztokem uhličitanu draselného a potom s vodou a odfiltruje.

’^τό·4ό 9 λ'v * Γ1 CG. l v * 4 Ί - r t » A -i· ^·. V -i .*. * t C* *1 ' J j ς LuA. *_ LU , U V V vCuCA jC , C· , dosáhne se tedv S0 % teorie).

F. Acetyl-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NHj [SEQ ID Nc: 1)

K roztoku produktu Z-Arg-?ro-Asp(OBzl)-Pro-Phe-Nr^, připraveného způsobem popsaným v odstavci E (11,10 g, 13 mmol) v kyselině octové (50 ml), se přidá 20% hydroxid palladia na uhlíku (1,0 g) a směs se hydrogenuje plynným vodíkem za tlaku 309 kPa. Průběh reakce se sleduje chromatografií na tenké vrstvě (TLC) a po jedné hodině se katalyzátor odfitruje a rozpouštědla odpaří za sníženého tlaku. Získá se Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NHj· Zbytek se rozpustí ve vodě (50 ml a lyofilizuje).

Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH2 se rozpustí v kyselině octové (20 ml) a na roztok se působí za konstantního míchání acetar.hydridem (6,12 g, 60 mmol). Po jedné hodině se reakční směs rozloží přídavkem vody (20 ml) a rozpouštědla se oddstraní za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí ve vodě (50 ml a lyofilizuje.

Takto získaný surový peptid se přečistí preparativní RP-HPLC způsobem popsaným v příkladu 1. Produkt se lyofilizuje do konstantní hmotnosti (obsah peptidu je 90 %). Výtěžek je 7,56 g (teroretický výtěžek je 8,73 g, dosáhne se tedy 77,9 % teorie). Získanou sloučeninu nelze odlišit od produktu získaného v příkladu 1.

Příklad 17

Zkoušení enzymatické stability

Ό >“ t ΊΊΐΤΓ“·*··*··“,**'·! ι^Λ·*'·^ν-,ΐ1·ί·^·’Γ Ύ—, ί— Κ' > -Ů , , 1 » » 1. -i. 1 ’ 7 C Ά >· X > Ο Λ

Α- χ C ύ U k·¹ 1 U - _ 2 LA — V7 V jj j i Ui + V- i J. wO <C. kV J_ V «Or následující zkouška:

Thymopentin a peptid acetvl-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-ΝΉ-,, označený názvem IRI-514 se odděleně rozpustí ve fosfátovém pufru o ρΗ 5,5. Dvanáctník krysy se otevře a upevní v 3,5 mi dífuzní cele (Crownglass, N. J., USA), přičemž v obou komorách je pufr. Zvolený zkoušený peptid ve fosfátovém pufru o pH 5,5 se přidá do obou cel, až do konečné koncentrace 1 mg/ml a vzorky se odebírají v čase 0 a po 2 a 4 hodinách. Alikvotní vzorky se podrobí vysoce výkonné kapalinové chromatograf ii (HPLC) s ultrafialovou detekcí při 220 nm. Rozpouštědlovým systémem pro thymopentin je fosfátový pufr a methanol. Pro IRI-514 se jako rozpouštědlového systému použije acetonitrilu a fosfátového pufru.

Jak je zřejmé ze sloupcového grafu na obr 1, v čase 0 h je thymopentin (TP-5) a IRI-514 ze 100 % neporušen. Po 2 hodinách je IRI-514 stále ještě přibližně ze 100 % neporušen, zatímco zůstalo pouze 20 % neporušeného TP-5. Nakonec, po 4 hodinách, množství neporušeného IRI-514 činí přibližně 90 %, zatímco množství neporušeného TP-5 je zanedbatelně. Navíc existuje důvodný předpoklad, že pokles množství neporušeného IRI-514 po 4 hodinách je způsoben absorpcí do tkáně dvanáctníku, poněvadž při HPLC nebyly naměřeny žádné píky degraaačních produktů.

Příklad 1S

Neuromuskulární zkouška

Touto zkouškou se měří schopnost peptidu ovlivňovat chclinergickou transmisi v neuromuskulárním spojení. Je známe, že thymepoietin a thymopentin mají tento účinek na neuromuskulární transmisi.

Různé dávky zkoušeného oeotidu se rozoustí v roztoku chloridu sodného tlumeném fosfátovým pufrem a roztoky se subkutánně vstříknou nebo orálně podají myším samicím o hmotnosti 25 až 30 g (kmen CD1). Provede se elektromvografické stanovení způsobem popsaným v G. Goldstein a další, J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 31: 453 až 459 (1963), 24 nebo 48 hodin po podání tohoto peptidu. Myši se anestetizují 0,5 ml 10% roztoku urethanu. Nerv se stimuluje pomocí stimulátoru Grass S-48 a stimulové izolační jednotky Grass SIU-5A (Grass Medical Instruments, Quincy, MA) a elektromyografická odpověď se zaznamenává osciloskopem s pamětí (Tektronix Storage Oscilloscope-5111), který je připojen k diferenciálnímu zesilovači 5A21N a časové bázi 5B10N (Tektronix, Beaverton, OR). Pří supramaximální nervové stimulaci (30 impulzů za sekundu) se vyjádří výška desátého svalového akčního potenciálu jako procentický podíl prvního svalového akčního potenciálu. Hodnoty P pro zkoušení statistických odchylek mezi kontrolními a zkoušenými sloučeninami se vypočítají pomocí testu Dunnetťs two-tailed t-test (Dunnettův t-test se dvěma větvemi). Na obr. 2 je znázorněn vliv orální dávky IRI-514 na odpověď neuromuskulární transmise při prahové dávce 0,05 mg/kg.

Příklad 19

Regulace anti-CD3-stimulovaných tlumivých T-bunék (T-supresorů)

Samice myší NZ3 x NZW F1, zakoupené oč firmy Jackscn Laboratories (Bar Harbour, ME) se po 6 umísrí na podestýlce v klecích zhotovených z krabic od bot. Potrava a voda se zvířatům poskytuje ad libítum. Po uzavření zkoušení se zvířata humánním způsobem usmrtí oxidem uhličitým.

Před usmrcením se myší ošetří zkoušenými pepridv podle jednoho ze dvou předpisů. Podle předpisu A se myším podávají peptidy rozpuštěné v baktericstatické vodě pro injekce v dávce 1 mg/kg subkutánně, 1 x za týden, po dobu 4 týdnů, počínaje 4. týdnem věku. Podle předpisu B se myším o stáří 7 týdnů podají 4 injekce o dávce 1 mg/kg subkutánně, v průběhu 4 po sobě následujících dnů. Všechna zvířata se usmrtí, za účelem stanovení aktivity T-supresorů v den, který následuje po poslední injekci.

Za aseptických podmínek se zvířatům odebere slezina a ze slezin jednotlivých zvířat se vyrobí suspenze individuálních buněk protlačením sleziny přes síto 60 mesh (otvory 256 um) a suspendováním vzniklých buněk v kultivačním prostředí pro tkáně, RPMI 1640 s 25 mM pufru Hepes, 10 % fatálního telecího séra, 2 % pyrohroznanu sodného, 1 % neesenciálních aminokyselin NEN, 1 % L-glutaminu (všechny reagencie pocházejí od firmy Gibcc, Grand Island, NY), 1 % β-merkaptoethanolu (Sigma, St. Louis, MO) a 0,05 % gentamicinu (Flow, McLean, V.A.).

Supresorové buňky pro mitogenem stimulovanou prcliferativní odpcvěd T-buněk se generují v 3 5 mm jamkách pro tkáňové kultury (Corning, Corning, NY), potažených anti-CD3 (klon 145-2C11, Boehringer Mannheim, Indianapclis, IN), zředěným na koncentraci 0,5 ug/ml v roztoku chloridu sodného, pufrovaném borátem na pH 8,5, Desky s jamkami se inkubují při teplotě místnosti po dobu 4 hodin a před přidáním buněk se 3 x opláchnou Hanksovým vyváženým solným roztokem. Do každé jamky se přidají 2 ml suspenze splenocvtů o koncentraci 5 x 10® buněk/ml z jednotlivých zvířat a kultury se inkubují po dobu 48 hodin v 5¾ oxidu uhličitém při 37 °C. Stimulované kultury se sklidí a koncentrace buněk se nastaví na hodnotu 1,25 x 10® buněk/ml pro přidání ke kultuře, v níž se 2kousí potlačování (suprese) při 25 % respondujíciho počtu buněk. Potlačování prbliferace T-bunék se měří v kulturách, které byly stimulovány mitogenem po dobu 4S hodin (0,25 pg/ml

a.nti-CD3, Boehringer, Mannheim) obsahujících 5 x 10-⁵ čerstvých syngeneických splenocytú a 1,25 x 10 ³ zkoušených buněk. Všechna měření se 3 x replikují na deskách s 96 jamkami. Posledních 7 hodin se jamky ošetřují v pulzech 1 |iCi [ ³H ] thymidinu (NEN Research Product, Chadds Ford, PA). Sklizen se provádí na filtračních podložkách (Pharmacia, Turku, Finsko) a počítání se provádí na kapalinovém scintilačním počítači LK3 1205 Betaplate.

Na obr. 3 jsou sumarizovány 4 experimenty, které ukazují, že buňky získané ze zvířat ošetřovaných IRI-514 (acetyl-ArgPro-Asp-Pro-Phe-NH₂), bud každý den v průběhu 4 dnů (předpis B) nebo 1 x za týden v průběhu 4 týdnů (předpis A) jsou při této zkoušce účinnějšími generátory supresorovycn buněk, ve srovnání s buňkami, které byly získány ze zvířat ošetřovaných pouze vehikulem (placebem). Každý symbol představuje jinou skupinu zvířat. Prázdné symboly představují kontrolní hodnoty. Černé symboly představují hodnoty získané za použití buněk získaných z ošetřovaných zvířat.

Přiklad 20

Účinek IRI-514 na behaviorálni odpověď u krys, u nichž byla předem vyvolána sociálním stresem úzkost

Expozice savců sociálnímu stresu má za následek aktivaci osy hypotalamus-podvěsek mozkový-nadledvina (HPA), změny v emocionalitě a zvýšenou úzkost. To lze studovat na krysách zkoušením chování stresovaných zvířat v bludišti eievated plus maze. Bludiště se skládá ze dvcu větví se stěnami o výšce 40 cm (uzavřené větve) a ze dvou větví beze stěn (otevřené větve). Zatímco normální, nestresovaná zvířata stráví srovnatelnou dobu při průzkumu každé z větvi bludiště, zvířata, která vykazuji zvýšenou úzkost a změny v emociona30 lite ztrácí podstatně kratší dobu průzkumem otevřených větvi bludiště.

Pří navezení sociálního stresu typu rezident-vetřelec se krysí samec, který je vetřelcem, umístí do domovské klece agresivního samce, který je v kleci rezidentem. Přitom dochází k interakci, při níž obvykle dominuje rezidentní krys Poražená zvířata vykazují zvýšenou hladinu hormonů pocházejících z osy HPA a zvýše.ncu úzkost stanovenou testem, v bludišti (plus-maze test).

Při těchto studiích se 15 až 17 krysích vetřelců AS hodin před umístěním dc klece rezidentního krysího samce ošetří subkutánním podáním IRI-514 v dávce l mg/kg nebo vehikulem (normální roztek chloridu sodného). Krysí vetřelci se vystaví interakci v průběhu 30 minut. Fyzickému napadení se zabrání tím, že je vetřelec chráněn klecí z plexiskla, čímž se vytvoří model relativně čistého psychologického stresu. Jednotlivá zvířata ošetřená IRI-514 nebo vehikulem se potem umístí do středu bludiště a nechají zkoumat po dobu 5 minut všechny 4 větve bludiště. Pro kontrolu se stejným způsobem zkoušejí také zvířata ošerřená IRI-514 nebo vehikulem, která nebyla vystavena interakci s rezidentním krysím samcem. Doba průzkumu každé z větví bludiště každým zvířenám se měří a zaznamenává automaticky pomocí zařízení s připojeným počítačem.

Jak je zřejmé z obr. 4, kontrolní (nestrescvaná) zvířata, která byla ošetřena vehikulem nebo IRI-514, stráví průzkumem otevřených větví bludiště 47,9 i 7,3 % a 41,3 z 8,3 % (střed ± sem) času. Krysy ošetřené vehikulem, které byly vystaveny sociálnímu stresu, naproti tomu stráví podstatně kratší dobu průzkumem otevřených větví bludiště (26,4 r 5,5 %; střed z sem; p = 0,038). Co však je důležitější, krysy, které obdržely před expozici sociálnímu stresu IRI-514, stráví v otevřených větvích bludiště srovnatelnou dobu s kontrolními, nestresovanými zvířaty (43,8 o 7,9; střed o sem). Celková aktivita krys byla ve všech skupinách podobná.

Tyto výsledky silně podporují předpoklad, že IRI-514 má schopnost zabránit změnám nebo normalizovat změny behaviorálních odpovědi, které jsou spojeny se zvýšenou úzkostí a změněnou emocionalitou po expozici psycho logickému (sociálnumi stresu).

Příklad 21

Účinek IRI-514 na hormony osy HPA po vyvolání úzkosti u krys sociálním stresem

Expozice savců sociálnímu stresu má za nnásledek aktivaci esy HPA a zvýšenou hladinu cirkulujícího kortikotrepinu (ACTH) a kortikosteroidů (COR).

Při modelové zkoušce sociálního stresu typu reziaentvetřelec, se krysí vetřelec umístí do domovské klece agresivního rezidentního samce. To má za následek interakci, při níž se obvykle projeví dominance rezidentní krysy. Poražená zvířata z toho důvodu vykazují zvýšenou hladinu hormonů pocházejících z esy HPA a zvýšenou úzkost.

Při těchto studiích se 13 až 16 krysím vetřelcům voperuje chronicky zabudovaný jugulární katetr, aby se usnadnil odběr krevních vzorků a zvířata se nechají zotavit. Potom se zvířatům, 24 hodin před umístěním do klece rezidentního krysího samce, subkutánně vstříkne IEI-514, v dávce 1 mg/kg, nebo stejný objem vehikula (normální roztok chloridu sodného; tato zvířata jsou označována jako kontrolní). Bezprostředně před expozici zvířat stresujícímu faktoru se jim odebere krevní vzorek, aby se stanovila základní hladina ACTH a COR v plasmě. Potom se krysí vetřelci vystaví po dobu 30 minut agonistické interakci rezidentních samců. Fyzickému napadení se 2abrání ochranou vetřelce pomocí klece z plexiskla, čimž se vytvoří model relativné čistého psychologického stresu. Krevní vzorky se odebírají po 10 a 20 minutách od střetnutí a stanovuje se hladina ACTH a COR.

Výsledky těchto experimentů jsou sumarizovány v tabulce 1. Uvádějí se geometrické středy a rozmezí spolehlivosti (C.l.) hodnot hladiny ACTH COR u kontrolních krys a krys ošetřených IRI-514, naměřené před expozicí stresu a 10 a 20 minut po ní. Základní hladiny ACTH jsou u kontrolních zvířat a zvířat ošetřených IRI-514 podobné (? = 0,2317). U kontrolních krys se periferní hladina ACTH zvýší z 3,4 pg/ml na 56,8 pg/ml za 10 minut expozice stresu a zůstává zvýšená po 20 minutách expozice modelovému sociálnímu stresu. Co je důležitější, u krys ošetřených IRI-5 se po 10 minutách expozice stresu naměří podstatně nižší hodnoty hladiny ACTH (P = 0,0370), t.j. 28,2 pg/ml, ve srovnání s kontrolními zvířaty.

I po 20 minutách expozice stresujícímu faktoru se u zvířat ošetřených IRI-514 naměří nižší hodnoty hladiny ACTH (25,2 pg/ml), ve srovnání s kontrolními krysami (52,5 pg/ml). Posledně uvedený rozdíl však nemá statisticky signifikantní povahu (P = 0,0788). V hladině COR před a po expozici stresujícímu faktoru se u kontrolních zvířat a u zvířat ošetřených IRI-514 nezjiscí žádné rozdíly.

		Tabulka	1
		vehi	kulum	(olacebo)
hormon doba		geometrie-	nižší	vyšší	p-hod-
(min)	N	ký střed	C.I.	C.I.	nota
ACTH základní
hladina	14	3,4	1,5	5,2	0,2817
10	14	c 6,3	40,5	/3,1	0,0370
20		52,5		6 9,3	0,0/88
kortiko-
steron základní
hladina	13	35,5	27,9	43,1	0,1906
10	13	245,7	210,7	280,7	0,7022
20	13	229,2	175,7	2S2,7	0 , 9637
		ΪΡΙ-	514 (1	ma/ko)
hormon doba		geometrie-	nižší	vyšší	p-hod-
{min)	N	ký střed	C.I.	C.I.	nota
ACTH základní
hladina	16	1,5	0,7	2,3	0,2817
10	16	28,2	23,1	33,3	0,0370
20	16	25,2	17,7	32,7	0,0733
kortiko-
steron základní
hladina	15	46,5	3 6,5	56,5	0,1906
10	15	230,9	210,9	250,9	0,7022
20	13	221,5	189,5	253,5	0,9687

p-hodncta představuje randomizovaný blok (dvě větve), založený na logaritmicky transformovaných datech nižší C.I. = geometrický střed - STE vyšší C.I. = geometrický střed - STE

Tyto výsledky silně podporují předpoklad, že IEI-I14 má schopnost potlačovat nebo modulovat zvýšení hladiny hormonů pocházejících z- osy KPA, které je spojeno se zvýšenou úzkostí nebo změněnou emocionalitou po expozici psychologickému (sociálnímu) stresu.

A. Stabilita IRI-514 in vivo

Tato studie byla převáděna, za účelem zkoumání dispozice a farmakekinetiky celkové radioaktivity po jediném intravenčzním (IV) podání ¹⁴C-1RI-514 krysám. Peptid IRI-514 byl syntetizován způsobem popsaným v příkladu 1, přičemž byl do něj zabudován ^^C-Arg, aby bylo možno sledovat sloučeninu prostřednictvím detekce radioaktivních emisí po podání sloučeniny zvířatům. Analýzuje se radioaktivita plasmy a moči, za účelem stanovení dispozičních charakteristik látky odvozené od ¹⁴C-TRI-514 při dvou úrovních dávky, 0,1 a 1 mg IRI-514/kg.

Krysím samcům (tři pro úroveň dávky 0,1 mg/kg a dva pro úroveň dávky 10 mg/kg) se zavedou katetry do jugulární vény, karotidové arterie a močového měchýře. Zvířata se udržují pcd infuzí 5% dextrózv, která se zavádí katetrem do jugulární vény a do močového měchýře se kontinuálně zavádí proplachovací sterilní voda, čímž se stimuluje časté vyprazdňování. Zředěná moč se zachycuje penilním katetrem pomocí sběrače frakcí. Každé zvíře obdrží prostřednictvím

Ί * katetru zavedeného do jugulární vény 10 uCi *'C-IRI-5I4 s neznačeným IRI-514, v celkové dávce bud 0,1 nebo 10 mg/kg. Prostřednictvím katetru zavedeného do karotidové arterie se odebírají krevní vzorky a to před podáním dávky a i, 5, 10, 20, 40 a S0 minut a 2, 4, 6 a 24 hodin pc podání dávky. Zředěná moč se zachycuje v časových intervalech 0 až 5, 5 až 10, 10 až 20, 20 až 40, 40 až 30 a 8 až 120 minut a každých

i.i±nu L·

-5 A or m 1 \ ii*-·» T A K r-3 ·'

Ca il <4 O CA K* J- J ii UA C- w- . .O _ cd dávkv. Vzorkv plasmy a moči, které vykazují dostatečnou radioaktivitu se zkoušejí pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) na obsah rodičovského ¹⁴C-IRI-514, za účelem stanovení rozsahu metabolismu.

Výsledky zjištěné u obou úrovní dávky ukazují, že poločas eliminace (tl/2) je v rozmezí od 25,3 do 23 minut, což vyplývá z dat celkové radioaktivity plasmy pozorovaných u krevních vzorku odebraných v rozmezí od 10 minut do 2 hodin po podání dávky. Plocha pod křivkou závislosti koncentrace v plasmě na čase (AUC), v rozmezí od 0 do 24 hodin, je úměrná podané dávce. AUC po nízké dávce je 0,162 a 0,164 μ9~6^νίvalentú x h/ml a AUC po vysoké dávce je 20,11 a 22,23 pg-ekvivalentů x h/ml. Analýza vzorků plasmy, získaných 0 až 40 minut po podání každé dávky, pomocí HPLC ukazuje na omezený metabolismus při obou úrovních dávky. Ve vzorku odebraném v dobé od 1 do 2 minut po podání dávky představuje rodičovský peptid přibližně 37,9 až 96,4 % celkové radioaktivity, zatímco u vzorku odebraného po 40 minutách od podání dávky představuje rodičovský peptid přibližné 44 až 61,9 % celkové readioaktivity.

Analýza dat získaných z moči při obou úrovních dávky ukazuje, že do 40 minut se eliminuje 38,8 a 67,1 % ; do 2 hodin se eliminuje 73,9 a 82,9 % a do 24 hodin od dávky se eliminuje 86,2 a 94 % rodičovského peptidů a jeho metabolitů. Analýza HPLC ukazuje, že 62,5 až 68,3 % celkové radioaktivity eliminované v prvních 5 minutách, je tvořeno rodičovským peptidem. Ve vzorku odebraném v rozmezí od 40 do 80 minut od dávky se identifikuje jako rodičovský peptid 5,4 až 13,6 % celkově eliminované radioaktivity.

těchto dat lže učinit závěr, že úroveň ceikove radioaktivity IRI-514 a jeho metabolitů v plasmě rychle klesá po IV podání ¹⁴'C-IRI-514, v důsledku vylučování ledvinami. Dispozice a farmakokinetika IRI-514 po IV podání se zdá být nezávislá na dávce (bud 0,1 nebo 10 mg/kg), na základě porovnání hodnot tl/2 v plasmě, AUC a dat vylučování močí. Konečně, v průběhu přítomnosti peptidů v oběhovém systému dochází k jeho omezenému metabolismu.

B. Stabilita dosažena zavedením Pro do polohy 4 peptidů

Způsobem popsaným výše se syntetizuje acetvl-Arg-?rcAsp-Val-Phe-Ní^ a acetyl-Arg-?ro-Asp-?ro-Phe-”H₇ (TP.T-514), přičemž se do nich zavede ^⁴C-Arg, aby bylo možno po podání sloučeniny zvířatům sledovat prostřednictvím detekce radioaktivních emisí. Po intravenózním podání krysám, způsobem popsaným v části A, se v případě obou sloučenin více než 90 % podané radioaktivity deteguje v moči v průběhu 6 hodin.

Moč se potom zkoumá v systému HPLC, který je schopen oddělit neporušenou rodičovskou sloučeninu od produktů jejího rozpadu. V případě acetyl-Arg-Pro-Asp-Val-Phe-Ni^ je přibližně 25 % radioaktivity v moči tvořeno rodičovskou sloučeninou, zatímco v případě acetyl-Arg-Pro-Asp-Pro-PheNH₂ je tvořeno rodičovskou sloučeninou 64 % radioaktivity. Náhrada Pro za Val v poloze 4 uděluje tedy intravenózně podané sloučenině zvýšenou stabilitu v průběhu průchodu tělem a eliminace moči.

Na základě výše uvedeného popisu je možno předložený vynález různým způsobem modifikovat a obměňovat. Mnohé z takových variací a modifikací jsou zřejmé odbrcnikům v tomto oboru. Tak například, různými způsoby je možno vyrábět jiné peptidv spadající do rozsahu výše uvedeného vzorce, které se liší od peptidů uvedených v příkladech. Tyto peptídy je možno podrobit výše uvedenému zkoušení, aniž by musel odborník vyvinout nadměrné experimentální úsilí. Takové modifikace a variace látek a postupů podle vynalezu spadají do rozsahu ochrany, pokud se na ně vztahují následující nároky.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) fřiklašovate:

Immunobiology Research Institute, lne (í i) NÁZEV VYNÁLE Z U

Peptides Useful in Reguiating The immune and Nervous Systems (Peptidy užitečné při regulaci imunitního a nervového systému) (iii) POČET SEKVENCÍ: 15 (iv) ADRESA PRO KORESPONDENCI:

(A)	ADRESÁT:	Howson and Howson
(B)	ULICE:	321 Norristown Road,
(o)	MĚSTO:	Spring House
(D)	STÁT:	PA
(E)	ZEMĚ:	USA
(F)	PSČ (ZIP	'): 19477

(v) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) STŘEDNÍ TYP: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC-kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DCS (D) SOFTWARE: Patentln Release sl.O, verze 1.25 (vi) DATA VZTAHUJÍCÍ SE K PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY:

(B) DATUM PODÁNI:

f /» \ ΤΛΤ τι ητη-Γ'τ·* \ ) ALP-C-Í ΙΛΛ'νί .

(vii) DATA VZTAHUJÍCÍ SE KE DŘÍVĚJŠÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 07/708,085 ,ΤίΉ POLÁN ; 3.

INFORMACE 0 PATENTOVÉM ZÁSTUPCI: ' ^{1 1} ΜΞΝΟ í V- vy £ .

(3/ REGISTRAČNÍ ČÍSLO: 31,215 (C) OZNAČENÍ PŘÍPADU: IR1P-PC42A

INFORMACE 0 TELEKOMUNIKAČNÍM (3) TELEFAX: (215' (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 1 (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (3) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOGIE: lineární (li) TY? MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (3) POLOHA: I (D) JINÉ INFORMACE: /označení^ acetyl /význam- acetyl umístěný na aminozbytku meotidu (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo ( 3) POLOHA: 5

JINÉ INFORMACE: 'cznačení= NrR /význam— NH-, sxupma umístěna konci oeotidu

Karxxv.c' ve;

(xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NC: 1:

Arg-?ro-Asp~?ro-Phe 1 5 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI Č. 2 [SEQ ID NC: 2j (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (3) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 1 (D) JINÉ INFORMACE: /označení^ acetyl /význam= acetyl umístěný na amino-terminélním zbytku peptidu (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= NH*,

z.

/význam= NH₂ skupina umístěná na karbcxylovém konci peptidu (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Arg-?ro-Asp-?ro-Tyr

5 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI Č. 3 [SEQ ID NC: 2] (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

	(A) DÉLKA: 5 aminokyselin
(3) (D)	TYP: aminokyselinový TOPOLOGIE: lineární
(li)	TY? í	MOLEKULY: peptid
(ix)	ZNAK
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo
	(3)	POLOHA: 1
	(D)	JINÉ INFORMACE: /označení^ aoetyl /význam= acetyl je připojen k aminovému konci peptidu
(ÍX)	ZNAK	J
	(A)	JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo
	(B)	POLOHA: 5
	(D)	JINÉ INFORMACE: /označení= NH₂

/význam= NH^ skupina je připojena ke karboxy iovému konci peptidu (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3:

Arg-Pro-Asn-Pro-Phe 1 5 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI Č. 4 [SEQ ID NO: 4j (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (s) TYP: aminokyselinový ,, 2 ) . OPOLOe i £,:' imeami (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikovaně místo (B) POLOHA: 1 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= acetyl /význam= acetyl je připojen k aminovému konci peptidu (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= NH₂ /význam= ΝΗ₂ skupina je připojena ke karbcx lovému konci peptidu (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

Arg-Pro-Asn-Pro-Tyr

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 5 [SEQ ID NO: 5] (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 1 <D) JINÉ INFORMACE: /označení= acetyl /význam= acetyl je připojen k aminovému konci peptidů (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení^ NH₂ /význam= NH₂ skupina je připojena ke karbcx levému konci peptidů (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NC: 5:

Arg-Pro-Ala-Pro-Phe 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č, 6 [SEQ ID NO: 6) (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOGIE: lineární (li) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 1 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= acetyl /význam= acetyl je připojen k aminovému konci peptidů (ix) ZNAK:

(A) JMENO/KLIC: mouifukované místo (B) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /cznačení= NH₂ /význam= NH₂ skupina je připojena ke karboxy lověnu konci peptidů (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

Arg-Pro-Ala-Pro-Tyr

5 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI Č. 7 [SEQ ID NO: 7] (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) 2NAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= NH₂ /význam= NH-, skupina je připojena ke karbc-xy íovému konci peptidů (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7:

Arg-Pro-Glu-Pro-Tyr 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 3 [SEQ ID NO: 5.' (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (3) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TY? MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (3) POLOHA: 1 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= acetyl /význam= acetyl je připojen k aminovému konci peptidů (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= NH₂ /význam= NH₂ skupina je připojena ke karboxy lovému konci peptidů (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: S:

Arg-Pro-Ser-Prc-Phe 1 5 (2) iNF(JRMACí O sr-KVENCÍ 0. 3 lSEO ID (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (B) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (íx) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 1 (D) JINÉ INFORMACE: /cznačení= acetvl /význam= acetvl je připojen k aminovému konci peptidu (íx) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= NH₂ /význam= NH₂ skupina je připojena ke karboxy lovému konci peptidu (xí) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 9:

Arg-Pro-Thr-Pro-Phe

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 10 [SEQ ID NO: 10j (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (5) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

INAK :

(A) JKENO/KLÍČ: modifikované místo (5) POLOHA: 1 (D) JINÉ INFORMACE: /označení^ acetyl /význam= acetyl je připojen k aminovému konci peptidů (ix) ZNAK:

(A) JKENO/KLIČ: modifikované místo (Ξ) POLOHA: = (D) JINÉ INFORMACE: /'označení= NH₂ /význam= NH₂ skupina je připojena ke karbox levému konci peptidů {xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 10:

Arg-Pro-Thr-Pro-Tyr

5 (2) INFORMACE O SEKVENCI C. II [SEQ ID NC: li (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (S) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TY? MOLEKULY: peptid ( ix) ZNAK:

(A) (3) ( D)

JMENCyKLIC: modifikované místo POLOHA: 1 jiNt j-Nr cídínC;. ,· o značeni= acety^. /vvznam= acetvl je připojen k aminovému konci peptidu (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= NH₂ /význam= NH₂ skupina je připojena ke karboxy lovému konci peptidu (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 11:

Arg-Pro-Ser-Pro-Tyr 1 5 (2) INFORMACE 0 SEKVENCI Č. 12 [SEQ ID NO: 12] (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMÉNO/KLÍČ; modifikované místo (B) POLOHA: 1 (D) JINÉ INFORMACE: /označení^ acety1 /význam^ acetyl je připojen k aminovému konci peptidu (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= pClPhe-NH₂ /význam= aminokyselina Phe je substituována p-Cl a NH₂ skupina je připojena ke karbcxylovém konci peptidů (Xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 12:

Arg-Pro-Asp-Pro-Xaa (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 13 ;SEQ ID NC: 13;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (3) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOC-IE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (3) POLOHA: 1 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= děkanovi /význam= děkanovi je připojen k aminovému konci peptidů (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (3) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= NH₂ /význam= NH2 skupina je připojena ke karbcxylovému konci peptidů

Arg-Pro-Asp-Pro-Phe 1 5 (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 14 [SEQ ID NO: 14 j (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) JMENO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 1 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= acetyl /význam= acetyl· je připojen k aminovému konci peptidů (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (B) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení= NH₂ /význam= NH₂ skupina je připojena ke karboxy lovému konci peptidů (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 14:

Arg-Pro-Glu-Pro-Phe (2) INFORMACE O SEKVENCI Č. 15 [SEQ ID NO: 15;

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5 aminokyselin (3) TYP: aminokyselinový (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid ( ix ) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (3) POLOHA: 1 (D) JINÉ INFORMACE: /označení- butyryl /význam- butyryl je ořipoje.n k aminovému konci peptidu (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/KLÍČ: modifikované místo (3) POLOHA: 5 (D) JINÉ INFORMACE: /označení- NH₂ /význam- NH₂ skupina je připojena ke karbcxv lovému konci peptidu (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 15:

Arg-Prc-Asn-Pro-Phe

Claims

PATENTOVĚ NÁROKY1. Pentapeptidy obecného vzorce

R¹-V-W-X-Y-2-R² nebo jejich farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinami nebo bázemi, kde

R představuje atom vodíku nebo nižší alkyl nebo alkanoyl, vždy s 1 až 10 atomy uhlíku,

V představuje Arg,

W představuje Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro,

X představuje Asp, Ser, Thr, Asn nebo Glu,

Y představuje Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro,

Z představuje Phe nebo Tyr, který je popřípadě substituován jedním nebo více atomy halogenu, nitroskupinami nebo hydroxyskupinami a

R² představuje skupinu OH nebo NR²R⁴, přičemž každý ze symbolů R² a R⁴ je nezávisle zvolen ze souboru zahrnujícího vodík, alkylskupiny nebo alkenylskupiny s přímým nebo rozvětveným retezcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, které jsou popřípadě substituovány arylskupinou nebo arylskupinou substituovanou halogenem nebo alkylskupinou nebo alkenylskupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů Uhlíku nebo R² a R** dohromady představují cyklickou methylenovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, přičemž všechny ze symbolu V, W, X, Y a Z představují L-aminokyseliny nebo popřípadě jeden nebo více ze symbolů , W, X, Y a Z představují D-aminckyseiiny.
2. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň jednoho pentapeptidů podle nároku 1 ve farmaceutické vhodné směsi.

3, Farmaceutický přípravek podle nároku 2, vyznačují c i se t í m, že je vhodný pro orální podávání.

4. Pentapeptid zvolený ze so uberu . za ihrn ujíčího acetyl-Arg-?rc-Asp-?ro-Phe-NH₂ [ SEQ ID Nc: 1J , acetyl-A.rg-Pro-Asp-Pro-Tyr-NH- [SEQ ID No: 2], acetyI-A.rg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH₂ [SEQ ID No: 3], acetvl-Arg-Pro-Asn-Pro-Tyr-NH₂ [SEQ ID No: 4 J , acetyl-Arg-Pro-Glu-Pro-Tyr-NH₂ [SEQ ID No: 7b acetyl-Arg-Pro-Ser-Pro-Phe-NH₂ [SEQ ID No: 8], acetyl-Arg-Pro-Thr-Pro-Phe-NH₂ [SEQ ID No: 9] , acetyl-Arg-Pro-Thr-Pro-Tyr-NH₂ [SEQ ID No: 10] , acetyl-Arg-Pro-Ser-Pro-Tyr-NH₂ [SEQ ID Nc: 11] , acetyl-Arg-Pro-Asp-Pro-pCIPhe-N h₂ ís <Q ID No: 12] děkanovi -A.rg-Pro-Asp-Pro-?he-NH 2 :q i :d n o; 13b acetyl-Arg-Pro-Glu-Pro-Phe-NH₂ [SEQ ID Nc : 14] a

butyryl-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH₂ [SEQ ID No: 15].

5. Pentapeptidy pro léčbu subjektů, jejichž fyzický stav je charakterizován narušením imunitního systému, zahrnující sloučeniny obecného vzorce

R¹-V-W-X-Y-Z~R² nebo jeho farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinami nebo bázemi, kde

R¹ představuje atom vodíku nebo nižší alkyl nebo alkanoyl, vždy s 1 až 10 atomy uhlíku,

V představuje Arg,

W představuje Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro,,X představuje Asp, Ser, Thr, Asn nebo Glu,

Y představuje Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro, “

Z představuje Phe nebo Tyr, který je popřípadě substituován jedním nebo více atomy halogenu, ; nitroskupinami nebo hydrcxyskupinami a | i ' R² představuje skupinu OH nebo NR²R⁴, ' přičemž každý ze symbolů R² a R⁴ je nezávisle zvolen ze souboru zahrnujícího vodík, alkylskupinv nebo alkenylskupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, které jsou popřípadě substituovány arylskupinou nebo arylskupinou substituovanou halogenem nebo alkylskupinou nebo alkenylskupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo R² a R⁴ dohromady představují cyklickou methylenovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, přičemž všechny ze symbolů V, W, X, Y a Z představuji L-aminokyseliny nebo popřípadě jeden nebo více ze symbolů V, W, X, Y a Z představují D-aminokyseliny.

6. Pentapeptidv pro léčbu subjektů, jejichž fyzický stav je charakterizován narušením centrálního nervového systému, zahrnující sloučeniny obecného vzorce obecného vzorce

R“ ........ „ „2 - „· -rt-/.- ϊ - Ζ-Λ nebo jeho farmaceurii c.uy v hodné adiční soli s kyselinami nebo bázemi, kde „ T_ představuje atom vodíku r.ebc nižší alkyl nebo alkancyl, v ždy s i až 10 atomy unlmu, V představuje Arg, W představuj e Rro, dehydro-Pro nebo hydrcxy-Pro, X představuje Asp, Ser, Thr, Asn nebo Glu, Y představuje Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro, z představuje Phe nebo Tyr, který je popřípadě

substituován jedním nebo více atomy halogenu, nitroskupinami nebo hydroxyskupinami a

R² představuje skupinu OH nebo NR^JR⁴, přičemž každý ze symbolů R^J a R“ je nezávisle zvolen ze souboru zahrnujícího vodík, alkylskupiny nebo alkenylskupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, které jsou popřípadě substituovány arylskupinou nebo arylskupinou substituovanou halogenem nebo alkylskupinou nebo alkenvlskupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo R³ a R*¹ dohromady představují cyklickou methylenovou skupinu se 3 až ⁷ atomy uhlíku, přičemž všechny ze symbolů V, W, X, Y a Z představují L-aminckvselinv nebo·poořitadě jeden nebe více ze symbolů V, w, X, Y a Z představují D-aminokyseliny.

7. Způsob výroby pentapeptidu obecného vzorce

RÍ-V-W-X-Y-Z-R² nebo jeho farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinami nebo bázemi, kde

R představuje atom vodíku nebo nižší alkyl nebo alkanovl, vždy s 1 až 10 atomy uhlíku,

V představuje Arg,

W představuje Pro, dehydro-Pro nebo hydrcxy-Pro,

X představuje Asp, Ser, Thr, Asn nebo Glu,

Y představuje Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro,

2 představuje Phe nebo Tyr, který je popřípadě substituován jedním nebo více atomy halogenu, nitroskupinami nebo hydroxyskupinami a

R² představuje skupinu OH nebo NR³R⁴, přičemž každý ze symbolů R³ a R⁴ je nezávisle zvolen ze souboru zahrnujícího vodík, alkylskupiny nebo alkenylskupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku,' které jsou popřípadě substituovány arylskupinou nebo arylskupinou substituovanou halogenem nebo alkylskupinou nebo alkenylskupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku nebo R^J a R⁴* dohromady představují cyklickou methylenovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, přičemž všechny ze symbolů V, W, X, Y a Z představují L-aminokyseliny nebo popřípadě jeden nebo více ze symbolů V, w, x, γ a Z představuji D-aminokyseliny, v y z oevné , že se syntéza prov

Zoůsob vvroby oentapeptidu obecného vzorce

R* - V-w-X-Y-Z-R nebo jeho farmaceuticky vhodné adiční seli s kyselinami nebe bázemi, kde

R¹ představuje atom vodíku nebo nižší alkyl nebo alkanovl, vždy s 1 až 10 atomy uhlíku,

V představuje Are,

W představuje Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro,

X představuje Asp, Ser, Thr, Asn nebo C-lu,

Y představuje Pro, dehydrc-Pro nebo hydroxy-Pro,

Z představuje Phe nebo Tyr, krerý je popřípadě substituován jedním nebo více atomy halogenu, nitroskupinami nebo hydroxyskupinami a

R² představuje skupinu OH nebo NR³R⁴, přičemž každý ze symbolu R³ a R⁴ je nezávisle zvolen ze souboru zahrnujícího vodík, alkylskupinv nebo alkenylskupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, které jsou popřípadě substituovány arylskupinou nebe arylskupinou substituovanou halogenem nebo alkylskupinou neb alkeny Iskupmou s přímým nebo rozvětveným řerězcem obsahujíc 1 až 6 atomů uhlíku nebo R³ a R⁴ dohromady představují cyklickou methylenovou skuolnu -se 3 až 7 atomy uhlíku.

přičemž všechny ze symbolů V, W, X, Y a Z představuji L-aminokyseliny nebo popřípadě jeden nebo více ze symbolů V, w, X, Y a Z představují D-aminokyseliny, vyznačující se tím, že se syntéza provádí v roztokové fázi.
9. Způsob podle nároku 8,vy značujicí se tím, že pentapeptid je zvolen ze souboru zahrnujícího acetyl-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH₂, acetyl-Arg-Pro-Asp-Pro-Tyr-NH₂, acetyl-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH₂, acetyl-Arg-Pro-Asn-Pro-Tyr-NH₂, acetyl-Arg-Pro-Glu-Pro-Tyr-NH₂, acetyl-Arg-Pro-Ser-Pro-Phe-NH₂, acetyl-Arg-Pro-Thr-Pro-Phe-NH₂, acetyl-Arg-Pro-Thr-Pro-Tyr-NH₂, acetyl-Arg-Pro-Ser-Pro-Tyr-NH₂, acetyl-Arg-Pro-Asp-Pro-pClPhe-NH₂, dekanoyl-Arg-Pro-Asp-Pro-Phe-NH₂, acetyl-Arg-Pro-Glu-Pro-Phe-NH₂ a butyryl-Arg-Pro-Asn-Pro-Phe-NH₂.
10. Použití pentapeptidu obecného vzorce

R¹-V-W-X-Y-Z-R² nebo jeho farmaceuticky vhodné adiční soli s kyselinami nebo bázemi, kde

R¹ představuje atom vodíku nebo nižší alkyl nebo alkanovl, vždy s 1 až 10 atomy uhlíku,

V představuje Arg,

W představuje Pro, dehydro-Pro nebo hydrcxy-Pro, představuje Asp, Ser,

Asn neoo představuje Pro, dehydro-Rro nel :rcxy-?ro,

Z představuje ?he nebo Tyr, který je popřípadě substituován jedním nebo více atomy halogenu, nitroskupinami nebo hydroxyskupinamí a

R^z představuje skupinu OH nebo NP/íC, přičemž každý ze symbolů R³ a PU je nezávisle zvolen ze souboru zahrnujícího vodík, alkylskupinv nebo alkenylskupiny s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, které jsou popřípadě substituovány arylskupincu nebo arylskupínou substituovanou halogenem nebo alkylskupinou nebo alkenylskupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až S atomů uhlíku nebo R³ a R*’ dohromady představují cyklickou methylenovou skupinu se 3 až 7 atomy uhlíku, přičemž všechny ze symbolů V, W, X, Y a 2 představují L-amínokvseliny nebo popřípadě jeden nebo více ze symbolů V, w, X, Y a 2 představují D-aminokyseliny, pro výrobu farmaceutického přípravku vhodného pro léčbu poruch imunitního systému a/nebo poruch centrálního nervového systému.