CZ55496A3

CZ55496A3 - Tripeptides, processes of their preparation, their use, pharmaceutical compositions and diagnostic agents based thereon

Info

Publication number: CZ55496A3
Application number: CZ96554A
Authority: CZ
Inventors: Gideon Goldstein; Ponniah Shenbagamurthi; James I Koenig
Original assignee: Immunobiology Research Inst
Priority date: 1993-08-26
Filing date: 1994-08-17
Publication date: 1996-08-14
Also published as: FI960839A0; HU9600432D0; HUT73777A; NO960710D0; ATE207757T1; CN1133563A; IL110585A0; KR960703612A; AU682898B2; BR9407357A; ZA946008B; EP0723454B1; EP0723454A1; AU7868194A; NO960710L; DE69428909D1; CA2169072A1; WO1995005841A1; EP0723454A4; US5639729A

Description

jejicji výroby, pejffch ]5dužití a J|armaa diagnostická činidla na jejich^bázi týká tripeptidů, které jsou užitečné při

Tripeptidy, způsoby ceutické prostředky

Oblast techniky

Vynález se léčbě chorob imunity a centrálního nervového systému. Dále se vynález týká i způsobů jejich výroby, farmaceutických prostředků a diagnostických činidel na jejich bázi a jejich použití pro výrobu farmaceutických prostředků.

Dosavadní stav techniky

Imunomodulační protein thymopoietin byl izolován z hovězího a humánního thymu. Kromě toho byly syntetizovány malé peptidy, které napodobují biologickou účinnost thymopoietinu (viz např. US 4 505 853 a odpovídající EP přihlášku č. 146 266 ) .

Byla publikována celá řada článků a patentů, které se vztahují k takovým proteinům a syntetizovaným peptidům.

V US patentu č. 4 190 646 je publikován pentapeptid, thymopentin, který představuje účinné místo thymopoietinu a má sekvenci SEQ ID NO:1

Arg-Lys-Asp-Val-Tyr, jakož i peptidy, v nichž jsou na aminový a/nebo karboxylový konec tohoto pentapeptidu připojeny různé skupiny, jako substituenty.

O thymopoietinu je známo, že reguluje cholinergickou neuromuskulární transmisi (G. Goldstein a W. W. Hoffman, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 31: 453 až 459 (1968) a G.

Goldstein, Nátuře, 247: 11 až 14......(1974)>. Thymopoietin je------obsažen v mozku, stejně tak jako receptory thymopoietinu (TPR), takže se thymopoietin téměř určité podílí na mozkové funkci.

Nedávno byl thymopentin identifikován jako antagonista změn indukovaných stresem, který vykazuje ochrannou účinnost proti poškození stresem (v. KXusa et al., Regulátory Peptides 27: 355 až 365 (1990)).

V tomto oboru stále existuje potřeba vyvinout další peptidy, které by byly užitečné jako diagnostická činidla a/nebo terapeutická činidla vhodná pro léčbu dysfunkcí imunitního systému člověka a jiných savců, včetně dysfunkcí spojených se stárnutím a různými fyzickými stavy. Také přetrvává potřeba vyvinout peptidy vhodné pro léčbu poruch funkcí centrálního nervového systému.

Podstata vynálezu

Vynález je zaměřen na nové tripeptidy, které jsou biologicky účinné a užitečné jako diagnostika a léčiva poruch imunitního a centrálního nervového systému. Tyto peptidy jsou obzvláště stálé a dobře se absorbují, a proto jsou účinné při podávání orální cestou.

Jedním předmětem tohoto vynálezu jsou nové peptidy obecného vzorce R-X-Y-Z-Rj, kde R, X, Y, Z a Rj mají význam uvedený dále. Tyto peptidy jsou užitečné při regulaci imunitního a/nebo centrálního nervového systému.

Dalším předmětem vynálezu jsou způsoby výroby výše popsaných peptidů syntézou v roztoku, syntézou v tuhé fázi nebo enzymatickou syntézou.

Ještě dalším předmětem.„vynálezu -je-farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje jeden nebo více výše popsaných peptidů v kombinaci s farmaceuticky vhodným nosičem.

Dalším předmětem vynálezu jsou také způsoby léčby různých poruch a nedostatečností imunitního systému, zejména vlivů stárnutí vyvolaných smršťováním brzlíku v průběhu času. Předmětem vynálezu jsou i způsoby léčby poruch centrálního nervového systému, včetně psychatrických poruch, jako je úzkost a deprese, jakož i chronických infekcí, imunitních nedostatečností a stresu. Tyto způsobu zahrnují podávání účinného množství farmaceutického prostředku podle vynálezu postiženým subjektům.

Jiné aspekty a výhody tohoto vynálezu jsou objasněny v následujícím podrobném popisu obsahujícím příklady a popis provedení, kterým se v současné době dává přednost.

Přehled obr, na výkresech

Na obr. 1 je uveden graf ukazující účinek hypoglykemie indukované inzulínem na koncentraci (pg/ml) ACTH v plasmě krysy (osa y). Na osu x jsou vyneseny dávky intraperitoneálně podaného inzulínu (m.j./kg).

Na obr. 2 jsou demonstrovány účinky peptidu podle vynálezu o složení acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl na sekreci ACTH indukovanou inzulínem. Je zde konkrétně porovnáváno orální dávkování (kroužky) se subkutánním podáváním (trojúhelníčky). Na osu y jsou vyneseny koncentrace (pg/ml) ACTH v plasmě po indukci inzulínem a na osu x dávky peptidu (mg/kg).

SSSSSaBOBBBBSl

VMiKSMl

Na obr. 3 je znázorněn graf demonstrující snížení behaviorální odpovědi na sociální stres u krys po podání peptidu acetyl-Arg-Pro-Asp-isobutylamid (IRI-695) vyhodnocené jako úzkost při zkoušce v bludišti Elevated Plus Maze Test (viz příklad 11). Osa y uvádí procentický podíl času stráveného v otevřených větvích bludiště a osa x uvádí různé skupiny zkoušených krys se stresem a bez něho a s předběžnou léčbou peptidem a bez ní.

Na obr. 4 je znázorněn graf popisující farmakokinetiku acetyl-Arg-Pro-Asp-isobutylamidu u krys vyjádřenou jako střední hodnotu (± směrodatná odchylka) koncentrace peptidu v plasmě po jediném orálním podání krysám (N = 4 krysy v určitém časovém bodu). Osa y uvádí koncentraci peptidu v ng/ml a osa x čas po dávce v minutách. Použité dávky jsou 5 mg/kg (prázdné kroužky), 50 mg/kg (prázdné trojúhelníčky) a 300 mg/kg (prázdné čtverečky).

Následuje podrobný popis tohoto vynálezu.

Předmětem vynálezu jsou tripeptidy obecného vzorce

R-X-Y-Z-NHR-, kde

R představuje atom vodíku, nižší alkylskupinu nebo nižší alkanoylskupinu;

X představuje L- nebo D-formu Arg nebo desamino-Arg;

Y představuje D- nebo L-formu Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro;

Z představuje D- nebo L-formu aminokyseliny zvolené ze souboru zahrnujícího Thr, Ser, Asp, Glu, Gin, Asn, β-Asp, Val nebo Ile; a

R-L je zvolen ze souboru zahrnujícího alkylovou nebo alkenylovou skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, popřípadě substituovanou arylskupinou nebo arylskupinou substituovanou atomem halogenu nebo alkylskupinou nebo alkenylskupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 6 atomy uhlíku nebo cyklickou methylenskupinou se 3 až 7 atomy uhlíku.

S překvapením se zjistilo, že tyto tripeptidy obsahující substituované amidové skupiny se chovají podobným způsobem jako analogy peptidu thymopentinu, které mají délku 4 nebo 5 aminokyselin. Tripeptidy podle vynálezu jsou tedy schopny regulovat a ovlivňovat savčí imunitní systém. Také mohou regulovat centrální nervový systém.

Jako peptidy, kterým se dává obzvláštní přednost, je možno uvést acetyl-Arg-Pro-Asp-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Thr-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Ser-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Val-isobutylamid, hexanoyl-Arg-Pro-Asp-isobutylamid,

Arg-Pro-Asp-methylamid,

Arg-Pro-Glu-isopropylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-methylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-isopropylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-fenylethylamid, formyl-Arg-Pro-Asp-methylamid, hexanoyl-Arg-Pro-Asp-methylamid a desamino-Arg-Pro-Asp-isobutylamid.

V tomto popisu jsou aminokyselinové zbytky peptidů a některé látky používané při výrobě těchto peptidů označoV-.

vány zkratkami. Většina třípísmenných zkratek aminokyselin je dobře známa. Pod označením nižší alkylskupina se rozumí alkylskupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, tj. skupina obecného vzorce C_nH_2n+1, kde n nabývá hodnoty 1 až 10. Podobně nižší alkanoylskupina je zde definována jako alkanoylskupina obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, tj. skupina obecného vzorce

O .¾ 11 ^cn^H2n+l“^c“ kde n představuje číslo 0 až 9.

Peptidy podle vynálezu lze obecně vyrábět známými technologiemi. Syntetická výroba polypeptidů podle vynálezu se může provádět konvenčním postupem v tuhé fázi (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 až 2154 (1963)). Tato technologie je dobře zvládnuta a představuje obvyklý postup pro výrobu peptidů. Syntéza v tuhé fázi zahrnuje postupné přidávání chráněných aminokyselin k rostoucímu peptidovému řetězci, který je vázán kovalentní vazbou k tuhé pryskyřičné částici. Při tom je možno reakční činidla a vedlejší produkty odstraňovat filtrací a odpadá nutnost čištění meziproduktů. Při tomto postupu je nutno nejprve připojit první aminokyselinu řetězce kovalentní vazbou k tuhému polymeru. Potom se přidávají následující chráněné aminokyseliny, bučí vždy pouze jedna (tj. jedná se o stupňovitou strategii), nebo v blocích (tj. jedná se o segmentovou strategii), tak dlouho, dokud se nesestaví požadovaná sekvence. Nakonec se chráněný peptid oddělí od tuhého pryskyřického nosiče a odštěpí se chránící skupiny.

Aminokyseliny je možno připojit k jakémukoliv vhodnému polymeru, jakožto nosičové pryskyřici. Vhodná pryskyřice musí obsahovat funkční skupinu, k níž lze první chráněnou aminokyselinu pevně připojit kovalentní vazbou.

Pro_ tento účel se hodí různé polymery, jako je_celulosa,___________ polyvinylalkohol, polymethylmethakrylát a polystyren. Vhodné pryskyřice jsou obchodně dostupné a odborníkům v tomto oboru jsou dobře známé. Jako vhodné chránící skupiny, kterých lze použít při této syntéze je možno uvést terč.butoxykarbonylskupinu (Boc), benzylskupinu (Bzl), terč.amyloxykarbonylskupinu (Aoc), toluensulfonylskupinu (Tos), o-bromfenylmethoxykarbonylskupinu (BrZ), 2,6-dichlorbenzylskupinu (BzlCl₂) a fenylmethoxykarbonylskupinu (Z nebo CBZ). Další chránící skupiny jsou uvedeny v Merrifieldově publikaci citované výše a také v publikaci J. F. W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenům Press, New York, USA, 1973. Obě tyto citace jsou zde uvedeny náhradou za přenesení jejich celého obsahu do popisu tohoto vynálezu.

Při obecném provedení způsobu výroby peptidů podle vynálezu se nejprve připojí aminokyselina s chráněným karboxylovým koncem k pryskyřici. Po připojení se pryskyřice odfiltruje, promyje a chránící skupina (s výhodou terc.butoxykarbonylskupina) na α-aminoskupině karboxyterminální aminokyseliny se odštěpí. Odštěpení chránící skupiny se samozřejmě musí provést bez porušení vazby mezi aminokyselinou a pryskyřicí. Potom se k volné α-aminoskupině aminokyseliny na pryskyřici kopuluje následující aminokyselina s chráněnou terminální aminoskupinou a popřípadě chráněnou aminoskupinou v bočním řetězci. Při této kopulaci vzniká amidová vazba mezi volnou karboxyskupinou druhé aminokyseliny a aminoskupinou první aminokyseliny vázané k pryskyřici. Tato sekvence činností se opakuje s následujícími aminokyselinami tak dlouho, dokud se všechny aminokyseliny nepřipojí k pryskyřici. Nakonec se chráněný peptid odštěpí od pryskyřice a peptid se zbaví chránících skupin. Pro oddělování peptidu od pryskyřice a odštěpování chránících skupin se používá vhodných technologií, které jsou závislé na druhu pryskyřice a chránících skupin. Všechny takové technologie jsou dobře známé odborníkům voboru syntézy peptidů.

Alternativní technologie syntézy peptidů je popsána v publikaci Bodanszky et al., Peptide Synthesis, 2. vydání, John Wiley and Sons, 1976. Peptidy podle vynálezu je například také možno syntetizovat za použití standardních roztokových způsobů syntézy peptidů, které zahrnují stupňovitou nebo blokovou kopulaci aminokyselin nebo peptidových fragmentů za použití chemických nebo enzymatických metod pro tvorbu amidové vazby (viz například H. D. Jakubke, The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Academie Press, New York, USA, 1987, str. 103 až 165; J. D. Glass, ibid., str. 167 až 184; a EP 0 324 659 A2, kde jsou popsány enzymatické způsoby syntézy peptidů). Tyto způsoby syntézy v roztoku jsou dobře známy odborníkům v tomto oboru.

Peptidy podle vynálezu je také možno vyrábět jinými technologiemi známými odborníkům v tomto oboru, jako jsou například technologie genového inženýrství (viz např. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA, 1989).

Jako diagnostických a/nebo terapeutických činidel je podle vynálezu možno použít také adičních solí výše de- . finovaných peptidů s kyselinami nebo bázemi. Jako neomezující příklady kyselin, které jsou schopny tvořit soli s těmito peptidy, je možno uvést anorganické kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina chloristá, kyselina dusičná, kyselina thiokyanatá, kyselina sírová, kyselina fosforečná apod. Pro výrobu solí podle vynálezu je také možno použít organických kyselin, jako je například kyselina mravenčí, kyselina octová, kyselina propionová, kyselina glykolová, kyselina mléčná, kyselina pyrohroznová, kyselina štavelová,_kyselina malonová, kyselina jantarová, kyselina maleinová, kyselina fumarová, kyselina citrónová, kyselina sukcinamová, kyselina anthranilová, kyselina skořicová, kyselina naftalensulfonová, kyselina sulfanilová apod.

Jako neomezující výčet bází, které jsou schopny tvořit soli s těmi'peptidy, které obsahují kyselé skupiny, je možno uvést anorganické báze, jako je hydroxid sodný, hydroxid amonný, hydroxid draselný apod. Z organických bází, které se hodí pro toto použití je možno uvést mono-, dia trialkylaminy a mono-, di- a triarylaminy (například triethylamin, diisopropylamin, methylamin a dimethylamin) a popřípadě substituované ethanolaminy (například ethanolamin a diethanolamin). Na tento výčet organických bází se vynález přirozeně neomezuje.

Peptidy podle vynálezu vykazují dostatečnou biologickou dostupnost, takže mohou vykazovat různé regulační účinky na savčí a lidský imunitní a/nebo centrální nervový systém. Peptidy podle vynálezu mají konkrétně poločas eliminace přibližně 50 až 100 minut, což ukazují farmakokinetické studie popsané dále v příkladu 11.

Peptidy podle vynálezu a farmaceutické prostředky s jejich obsahem s překvapením vykazují různé regulační účinky na savčí imunitní a/nebo centrální nervový systém. Peptidy podle vynálezu umožňují například léčbu autoimunitních poruch a jiných stavů, pro něž je charakteristické narušení imunitního systému. S ohledem na imunomodulační vlastnosti těchto peptidů se jedná o látky terapeuticky užitečné a vhodné pro léčbu člověka a případně i jiných zvířat v těch případech, kdy je zapotřebí vyvolat změny imunitního systému léčených subjektů.

_____________Peptidypodle vynálezu mohou být také užitečné jako anxiolytická terapeutická činidla. Tak například, když se pacient předem podrobí léčbě peptidem podle vynálezu, může to mít za následek snížení hladiny faktoru uvolňujícího kortikotropin (CRF), který zprostředkovává stresové reakce. Kromě toho bylo pozorována snížení behaviorální odpovědi na sociální stres u krys po předběžném ošetření peptidem podle vynálezu při zkoušce v bludišti Elevated Plus Maze Test, což je modelová zkouška úzkosti na hlodavcích. Tato zkouška je dobře zavedena v popisovaném oboru pro identifikaci tříd potenciálních anxiolytických sloučenin a bylo jí použito pro studii behaviorální odpovědi na sociální stres u krys [viz Pich, E. M. et al., Psychoneuroendokrinology 18: 495 až 507 (1993); Pellow S. et al., J. Neurosci. Meth., 14: 149 až 167 (1985)]. Peptidy podle vynálezu jsou tedy užitečné také pro antidepresivní léčbu a podobně jsou užitečné i pro léčbu jiných poruch indukovaných stresem.

Peptidů podle tohoto vynálezu je také možno použít pro snížení účinků stárnutí na imunitní systém. Se smršťováním thymu s věkem se snižuje hladina thymopoietinu, což je polypeptid pocházející z brzlíku a v důsledku toho úměrně roste hladina CRF indukovaného stresem, adrenokortikotropického hormonu (ACTH) a kortikosteroidů. Podávání peptidů podle vynálezu, které mají biologickou účinnost podobnou thymopoietinu může napomáhat snižování účinků stárnutí, které jsou spojeny s neúčinným nebo nefunkčním imunitním systémem.

Peptidy podle vynálezu mohou být také užitečné jako imunostimulátory, pokud se podávají pacientům s chronickou infekcí nebo s nedostatečností imunitního systému. Nedostatečnost imunitního systému může být důsledkem rakoviny nebo její léčby, důsledkem virových infekcí včetně HIV a herpes simplex (tyto infekce jsou uvedeny pouze jako příklady).

sa^tnunsř

- 11 Peptidy podle vynálezu mohou být kromě toho užitečné„při_________ léčbě stresu spojeného s většími chirurgickými zákroky nebo stresu spojeného s jinými úrazy, například popáleninami.

Předmětem vynálezu jsou dále farmaceutické prostředky obsahující jeden nebo více výše popsaných peptidů nebo jejich adičních solí s kyselinami nebo bázemi. Peptidy podle vynálezu a farmaceutické prostředky, které tyto peptidy nebo jejich soli s kyselinami nebo bázemi obsahují, jsou obecně považovány za užitečné v jakékoliv oblasti, kde je problémem buněčná imunita a zejména v případě nedostatečné imunity. Farmaceutické prostředky podle vynálezu jsou také užitečné při regulaci nerovnováh centrálního nervového systému.

Vynález se také týká způsobů léčby stavů, které jsou důsledkem poruch imunitního systému a/nebo centrálního nervového systému pacienta. Léčba podle vynálezu spočívá v podávání terapeuticky účinného množství alespoň jednoho peptidu nebo farmaceutického prostředku podle vynálezu pacientovi, který takovou léčbu potřebuje. Pod označením terapeuticky účinné množství se v tomto popisu rozumí množství, které je účinné při léčbě výše popsaných stavů.

Při výrobě farmaceutických prostředků podle vynálezu se peptid podle vynálezu, který tvoří účinnou přísadu, zpracovává na homogenní směs s farmaceutickým nosičem v souladu s běžnými technologiemi výroby farmaceutických směsí. Nosič může nabývat řady různých forem v závislosti na požadované podobě přípravku a způsobu, jakým má být podáván. Podávání může být například orální, sublinguální, rektální, nasální nebo parenterální. V současné době se dává přednost orálnímu podávání.

-..um

Rsaaeoc

- 12 Při výrobě farmaceutických prostředků. vpřednostní dávkovači formě vhodné pro orální podávání se může používat jakýchkoliv obvyklých farmaceutických médií. Pro orální kapalné prostředky (například suspenze, elixíry a roztoky) se jako médií může používat například vody, olejů, alkoholů, ochucovadel, konzervačních činidel, barvicích činidel apod. Při výrobě orálních pevných prostředků, jako jsou například prášky, kapsle a tablety, se může používat takových nosičů, jako jsou škroby, cukry, ředidla, granulační činidla, lubrikanty, pojivá, desintegrační činidla apod. Také se může používat forem s regulovaným uvolňováním. S ohledem na snadnost podávání představují tablety a kapsle nejvýhodnější orální dávkovači jednotkové formy a v těchto případech se samozřejmě používá pevných farmaceutických nosičů. Pokud je to žádoucí, mohou být tablety potaženy cukrem nebo enterickým povlakem za použití standardních technologií.

Nosiče pro parenterální farmaceutické prostředky zahrnují například sterilní vodu, přestože se může použít i jiných přísad, například pro usnadnění rozpouštění nebo pro konzervaci. Také se mohou vyrábět injekční suspenze, a v tomto případě se používá vhodných kapalných nosičů, suspenzních činidel apod.

Tripeptidy podle vynálezu jsou obecně účinné při parenterálnxm podání v množství nad asi 0,03 mg/kg tělesné hmotnosti a až do asi 30 mg/kg tělesné hmotnosti. Přednostní množství činí asi 0,3 mg/kg. Při orálním podávání jsou peptidy podle vynálezu obvykle účinné v množství v rozmezí od asi 0,5 do asi 50 mg/kg tělesné hmotnosti, přičemž přednostní množství činí asi 3 mg/kg tělesné hmotnosti. Účinnost tohoto řádu činí peptidy podle vynálezu obzvláště vhodnými pro farmaceutické prostředky v podobě tablet pro orální podávání . Výše uvedené dávky se mohou podávat humánnímu pacientovi v různých intervalech, například každý den nebo alespoň dvakrát týdne. Interval dávkování,„kterému se v sou časné době dává přednost, zahrnuje dávkování třikrát za týden. Dávkovači režim však s konečnou platností závisi na fyzickém stavu pacienta a době trvání léčeného stavu. Podle trvání choroby se například dávkovači režim volí v případě virových chorob. U chronických poruch, jako je například stres, HIV apod. bude dákovací režim záviset na trvání symptomů.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

V příkladech a v celém popisu se pod údaji v dílech rozumějí údaje hmotnostní, pokud není uvedeno jinak. Kromě zkratek popsaných výše se v příkladech používá také následujících zkratek; TFA = kyselina trifluoroctová, HOAc = kyselina octová, CH₂C1₂ = methylenchlorid, CH₃CN = acetonitril, DMF = dimethylformamid, NH₄OAc = octan amonný, NH₄OH = hydroxid amonný, n-PrOH = n-propanol, n-BuOH = n-butanol, Pyr = pyridin, DCC = dicyklohexylkarbodiimid, HOBt = 1hydroxybenzotriazol, DMAP = dimethylaminopyridin, HF = fluorovodík, TCA = kyselina trichloroctová, BHA = benzhydrylamin, p-MBHA = p-methylbenzhydrylamin, DIC = diisopropylkarbodiimid, NMM = N-methylmorfolin a MeOH = methanol Jiné standardní zkratky jsou vysvětleny v publikaci The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, sv. 1 a 2, red. E. Gross a J. Meienhofer, Academie Press, New York, 1987 a IUPAC-IUB Commision on Biochemical Nomenclature, J. Biol. Chem., 245:6489-6497 (1970) a J. Biol. Chem. 250:3215-3216 (1975).

Dále uvedené příklady ilustrují přednostní způsoby výroby peptidů podle vynálezu. Na způsoby uvedené v příkladech není vynález omezen.

Příklady provedení vynálezu

Přikladl

Syntéza hexanoyl-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl

A. Výroba N-isobutylaminomethylpryskyřice

Na Merrifieldovu pryskyřici (20 g, 1,06 mmol Cl/g) se působí isobutylaminem (200 ml) 72 hodin při 45*C. Baňka se míchá pomalým otáčením v rotačním odpařováku za atmosférického tlaku. Po 72 hodinách se nadbytek isobutylaminu odfiltruje a pryskyřice se promyje dichlormethanem (3 x 100 ml), dimethylformamidem (3 x 100 ml), dichlormethanem (3 x 100 ml), methanolem (3 x 100 ml), dichlormethanem (3 x 100 ml) a bezvodým etherem (3 x 100 ml). Výsledná pryskyřice se vysuší za sníženého tlaku (20,05 g).

B. Syntéza produktu hexanoyl-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl postupem v tuhé fázi

Peptid charakterizovaný v podtitulku se syntetizuj stupňovitou kopulací metodou v tuhé fázi. Syntéza se zahájí za použití 3 mmol N-isobutylaminomethylpryskyřice (3 g, 1 mmol/g pryskyřice). Všechny aminokyseliny se chrání na aaminoskupině prostřednictvím skupiny Boc. Skupiny Tos se používá pro ochranu guanidinoskupiny v postranním řetězci Arg. Karboxyskupina v postranním řetězci Asp se chrání za použití skupiny Bzl. Všechny kopulace se provádějí za použití metody diisopropylkarbodiimid-HOBt podle následujícího protokolu.

Stupeň Reakční činidlo______________ Doba (min)

1	promytí CH₂C1₂	3 X	1
2	40% TFA - 10% anisol v CH₂C1₂	1	X	5
3	40% TFA - 10% anisol v CH₂C1₂	1	X	25
4	promytí CH₂C1₂	3	X	1
5	10% NMM v CH₂C1₂	2	X	5
6	promytí CH₂C1₂	3	X	1
7	promytí DMF	2	X	1
8	Boc-aminokyselina (9 mmol) a HOBt (3 mmol) v DMF	1	X	3
9	DIC (9 mmol) (po přidání se směs třepe)	1	X	180
10	rekopulace, je-li zapotřebí opakují se stupně 4 až 9
11	promytí DMF	3	X	1

Po odštěpení N-terminální skupiny Boc z Arg a neutralizaci se výsledný produkt peptid-pryskyřice kopuluje s hexanovou kyselinou (1,5 ml, 12 mmol) za přítomnosti Hobt (12 mmol) a DIC (12 mmol). Potom se pryskyřice promyje dimethylformamidem (3 x 50 ml) a dichlormethanem (3 x 50 ml) a nakonec se vysuší ve vakuové sušárně při 30’C (4,46 g).

Peptid se odštěpí od pryskyřičného nosiče ve dvou dávkách (2,23 g/dávka) mícháním v bezvodém kapalném fluorovodíku (45 ml), p-kresolu (1,4 ml), p-thiokresolu (1,4 ml) a dimethylsulfidu (1,4 ml) po dobu 1 hodiny při 0’C a 3 hodin při 20’C. Nadbytek fluorovodíku se odstraní za sníženého tlaku a směs obsahující pryskyřici a peptid se extrahuje bezvodým diethyletherem (3 x 200 ml). Etherové extrakty se zlikvidují. Odštěpený peptid se extrahuje 30% kyselinou octovou (3 x 100 ml), rozpouštědla se odstraní za sníženého tlaku a zbytek se rozpustí ve vodě (60 ml) a lyofilizuje (1,1 g). Získaná pevná látka se rozpustí v 30%

- 16 kyselině octové (2.x 20 ml) a roztok se nechá projit____________ sloupcem ionexové pryskyřice Amberlite IRA-68 (v acetátové formě) (60 g, 1,6 mekv./ml, vnitřní průměr 27,3 mm, délka 180 mm) ve 30% kyselině octové při průtokové rychlosti 60 ml/h. Vhodné frakce se spojí a lyofilizují (930 mg).

Surový peptid se přečistí preparativní chromatograf ií RP-HPLC za použití sloupce Vydac 218TP1022 (22 x 250 mm). Použije se těchto mobilních fází:

A « 0,1% kyselina trifluoroctová ve vodě

B = 0,1% kyselina trifluoroctová ve směsi acetonitrilu a vody v objemovém poměru 4:1.

Použije se lineárního gradientu od 5 % B do 20 % B v průběhu 60 minut při průtokové rychlosti 15 ml/min. Relevantní frakce se spojí a rozpouštědla se odstraní za sníženého tlaku. Vodný zbytek se lyofilizuje, a tak se získá konečný produkt (515 mg).

Chromatografie na tenké vrstvě (TLC) se provádí na silikagelových deskách Merck F-254 (5 x 10 cm) za použití následujících rozpouštědlových systémů (poměry jsou objemové).

Rf(l)	= 0,47	(1-BuOH :	HOAc	: H₂0, 4:1:	1)
Rf(2)	= 0,68	(1-BuOH :	HOAc	: EtOAc : H₂0,	1:1:1:1)
Rf(3)	= 0,83	(1-BuOH :	HOAc	: Pyr : H₂0, 5	: 4 : 4 : 2)

Analýza aminokyselin (AAA):

Arg 1,04 (1), Pro (1,00 (1), Asp 0,97 (1)

Kapalinová chromátografie - hmotností spektrometrie (LC-MS) [MH⁺] při m/z = 540 a.m.u. (mol.hmot. 536,69), kde

- 17 [MH⁺]__ představuje kladně nabitý hmotnostní ion;

m/z představuje poměr hmotnost/náboj a

a.m.u. představuje jednotky atomové hmotnosti.

Příklad 2

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl

1¾

Výše uvedený peptid, acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl, se syntetizuje postupem v tuhé fázi popsaným v příkladu 1. Chráněné aminokyseliny se postupně přidávají k N-isobutylaminomethylpryskyřici (3,4 g, 3,2 mmol). Po odštěpení N-ter-minální skupiny BOC z Arg a neutralizaci se výsledný produkt peptid-pryskyřice acetyluje acetanhydridem (8 ml) v dichlormethanu (70 ml) s obsahem 4-dimethylaminopyridinu (120 mg) po dobu 30 minut. Potom se pryskyřice promyje dimethylformamidem (3 x 50 ml) a dichlormethanem (3 x 50 ml) a nakonec se vysuší ve vakuové sušárně při 30’C.

Peptid se odštěpí od tuhého nosiče pomocí kapalného fluorovodíku a přečistí pomocí RP-HPLC (vysoce účinné kapalinové chromatografie s obrácenými fázemi) způsobem uvedeným v příkladu 1.

TLC: Rf(l) =0,36, Rf(2) = 0,62, Rf (3) = 0,81

AAA: Arg 0,99 (1), Pro 0,97 (1), Asp 1,05 (1)

LC-MS: [MH⁺] při m/z 484 a.m.u. (mol. hmot. 483,57)

Příklad 3

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl v roztokové fázi

A. Boc-Asp(OBzl)-NH-Ísobutyl

BEWBBSW

551

- 18 K roztoku. Boc-Asp(OBzl)-OH (6,46 g, -2h~mmol) ______ ethylacetátu (70 ml) se při -15’C přidá N-methylmorfolin (2,2 ml, 20 mmol) a isobutylchlorformiát (2,6 ml, 20 mmol). Po aktivační době 10 minut při -15’C se přidá isobutylamin (2,0 ml, 20 mmol). Reakční směs se 30 minut míchá při -15’C a potom se nechá ohřát na teplotu místnosti. Směs se 2 hodiny míchá při teplotě místnosti a potom se rozloží přídavkem 5% roztoku uhličitanu sodného (100 ml). Dvě čiré vrstvy se převedou do dělicí nálevky a organická vrstva se postupně promyje 5% roztokem uhličitanu sodného (2 x 50 ml), vodou (3 x 50 ml), 5% kyselinou citrónovou (2 x 50 ml) a vodou (3 x 50 ml). Organický roztok se vysuší bezvodým síranem sodným a zkoncentruje za sníženého tlaku na bílou pevnou látku. Výtěžek je 6,05 g (79,9 % teorie).

B. HCl.Asp(OBzl)-NH-isobutyl

K roztoku Boc-Asp(OBzl)-NH-isobutyl (1,89 g, 5 mmol) v ethylacetátu (20 ml) se přidá 5N chlorovodík v ethylacetátu (20 ml). Roztok se 40 hodin míchá a potom zkoncentruje za sníženého tlaku. Získá se HCl.Asp(OBzl)NH-isobutyl ve formě oleje. Tento produkt se vysuší za vakua nad peletami hydroxidu draselného (přes noc).

C. Z-Arg-Pro-Asp(OBzl)-NH-isobutyl

K roztoku Z-Arg(HCl)-Pro-OH (2,21 g, 5 mmol) v dimethy lformamidu (20 ml) se při 0*C přidá 0,5M roztok HOBt v dimethy lformamidu (10 ml) a 0,5M roztoku DCC v dichlormethanu (10 ml). Směs se 30 minut míchá při 0’C a potom se k ní přidá roztok HCl.Asp(OBzl)NH-isobutyl (1,57 g, 5 mmol) a NMM (1,1 ml, 10 mmol) v DMF (20 ml). Reakční směs se míchá 2 hodiny při 0’C a potom přes noc při teplotě místnosti. Vysrážená dicyklohexylmočovina se odfiltruje a filtrát se zkoncentruje za sníženého tlaku. Tak se získá surový produkt

Z-Arg-Pro-Asp(OBz1)-NH-isobutyl ve formě pevné látky (2,84 g, 84 %).

D. Acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-isbutyl

Z-Arg-Pro-Asp(OBzl)-NH-isobutyl (2,84 g) se rozpustí v kyselině octové (100 ml) a přidá se 10% palladium na uhlíku (2,7 g). Vzniklý roztok se hydrogenuje plynným vodíkem za tlaku 309 kPa. Reakce se monitoruje chromátografií na tenké vrstvě a po 24 hodinách se katalyzátor odfiltruje. Rozpouštědlo se odpaří za sníženého tlaku, a tak se získá olejovitý produkt Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl. Tento produkt se rozpustí v ledové kyselině octové (10 ml) a acetyluje působením acetanhydridu v 5 dávkách (po 1 ml). Směs se 4 hodiny míchá a potom se reakční směs rozloží přídavkem vody (5 ml). Rozpouštědla se odpaří za snížného tlaku a zbytek se rozpustí ve vodě (40 ml). Vodný roztok se lyofilizuje.

Surový peptid se přečistí preparativní RP-HPLC za použití postupu popsaného v příkladu 1. Produkt se lyofilizuje do konstantní hmotnosti (180 mg).

TLC: Rf(l) = 0,36, Rf(2) = 0,60, Rf (3) = 0,70

AAA: Arg 0,99 (1), Pro 1,01 (1), Asp 1,01 (1)

LC-MS: [MH⁺] při m/z 484 a.m.u. (mol. hmot. 483,57)

Příklad 4

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Ser-NH-isobutyl

Boc-Ser(OBzl)-NH-isobutyl se vyrobí kopulací Boc-Ser(OBzl)-OH s isobutylaminem způsobem popsaným v příkladu 3A. Vzniklý produkt se zbaví chránící skupiny za použití chlorovodíku v ethylacetátu a hydrochloridová sůl peptidu se vysuší za vakua.

- 20 ________________KopulaceAc-Arg-Pro-OH s produktem HCl.Ser(OBzl)-__________

NH-isobutyl se provádí způsobem popsaným v příkladu 3C.

Chráněný tripeptid acetyl-Arg-Pro-Ser(OBzl)-NH-isobutyl se katalyticky hydrogenuje za účelem odstranění benzylové skupiny způsobem popsaným v příkladu 3D. Surový peptid acetylArg-Pro-Ser-NH-isobutyl se přečistí RP-HPLC.

TLC: Rf(l) = 0,38, Rf(2) = 0,40, Rf (3) = 0,64

AAA: Arg 0,98 (1), Pro 1,02 (1),

Za těchto podmínek hydrolýzy peptidu podléhá Ser degradaci a nelze ho tedy stanovit.

LC-MS: [MH⁺] při m/z 456 a.m.u. (mol. hmot.455,56)

Příklad 5

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Thr-NH-isobutyl

Peptid acetyl-Arg-Pro-Thr-NH-isobutyl se syntetizuje způsobem popsaným v příkladu 4, přičemž se Ser v poloze 3 nahradí Thr. Získaný peptid má následující charakteristiky:

TLC: Rf(l) = 0,4, Rf(2) = 0,64, Rf (3) = 0,77

AAA: Arg 1,01 (1), Pro 0,99 (1),

Za těchto.podmínek hydrolýzy peptidu podléhá Thr degradaci a nelze ho tedy stanovit.

LC-MS: [MH⁺] při m/z = 470 a.m.u. (mol.hmot.469,59)

Příklad 6

Syntéza produktu acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-fenylethyl

Boc-Asp(OBzl)-NH-fenylethyl se vyrobí kopulací Boc-Asp(OBzl)-0H s fenylethylaminem způsobem popsaným v příkladu 3A. Vzniklý., produkt se zbaví chránící skupiny za___ použití 4N chlorovodíku v dioxanu a hydrochloridová sůl peptidu se přes noc vysuší za vakua nad peletami hydroxidu sodného.

Kopulace acetyl-Arg-Pro-OH s produktem HCl.Asp(OBzl) NH-fenylethyl se provádí způsobem popsaným v příkladu 3C. Chráněný tripeptid acetyl-Arg-Pro-Asp(OBzl)-NH-fenylethyl se katalyticky hydrogenuje za účelem odstranění benzylové skupiny způsobem popsaným v příkladu 3D. Surový peptid acetylArg-Pro-Asp-NH-fenylethyl se přečistí RP-HPLC.

TLC: Rf(l) = 0,32, Rf(2) = 0,60, Rf (3) = 0,75

AAA: Arg 0,98 (1), Pro 1,01 (1), Asp 1,02 (1)

LC-MS: [MH⁺] při m/z 532 a.m.u. (mol. hmot. 531,62)

Příklad 7

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Val-NH-isobutyl

Acetyl-Arg-Pro-Val-NH-isobutyl se syntetizuje metodou v tuhé fázi zahrnující stupňovité přidávání chráněných aminokyselin k rostoucímu řetězci peptidu, který je připojen kovalentní vazbou k tuhé pryskyřičné částici, jak je to popsáno v příkladu 1B.

Syntéza se zahájí za použití 4,5 mmol N-isobutylaminomethylpryskyřice (4,5 g, 1 mmol/g pryskyřice). Všechny aminokyseliny se chrání na α-aminoskupině prostřednictvím skupiny Boc. 2-chlorbenzyloxykarbonylskupiny se používá pro ochranu e-aminového postranního řetězce Arg. Všechny kopulace se provádějí za použití metody diisopropylkarbodixmid“ HOBt podle následujícího protokolu.

Stupeň^ Reakční činidlo ______

- Doba -(nin)_________ promytí CH₂C1₂ 3x1

40% TFA - 10% anisol V CH₂C1₂ 1x5

40% TFA - 10% anisol V CH₂C1₂ 1 x 25 promytí CH₂C1₂ 3x1

10% NMM V CH₂C1₂ 2X5 promytí CH₂C1₂ 3x1 promytí DMF 2x1

Boc-aminokyselina (13,5 mmol) a

HOBt (13,5 mmol) v DMF 1x3

DIC (13,5 mmol) (po přidání se směs třepe) 1 x 180 rekopulace, je-li zapotřebí opakují se stupně 4 až 9 promytí DMF 3x1 .-¾

Po odštěpení N-terminální skupiny Boc z Arg a neutralizaci se výsledný produkt peptid-pryskyřice acetyluje působením acetanhydridu (10 ml) v dichlormethanu (70 ml) s obsahem 4-dimethylaminopyridinu (120 mg) po dobu 30 minut. Potom se pryskyřice promyje dimethylformamidem (3 x 50 ml) a dichlormethanem (3 x 50 ml) a nakonec se vysuší ve vakuové sušárně při 30’C (6,8 g).

Peptid se odštěpí od pryskyřičného nosiče tak, že se produkt chráněný peptid-pryskyřice míchá v kapalném fluorovodíku za přítomnosti p-kresolu, p-thiokresolu a dimethylsulfidu, jako zachycovačů, po dobu 1 hodiny při 0’C a 3 hodin při 20’C. Nadbytek fluorovodíku se odstraní za sníženého tlaku a zbytek se zpracuje etherem, aby se odstranily produkty odstraňovačů. Odštěpený peptid se extrahuje 30% kyselinou octovou (3 x 50 ml), rozpouštědla se odstraní za sníženého tlaku a produkt se lyofilizuje (1,051 g).

Surový peptid se nejprve přečisti na sloupci__ ionexové pryskyřice Amberlite IRA-68. Další čištění se provádí několika elucemi na preparativním sloupci HPLC s reversní fází C-18. Použije se těchto mobilních fází: pufr A = 0,1% kyselina trifluoroctová ve vodě pufr B = 0,1% kyselina trifluoroctová ve směsi acetonitrilu a vody v objemovém poměru 4:1.

Použije se lineárního gradientu od 0 % B do 50 % B v průběhu 120 minut v závislosti na konkrétní eluci. Relevantní frakce obsahující peptid se spojí a rozpouštědla se odstraní za sníženého tlaku. Produkt, acetyl-Arg-Pro-Val-NHisobutyl.TFA se lyofilizuje. Sůl peptidu s TFA se převede na acetátovou formu na ionexovém sloupci.

Chromátografie na tenké vrstvě (TLC) se provádí na silikagelových deskách Merck F-254 (5 x 10 cm) za použití následujících rozpouštědlových systémů (poměry jsou obj emové).

Rf(1) = 0,43	(1-BuOH :	HOAC	: H₂O, 4:1:	1)
Rf(2) = 0,68	(1-BuOH :	HOAc	: EtOAc : H₂O,	1:1:1:1)
Rf (3) = 0,86	(1-BuOH :	HOAC	: Pyr : H₂0, 5	: 4 : 4 : 2)

Analýza aminokyselin (AAA):

Arg 1,20 (1), Pro (1,17 (1), Val 0,64 (1)

Kapalinová chromatografie - hmotností spektrometrie (LC-MS) [MH⁺] při m/z = 468,5 a.m.u.; Pozorovaná molekulová hmotnost je 467,5 (teoretická molekulová hmotnost je 467,62.

[MH⁺], m/z a.m.u. mají výše uvedený význam.

_________________________________ P ř i k lad 8 _________________

Syntéza desamino-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl postupem v tuhé fázi

Peptid uvedený v nadpisu se syntetizuje metodou v tuhé fázi popsanou v Merrifield, J. Am. Chem. Soc. , 85:

2149 až 2154 (1963). Syntetický postup v tuhé fázi zahrnuje stupňovité přidávání chráněných aminokyselin k rostoucímu řetězci peptidu, který je připojen kovalentnx vazbou k tuhé pryskyřičné částici.

Syntéza se zahájí za použití 4 mmol N-isobutylaminomethylpryskyřice (4 g, 1 mmol/g pryskyřice). Všechny aminokyseliny se chrání na aminoskupině prostřednictvím skupiny Boc. Benzylskupiny se používá pro ochranu β-karboxylové skupiny Asp. Všechny kopulace se provádějí za použití metody diisopropylkarbodiimid-HOBt podle následujícího protokolu.

Stupeň Reakční činidlo Doba (min) promytí CH₂C1₂ 3x1

40% TFA - 10% anisol v CH₂C1₂ 1x5

40% TFA - 10% anisol v CH₂C1₂ 1 x 25 promytí CH₂C1₂ 3x1

10% NMM v CH₂C1₂ 2X5 promytí CH₂C1₂ 3x1 promytí DMF 2x1

Boc-aminokyselina (12 mmol) a

HOBt (12 mmol) v DMF 1x3

DIC (12 mmol) (po přidání se směs třepe) 1 x 180 rekopulace, je-li zapotřebí opakují se stupně 4 až 9 promytí DMF 3x1

-------------Chráněnéderiváty aminokyselin, Boc-AspíOBzl

Boc-Pro-OH a Boc-5-aminovalerová kyselina, se postupně přidají k N-isobutylaminomethylpryskyřici podle výše uvedeného protokolu. Po odštěpení N-terminální skupiny Boc z

5-aminovalerové kyseliny a neutralizaci se výsledný produkt peptid-pryskyřice nechá reagovat s 3,5-dimethyl-l-pyrazolylformaminidiumnitrátem (12 g) a diisopropylethylaminem (5 ml) v dimethylformamidu po dobu 3 hodin. Potom se pryskyřice promyje dimethylformamidem (3 x 60 ml) a dichlormethanem (3 x 60 ml) a nakonec se vysuší ve vakuové sušárně při 30’C (6,97 g).

Peptid se odštěpí od pryskyřičného nosiče tak, že se produkt chráněný peptid-pryskyřice (3,38 g) míchá v kapalném fluorovodíku za přítomnosti p-kresolu, p-thiokresolu a dimethylsulfidu, jako zachycovačů, po dobu 1 hodiny při 0’C a 3 hodin při 20’C. Nadbytek fluorovodíku se odstraní za sníženého tlaku a zbytek se zpracuje etherem, aby se odstranily produkty odstraňovačů. Odštěpený peptid se extrahuje 30% kyselinou octovou (3 x 150 ml), rozpouštědla se odstraní za sníženého tlaku a produkt se lyofilizuje. Surový peptid se rozpustí v 30% kyselině octové a roztok se nechá projít sloupcem ionexové pryskyřice Amberlite IRA-68 (v acetátové formě) (60 g, 1,6 mekv./ml, vnitřní průměr 27,3 mm, délka 180 mm) ve 30% vodné kyselině octové při průtokové rychlosti 6Ó ml/h. Vhodné frakce se spojí a lyofilizují.

Surový peptid se rozpustí v 0,1% kyselině trifluoroctové a vodě a přečistí na preparativním sloupci RP-HPLC (Vydac 218TP1022, 22 x 250 mm). Použije se těchto mobilních fází:

pufr A = 0,1% kyselina trifluoroctová ve vodě pufr B = 0,1% kyselina trifluoroctová ve směsi acetonitrilu a vody v objemovém poměru 4:1.

_________Použije_ se lineárního gradientu od M-B-do-10 % B „ v průběhu 100 minut při průtokové rychlosti 15 ml/min. Frakce se analyzují HPLC a podle analýzy se frakce obsahující. čistý peptid spojí a organická rozpouštědla se z nich odstraní za sníženého tlaku. Zbytek se rozpustí ve vodě, převede na acetátovou formu průchodem sloupcem ionexové pryskyřice a lyofilizuje (185 mg).

Chromátografie na tenké vrstvě (TLC) se provádí na silikagelových deskách Merck F-254 (5 x 10 cm) za použití následujících rozpouštědlových systémů (uváděné poměry jsou obj emové).

Rf(l)	= 0,25	(1-BuOH ;	HOAc ; H₂0, 4:1:	1)
Rf (2)	= 0,49	(1-BuOH :	HOAc : EtOAc : H-jO,	1:1:1:1)
Rf (3)	= 0,80	(1-BuOH :	Pyr : HOAc : H₂O, 5	: 4 : 4 : 2)

Analýza aminokyselin (AAA):

Arg 1,00 (1), Asp (0,66 (1)

Kapalinová chromátografie - hmotností spektrometrie (LC-MS) [MH⁺] při m/z = 427 a.m.u.; Pozorovaná molekulová hmotnost je 426 (teoretická molekulová hmotnost je 426,26), kde [MH⁺] představuje kladně nabitý hmotnostní ion;

m/z představuje poměr hmotnost/náboj a

a.m.u. představuje jednotky atomové hmotnosti.

Příklad 9

Neuromuskulární zkouška _______Při.této zkoušce se měří schopnost peptidu ovlivňo-_________ vat neuromuskulární transmisi. Předpokládá se, že tuto schopnost umožňuje interakce peptidu s receptorem nikotinového acetylcholinu. O thymopoietinu a thymopentinu je známo, že vykazují inhibiční účinky na neuromuskulární transmisi.

A. Zkouška prováděná na myších

Různé dávky zkoušeného peptidu se rozpustí ve fyziologickém solném roztoku tlumeném fosfátem a roztoky se orálně podají samicím myši o hmotnosti 25 až 30 g (kmen CD1). Použije se elektromyografické zkoušky vycházející z postupu popsaného v G. Goldstein et al. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 31: 453 až 459 (1968). Tato zkouška je modifikována tak, že se provádí 48 hodin po podáni peptidu a nikoliv po 24 hodinách, jak je to uvedeno v citované publikaci. Myši se anestetizují 0,5 ml 10% roztoku urethanu.

Nerv se stimuluje pomocí stimulátoru Grass S-48 a izolační jednotky pro stimul Grass SIU-5A (Grass Medical Instruments,

Quincy, MA, USA) a elektromyografická odpovědí se zaznamenává pomocí paměťového osciloskopu Tektroniks 5111, který je připojen k diferenciálnímu zesilovači 5A21N a časové bázi 5B10N (Tektroniks, Beaverton, OR, USA).

Při supramaximální stimulaci nervu (30 impulsů/s) se výška desátého svalového akčního potenciálu vyjádří jako procentický podíl prvního svalového akčního potenciálu.

Hodnoty P pro zkoušení statistických rozdílů mezi kontrolními pokusy a pokusy se zkoušenými sloučeninami se vypočítají pomocí Dunnetova t-testu se dvěma větvemi. Výsledky získané se zkoušenými peptidy při této neuromuskulární zkoušce jsou uvedeny v tabulce I.

— --------- ---------------- T a b u 1 _k a________I —-—

Sekvence Dávka (mg/kg) P hodnota¹

Acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl	1 1 1 0,1 0,1	0,004 0,000 0,000 0,000 0,006
Acetyl-Arg-Pro-Thr-NH-isobutyl	1	0,000
	1	0,001
Acetyl-Arg-Pro-Ser-NH-isobutyl	1	0,000
	1	0,001
Hexanoyl-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl	0,1	0,000
	0,1	0,000
Acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-fenylethyl	1	0,000
	1	0,001

¹ P hodnota měří schopnost zhoršovat neuromuskulární transmisi. Nízká hodnota P ukazuje, že peptid je schopen zhoršovat neuromuskulární transmisi, a je tedy účinný.

B. Zkouška prováděná na krysách

Různé dávky zkoušeného peptidu se rozpustí ve fyziologickém solném roztoku tlumeném fosfátem a roztoky se orálně podají samicím krysy o hmotnosti 250 až 300 g (kmen CD1). Použije se elektromyografické zkoušky vycházející z postupu popsaného v G. Goldstein et al. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 31: 453 až 459 (1968). Tato zkouška je modifikována tak, že se provádí 48 hodin po podání peptidu a nikoliv po 24 hodinách, jak je to uvedeno v citované publikaci. Krysy se anestetizují 1 ml 40% roztoku urethanu.

Nerv se stimuluje pomocí stimulátoru Grass S-48 a izolační jednotky pro stimul Grass SIU-5A (Grass Medical Instruments, Quincy, MA, USA) a elektromyografická odpověď se zaznamenává pomocí paměťového osciloskopu Tektroniks 5111, který je

-----------------—připojen k diferenciálnímu zesilovači 5A2IN a časové bázi-----------------5B10N (Tektroniks, Beaverton, OR, USA).

Při supramaximální stimulaci nervu (20 impulsů/s) se výška desátého svalového akčního potenciálu vyjádří jako procentický podíl prvního svalového akčního potenciálu.

Hodnoty P pro zkoušení statistických rozdílů mezi kontrolními pokusy a pokusy se zkoušenými sloučeninami se vypočítají pomocí Dunnetova t-testu se dvěma čtverní. Provedou se čtyři experimenty s dávkou sloučeniny 1 mg/kg. Výsledky získané se zkoušeným peptidem, acetyl-Arg-Pro-Val-NH-isobutyl, při této neuromuskulární zkoušce jsou uvedeny v tabulce II.

Tabulka II

Sekvence Dávka (mg/kg) P hodnota¹

Acetyl-Arg-Pro-Val-NH-isobutyl i < 0,001

Výsledky získané při této neuromuskulární zkoušce za použití desamino-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl jsou označeny písmenem P v dále uvedené tabulce III. Pro srovnání jsou v této tabulce uvedeny také hodnoty pro acetyl-Arg-Pro-Val-NHisobutyl (hodnoty označené písmenem p).

_____<	Γ a -b u -1 -k a	II I —
Sekvence	mg/kg (PO)	Hodnota P	Hodnota p
desamino-Arg-Pro-
Asp-NH-isobutyl	3	0,000	0,000
	3	0,013	0,003
	3	0,000	0,000
	1	0,000	0,002
	1	0,000	0,000
		0,000	0,000
	0,5	0,096	0,165
	0,5	0,000	0,009
	0,5	0,310	0,010
	0,25	0,000	0,002
	0,25	0,667	0,012
	0,25	0,000	0,000
	0,125	0,151	0,536
	0,125	0,605	0,612
	0,125	0,001	0,013
	Příklad	1 0

Studie s inzulínovou provokací

Koncentrace glukosy v plasmě jsou udržovány na fyziologicky stanovené hodnotě různými nervovými a hormonálními mechanismy. Hlavním hormonem, který snižuje hladinu glukosy v krvi je insulin a hlavním hormonem zvyšujícím hladinu glukosy v krvi je glukagon, což jsou oba hormony slinivky břišní. Při glukoregulaci však hrají důležitou úlohu také některé další hormony, jako jsou růstový hormon, epinefrin a adrenální glukokortikoidy. Odchylky od normálně nastavené koncentrace glukosy jsou zaznamenávány nervovými buňkami sídlícími v hypotalamové oblasti mozku. Když tyto buňky zaznamenají pokles hladiny glukosy v krvi, aktivují špatně definované neurální dráhy mozku, což má za následek excitaci jiných buněk hypotalamu, které produkují uvolňující faktor 41-aminokyselinového peptidů, kortikotropinu (CRF) a 9-aminokyselinový peptid arginin vaso31

-presin- (VP >. Tyto hypothalámové _£faktory... jsouvylučovány z-------mozku do specializované hypotalamo-hypofýzové portální kapilární sítě, a jsou unášeny krví pravým endokrinním způsobem do předního laloku hypofýzy. Zde se tyto hormony vážou s vysokou afinitou k receptorúm umístěným na kortikotropních buňkách hypofýzy. Aktivace receptoru CRF a/nebo VP depolarizuje buňky, zvyšuje influx vápníku a sekreci adrenokortikotropinu (ACTH) do periferní krve. ACTH, jak již je z jeho jména zřejmé, stimuluje adrenální kortex pro syntézu a uvolňování primárních glukokortikoidních hormonů, kortisolu (u člověka) a kortikosteronu (u hlodavců). Tyto hormony potom vyvolávají zvýšení koncentrace glukosy v plasmě.

Podání inzulínu normálnímu subjektu (at již člověku nebo hlodavci) se tedy může použít jako provokační zkoušky pro stanovení odpovědi subjektu na stres. Stres může být v tomto případě definován jako nekontrolovatelné narušení normálního glukoregulačního mechanismu subjektu exogenním inzulínem. Experimentální indukce takového stresu je užitečná při zjištování kompenzačních mechanismů, které se podílejí na odstraňování stresových situací. Kromě toho je tato provokační zkouška užitečná pro stanovení účinnosti farmakologických činidel modulujících endokrinní změny indukované stresem a poruchy, které z takových změn vyplývají.

A. Účinky inzulínu na sekreci ACTH

Pro stanovení, zda léčivo může modifikovat odpověd na stres, je třeba charakterizovat samotnou odpověd na stres. K tomuto účelu se dospělým samcům krysy SpragueDawley (Charles River, Kingston, New York, USA) podává zvyšující se dávka inzulínu (Humulin, Eli Lilly Co.) v rozmezí od 0,05 do 5 m.j./kg nebo fyziologický roztok chloridu sodného intraperitoneálně, vždy po nočním půstu. 30 minut po podání inzulínu se zvířata usmrtí dekapitací a krev z trupu se zachytí do polypropylenových zkumavek obsahujících-400 μΐ 10% roztoku kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) o- teplo tě 4’C. Plasma se oddělí centrifugací a uskladní při -80’C až do doby použití pro stanovení ACTH. Koncentrace ACTH v plasmě se stanoví radioimunoesejem za použití antiséra (IgG Corporation, Nashville, TN, USA) a ¹²⁵I-značeného ACTH (ICN Corporation, Costa Mesa, CA, USA) způsobem popsaným v publikaci Nicholson et al., Clin. Chem. 30: 259 až 265 (1984).

Účinky hypoglykemie indukované inzulínem na sekreci ACTH u samců krysy jsou znázorněny na obr. 1. Podáním vehikula (v roztoku chloridu sodného; 0) se neovlivní základní hladina ACTH u experimentálních zvířat (hladina ACTH v plasmě 42,1 ± 4,2 pg/ml). Při nejnižší zkoušené dávce inzulínu (0,05 m.j./kg) se hladina ACTH nezvýší. Při dávce 0,1

m.j./kg dojde ke značnému zvýšení koncentrace ACTH v plasmě ve srovnání s kontrolními zvířaty ošetřenými pouze vehikulem, přičemž vyšší dávky inzulínu poskytují srovnatelně vyšší odpověď ACTH, která se začne ustalovat (vytváří plato) při dávce 5 m.j./kg. Na základě těchto dat se pro další experimentální studie zvolí dávka 0,5 m.j./kg. Tato dávka totiž poskytuje odpověď ACTH s vysokou amplitudou, která je snadno detegovatelná radioimunoesejem (RIA), ale nepředstavuje maximální odpověď. Kdyby se použilo vyšší dávky inzulínu, přiblížila by se odpověď ustálené hodnotě plato na křivce, což by mohlo stížit detekci následného odvrácení stresu indukovaného inzulínem. Dávka 0,5 m.j./kg se nalézá v nejstrmější části křivky závislosti odpovědi na dávce, což usnadňuje detekci signifikantních modifikací responsivní sekrece ACTH.

B. Účinek peptidu podle vynálezu na sekreci ACTH indukovanou inzulínem

-UWJWJBR

- 33 .................Jak již bylo uvedeno výše, podání inzulínu se může________ použít jako provokační zkoušky pro zjištění, jak organismus odpovídá na stres a jak lze odpovědí manipulovat. Na obr. i je ukázáno, že podání inzulínu krysám vyvolává zvýšení koncentrace ACTH v plasmě. Pro demonstraci faktu, že tuto odpověď je možno ovlivnit peptidy podle vynálezu, například peptidem acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-isobutyl (dále jen peptidem), se provedou následující experimenty.

Při těchto experimentech se použije dospělých samců krysy Sprague-Dawley. Po nočním půstu se zkušebním zvířatům orální sondou zavede peptid nebo roztok chloridu sodného.

Také se použije podávání ve formě subkutánních injekcí.

Dávka peptidu leží při orálním podávání v rozmezí od 0,1 do 10 mg/kg a při subkutánním podávání v rozmezí od 0,03 do 3,0 mg/kg tělesné hmotnosti. Po 48 hodinách se všem zkušebním zvířatům podá inzulín (0,5 m.j./kg) a po dalších 30 minutách se zvířata usmrtí dekapitací. Krev z trupu se tak jako ve výše popsaném případě zachytí do polypropylenových zkumavek obsahujících 400 μΐ 10% roztoku EDTA o teplotě 4’C. Plasma se oddělí centrifugací a uskladní při -80*C až do doby použití pro stanovení ACTH. Koncentrace ACTH v plasmě se stanoví radioimunoesejem způsobem popsaným ve výše uvedené publikaci Nicholson et al. za použití antiséra (IgG Corporation, Nashville, TN, USA) a ¹²⁵I-značeného ACTH (ICN Corporation, Costa Mesa, CA, USA).

Intraperitoneální podání inzulínu v dávce 0,5 m.j./kg zvýší u zvířat, která byla předběžně ošetřena roztokem chloridu sodného podaným orální sondou nebo ve formě subkutánní injekce, koncentraci ACTH v plasmě z hodnoty 16,8 ± 0,8 pg/ml přibližně na 200 pg/ml (viz obr. 2).

Podání peptidu subkutánní cestou v dávce 0,1 mg/kg vyvolá mírné potlačení odpovědi ACTH na inzulín. Prahová dávka pro signifikantní potlačení sekrece ACTH vyvolané inzulínem je

0,3 mg/kg Cs♦c.J ^_při podání 48 hodin před inzulínem. Peptid v subkutánní dávce 1,0 a 3,0 mg/kg také potlačuje odpověď ACTH. K potlačení odpovědi ACTH na inzulín dochází i při podání peptidu orální sondou. V dávce 1 mg/kg p.o. vykazuje peptid pouze malé účinky na sekreci ACTH indukovanou inzulínem. Vyšší dávky peptidu (3,0 a 10,0 mg/kg) vyvolávají vysoce signifikantní pokles intenzity odpovědi ACTH na inzulín.

Tyto experimenty ukazují, že peptid podle vynálezu má schopnost potlačovat sekreci ACTH indukovanou stresem.

Jak je zřejmé z obr. 2, je při této provokační zkoušce peptid účinný jak při orálním, tak při subkutánním způsobu podání. Minimální účinná dávka při subkutánním podávání je přitom desetkrát nižší než minimální účinná dávka při podání orální cestou, což ukazuje, že peptid překonává gastrointestinální absorpční bariéru.

Přikladli

Snížení behaviorální odpovědi na sociální stres

Behaviorální odpověď na sociální konfliktní stres (paradigma resident/vetřelec) [E. M. Pich et al., Psychoneuroendocrinology 18; 495 až 507 (1993)] se vyhodnocuje pomocí zkoušky úzkosti v bludišti Elevated Plus Maze Test [S. Pellow et al., J. Neurosci. Meth. 14; 149 až 167 (1985)] za použití dospělých krys Wistar. Experimentální skupiny se 2 dny před zkouškou ošetřují orálním podáváním acetyl-ArgPro-Asp-isobutylamidu nebo vehikula (kontrolní skupina) v dávce 5 mg/kg. Sociální konfrontace se zahájí vnesením experimentální krysy do domovského teritoria agresivního samčího residenta. Skupiny se rozdělí tak, že se krysy buď umístí na 30 minut do nové klece bez sociální interakce (nulový stres) nebo jsou sociálně deprimovány a exponovány res identní kryse na_dobu,3 Q._minut_< sociální stres) B e z ---prostředně po sociálním konfliktu se zvířata jednotlivě umístí na 5 minut na centrální plošinu obrácenou do uzavřené větve bludiště. Pětiminutová zkouška zahrnuje měření jednak celkové aktivity (počet vstupů do otevřených a uzavřených větví bludiště) a jednak doby strávené v otevřených a uzavřených větvích bludiště. Toto měření se provádí automaticky a je řízeno počítačem.

Stresované krysy stráví podstatně kratší dobu v otevřených větvích a dávají přednost ohraničenému prostoru uzavřených větví. Jak je to zřejmé z obr. 3, stresované krysy, které byly po dobu 2 dnů před zkouškou ošetřovány vehikulem, stráví podstatně kratší dobu v otevřených větvích (P = 0,008), zatímco krysy 2 dny před zkouškou ošetřované peptidem neprojevují tuto stresovou změnu chování. Posledně uvedené krysy nevykazují žádný signifikantní rozdíl (P = 0,199) ve srovnání s nestresovanými krysami a stráví podstatně více času v otevřených větvích (P = 0,041), než srovnatelně stresované krysy, které obdržely kontrolní vehikulum. Je tedy možno uzavřít, že acetyl-Arp-Pro-Asp-isobutylamid v orální dávce 5 mg/kg blokuje anxiogenní změny chování vyvolané sociálním stresem.

Příklad 12

Farmakokinetika acetyl-Arp-Pro-Asp-isobutylamidu u krysy

Krysám se podá jedna orální dávka roztoku výše uvedeného peptidu (ve sterilní vodě pro injekce podle lékopisu U.S.P. (WFI). Použije se dávky acetyl-Arp-ProAsp-isobutylamidu 5, 50 nebo 300 mg/kg. Po podání dávky se krysám v několika časových intervalech odebírají krevní vzorky. Hladina peptidu v plasmě se stanovuje po extrakci z plasmy za použití stanovení zahrnujícího kapalinovou chro36 matografix aelektrosprejovou hmotnostní spektrometrii Electrospray způsobem popsaným v J. Crowther et al.,

Anal. Chem. 66: 2356 až 2361 (červenec 1994).

Po jediném orálním podání kryse v dávce 5, 50 nebo 300 mg/kg se peptid rychle absorbuje za dosažení střední píkové koncentrace v plasmě (C_max) 22, 314 a 1294 ng/ml (tyto hodnoty jsou uvedeny v pořadí, kter^ přísluší pořadí výše uvedených dávek) (viz obr. 4). Odpovídající doba po dávce (T_max) je 30 až 60 minut. Hodnoty c_max a plochy pod křivkou (AUC) získané za použití tohoto peptidu u krysy jsou úměrné dávce peptidu, což ukazuje na lineární farmakokinetiku peptidu acetyl-Arp-Pro-Asp-isobutylamid.

Příklad 13

Syntéza acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-methyl

Kopulací Boc-Asp(OBzl)-0H s methylaminem (způsobem popsaným v příkladu 3A) se vyrobí Boc-Asp(OBzl)-NH-methyl. Tato sloučenina se zbaví chránící skupiny pomocí 4M chlorovodíku v dioxanu a získaná hydrochloridová sůl peptidu se za vakua vysuší.

Kopulace acetyl-Arg-Pro-OH se sloučeninou HCl.Asp(OBzl)-NH-methyl se provedé způsobem popsaným v příkladu 3C. Chráněný tripeptid, acetyl-Arg-Pro-Asp(OBzl)-NH-methyl se katalyticky hydrogenuje za účelem odstranění benzylskupiny způsobem popsaným v příkladu 3D. Surový peptid, acetyl-ArgPro-Asp-NH-methyl, se přečistí RP-HPLC.

TLC: Rf(l) = 0,26, Rf(2) = 0,53, Rf (3) = 0,87

AAA: Arg 1,02 (1), Pro 0,98 (1), Asp 0,74 (1)

LC-MS: [MH⁺] při m/z 442,9 a.m.u. (mol.hmot.441,49)

- 37 ______________Získanýpeptidse podrobí- neuromuskulární zkoušce _ podle příkladu 9 za použití dávky 1 mg/kg. Zjištěná hodnota P je nižší než 0,001. S tím kontrastuje hodnota P (při dávce 1 mg/kg peptidů acetyl-Arg-Pro-Asp-NH₂, která činí 0,150.

Vzájemné meziskupinové porovnání (kontrolní skupina versus skupina se zkoušenou sloučeninou) poměru posledního měření k prvnímu měření se provádí dvouvzorkovým t-testem (dvě větve).

Přikladl 4

Syntéza produktu acetyl-Arg-Pro-Asp-NH-isopropyl

Kopulací Boc-Asp(OBzl)-OH s isopropylaminem (způsobem popsaným v příkladu 3A) se vyrobí Boc-Asp(OBzl)-NHisopropyl. Tato sloučenina se zbaví chránící skupiny pomocí 4M chlorovodíku v dioxanu a získaná hydrochloridová sůl peptidů se za vakua vysuší.

Kopulace produktu acetyl-Arg-Pro-OH se sloučeninou HCl.Asp(OBzl)-NH-isopropyl se provede způsobem popsaným v příkladu 3C. Chráněný tripeptid, acetyl-Arg-Pro-Asp(OBzl)NH-isopropyl se katalyticky hydrogenuje za účelem odstranění benzylskupiny způsobem popsaným v příkladu 3D. Získaný surový peptid, acetyl-Arg- Pro-Asp-NH-isopropyl, se přečistí RP-HPLC.

TLC: Rf(l) = 0,14, Rf(2) = 0,40, Rf (3) = 0,65

AAA: Arg 1,00 (1), Pro 1,00 (1), Asp 1,01 (1)

LC-MS: [MH⁺] při m/z 471 a.m.u. (mol.hmot.470,56)

Získaný peptid se podrobí neuromuskulární zkoušce podle příkladu 9 za použití dávky 1 mg/kg. Zjištěná hodnota P je nižší než 0,001.

- 38 -- ----Vynález-je možno různými.způsoby modifikovat—a---všechny takové modifikace, které jsou učiněny v duchu vynálezu a které jsou zřejmé odborníkům v tomto oboru, také spadají do rozsahu tohoto vynálezu. Pro rozsah vynálezu jsou určující následující patentové nároky.

Claims

PAT Ε N -T O -V. É______NÁROK Y < 1 10.N 1SVU

5Η3ΛΠ 3ÁW3dd avy q

1. Tripeptidy obecného vzorce 9 5 II S Z

Κ-Χ-Ϊ-Z-NHR! 1 kde | *

R představuje atom vodíku, nižší alkylskupiniy hébó', I ’» nižší alkanoylskupinu; 1 * '('2

X představuje D- nebo L-formu Arg nebo desamŤTTtr=Argó

Y přédstavuje D- nebo L-formu Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro;

Z představuje D- nebo L-formu aminokyseliny zvolené ze souboru zahrnujícího Thr, Ser, Asp, Glu, Gin,

Asn, β-Asp, Val nebo Ile; a

Rj je zvolen ze souboru zahrnujícího alkylovou nebo alkenylovou skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, popřípadě substituovanou arylskupinou nebo arylskupinou substituovanou atomem halogenu nebo alkylskupinou nebo alkenylskupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem s l až 6 atomy uhlíku nebo cyklickou methylenskupinou se 3 až 7 atomy uhlíku.
2. Tripeptidy podle nároku 1, uvedené v následujícím seznamu acetyl-Arg-Pro-Asp-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Thr-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Ser-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Val-isobutylamid, hexanoyl-Arg-Pro-Asp-isobutylamid,

Arg-Pro-Asp-methylamid,

Arg-Pro-Glu-isopropylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-methylamid,—-------------------------------acetyl-Arg-Pro-Asp-isopropylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-fenylethylamid, formyl-Arg-Pro-Asp-methylamid, hexanoyl-Arg-Pro-Asp-methylamid a desamino-Arg-Pro-Asp-isobutylamid.
3. Farmaceutický prostředek, vyznačuj ιοί se tím, že obsahuje alespoň jeden tripeptid obecného vzorce

R-X-Y-Z-NIO^ kde

R představuje atom vodíku, nižší alkylskupinu nebo nižší alkanoylskupinu;

X představuje D- nebo L-formu Arg nebo desamino-Arg;

Y představuje D- nebo L-formu Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro;

Z představuje D- nebo L-formu aminokyseliny zvolené ze souboru zahrnujícího Thr, Ser, Asp, Glu, Gin, Asn, β-Asp, Val nebo Xle; a

R_x je zvolen ze souboru zahrnujícího alkylovou nebo alkenylovou skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, popřípadě substituovanou arylskupinou nebo arylskupinou substituovanou atomem halogenu nebo alkylskupinou nebo alkenylskupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 6 atomy uhlíku nebo cyklickou methylenskupinou se 3 až 7 atomy uhlíku, ve farmaceuticky vhodné směsi.
4. Způsob výroby tripeptidů obecného vzorce R-X-Y-Z-NHR·, kde

R představuje atom vodíku, nižší alkylskupinu nebo nižší alkanoylskupinu;

X představuje D- nebo L-formu Arg nebo desamino-Arg;

Y představuje D- nebo L-formu Pro, <Aehydro-Pro nebo hydroxy-Pro;

Z představuje D- nebo L-formu aminokyseliny zvolené ze souboru zahrnujícího Thr, Ser, Asp, Glu, Gin, Asn, β-Asp, Val nebo Ile; a

Rjl je zvolen ze souboru zahrnujícího alkylovou nebo alkenylovou skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující l až 6 atomů uhlíku, popřípadě substituovanou arylskupinou nebo arylskupinou substituovanou atomem halogenu nebo alkylskupinou nebo alkenylskupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 6 atomy uhlíku nebo cyklickou methylenskupinou se 3 až 7 atomy uhlíku, vyznačující se tím, že se provádí postupem syntézy v tuhé fázi.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se t í m , že se použije výchozích látek vedoucích k peptidům uvedeným v následujícím seznamu acetyl-Arg-Pro-Asp-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Thr-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Ser-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Val-isobutylamid, ______hexanoyl-Arg-Pro-Asp-isobutylamid,--------------------- —--------Arg-Pro-Asp-methylamid,

Arg-Pro-Glu-isopropylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-methylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-isopropylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-fenylethylamid, formyl-Arg-Pro-Asp-methylamid, hexanoyl-Arg-Pro-Asp-methylamid a desamino-Arg-Pro-Asp-isobutylamid.
6. Způsob výroby tripeptidů obecného vzorce R-X-Y-Z-NHR-, kde

R představuje atom vodíku, nižší alkylskupinu nebo nižší alkanoylskupinu;

X představuje D- nebo L-formu Arg nebo desamino-Arg;

Y představuje D- nebo L-formu Pro, dehydro-Pro nebo hydroxy-Pro;

Z představuje D- nebo L-formu aminokyseliny zvolené ze souboru zahrnujícího Thr, Ser, Asp, Glu, Gin, Asn, β-Asp, Val nebo Ile; a

Rj je zvolen ze souboru zahrnujícího alkylovou nebo alkenylovou skupinu s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující 1 až 6 atomů uhlíku, popřípadě substituovanou arylskupinou nebo arylskupinou substituovanou atomem halogenu nebo alkylskupinou nebo alkenylskupinou s přímým nebo rozvětveným řetězcem s 1 až 6 atomy uhlíku nebo cyklickou methylenskupinou se 3 až 7 atomy uhlíku,

- 45 ______vyz naču __j _í__c_í___________s e_________t í m _L Je se provádí postupem syntézy v roztokové fázi.

*►
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se t í m , že se použije výchozích látek vedoucích k peptidům uvedeným v následujícím seznamu acetyl-Arg-Pro-Asp-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Thr-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Ser-isobutylamid, acetyl-Arg-Pro-Val-isobutylamid, hexanoyl-Arg-Pro-Asp-isobutylamid,

Arg-Pro-Asp-methylamid,

Arg-Pro-Glu-isopropylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-methylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-isopropylamid, acetyl-Arg-Pro-Asp-fenylethylamid, formy1-Arg-Pro-Asp-methylamid, hexanoyl-Arg-Pro-Asp-methylamid a desamino-Arg-Pro-Asp-isobutylamid.
8. Použití peptidu podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky vhodné soli pro výrobu prostředku vhodného pro regulaci imunitního systému subjektu postiženého poruchou imunitního systému.
9. Použití peptidu podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky vhodné soli pro výrobu prostředku vhodného pro regulaci nervového systému subjektu postiženého stresem, úzkostí nebo depresí.
10. Diagnostické činidlo, vy z_n a č u j i c í_____ se t ím, že obsahuje peptid nebo jeho farmaceuticky vhodnou sůl podle nároku 1.