HUT73777A - Novel tripeptides useful in immune and central nerve system therapy - Google Patents

Novel tripeptides useful in immune and central nerve system therapy Download PDF

Info

Publication number
HUT73777A
HUT73777A HU9600432A HU9600432A HUT73777A HU T73777 A HUT73777 A HU T73777A HU 9600432 A HU9600432 A HU 9600432A HU 9600432 A HU9600432 A HU 9600432A HU T73777 A HUT73777 A HU T73777A
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
pro
arg
asp
acetyl
isobutylamide
Prior art date
Application number
HU9600432A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9600432D0 (en
Inventor
Gideon Goldstein
James I Koenig
Ponniah Shenbagamurthi
Original Assignee
Immunobiology Res Inst Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immunobiology Res Inst Inc filed Critical Immunobiology Res Inst Inc
Publication of HU9600432D0 publication Critical patent/HU9600432D0/hu
Publication of HUT73777A publication Critical patent/HUT73777A/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
    • C07K5/0823—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/26—Psychostimulants, e.g. nicotine, cocaine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Az immunrendszer és a központi idegrendszer kezelésére hasznos új tripeptidek
A bejelentés általában az immunrendszer és a központi idegrendszer kezelésében hatásos peptidekre vonatkozik, közelebbről biológiailag aktív új peptidekre.
Az immunmodulátor hatású timopoietin fehérjét marha és humán csecsemőmirigyből izolálták. Továbbá, olyan kis peptideket szintetizáltak kémiai úton, amelyek a timopoietin biológiai aktivitását utánozzák. Lásd például az U.S. 4 505 853 számú szabadalmi leírásban és az ennek megfelelő 146 266 számú európai szabadalmi bejelentésben.
Az utóbbi időben nagyszámú olyan közleményt és szabadalmat tettek közzé, amelyek ilyen fehérjékre és szintetizált peptidekre vonatkoznak. Az U.S. 4 190 646 számú szabadalmi leírásban a timopentin pentapeptidet ismertetik, amely a timopoietin aktív helye, és amelynek szekvenciája Arg-Lys-Asp-Val-Tyr, valamint olyan peptid kompozíciókat ismertetnek, amelyekben a fenti pentapeptidnek az amino- és/vagy karboxil terminálisát különböző csoportokkal helyettesítették.
A timopoietinről ismert, hogy a kolinerg neuromuszkuláris transzmissziót szabályozza [G. Goldstein és W. W. Hoffman, J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry, 31, 453-459 (1968); és G. Goldstein, Natúré, 247, 11-14 (1974)]. Á timopoietin, akárcsak a timopoietin receptorok (TPR) az agyban vannak jelen, így a timopoietin szinte bizonyosan agyi funkciókban érintett.
Az utóbbi időkben a timopentint mint a stressz által kiváltott változások antagon istáját, stressz-védő aktivitást kifejtő anyagot azonosították [V. Klusa és munkatársai, Regulatory Peptides, 27, 355-365 (1990)].
A szakterületeken további olyan peptidek iránti igény áll fenn, amelyek az ember és más emlősök immunrendszerének diszfunkciói kezelésében hasznos diagnosztikai és/vagy terápiás szerek lehetnek, beleértve ezekbe a
Aktaszám: 83266-3839-GÁ/KmO • · · ·
- 2 diszfunkciókba azokat, amelyek az öregedéssel és különféle fizikai állapotokkal kapcsolatosak, valamint igény van olyan peptidekre, amelyek a központi idegrendszer működési rendellenességeinek kezelésére hasznosak.
A következőkben a találmány összegzését adjuk.
A találmány új tripeptidekre vonatkozik, amelyek biológiailag aktívak, és az immunrendszer és a központi idegrendszer diagnosztikumaként és kezelésére alkalmasak. Ezek a peptidek különösen stabilak, és jól abszorbeálódnak, így orális adagolási mód mellett hatásosak.
A találmány további szempontja szerint egy olyan új peptidre vonatkozik, amely az R-X-Y-Z-F^ általános képlettel írható le, ahol R, X, Y, Z és Rí jelentése az alábbiakban, a részletes leírásban ismertetett. Ezek a peptidek az immunrendszer és/vagy a központi idegrendszer szabályozásában hasznosak.
A találmány egy további szempontja szerint a fenti peptidek előállítási eljárására vonatkozik, amely történhet oldatban végrehajtott szintézissel, szilárd fázisú szintézissel vagy enzimes szintézissel.
Egy még további szempont szerint a találmány gyógyászati készítményekre vonatkozik, amelyek az előzőekben megnevezett peptidek közül egyet vagy többet gyógyászati szempontból elfogadható hordozóanyaggal kombináltan tartalmaznak.
Egy még további szempontja szerint a találmány eljárást nyújt különféle, az idegrendszerrel kapcsolatos rendellenességek és hiányosságok kezelésére, különösen az öregedésnek a csecsemőmirigy idővel való összezsugorodása által kiváltott hatásai kezelésére.
A találmány eljárást nyújt továbbá a központi idegrendszer rendellenességeinek kezelésére, beleértve pszichiátriai rendellenességeket, például szorongást és depressziót, valamint krónikus fertőzések, immunhiány és stressz kezelésére. Ezek az eljárások abban állnak, hogy az érintett személynek a találmány szerinti gyógyászati készítmény hatásos mennyiségét adagoljuk.
• · · · « ····· · · • · · · · ··· ···· ··· ·« ·«·
- 3 A találmány további szempontjai és előnyei a következő részletes leírástól tűnnek ki, amelyek a jelenleg előnyösnek tartott megvalósítási módokat bemutató példákat tartalmaznak.
A következőkben a rajzok rövid ismertetését adjuk.
Az 1. ábrán inzulinnal kiváltott hipoglikémia hatását mutatjuk be plazma ACTH koncentrációkra (pg/ml) patkányban, az Y tengelyen a plazma ACTH koncentrációt, az X tengelyen az intraperitoniálisan adagolt inzulin dózisát (ΙΕ/kg) adjuk meg.
A 2. ábrán az acetil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil, egy a találmány szerinti peptid hatását mutatjuk be inzulinnal kiváltott ACTH kiválasztásra, összehasonlítjuk az orális adagolás mellett (körökkel jelölt görbe) és a szubkután adagolás mellett (háromszöggel jelölt görbe) elért hatásokat. Az Y tengelyen a plazma inzulinnal kiváltott ACTH szintjét (pg/ml), az X tengelyen a peptid dózisát (mg/kg) adjuk meg.
A 3. ábrán patkányokon szociális stresszre adott viselkedési válasz acetil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid (IRI-695) adagolása hatására bekövetkező csökkenése látható, amint azt a szorongás értékelésére a 11. példában a labirintus vizsgálatban (Elevated Plus Maze teszt) leírtuk. Az Y ordinátán a nyitott karokban töltött idő százalékos értéke, az X ordinátán a stressz hatásnak kitett vagy ki nem tett, peptid kezelésben részesült vagy nem részesült patkányok csoportjai szerepelnek.
A 4. ábrán acetil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid farmakokinetikáját mutatjuk be patkányokon (N = 4 patkány egy időpontra) a peptid egyetlen orális adagolását követően mért átlag (± S. D.) plazma koncentráció értékként. Az Y tengelyen a peptid koncentrációja ng/ml értékben, az X tengelyen az adagolástól számítva eltelt idő percekben szerepel. Az adagolt dózisok 5 mg/kg (üres kör), 50 mg/kg (üres háromszög) és 300 mg/kg (üres négyzet).
A következőkben a találmány részletes ismertetését adjuk.
• · · · · · • ·
- 4 A találmány tárgyát az R-X-Y-Z-NHRi általános képletű peptid képezi, ahol
R jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil- vagy rövid szénláncú alkanoilcsoport;
X jelentése Arg vagy dezamino Arg L- vagy D-formája,
Y jelentése Pro, dehidro-Pro vagy hidroxi-Pro D- vagy L-formája;
Z jelentése a Thr, Ser, Asp, Glu, Gin, Asn, β-Asp, Val vagy Ile aminosavak D- vagy L-formája; és
Rí jelentése 1-6 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú alkil- vagy alkenilcsoport, amelyek adott esetben egy arilcsoporttal helyettesítettek lehetnek, vagy egy halogénatommal vagy egyenes vagy elágazó láncú, 1-6 szénatomos alkil- vagy alkenilcsoporttal helyettesített arilcsoport vagy egy 3-7 szénatomos gyűrűs metiléncsoport.
Nem várt módon arra a felismerésre jutottunk, hogy ezek a helyettesített amidcsoportokat tartalmazó tripeptidek hasonló módon viselkednek, mint a timopentin peptid analógok, amelyek négy vagy öt aminosav hosszúságúak. így a találmány szerinti tripeptidek képesek emlősök immunrendszerének szabályozására és arra való hatás gyakorlásra. Ezek a tripeptidek a központi idegrendszer szabályozására is képesek.
Különösen előnyösek az alábbi peptidek: acetil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Thr-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Ser-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Val-izobutilamid, hexanoil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid,
Arg-Pro-Asp-metilamid,
Arg-Pro-Glu-izopropilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-metilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-izopropilamid, ·· ····
- 5 acetil-Arg-Pro-Asp-fenil-etilamid, formil-Arg-Pro-Asp-metilamid, hexanoil-Arg-Pro-Asp-metilamid, és dezamino-Arg-Pro-Asp-izobutilamid.
A leírásban a peptidek aminosav összetevőit, és bizonyos, a peptidek előállításánál alkalmazott anyagokat a célszerűség kedvéért rövidítésükkel azonosítjuk. Az aminosavak jelölésére alkalmazott ezen hárombetűs rövidítések többsége jól ismert A rövid szénláncú alkilcsoport megjelölésen 1-10 szénatomos alkilcsoportot értünk, azaz olyan CnH2n+i általános képletű csoportot, ahol n értéke 1 és 10 közötti. Hasonló módon, rövid szénláncú alkanoilcsoporton 1 és 10 szénatom közötti alkanoilcsoportot értünk, azaz olyan 0
II CnH2n+1 C általános képletű csoportot, ahol n értéke 0 és 9 közötti.
A találmány szerinti peptideket általában ismert eljárásokkal állítjuk elő. Célszerűen a találmány szerinti polipeptid szintézisét a Merrifield, J.A.C.S., 85, 2149-2154 (1963) szakirodalmi helyen leírt szilárdfázisú szintézis eljárással végezzük. Ez az eljárás jól ismert, a peptidek előállításánál szokásosan alkalmazott módszer. A szilárdfázisú szintézis eljárás védett aminosavak növekvő peptidlánchoz való lépésenként! adagolását foglalja magában, ahol a peptidlánc egy szilárd gyanta részhez kovalensen kötött. Ezzel az eljárással a reagenseket és a melléktermékeket szűréssel távolítjuk el, így kiküszöböljük a köztitermékek tisztításának szükségességét. Az eljárás általános elve abban áll, hogy a lánc első aminosavát egy szilárd polimerhez kötik kovalens kötéssel. Ezt követően védett aminosavakat adagolnak, egyszerre egyet (lépésenként! stratégia), vagy blokkokat (szegmens stratégia), míg a kívánt szekvencia felépül. Végül a védett peptidet a szilárd gyanta hordozóról eltávolítják, és a védőcsoportokat lehasítják.
• «<
V ·*·♦<· 4 • · · « Β ·*«*·«···» »e e
- 6 Az aminosavak bármely megfelelő polimerhez, mint gyantához kapcsoltak lehetnek. A gyantának egy olyan funkciós csoportot kell tartalmaznia, amellyel a védett aminosav kovalens kötés révén erősen kötődik. Erre a célra különböző polimerek alkalmasak, például a cellulóz, a poli(vinil-alkohol), a poli(metil-metakrilát), továbbá a polisztirol. A megfelelő gyanták kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, és szakember számára jól ismertek. Az ilyen szintézisben alkalmas védőcsoportok közé tartoznak például a terc-butil-oxi-karbonil- (Boc), benzil- (Bzl), terc-amil-oxi-karbonil- (Aoc), tozil- (Tos), o-bróm-fenil-metoxi-karbonil- (BrZ), 2,6-diklór-benzil- (BzlCI2), és fenil-metoxi-karbonil- (Z vagy CBZ) -csoport. További védőcsoportokat ismertetnek Merrifield előzőekben idézett közleményében, valamint a J.F.W. McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, 1973. szakirodalmi helyen. Ezen szakirodalmakat leírásunkba referenciaként építjük be.
A találmány szerinti peptidek előállítására szolgáló általános eljárás elsőként a karboxil-terminálisán védett aminosav gyantához való kapcsolását foglalja magában. A kapcsolást követően a gyantát szűrjük, mossuk, és a karboxil-terminális aminosav α-aminocsoportján lévő védőcsoportot (célszerűen terc-butil-oxi-karbonil-csoportot) eltávolítjuk. Természetesen ennek a védőcsoportnak az eltávolítását a gyanta és az aminosav közötti kötés megszakítása nélkül végezzük el. Ezután a következő aminosavat, kívánt esetben oldalláncán védőcsoporttal ellátott aminosavat, kapcsoljuk a gyantán lévő aminosav szabad α-amino-csoportjára. Ez a kapcsolás a második aminosav szabad karboxilcsoportja és a gyantához kapcsolt első aminosav aminocsoportja közötti amidkötés képződésével jár. A műveleteknek ezt a sorát ismételjük meg a következő aminosavakkal mindaddig, míg valamennyi aminosavat a gyantához kapcsoljuk. Végül a védett peptidet lehasítjuk a gyantáról, és a védőcsoportok eltávolításával nyerjük a kívánt peptidet. A peptidnek a gyantáról való lehasításához és a védőcsoportoknak a pepiidről való eltávolításához alkalmazott hasi• · ·Ό» * » ·· · · · * · ♦ · • ····« · · • Λ · « ♦*·♦·«···· · · ·
- 7 tási eljárások megválasztása a gyantától és a védőcsoportoktól függő, a peptidszintézisben jártas szakember számára ismert.
A peptidszintézis más eljárását ismertetik a Bodanszky és munkatársai, Peptide Synthesis, 2. kiadás (John Wiley and Sons: 1976) szakirodalmi helyen. Például a találmány szerinti peptidek standard oldatban végrehajtott peptidszintézis eljárásokkal szintetizálhatok, amelyek aminosavak vagy peptid fragmentumok lépésenként! vagy blokként való kapcsolását foglalják magukban az amidkötés kémiai vagy enzimes eljárásokkal való képzésével. [Lásd a H.D. Jakubke, The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press (New York 1987), 103-165. oldal; J.D. Glass, u.o., 167-184. oldal szakirodalmi helyen, és az EP 0324659 A2 számú szabadalmi leírásban, ahol enzimes peptidszintézis eljárásokat ismertetnek]. Ezek az oldatban végrehajtott szintézis eljárások szakember számára jól ismertek.
A találmány szerinti peptidek más, szakember számára ugyancsak ismert eljárásokkal is előállíthatok, például géntechnológiai eljárásokkal [lásd például a Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2. kiadásában, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989) szakirodalmi helyen].
A találmány szerinti peptidek sav- és bázis-addíciós sói ugyancsak alkalmasak diagnosztikai és/vagy terápiás szerekként. Az ezekkel a peptidekkel sóképzésre képes savak körébe tartoznak például - a korlátozás szándéka nélkül - szervetlen savak, például hidrogén-klorid, hidrogén-bromid, perklórsav, salétromsav, tiociánsav, kénsav, foszforsav és hasonlók. Szerves savakat is alkalmazhatunk a találmány szerinti sók előállítására, például hangyasavat, ecetsavat, propionsavat, glikolsavat, tejsavat, piruvinsavat, oxálsavat, malonsavat, borostyánkősavat, almasavat, fumársavat, citromsavat, szukcinaminsavat, antranilsavat, fahéjsavat, naftalinszulfonsavat, szulfanilsavat és hasonlókat.
• · • · · · · · · • · · · • · · · *
- 8 A találmány szerinti peptidek közül a savas egységekkel bíró peptidekkel sók képzésére képes bázisok körébe tartoznak többek között szervetlen bázisok, például nátrium-hidroxid, ammónium-hidroxid, kálium-hidroxid és hasonlók. Szerves savak is alkalmazhatók, például többek között mono-, di- és trialkilés aril-aminok, például trietil-amin, diizopropil-amin, metil-amin és dimetil-amin, továbbá adott esetben helyettesített etanolaminok, például etanolamin vagy dietanolamin.
A találmány szerinti peptidek biológiai hozzáférhetősége kielégítő ahhoz, hogy emlősök, ezen belül ember immunrendszerére és/vagy központi idegrendszerére különféle szabályozó hatásokat fejtsenek ki. Sajátosan a találmány szerinti peptidek eliminációs féléletideje mintegy 50-100 perc, amint azt a 11. példában bemutatásra kerülő farmakokinetikai vizsgálatokkal kimutattuk.
Ezek a peptidek, és az ezeket tartalmazó készítmények nem várt módon különféle szabályozó hatásokat fejtenek ki emlősök immunrendszerére és/vagy központi idegrendszerére. Például a találmány szerinti peptidek autoimmun rendellenességek, valamint az immunrendszer rendellenességeivel jellemezhető állapotok kezelésére alkalmasak. A találmány szerinti peptidek immunmodulátor jellemzőik folytán terápiásán hasznosak emberek és feltehetően más állatok kezelésében, mivel képesek emlősök immunrendszerében való változások kiváltására.
A találmány szerinti peptidek szorongásoldó terápiás szerekként is hasznosak lehetnek. Például egy a találmány szerinti peptiddel előkezelt betegben csökkenhet a stressz reakciókat közvetítő kortikotropint szabaddá tevő faktor (CRF) szintje. Továbbá, patkányokban szociális stresszre adott viselkedési válasz csökkenését észleltük a találmány szerinti peptidekkel előkezelt állatokon, amint azt a rágcsálók szorongásának vizsgálatára szolgáló állatmodellen, labirintus tesztben (Elevated Plus Maze teszt) mértük. Ez a teszt a szakterületeken jól ismert, mint a lehetséges szorongásoldó vegyületek osztályainak azonosítá- 9 sára szolgáló teszt, szokásosan használják patkányok szociális stresszre adott viselkedési válaszának tanulmányozására [lásd a Pich, E.M. és munkatársai, Psychoneuroendocrinology, 18, 495-507 (1993); Pellow, S. és munkatársai, J. Neurosci. Meth., 14. 149-167 (1985)] szakirodalmi helyeken. így a találmány szerinti peptidek hasznosak depresszió ellenes kezelésekre alkalmazva, és hasonlóan hasznosak más stressz által kiváltott rendellenességek kezelésére.
A találmány szerinti peptidek használhatók az immunrendszer öregedésének hatásai csökkentésére is. Amint a csecsemőmirigy a korral összezsugorodik, a timopoietin szintje, amely egy a csecsemőmirigyből származó poiipeptid, csökken, és ennek eredményeként arányosan nő a stressz által kiváltott CRF, adrenokortikotróp hormon (ACTH) és kortikoszteroidok szintje. így a találmány szerinti peptidek adagolása, amelyek biológiai aktivitása hasonló a timopoietinéhez, segíthet az öregedésnek az immunrendszer nem kielégítő működésével vagy működéshiányával kapcsolatos hatásai csökkentésében.
A találmány szerinti peptidek hasznosak lehetnek immunstimulátorokként is krónikus fertőzésben szenvedő, vagy az immunrendszer hiányosságával küzdő betegeknek adagolva. Az immunrendszer hiányossága lehet rákos megbetegedés vagy annak kezelése következménye, vírusfertőzések, köztük HÍV és herpesz szimplex és egyebek eredménye.
Továbbá, a találmány szerinti peptidek hasznosak nagyobb sebészeti beavatkozások által kiváltott vagy más traumákkal, például égéssel járó stressz kezelésére.
A találmány tárgyát képezik továbbá az előzőekben ismertetett peptidek vagy sav vagy bázis addíciós sóik közül egyet vagy többet tartalmazó gyógyászati készítmények is. Ezeket a peptideket, vagy a peptideket vagy savakkal vagy bázisokkal alkotott sóikat tartalmazó gyógyászati készítményeket általában bármely olyan területen hasznosnak tekintjük, amelyben a sejt-immunitás részes, különösen immunitáshiány esetén. A találmány szerinti gyógyászati ké- 10 szítmények hasznosak továbbá a központi idegrendszer egyensúlyh lányának szabályozásában is.
A találmány eljárást nyújt egy egyén immunrendszerének és/vagy központi idegrendszerének rendellenességeiből adódó állapotok kezelésére, amely eljárás abban áll, hogy az egyénnek a találmány szerinti peptidek vagy gyógyászati készítmények közül legalább egyet terápiásán hatékony mennyiségben adagolunk. A terápiásán hatékony mennyiség megjelölésen olyan mennyiséget értünk, amely a fent hivatkozott állapotok kezelésére hatékony.
A találmány szerinti gyógyászati készítmények előállítására egy találmány szerinti peptidet mint hatóanyagot bensőséges elegybe hozunk egy a gyógyászati készítmények készítésénél szokásosan alkalmazott gyógyászati hordozóanyaggal. Ez a hordozóanyag széles körben változó lehet a készítmény adagolásának kívánt módjától függően, például orális, szublingvális, rektális, nazális vagy parenterális adagolástól függően. Jelenleg előnyösnek tartjuk az orális adagolást.
Az előnyös orális adagolási formáknak megfelelő készítmények előállításánál bármely szokásos gyógyászati közeget alkalmazhatunk. Például orális folyékony készítmények (például szuszpenziók, elixírek és oldatok) készítésére olyan közeget alkalmazunk, mint például a víz, olajok, alkoholok, alkalmazhatunk továbbá ízesítőanyagokat, tartósítószereket, színezékeket és. hasonlókat. Az orális adagolásra szolgáló szilárd készítmények (például porok, kapszulák és tabletták) készítésére hordozóanyagként használhatunk például keményítőket, cukrokat, hígítóanyagokat, granulálószereket, csúszást elősegítő szereket, kötőanyagokat, szétesést elősegítő szereket és hasonlókat. Alkalmazhatunk szabályozottan felszabaduló formákat is. Adagolásuk egyszerűsége miatt a legelőnyösebb orális dózisegység formáknak a tablettákat és a kapszulákat tekintjük, ezek készítésénél nyilvánvalóan szilárd, gyógyászati célra alkalmas
- 11 hordozóanyagokat alkalmazunk. Kívánt esetben a tabletták bevonhatók cukorral vagy bélben oldódó bevonattal szokásos eljárások alkalmazásával.
Parenterális készítmények céljára hordozóanyagként előnyösen vizet alkalmazunk, bár más összetevők is lehetnek jelen, például az oldhatóság elősegítésére vagy tartósítás céljára. Injektálható szuszpenziókat is készíthetünk, ebben az esetben megfelelő folyékony hordozóanyagokat, szuszpendálóanyagokat és hasonló összetevőket alkalmazunk.
A találmány szerinti tripeptid általában parenterális adagolás esetén mintegy 0,03 és 30 mg/testtömeg kg közötti mennyiségekben hatásos. Előnyös a mintegy 0,3 mg/testtőmeg kg mennyiség. Orális adagolás esetén a találmány szerinti peptidek általában mintegy 0,5 és 50 mg/testtömeg kg között hatásosak, előnyös a mintegy 3 mg/kg mennyiség. Az ilyen szintek mellett gyakorolt aktivitás különösen alkalmassá teszi ezeket a peptideket tabletta méretű, orális adagolásra szolgáló gyógyászati készítményekként. A fenti dózisokat különféle időközönként adhatjuk be embernek, például a napi adagolás és a legalább hetente két alkalommal történő közötti adagolás közötti variációkban. A jelenleg legelőnyösebbnek tartott adagolási periodicitás a heti három alkalom. Végülis azonban az adagolási rend a beteg fizikai állapotától és a kezelendő állapot fennállásának időtartamától függ, például vírusos megbetegedések esetén az adagolási rendet a betegség időtartamára választjuk. Krónikus betegség, például stressz, HÍV és hasonlók esetén az adagolás a tünetek időtartamától függő.
A következő példákban a találmányt részleteiben mutatjuk be a korlátozás szándéka nélkül. A leírásban mindvégig, és a példákban a rész megjelölésen tömegrészt értünk, ha más megjelölés nem szerepel. Az előzőekben ismertetett rövidítéseken kívül a példákban a következő rövidítéseket alkalmazzuk: TFA: trifluor-ecetsav; HOAc: ecetsav; CH2CI2: metilén-klorid; CH3CN: acetonitril; DMF: dimetil-formamid; NH4OAc: ammónium-acetát; NH4OH: ammónium- 12 - • · · · · · 4 • · · · ·· • · · · · * «··« «· ·*«·
-hidroxid; n-PrOH: n-propanol; n-BuOH: n-butanol; Pir: piridin; DCC: diciklohexil-karbodiimid; HOBt: 1-hidroxi-benzotriazol; DMAP: dimetil-amino-piridin; HF: hidrogén-fluorid; TCA: triklór-ecetsav; BHA: benzhidril-amin; p-MBHA: p-metil-benzhidril-amin; DIC: diizopropil-karbodiimid; NMM: N-metil-morfolin; és MeOH: metanol. A további, szokásos rövidítések azonosítása a The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, 1. és 2. kötet, szerk.: E. Gross and J. Meienhofer, Academic Press (New York 1987) és a IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature, J. Bioi. Chem., 245, 6489-6497 (1970) és J. Bioi. Chem., 250, 3215-3216 (1975) szakirodalmi helyen található.
Ezek a példák a találmány előnyős megvalósítási módjait illusztrálják. A példák csak a bemutatást szolgálják, nem az oltalmi kör korlátozását
1. Példa
Hexanoil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil szintézise
A. N-izobutil-amino-metil - gyanta készítése g, 1,06 mmól Cl/g Merrifield gyantát 200 ml izobutil-aminnal reagáltatunk 45 °C hőmérsékleten 72 órán át. A lombikot rotációs bepárlón légköri nyomáson gyenge forgatással keverjük. 72 óra elteltével a feleslegben lévő izobutil-amint szűréssel eltávolítjuk, és a gyantát 3 x 100 ml CH2CI2, 3 x 100 ml DMF, 3 x 100 ml CH2CI2, 3 x 100 ml MeOH, 3 x 100 ml CH2CI2 és 3 x 100 ml vízmentes éter alkalmazásával mossuk. A kapott gyantát vákuumban szárítjuk, így 20,05 g gyantát nyerünk.
B. Hexanoil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil szilárdfázisú szintézise
Az előzőekben említett peptidet szilárdfázisú eljárással, lépésenként! kapcsolással szintetizáljuk. A szintézist 3 mmól, 3 g, 1 mmól/g gyanta N-izobutil-amino-metil - gyanta alkalmazásával kezdjük, az aminosavakat a-amino-csoportjukon Boc csoporttal védjük. A guanidino Arg oldallánc védelmére Tos csoportot alkalmazunk. Az Asp oldallánc karboxilcsoportot Bzl csoporttal véd• · jük. Minden kapcsolást diizopropil-karbodiimid - HOBt módszerrel végzünk az
alábbiakban megadott műveleti rendnek megfelelően:
Lépés Reagens Idő (perc)
1. CH2CI2 mosás 3x1 perc
2. 40 % TFA -10 % anizolt tartalmazó CH2CI2 1x5 perc
3. 40 % TFA -10 % anizolt tartalmazó CH2CI2 1 x 25 perc
4. CH2CI2 mosás 3x1 perc
5. 10 % NMM-t tartalmazó CH2CI2 2x5 perc
6. CH2CI2 mosás 3x1 perc
7. DMF mosás 2x1 perc
8. Boc-aminosav (9 mmól) és HOBt (3 mmól) DMF-ban 1x3 perc
9. DIC (9 mmól) a fentiekhez adva és összerázva 1 x 180 perc
10. Kívánt esetben ismételt kapcsolás a 4-9. lépések ismétlésével
11. DMF mosás 3x1 perc
Az Arg N-terminális Boc-csoportjának eltávolítása és semlegesítése után kapott peptid-gyantát 1,5 ml, 12 mmól hexánsawal kapcsoljuk 12 mmól HOBt és 12 mmól DIC jelenlétében. A gyantát ezután 3 x 50 ml dimetil-formamiddal és 3 x 50 ml diklór-metánnal mossuk, végül vákuumkemencében 30 °C hőmérsékleten szárítjuk, 4,46 g terméket nyerünk.
A peptidet a gyanta hordozóról két adagban hasítjuk le (2,23 g/adag), a peptidet hordozó gyantát 45 ml vízmentes folyékony HF-ban, 1,4 ml p-krezollal,
1,4 ml p-tiokrezollal és 1,4 ml dimetil-szulfiddal 1 órán át 0 °C hőmérsékleten, majd 3 órán át 20 °C hőmérsékleten keverve. A feleslegben lévő HF-t vákuumban eltávolítjuk, és a gyanta - peptid elegyet 3 x 200 ml vízmentes dietil-éterrel extraháljuk. Az éteres extraktumokat előntjük, a lehasított peptidet ezután 3 x
- 14 100 ml 30 %-os ecetsawal extraháljuk. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, majd a visszamaradó anyagot 60 ml vízben oldjuk, és fagyasztva szárítjuk. A kapott 1,1 g szilárd terméket 2 x 20 ml 30 %-os ecetsavban oldjuk, és Amberlite IRA-68 (acetát formájú) ioncserélő oszlopra (60 g, 1,6 mekv/ml, 2,73 cm belső átmérő x 18 cm oszlophossz) visszük 30 %-os ecetsavban, 60 ml/óra áramlási sebesség mellett. A megfelelő frakciókat egyesítjük, és fagyasztva szárítjuk. 930 mg nyers peptidet nyerünk, ezt preparatív RP-HPLC (fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás eljárás) révén tisztítjuk Vydac 218TP1022 oszlop (22 x 250 mm) alkalmazásával. Az alkalmazott mozgó fázis az alábbi:
A = 0,1 % TFA/H2O
B = 0,1 % TFA/CH3CN-H2O 4:1 térf. arány % B és 20 % B összetevő közötti lineáris gradienst alkalmazunk 60 percen át 15 ml/perc áramlási sebesség mellett. A megfelelő frakciókat egyesítjük, és az oldószert vákuumban eltávolítjuk róluk. A visszamaradó vizes anyagot fagyasztva szárítjuk, így 515 mg végterméket nyerünk.
Vékonyrétegkromatográfiás elválasztást (TLC) végzünk 5 x 10 cm-es Merek F-254 szilícium-dioxid lemezeken az alábbi oldószerrendszerek alkalmazásával (a jelölt arányok térfogatarányt jelentenek):
Rt (1) = 0,47 (1-BuOH:HOAc:H2O, 4:1:1)
Rf (2) = 0,68 (1-BuOH:HOAc:EtOAc:H2O, 1:1:1:1)
Rf (3) = 0,83 (1-BuOH:HOAc:Pyr:H2O, 5:4:4:2)
Aminosav analízis (AAA):
Arg 1,04 (1), Pro 1,00 (1), Asp 0,97 (1)
Folyadékkromatográfiás - tömegspektrometriás vizsgálat (LC-MS):
[MH*] m/z = 540 a.m.u. (M = 539,69), ahol [MH*] jelentése egy pozitívan töltött tömegion; m/z jelentése tömeg/töltés; és a.m.u. az atom tömeg egység.
2. Példa
Acetil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil szintézise
A fenti acetil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil pepiidet az 1. példában leírt szilárdfázisú eljárással szintetizáljuk. A védett aminosavakat egymást követően adjuk
3,4 g, 3,2 mmól N-izobutii-amino-metil - gyantához. Az Arg N-terminális Boc csoportjának eltávolítása és semlegesítés után a kapott peptid - gyantát 8 ml ecetsavanhidriddel 120 mg 4-dimetil-amino-piridint tartalmazó 70 ml diklór-metánban 30 percig acetilezzük. Ezután a gyantát 3 x 50 ml dimetil-formamiddal és 3 x 50 ml diklór-metánnal mossuk, majd vákuumkemencében 30 °C hőmérsékleten szárítjuk.
A peptidet a szilárd hordozóról folyékony hidrogén-fluoriddal hasítjuk le, és RP-HPLC eljárással tisztítjuk az 1. példában leírt módon.
TLC: Rr (1) = 0,36, Rf (2) = 0,62, Rf (3) = 0,81
AAA: Arg 0,99 (1), Pro 0,97 (1), Asp 1,05 (1)
LC-MS: [MH*] m/z = 484 a.m.u. (M = 483,57).
3. Példa
Acetil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil oldat fázisban való szintézise
A. Boc-Asp(OBzl)-NH-izobutil
6,46 g, 20 mmól Boc-Asp(OBzl)-OH 70 ml etil-acetátban lévő oldatához -15 °C hőmérsékleten 2,2 ml, 20 mmól N-metil-morfolint és 2,6 ml, 20 mmól izobutil-klór-formiátot adunk. -15 °C hőmérsékleten 10 perc aktiválási idő után az elegyhez 2,0 ml, 20 mmól izobutil-amint adunk, majd -15 °C hőmérsékleten 30 percig keverjük, ezután hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni. Szobahőmérsékleten végzett 2 órás keverést követően az elegyhez 100 ml 5 %-os nátrium-karbonát-oldatot adunk, a kétfázisú anyagot választótölcsérbe visszük, és a szerves fázist egymást követően 2 x 50 ml 5 %-os nátrium-karbonát-oldattal, 3 x 50 ml vízzel, 2 x 50 ml 5 %-os citromsav-oldattal és 3 x 50 ml vízzel mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, és vákuumban besűrít-
- 16 • ·· ·· ·· ·· * ·· · · · ♦ · ·· • · ··· 4 · · • · · · · ··· *·*· ··· «« · -.
jük, így az elméleti hozamra viszonyított 79,9 %-os hozammal 6,05 g fehér, szilárd terméket nyerünk.
B. HCI.Asp(OBzl)-NH-izobutil
1,89 g, 5 mmól Boc-Asp(OBzl)-NH-izobutil 20 ml etil-acetátban készült oldatához 20 ml 5 n etil-acetátos hidrogén-klorid-oldatot adunk. Az oldatot 40 percig keverjük, majd vákuumban besűrítjük, így a HCI.Asp(OBzl)-NH-izobutil terméket olajként nyerjük. A terméket vákuumban kálium-hidroxid szemcséken éjszakán át szárítjuk.
C. Z-Arg-Pro-Asp(OBzl)-NH-izobutil
2,21 g, 5 mmól Z-Arg(HCI)-Pro-OH 20 ml DMF-ban készült oldatához 0 °C hőmérsékleten 10 ml 0,5 mól/l-es HOBt/DMF-t és 10 ml 0,5 mól/l-es DCC/CH2CI2-t adunk. Az elegyet 30 percig 0 °C hőmérsékleten keveijük, majd hozzáadjuk 1,57 g, 5 mmól HCI.Asp(OBzl)-NH-izobutil és 1,1 ml, 10 mmól NMM 20 ml DMF-ban készült oldatát. A reakcióelegyet 0 °C hőmérsékleten 2 órán át, majd szobahőmérsékleten éjszakán át keverjük. A kapott diciklohexil-karbamid csapadékot kiszűrjük, és a szűrletet vákuumban besűrítjük, így 84 %-os hozammal 2,84 g Z-Arg-Pro-Asp(OBzl)-NH-izobutil nyersterméket kapunk szilárd anyag formájában.
D. Acetil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil
2,84 g Z-Arg-Pro-Asp(OBzl)-NH-izobutilt 100 ml ecetsavban oldunk, és 2,7 g 10 % fémtartalmú szénhordozós palládiumkatalizátort adunk hozzá. Az oldatot 4,83 x 106 Pa hidrogéngáz nyomással hidrogénezzük. A reakciót vékonyrétegkromatográfiás vizsgálattal követjük nyomon, és 24 óra elteltével a katalizátort kiszűrjük. Az oldószert vákuumban eltávolítjuk, így az Arg-Pro-Asp-NH-izobutil terméket olaj formájában nyerjük. Ezt a terméket 10 ml jégecetben oldva, és öt részletben, alkalmanként 1 ml ecetsavanhidriddel reagáltatva acetilezzük. 4 órás keverést kővetően a reakcióelegyhez 5 ml vizet adunk, és az oldószereket vákuumban lepároljuk. A visszamaradó anyagot 40 ml vízben • · • · · · · · · • · ··♦ · · • · · · · ·♦· ··♦· ··· · ·
- 17 oldjuk, és fagyasztva szárítjuk. A nyers pepiidet preparatív RP-HPLC eljárással tisztítjuk az 1. példában leírt módon. A kapott terméket tömegállandóságig liofilizáljuk, 180 mg terméket nyerünk.
TLC: Rr (1) = 0,36, Rf (2) = 0,60, Rf (3) = 0,70
AAA: Arg 0,99 (1), Pro 1,01 (1), Asp 1,01 (1)
LC-MS: [MH*] m/z = 484 a.m.u. (M = 483,57).
4. Példa
Acetil-Arg-Pro-Ser-NH-izobutil szintézise
Boc-Ser(OBzl)-NH-izobutilt készítünk Boc-Ser(OBzl)-OH és izobutil-amin kapcsolásával a 3A. példában leírt eljárást követve. A kapott vegyületről a védőcsoportokat HCI - etil-acetát alkalmazásával eltávolítjuk, és a peptid hidrogén-klorid-sóját vákuumban szárítjuk.
Az Ac-Arg-Pro-OH és HCI.Ser(OBzl)-NH-izobutil kapcsolását a 3C. példában leírt módon hajtjuk végre. A védett acetil-Arg-Pro-Ser(OBzl)-NH-izobutil tripeptidet katalitikusán hidrogénezzük a benzilcsoport eltávolítására, majd a 3D. példa szerinti eljárást követve. A nyers Acetil-Arg-Pro-Ser-NH-izobutil peptidet RP-HPLC eljárással tisztítjuk.
TLC: Rf (1) = 0,38, Rf (2) = 0,40, Rf (3) = 0,64
AAA: Arg 0,98 (1), Pro 1,02 (1). A peptid hidrolízis körülményei mellett a Ser bomláson megy át, és ennek folytán nem kimutatható.
LC-MS: [MH*] m/z = 456 a.m.u. (M = 455,56).
5. Példa
Acetil-Arg-Pro-Thr-NH-izobutil szintézise
Acetil-Arg-Pro-THr-NH-izobutil peptidet a 4. példában leírt módon szintetizáljuk a 3-helyzetben Thr-t helyettesítve a Ser helyébe. A peptid jellemzői a következők:
TLC: Rf (1) = 0,4, Rf (2) = 0,64, Rf (3) = 0,77 ·
• ·· ···· ·· · · · · · ·· • ······ · • · · · · ·♦· ·*·· «·« ,, φ . .
- 18 ΑΑΑ: Arg 1,01 (1), Pro 0,99 (1). A peptid hidrolízis körülményei mellett a Thr bomláson megy át, így nem kimutatható.
LC-MS: [MH*] m/z = 470 a.m.u. (M = 469,59).
6. Példa
Acetil-Arg-Pro-Asp-NH-fenil-etil szintézise
Boc-Asp(OBzl)-NH-fenil-etilt készítünk Boc-Asp(OBzl)-OH és fenil-etil-amin kapcsolásával a 3A. példában leírt eljárással. A kapott terméket 4n dioxános hidrogén-kloriddal védőcsoportjaitól megfosztjuk, és a peptid hidrogén-klorid-sóját vákuumban NaOH szemcséken éjszakán át szárítjuk.
Az acetil-Arg-Pro-OH és HCI.Asp(OBzl)-NH-fenil-etil kapcsolását a 3C. példában leírt eljárással végezzük. A védett acetil-Arg-Pro-Asp(OBzl)-NH-fenil-etil tripeptidet katalitikus hidrogénezésnek tesszük ki a benzilcsoport eltávolítására a 3D. példában leírt módon. A kapott nyers acetil-Arg-Pro-Asp-NH-fenil-etil peptidet RP-HPLC eljárással tisztítjuk.
TLC: Rf (1) = 0,32, Rf (2) = 0,60, R, (3) = 0,75
AAA: Arg 0,98 (1), Pro 1,01 (1), Asp 1,02 (1)
LC-MS: [MH*J m/z = 532 a.m.u. (M = 531,62).
7. Példa
Acetil-Arg-Pro-Val-NH-izobutil szintézise
Acetil-Arg-Pro-Val-NH-izobutilt szintetizálunk szilárdfázisú eljárással, védett aminosavaknak egy szilárd gyanta részecskéhez kovalensen kötött növekvő peptidlánchoz való lépésenként! hozzáadásával az 1B. példában leírt módon.
A szintézist 4,5 g, 4,5 mmól, 1 mmól/g gyanta izobutil-amino-metil - gyantával kezdjük meg. Az aminosavakat α-amino-csoportjukon Boc csoporttal védjük. Az Arg oldallánc ε aminjának védelmére 2-klór-benzil-oxi-karbonil-csoportot alkalmazunk. A kapcsolást diizopropil-karbodiimid - HOBt eljárással végezzük. Az eljárás részleteit az alábbiakban ismertetjük:
Lépés Reagens Idő (perc)
1. CH2CI2 mosás 3x1 perc
2. 40 % TFA -10 % anizolt tartalmazó CH2CI2 1x5 perc
3. 40 % TFA -10 % anizolt tartalmazó CH2CI2 1 x 25 perc
4. CH2CI2 mosás 3x1 perc
5. 10 % NMM-t tartalmazó CH2CI2 2x5 perc
6. CH2CI2 mosás 3x1 perc
7. DMF mosás 2x1 perc
8. Boc-aminosav (13,5 mmól) és HOBt (13,5 mmól) DMF-ban 1x3 perc
9. DIC-t (13,5 mmól) adunk a fentiekhez és összerázzuk 1 x 180 perc
10. Kívánt esetben ismételt kapcsolás a 4-9. lépések ismétlésével
11. DMF mosás 3x1 perc
Az Arg N-terminális Boc-csoportjának eltávolítása és semlegesítés után kapott peptid - gyantát 10 ml ecetsavanhidrid alkalmazásával 120 mg 4-dimetil-amino-piridint tartalmazó 70 ml diklór-metánban 30 percig acetilezzük. A gyantát ezután 3 x 50 ml dimetil-formamiddal és 3 x 50 ml diklór-metánnal mossuk, végül vákuumkemencében 30 °C hőmérsékleten szárítjuk. 6,8 g terméket nyerünk.
A védett peptid - gyantát folyékony hidrogén-fluoriddal kezeljük p-krezol, p-tiokrezol és dimetil-szulfid megkötőanyagok jelenlétében állandó keverés mellett, 0 °C hőmérsékleten 1 órán át, majd 20 °C hőmérsékleten 3 órán át. A feleslegben lévő hidrogén-fluoridot vákuumban eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot éterrel kezeljük a megkötés termékeinek eltávolítására. A peptidet 3 x 50 ml 30 %-os ecetsavval extraháljuk, az oldószereket vákuumban lepároljuk, és a terméket fagyasztva szárítjuk.
• ·
- 20 A kapott 1,051 g nyers peptidet először Amberlite IRA-68 ioncserélő oszlopon tisztítjuk, majd a további tisztítást néhány fordított fázisú HPLC eluálással végezzük preparatív Ci8 oszlopon. Az alkalmazott oldószerek: 0,1 % trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmazó víz (A puffer) és CH3CN - H2O (0,1 % TFA tartalmú) 4:1 arányú elegye (B puffer). A B puffer 0-50 %-ig terjedő lineáris gradiensét alkalmazzuk 120 percig terjedő időtartamon át az adott eluálástól függően. A peptidet tartalmazó megfelelő frakciókat összegyűjtjük, az oldószereket vákuumban lepároljuk, és az acetil-Arg-Pro-Val-NH-izobutil TFA terméket fagyasztva szárítjuk. A peptid TFA sóját acetát formára hozzuk ioncserélő oszlop alkalmazásával.
Vékonyrétegkromatográfiás (TLC) vizsgálatot végzünk Merek F-254 lemezeken (5 x 10 cm) az alábbi oldószerrendszerben (térfogatarányokat aduk meg):
Rf (1) = 0,43 (1-BuOH:HOAc:H2O, 4:1:1)
Rt (2) = 0,68 (1-BuOH:HOAc:EtOAc:H2O, 1:1:1:1)
Rf (3) = 0,86 (1-BuOH:HOAc:Pyr:H2O, 5:4:4:2)
Aminosav analízis (AAA):
Arg 1,20 (1), Pro 1,17 (1), Val 0,64 (1).
Folyadékkromatográfiás - tömegspektrometriás vizsgálat (LC-MS):
[MH*] m/z = 468,5 a.m.u. Az észlelt molekulatömeg 467,5, az elméleti molekulatömeg 467,62; MH+, m/z és a.m.u. az előzőekben megadott.
8. Példa
Dezamino-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil szilárdfázisú szintézise
Az előzőekben említett peptidet R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963) szilárdfázisú eljárásával szintetizáljuk. A szilárdfázisú szintézis eljárás a védett aminosavak lépésenként! hozzáadását foglalja magában egy olyan növekvő peptidlánchoz, amely egy szilárd gyanta részecskéhez kovalens kötéssel kötött.
- 21 A szintézist 4 mmól, 4 g, 1 mmól/g gyanta N-izobutil-amino-metil-gyantával kezdjük meg. Minden aminosavat aminocsoportján Boc csoporttal védünk. Az Asp β-karboxilcsoportjának védelmére benzilcsoportot alkalmazunk. Minden kapcsolást diizopropil-karbodiimid - HOBt eljárással végzünk az alábbi műveleti rend szerint:
Lépés Reagens Idő (perc)
1. CH2CI2 mosás 3x1 perc
2. 40 % TFA -10 % anizolt tartalmazó CH2CI2 1x5 perc
3. 40 % TFA -10 % anizolt tartalmazó CH2CI2 1 x 25 perc
4. CH2CI2 mosás 3x1 perc
5. 10 % NMM-t tartalmazó CH2CI2 2x5 perc
6. CH2CI2 mosás 3x1 perc
7. DMF mosás 2x1 perc
8. Boc-aminosav (12 mmól) és HOBt (12 mmól) 1x3 perc
DMF-ban
9. DIC-t (12 mmól) adunk a fentiekhez és 1 x 180 perc
ősszerázzuk
10. Kívánt esetben ismételt kapcsolás a 4-9.
lépések ismétlésével
11. DMF mosás 3x1 perc.
A Boc-Asp(OBzl)-OH, Boc-Pro-OH és Boc-5-amino-valeriánsav védett aminosavakat egymást követően adjuk N-izobutil-amino-metil - gyantához az előzőekben megadott műveleti rend szerint. Az 5-amino-valeriánsav N-terminális Boc-csoportjának eltávolítása és semlegesítés után kapott peptid - gyantát 12 g 3,5-dimetil-1-pirazolil-formaminidium-nitráttal és 5 ml diizopropil-etil-aminnal DMF-ban 3 órán át reagáltatjuk. A gyantát ezután 3 x 60 ml DMF-dal és 3 x 60 ml diklór-metánnal mossuk, végül vákuumkemencében 30 °C hőmérsékleten szárítjuk. 6,97 g terméket nyerünk.
3,38 g védett peptid - gyantát folyékony hidrogén-fluoriddal kezelünk p-krezol, p-tiokrezol és dimetil-szulfid, mint megkötőanyag jelenlétében 0 °C hőmérsékleten 1 órán, majd 20 °C hőmérsékleten 3 órán át végzett állandó keverés mellett. A HF feleslegét vákuumban eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot éterrel kezeljük a megkötés termékeinek eltávolítására. A peptidet 3 x 150 ml 30 %-os ecetsavval extraháljuk, az oldószereket vákuumban lepároljuk, és a terméket fagyasztva szárítjuk. A nyers peptidet 30 %-os ecetsavban oldjuk, és Amberlite IRA-68 (acetát formájú) ioncserélő oszlopon (60 g, 1,6 mekv/ml, 2,73 cm belső átmérő x 18 cm hosszúság) ioncserélő oszlopon engedjük át 30 %-os vizes ecetsavoldatban, 60 ml/óra áramlási sebességgel. A megfelelő frakciókat egyesítjük és fagyasztva szárítjuk.
A nyers peptidet 0,1 % trifluor-ecetsavat tartalmazó vízben oldjuk, és Vydac 218TP1022 oszlop alkalmazásával preparatív RP-HPLC eljárással tisztítjuk. Mozgó fázisként az alábbiakat alkalmazzuk:
A = 0,1 % TFA/H2O
B = 0,1 % TFA/CH3CN - H2O, 4:1 térfogatarány.
% B és 10 % B fázis közötti lineáris gradienst alkalmazunk 100 percen át 15 ml/perc áramlási sebességgel. A frakciókat HPLC eljárással elemezzük, és a tiszta peptidet tartalmazókat egyesítjük, és az oldatról vákuumban eltávolítjuk az oldószereket. A visszamaradó anyagot vízben oldjuk, ioncserélő oszlopon való átengedéssel acetát formára hozzuk, és fagyasztva szárítjuk, 185 mg terméket nyerünk.
Vékonyrétegkromatográfiás elválasztást végzünk Merek F-254 (5x10 cm) lemezeken az alábbi oldószerrendszerben (az arányok térfogatarányt jelentenek):
Rf (1) = 0,25 (1-BuOH:HOAc:H2O, 4:1:1)
Rf (2) = 0,49 (1-BuOH:HOAc:EtOAc:H2O, 1:1:1:1)
Rf (3) = 0,80 (1-BuOH: Pyr:H0Ac:H20, 5:4:4:2)
- 23 Aminosav analízis (AAA):
Pro 1,00 (1), Asp 0,66 (1).
Folyadékkromatográfiás - tömegspektrometriás vizsgálat (LC-MS):
[MH*] m/z = 427 a.m.u. Az észlelt molekulatömeg 426, az elméleti molekulatömeg 426,26. MH* jelentése pozitívan töltött tömegion; m/z jelentése tömeg/töltés; a.m.u. atom tömeg egység.
9. Példa
Neuromuszkuláris vizsgálat
Ez a vizsgálat azt méri, képes-e a peptid a neuromuszkuláris transzmiszszióra hatni. Elméleti feltevés szerint ezt a képességet a peptidnek a nikotin acetil-kolin receptorral való kölcsönhatása teszi lehetővé. A timopoietinről és a timopentinről ismert, hogy a neuromuszkuláris transzmisszióra gátló hatással bírnak.
A. Egereken végzett vizsgálatok
A vizsgálandó peptid különböző dózisait oldjuk foszfáttal pufferolt sóoldatban, és orálisan 25-30 g testtömegű nőstény egereknek (CD1 törzs) adagoljuk. A végzett elektromiográfiás vizsgálat G. Goldstein és munkatársai [J. Neurol. Neurosurg. Psychiat., 31, 453-459 (1968)] eljárásának módosított változata, a módosítás abban áll, hogy a vizsgálatot a megjelölt 24 óra helyett 48 órával a peptid adagolása után végezzük. Az egereket 0,5 ml 10 %-os uretánoldattal anesztetizáljuk. Az idegeket Grass S-48 stimulátorral és Grass SIU-5A stimulus izoláló egységgel (Grass Medical instruments, Quincy, MA, USA) stimuláljuk, és az elektromiográfiás választ 5A21N differenciál sokszorozóval és 5B10N időtengellyel kapcsolt Tektronix tároló őszeilloszkóp-5111 (Tektronix, Beaverton, OR, USA) alkalmazásával regisztráljuk.
impulzus/sec-os, szupramaximális idegstimulálás mellett a 10. izom hatáspotenciál magasságát az első százalékában fejeztük ki. A kontroll és a vizsgálati minta közötti statisztikai különbségeket jelölő P értékeket Dunnett-féle • · · ·
t-teszttel számítottuk. A vizsgálati peptidekkel a neuromuszkuláris vizsgálatban kapott eredményeket az 1. táblázatban ismertetjük.
1. Táblázat
Szekvencia mg/kg P érték1
Acetil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil 1 0,004
1 0,000
1 0,000
0,1 0,000
0,1 0,006
Acetil-Arg-Pro-Thr-NH-izobutil 1 0,000
1 0,001
Acetil-Arg-Pro-Ser-NH-izobutil 1 0,000
1 0,001
Hexanoil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil 0,1 0,000
0,1 0,000
Acetil-Arg-Pro-Asp-NH-fenil-etil 1 0,000
1 0,001
1 A P érték a neuromuszkuláris transzmisszió gyengítésére való képességet méri. Az alacsony P értékek azt jelzik, hogy a pepiid a neuromuszkuláris transzmisszió gyengítésére képes, és így aktív.
B. Patkányokon végzett vizsgálat
A vizsgálati peptidek különböző dózisait foszfáttal pufferolt sóoldatban oldjuk, és orálisan 250 - 300 g testtömegű nőstény patkányoknak (CD1 törzs) adjuk be. A végzett elektromiográfiás vizsgálat G. Goldstein és munkatársai [J. Neurol. Neurosurg. Psychiat., 31, 453-459 (1968)] eljárásának módosított változata, a módosítás abban áll, hogy a vizsgálatot a megjelölt 24 óra helyett 48 órával a peptid adagolása után végezzük. A patkányokat 1 ml 40 %-os uretán• · · • · · • * oldattal anesztetizáljuk. Az idegeket Grass S-48 stimulátorral és Grass SIU-5A stimulus izoláló egységgel (Grass Medical instruments, Quincy, MA, USA) stimuláljuk, és az elektromiográfiás választ 5A21N differenciál sokszorozóval és 5B10N időtengellyel kapcsolt Tektronix tároló oszcilloszkóp-5111 (Tektronix, Beaverton, OR, USA) alkalmazásával regisztráljuk. 20 impulzus/sec-os, szupramaximális idegstimulálás mellett a 10. izom hatáspotenciál magasságát az első százalékában fejeztük ki. A kontroll és a vizsgálati minta közötti statisztikai különbségeket jelölő P értékeket Dunnett-féle t-teszttel számítottuk.
A vegyület 1 mg/kg dózisával négy vizsgálatot végeztünk. Az acetil-Arg-Pro-Val-NH-izobutil vegyülettel végzett neuromuszkuláris vizsgálatok eredményeit a 2. táblázatban közöljük.
2. Táblázat
Szekvencia mg/kg P érték1
Acetil-Arg-Pro-Val-NH-izobutil 1 <0,001
A dezamino-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil vegyülettel kapott neuromuszkuláris vizsgálat eredményeit a 3. táblázatban P jellel jelöljük. Az acetil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil p-értékeit az összehasonlítás kedvéért p érték jelöléssel adjuk meg.
3. Táblázat
Szekvencia mg/kg (PO) P érték p érték
Dezamino-Arg-Pro-Asp-NH- 3 0,000 0,000
izobutil 3 0,013 0,003
3 0,000 0,000
1 0,000 0,002
1 0,000 0,000
1 0,000 0,000
0,5 0,096 0,165
0,5 0,000 0,009
• ·
Szekvencia mg/kg (PO) P érték p érték
0,5 0,310 0,010
0,25 0,000 0,002
0,25 0,667 0,012
0,25 0,000 0,000
0,125 0,151 0,536
0,125 0,605 0,612
0,125 0,001 0,013
ÍO. Példa
Inzulin provokációs vizsgálatok
A plazma glükózkoncentrációit az idegi és hormon mechanizmusok sokasága tartja fiziológiás nyugvóponton. Az inzulin és a glukagon, amelyek a pankreászból származnak, a vér glükózszintjét csökkentő, illetve növelő legfontosabb hormonok. Azonban néhány további hormon, köztük a növekedési hormon, az epinefrin és az adrenális glükokortikoidok fontos szerepet játszanak a glükózszint szabályozásában. A glükózkoncentráció normális nyugalmi pontjától való eltéréseket az agy hipotalamusz régiójában lévő idegsejtek érzékelik. Ha ezek a sejtek a vér glükózszintjének esését érzékelik, az agy rosszul definiált idegi útjait aktiválják, ami más hipotalamusz sejtek izgatását eredményezi, ezek az utóbbi sejtek termelik a 41-aminosavból álló kortikotropin-felszabadító faktor peptidet (CRF) és a 9-aminosavból álló arginin vazopresszin peptidet (VP). Ezeket a hipotalamusz faktorokat az agy egy specializálódott hipotalamusz-hipofízis portális kapilláris hálózatba választja ki, és a vér révén valódi endokrin módon a hipofízis mirigy elülső lebenyébe jutnak. Az elülső lebenyben ezek a hormonok nagy affinitással kötődnek a hipofízis kortikotróp sejtjein elhelyezkedő receptorokhoz. A CRF és/vagy VP receptor aktiválása depolarizálja a sejteket, növeli a kalcium beáramlást és növeli az adrenokortikotropin (ACTH) perifériás vérbe való kiválasztását Az ACTH - amint nevében rejlik - a mellék- 27 vese kérget (adrenális kortex) stimulálja arra, hogy az szintetizálja és bocsássa szabadon a primer glükokortikoid hormonokat, emberben a kortizolt, rágcsálókban a kortikoszteront. Ezt követően ezek a hormonok hatnak a plazma glükózkoncentráció növekedésére.
így az inzulint normális lénynek - akár embernek, akár rágcsálónak - adagolva az provokáló vizsgálatként használható fel a lény stresszre adott válaszának meghatározására. A stressz - ebben az esetben - úgy határozható meg, mint a lény normális glükóz szabályozási mechanizmusának szabályozhatatlan szétesése exogén inzulin hatására. Az ilyen stressz kísérletes kiváltása hasznos a stresszel teli helyzetek jobbítására szolgáló kompenzációs mechanizmusok meghatározásánál. Továbbá, az ilyen provokációs vizsgálatok hasznosak gyógyászati anyagok hatékonyságának meghatározására a stresszel kiváltott endokrin változások és az ezekből a változásokból származó rendellenességek módosításában.
A. Inzulin hatásai ACTH kiválasztásra
Annak meghatározására, hogy egy hatóanyag képes-e a stressz válaszok módosítására, a stressz választ magát kell jellemezni. Ennek a célnak az elérésére felnőtt, hím Sprague-Dawley patkányokat [Charles River, Kingston, NY (USA)] kezeltünk növekvő dózisú inzulinnal [Humulin, Éli Lilly Co.], a dózis 0,05 és 5 NE/kg közötti, vagy sóoldattal intraperitoneálisan egy éjszakán át való éheztetést követően. Az inzulin adagolása után 30 perccel az állatokat dekapitálással leöltük, és a törzsből származó vért 400 μ110 %-os, 4 °C hőmérsékletű EDTA tartalmú polipropilén csövekbe gyűjtöttük. A plazmát centrifugálással szétválasztottuk, és ACTH meghatározásokra való felhasználásig -80 °C hőmérsékleten tároltuk. A plazma ACTH koncentrációit radioimmunológiai vizsgálattal határoztuk meg antiszérum [IgG Corporation, Nashville, TN, USA] és 125l-jelzett ACTH [ICN Corporation, Costa Mesa, CA (USA)] alkalmazásával a
- 28 Nicholson és munkatársai, Clin. Chem. 30, 259-265 (1984) szakirodalmi helyen leírt módon.
Az 1. ábrán inzulinnal kiváltott hipoglikémia hatását mutatjuk be ACTH kiválasztásra hím patkányokon. A sóoldat hordozóanyag (0) adagolása nem volt hatással a kísérleti állatok alap-ACTH szintjeire (plazma ACTH szintek 42,1 ± 4,2 pg/ml). A legalacsonyabb vizsgált inzulin dózis (0,05 NE/kg) nem váltotta ki az ACTH szintek növekedését. 0,1 NE/kg dózisnál a plazma ACTH koncentrációi szignifikánsan nagyobbak, mint a hordozóanyaggal kezelt kontrolloknál, és a nagyobb inzulin dózisok arányosan nagyobb ACTH válaszokat váltottak ki, 5 NE/kg dózisnál egy plató kezdetével. Ezen adatok alapján a további vizsgálatokhoz 0,5 NE/kg dózist választottunk, mivel ez nagy amplitúdójú ACTH választ vált ki, amely RIA esetén könnyen kimutatható, de nem maximális válasz. Ha nagyobb inzulin dózist alkalmazunk, megközelítjük a válasz platóját, ami megnehezítheti az inzulin által kiváltott stressz hatás bármely későbbi változásának kimutatását, míg a 0,5 NE/kg dózis a dózis - hatás görbe legmeredekebb részén van, így megkönnyíti az ACTH szekréciós válasz szignifikáns módosulásainak kimutatását.
B. Egy találmány szerinti peptid hatása inzulinnal kiváltott ACTH kiválasztásra
Amint azt az előzőekben említettük, az inzulin provokációs vizsgálatként használható annak meghatározására, hogyan reagál egy szervezet stresszre, és hogyan manipulálható a válasz. Az 1. ábrán látható, hogy patkányoknál inzulin adagolása növekedést vált ki a plazma ACTH koncentrációiban. Annak kimutatására, hogy ez a válasz módosítható a találmány szerinti peptidekkel, például acetil-Arg-Pro-Asp-NH-izobutil (a továbbiakban a peptid) alkalmazásával, az alábbi kísérletet végeztük.
A kísérletnél hím, felnőtt Sprague Dawley patkányokat használtunk. Egy éjszakán át való éheztetést kővetően szájon át bejuttatott szondán keresztül
- 29 vagy szubkután injekció formájában a kísérleti alanyoknak a pepiidet vagy sóoldatot adtunk be. A peptid dózisa orális adagolás esetén 0,1-10 mg/kg, szubkután adagolásnál 0,03 - 3,0 mg/kg. 48 óra múlva az állatokat 0,5 NE/kg inzulinnal kezeljük, és ezután 30 perccel dekapitálással leöljük. Az előzőekhez hasonlóan a törzsükből a vért polipropilén csövekben lévő, 4 °C hőmérsékletre hűtött 400 μΙ 10 %-os EDTA-ba gyűjtjük. A plazmát centrifugálással elválasztjuk, és ACTH meghatározásokra való felhasználásig -80 °C hőmérsékleten tároljuk. Az ACTH koncentráció meghatározását RIA alkalmazásával végezzük a Nicholson és munkatársai által leírt, az előzőekben hivatkozott módon antiszérum (IgG Corporation) és 125l-jelzett ACTH [ICN Corporation] alkalmazásával.
0,5 NE/kg inzulin intraperitoneális adagolása a plazma ACTH koncentrációt 16,8 ± 0,8 pg/ml értékről mintegy 200 pg/ml értékre növelte a sóoldattal szájon át bevezetett szondán vagy szubkután injekció formájában előkezelt állatoknál (2. ábra). A peptidnek szubkután, 0,1 mg/kg dózisban való adagolása enyhén csökkentette az inzulinra adott ACTH választ. Az inzulinnal kiváltott ACTH kiválasztás szignifikáns visszaszorításának küszöb-dózisa szubkután adagolás mellett 0,3 mg/kg, az inzulint megelőzően 48 órával adagolva. Az 1,0 és 3,0 mg/kg szubkután dózisú peptid ugyancsak visszaszorítja az ACTH választ. Az orálisan gyomorszondán át adott 1 mg/kg peptid csak kjs hatást gyakorolt az inzulinnal kiváltott ACTH kiválasztásra. A peptid nagyobb dózisai (3,0 és 10,0 mg/kg) erősen szignifikáns csökkenést váltottak ki az inzulinra adott ACTH válasz nagyságában.
Ezért ezek a kísérletek azt jelzik, hogy a találmány szerinti peptid képes a stressz által kiváltott ACTH kiválasztás visszaszorítására. A 2. ábrából nyilvánvaló, hogy a peptid akár orális, akár szubkután adagolás esetén hatásos ebben a provokációs vizsgálatban. Továbbá, a szubkután úton való adagolás esetén a minimális hatásos dózis tizede annak, mint az orális úton adagolt dózisé, azt a • · · · ··· ·· · ··· • ···«· · · • · · · ·
- 30 feltételezést keltve, hogy a peptid a gasztrointesztinális abszorpciós gátat lépi át.
11. Példa
Szociális stresszre adott viselkedési válasz csökkentése
A szociális konfliktus (honos/betolakodó paradigma) kiváltotta stresszre adott viselkedési választ [E. M. Pich és munkatársai, Psychoneuroendocrinology, 18, 495-507 (1993)] labirintus teszttel (Elevated Plus Maze teszt) [S. Pellow és munkatársai, J. Neurosci. Meth. 14. 149-167 (1985)] vizsgáltuk kifejlett Wistar patkányok szorongását értékelve. A kísérleti csoportokat 2 nappal korábban 5 mg/kg acetil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid hatóanyaggal vagy hordozóanyaggal (kontroll) kezeltük orálisan. A szociális konfrontációt egy kísérleti patkánynak egy agresszív hím honos patkány területére való betolakodásával váltottuk ki. A csoportokat úgy osztottuk szét, hogy a patkányokat 30 percre új ketrecbe helyeztük szociális kölcsönhatás (stressz) nélkül vagy szociális legyőzetésnek, a honos patkánynak tettük ki 30 percig (szociális stressz). Közvetlenül a szociális konfliktust követően az állatokat egyénenként 5 perces vizsgálatnak tettük ki egy a zárt karral szemben lévő központi térre helyezve. Az 5 perces vizsgálat során komputerrel automatizált méréseket végeztünk mind az általános aktivitás tekintetében (a nyitott és zárt karokba való belépések száma), mind a labirintus nyitott karjaiban és zárt karjaiban eltöltött időt tekintve.
A stressz hatáson átment patkányok szignifikánsan kevesebb időt töltenek a nyitott karokban, előnyben részesítik a zárt karok meghatározott terét. Amint azt a 3. ábráról láthatjuk, a hordozóanyaggal 2 nappal korábban előkezelt, majd stressznek kitett patkányok szignifikánsan kevesebb időt töltöttek a nyitott karokban (P = 0,008), míg a 2 nappal korábban a peptiddel előkezelt patkányok viselkedésében nem manifesztálódott ez a stresszt kővető viselkedési változás; nem mutatkozott szignifikáns különbség (P = 0,199) a stressznek ki nem tett patkányokhoz képest, és szignifikánsan több időt töltöttek a nyitott karokban (P • · ·· ··
- 31 = 0,041), mint a hasonló stresszben részesült, hordozóanyag kontrollal kezelt patkányok. így 5 mg/kg orálisan beadott acetil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid blokkolta a szociális stressz által kiváltott szorongásszerű viselkedési változásokat.
12. Példa
Acetil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid farmakokinetikája patkányokban
Patkányoknak egyetlen orális dózisban adtuk be a cím szerinti peptid oldatát [steril víz, injekciós minőségű, U.S.P. (WFI), 5, 50 vagy 300 mg/kg koncentráció]. A patkányoktól a hatóanyag beadása után néhány időpontban vérmintákat gyűjtöttünk. A peptid plazmaszinteket. folyadékkromatográfiás - elektropermetezéses tömegspektrometriás eljárással határoztuk meg a plazmából való extrahálást követően a J. Crowther és munkatársai, Anal. Chem., 66, 2356-2361 (1994. július) szakirodalmi helyen leírt módon.
5, 50 vagy 300 mg/kg patkánynak adott egyetlen orális dózisát követően a peptid gyorsan abszorbeálódik 22, 314, illetve 1294 ng/ml átlagos csúcs plazmakoncentrációt (Cmax) adva, amint az a 4. ábrán látható. A megfelelő idők (Tmax) 30, illetve 60 perc az adagolást követően. Az eliminációs féléletidő (T1/2) 51, illetve 99 perc. Patkányban a peptid Cmax értékét és a görbe alatti terület (AUC) értéket arányosnak találtuk az adagolt peptid dózissal, azt a feltételezést keltve, hogy az acetil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid farmakokinetikája lineáris.
13. Példa
Acetil-Arg-Pro-Asp-NH-metil szintézise
Boc-Asp(OBzl)-NH-metilt készítünk Boc-Asp(OBzl)-OH és metil-amin kapcsolásával, amelyet a 3A. példában leírt módon végzünk. A kapott terméket 4 mól/literes dioxános HCI alkalmazásával védőcsoportjaitól megfosztjuk, és a peptid hidrogén-klorid-sóját vákuumban szárítjuk,
Acetil-Arg-Pro-OH és HCI.Asp(OBzl)-NH-metil kapcsolását végezzük el a 3C. példában leírt módon. A védett acetil-Arg-Pro-Asp-(OBzl)-NH-metil tripeptidet katalitikus hidrogénezésnek tesszük ki a benzilcsoport eltávolítására
- 32 ·· ·«·· ·· · • · · · · · • · · · · · « • · · · •·· ··· ·· * a 3D. példában leírt módon. A kapott nyers acetil-Arg-Pro-Asp-NH-metil peptidet RP-HPLC eljárással tisztítjuk.
TLC:
Rr (1) = 0,26, Rf (2) = 0,53, Rf (3) = 0,87
AAA:
Arg 1,02 (1), Pro 0,98 (1), Asp 0,74 (1)
LC-MS:
[ΜΗ*] m/z = 442,9 a.m.u. (M = 441,49).
A peptid P értéke <0,001 a 9. példa szerinti neuromuszkuláris vizsgálatban 1 mg/kg dózisban vizsgálva. Ezzel ellentétben az acetil-Arg-Pro-Asp-NH2 peptid P értéke 1 mg/kg dózis mellett 0,150.
A csoporton belüli összehasonlítás, a kontroll és a vizsgálati vegyület öszszehasonlítása két-mintás t-teszttel történt, az utóbbi mérés előbbihez való arányának meghatározására.
14. Példa
Acetil-Arg-Pro-Asp-NH-izopropil szintézise
Boc-Asp(OBzl)-NH-izopropilt készítünk Boc-Asp(OBzl)-OH és izopropil-amin kapcsolásával a 3A. példában leírt eljárás szerint. A védőcsoportokat 4 mól/l-es dioxános HCI alkalmazásával eltávolítjuk, és a peptid hidrogén-klorid-sóját vákuumban szárítjuk.
Acetil-Arg-Pro-OH és HCI.Asp(OBzl)-NH-izopropil kapcsolását végezzük el a 3C. példában leírt módon. A védett acetil-Arg-Pro-Asp-(OBzl)-NH-izopropil tripeptidet katalitikus hidrogénezésnek tesszük ki a benzilcsoport eltávolítására, amelyet a 3D. példában leírt módon végzünk. A kapott nyers acetil-Arg-Pro-Asp-NH-izopropil peptidet RP-HPLC eljárással tisztítjuk.
TLC:
Rf (1) = 0,14, Rf (2) = 0,40, Rf (3) = 0,65
AAA:
- 33 Arg 1,00 (1), Pro 1,00 (1), Asp 1,01 (1)
LC-MS:
[MH+] m/z = 471 a.m.u. (M = 470,56).
A vegyületet 1 mg/kg dózisban a 9. példa szerinti neuromuszkuláris vizsgálatban vizsgálva a peptid P értéke <0,001.
A bemutatottakon kívül a találmány számos módosítást és variációt is magában foglal, ezek szakember számára nyilvánvalóak. A készítményeket és eljárásokat illető ilyen módosítások és változtatások a találmány oltalmi körébe tartoznak.

Claims (10)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Egy R-X-Y-Z-NHRi általános képletű tripeptid vagy gyógyászati szempontból elfogadható sav- vagy bázisaddíciós sói - a képletben
    X jelentése Arg vagy dezamino Arg L- vagy D-formája,
    R jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil- vagy rövid szénláncú alkanoilcsoport;
    Y jelentése Pro, dehidro-Pro vagy hidroxi-Pro D- vagy L-formája;
    Z jelentése a Ser, Thr, Asp, Glu, Gin, Asn, β-Asp, Val vagy He aminosavak D- vagy L-formája; és
    R1 jelentése 1-6 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú alkil- vagy alkenilcsoport, amelyek adott esetben egy arilcsoporttal helyettesítettek lehetnek, vagy egy halogénatommal vagy egyenes vagy elágazó láncú, 1-6 szénatomos alkil- vagy alkenilcsoporttal helyettesített arilcsoport vagy egy 3-7 szénatomos gyűrűs metiléncsoport.
  2. 2. Az alábbi tripeptidek valamelyike: acetil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Thr-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Ser-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Val-izobutilamid, hexanoil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid, Arg-Pro-Asp-metilamid, Arg-Pro-Glu-izopropilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-metilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-izopropilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-fenil-etilamid, formil-Arg-Pro-Asp-metilamid, hexanoil-Arg-Pro-Asp-metilamid, és ••«4 ·«
    - 35 dezamino-Arg-Pro-Asp-izobutilamid.
  3. 3. Gyógyászati készítmény, amely legalább egy
    R-X-Y-Z-NHRi általános képletű tripeptidet vagy gyógyászati szempontból elfogadható savvagy bázisaddíciós sóját tartalmazza - a képletben
    X jelentése Arg vagy dezamino Arg L- vagy D-formája,
    R jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil- vagy rövid szénláncú alkanoilcsoport;
    Y jelentése Pro, dehidro-Pro vagy hidroxi-Pro D- vagy L-formája;
    Z jelentése a Ser, Thr, Asp, Glu, Gin, Asn, β-Asp, Val vagy lle aminosavak D- vagy L-formája; és
    Rí jelentése 1 - 6 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú alkil- vagy alkenilcsoport, amelyek adott esetben egy arilcsoporttal helyettesítettek lehetnek, vagy egy halogénatommal vagy egyenes vagy elágazó láncú, 1-6 szénatomos alkil- vagy alkenilcsoporttal helyettesített arilcsoport vagy egy 3-7 szénatomos gyűrűs metiléncsoport.
  4. 4. Eljárás az
    R-X-Y-Z-NHRi általános képletű tripeptid, gyógyászati szempontból elfogadható sav- vagy bázisaddíciós sója előállítására - a képletben
    X jelentése Arg vagy dezamino Arg L- vagy D-formája,
    R jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil- vagy rövid szénláncú alkanoilcsoport;
    Y jelentése Pro, dehidro-Pro vagy hidroxi-Pro D- vagy L-formája;
    Z jelentése a Ser, Thr, Asp, Glu, Gin, Asn, β-Asp, Val vagy lle aminosavak D- vagy L-formája; és
    Rí jelentése 1-6 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú alkil- vagy alkenilcsoport, amelyek adott esetben egy arilcsoporttal helyettesítettek lehet·· «·(« • ·
    - 36 I nek, vagy egy halogénatommal vagy egyenes vagy elágazó láncú, 1-6 szénatomos alkil- vagy alkenilcsoporttal helyettesített arilcsoport vagy egy 3-7 szénatomos gyűrűs metiléncsoport, azzal jellemezve, hogy szilárdfázisú szintézist végzünk.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás az acetil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Thr-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Ser-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Val-izobutilamid, hexanoil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid, Arg-Pro-Asp-metilamid, Arg-Pro-Glu-izopropilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-metilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-izopropilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-fenil-etilamid, formil-Arg-Pro-Asp-metilamid, hexanoil-Arg-Pro-Asp-metilamid, és dezamino-Arg-Pro-Asp-izobutilamid tripeptidek előállítására.
  6. 6. Eljárás az
    R-X-Y-Z-NHR, általános képletű tripeptid, gyógyászati szempontból elfogadható sav- vagy bázisaddíciós sója előállítására - a képletben
    X jelentése Arg vagy dezamino Arg L- vagy D-formája,
    R jelentése hidrogénatom, rövid szénláncú alkil- vagy rövid szénláncú alkanoilcsoport;
    Y jelentése Pro, dehidro-Pro vagy hidroxi-Pro D- vagy L-formája;
    ·* «*··
    - 37 Z jelentése a Ser, Thr, Asp, Glu, Gin, Asn, β-Asp, Val vagy lle aminosavak D- vagy L-formája; és
    Rf jelentése 1-6 szénatomos, egyenes vagy elágazó láncú alkil- vagy alkenilcsoport, amelyek adott esetben egy árucsoporttal helyettesítettek lehetnek, vagy egy halogénatommal vagy egyenes vagy elágazó láncú, 1-6 szénatomos alkil- vagy alkenilcsoporttal helyettesített arilcsoport vagy egy 3-7 szénatomos gyűrűs metiléncsoport, azzal jellemezve, hogy oldat fázisban végzett szintézist hajtunk végre.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás az acetil-Arg-Pro-Asp-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Thr-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Ser-izobutilamid, acetil-Arg-Pro-Val-izobutilamid, hexanoil-Arg-Pro-Asp-izobutiiamid, Arg-Pro-Asp-metilamid, Arg-Pro-Glu-izopropilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-metilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-izopropilamid, acetil-Arg-Pro-Asp-fenil-etilamid, formil-Arg-Pro-Asp-metilamid, hexanoil-Arg-Pro-Asp-metilamid, és dezamino-Arg-Pro-Asp-izobutilamid tripeptidek előállítására.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti peptid vagy gyógyászati szempontból elfogadható sója alkalmazása az immunrendszer rendellenességében szenvedő beteg immunrendszerének szabályozására alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.
  9. 9. Az 1. igénypont szerinti peptid vagy gyógyászati szempontból elfogadható sója alkalmazása stressztől, szorongástól vagy depressziótól szenvedő személy idegrendszerének szabályozására szolgáló gyógyászati készítmény előállítására.
  10. 10. Egy az 1. igénypont szerinti peptidet vagy gyógyászati szempontból elfogadható sóját tartalmazó diagnosztikai reagens.
HU9600432A 1993-08-26 1994-08-17 Novel tripeptides useful in immune and central nerve system therapy HUT73777A (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/112,413 US5639729A (en) 1993-08-26 1993-08-26 Tripeptides useful in immune and CNS therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU9600432D0 HU9600432D0 (en) 1996-04-29
HUT73777A true HUT73777A (en) 1996-09-30

Family

ID=22343770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9600432A HUT73777A (en) 1993-08-26 1994-08-17 Novel tripeptides useful in immune and central nerve system therapy

Country Status (17)

Country Link
US (1) US5639729A (hu)
EP (1) EP0723454B1 (hu)
JP (1) JPH09502175A (hu)
KR (1) KR960703612A (hu)
CN (1) CN1133563A (hu)
AT (1) ATE207757T1 (hu)
BR (1) BR9407357A (hu)
CA (1) CA2169072A1 (hu)
CZ (1) CZ55496A3 (hu)
DE (1) DE69428909D1 (hu)
FI (1) FI960839A0 (hu)
HU (1) HUT73777A (hu)
IL (1) IL110585A0 (hu)
NO (1) NO960710D0 (hu)
PL (1) PL313257A1 (hu)
WO (1) WO1995005841A1 (hu)
ZA (1) ZA946008B (hu)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4727770B2 (ja) * 1997-09-26 2011-07-20 カルピス株式会社 尿中カテコールアミン低下、尿中ノルアドレナリン低下、尿中ドーパミン低下及びＦｉｓｃｈｅｒ比低下の少なくとも１つの軽減剤
EP1401808B1 (en) 2001-05-24 2009-07-08 Neuren Pharmaceuticals Limited Gpe analogs and peptidomimetics
US7714020B2 (en) * 2001-05-24 2010-05-11 Neuren Pharmaceuticals Limited Treatment of non-convulsive seizures in brain injury using G-2-methyl-prolyl glutamate
US20070004641A1 (en) * 2001-05-24 2007-01-04 Neuren Pharmaceuticals Limited Cognitive enhancement and cognitive therapy using glycyl-L-2-methylprolyl-L-glutamate
US7605177B2 (en) * 2001-05-24 2009-10-20 Neuren Pharmaceuticals Limited Effects of glycyl-2 methyl prolyl glutamate on neurodegeneration
SG187271A1 (en) * 2011-07-07 2013-02-28 Agency Science Tech & Res Anti-amyloidogenic, alpha-helix breaking ultra-small peptide therapeutic

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4190646A (en) * 1975-11-11 1980-02-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Polypeptide compositions and methods
US4505853A (en) * 1983-11-18 1985-03-19 Ortho Pharmaceutical Corporation Enzyme-resistant immunomodulatory peptides
US4629723A (en) * 1984-06-27 1986-12-16 Ortho Pharmaceutical Corporation Potent thymopentin analogs
US5028592A (en) * 1986-08-08 1991-07-02 Lipton James M Antipyretic and anti-inflammatory peptides
IT1216908B (it) * 1987-03-19 1990-03-14 Eniricerche Spa Analoghi retro-inversi della timopentina e dei suoi frammenti, il metodo per la loro sintesi ed il loro impiego per la preparazionedi composizioni farmaceutiche.
IT1222437B (it) * 1987-08-04 1990-09-05 Ellem Ind Farmaceutica Tripeptidi utili come immunostimolanti e nella prevenzione delle metastasi e relativo procedimento di preparazione
NZ229004A (en) * 1988-05-19 1993-09-27 Immunobiology Res Inst Inc Tetrapeptides having t cell helper acitivity
HU201095B (en) * 1988-06-14 1990-09-28 Richter Gedeon Vegyeszet New peptides inhibiting the activity of the immune system and pharmaceutical compositions comprising same, as well as process for producing these peptides and compositions
WO1990003180A1 (en) * 1988-09-30 1990-04-05 Immunobiology Research Institute, Inc. Peptides having t cell suppressor activity
DD296084A5 (de) * 1989-07-27 1991-11-21 Adw Verfahren zur herstellung von humanen spleninderivaten

Also Published As

Publication number Publication date
PL313257A1 (en) 1996-06-24
JPH09502175A (ja) 1997-03-04
IL110585A0 (en) 1994-11-11
FI960839A (fi) 1996-02-23
ATE207757T1 (de) 2001-11-15
NO960710L (no) 1996-02-22
NO960710D0 (no) 1996-02-22
CZ55496A3 (en) 1996-08-14
DE69428909D1 (de) 2001-12-06
US5639729A (en) 1997-06-17
ZA946008B (en) 1995-03-29
KR960703612A (ko) 1996-08-31
AU682898B2 (en) 1997-10-23
EP0723454A1 (en) 1996-07-31
CN1133563A (zh) 1996-10-16
EP0723454A4 (en) 1998-07-29
EP0723454B1 (en) 2001-10-31
BR9407357A (pt) 1996-10-29
HU9600432D0 (en) 1996-04-29
FI960839A0 (fi) 1996-02-23
WO1995005841A1 (en) 1995-03-02
CA2169072A1 (en) 1995-03-02
AU7868194A (en) 1995-03-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5298490A (en) Tetra and penta-peptides useful in regulating the immune system
US4024248A (en) Peptides having LH-RH/FSH-RH activity
EP0672055B1 (en) Neuropeptide y antagonists
EP0016612A2 (en) Peptides having ubiquitin-like activity, process for their preparation, therapeutic compositions containing them and their use
HUT73777A (en) Novel tripeptides useful in immune and central nerve system therapy
JP4401170B2 (ja) 新規ペプチドであるヒト成長ホルモン放出ホルモンの類似体
EP0018182A1 (en) Peptides having thymopoietin-like activity, therapeutic compositions containing them, and process for their preparation
US5215964A (en) Peptides useful in regulating the immune and nervous systems
RU2120944C1 (ru) [(s) pmp1, d-trp2, pen6, arg8]окситоцин
EP0479899B1 (en) Vasodilatory and immune suppressant peptides
CZ553289A3 (en) Peptide exhibiting immunomodulating activity, process of its preparation and pharmaceutical preparation in which it is comprised
AU682898C (en) Novel tripeptides useful in immune and CNS therapy
JPH0135839B2 (hu)
NZ241224A (en) Pentapeptides having t cell helper activity
IL104293A (en) Pentapeptides that have the activity of helper T cells and pharmaceutical preparations that contain them

Legal Events

Date Code Title Description
DFC4 Cancellation of temporary protection due to refusal