CZ486089A3 - vasopressin analogs - Google Patents

Description

Vynález· se- týká' nových analogů vasopresinu.

Kombinace záměn aminokyselin v poloze- 2. a 8 pept.ídového řetězce 8-L-arginin- vasopresinu, je jedniitr z nej — produktivnějších přístupů, v kvalitativních a’ kvantitativních obměnách biologických vlastností tohoto typu, peptí— du /K.JoSt a kol..: Handbook of Neurohypophyseal hormoneanalogs, CRC Press,, Boča Ra.ton,. U.S.A.., 1987/. Zachování volné aminoskupiňy na cysteinu v poloze- 1 peptidu dává možnost další obměny,, především ve smyslu. změny doby účinku,. a to při substituci této skupiny aminoacyLovýra či peptí dovým zbytkem, kdy dojde k; vytvořeni prekursorové formy základních peptí dů..

Byly připraveny a studovány- účinky analogů vasopresinu s D-homoargi/nem v poloze 8, kde byly dále. modifikovány vhodnými substitucemi v poloze 2..

Synthesa těchto Látek byla provedena na pevné fázi za použití benzhydrylaminové pryskyřice postupným.napojováním-; aminokyselin chráněných, obecně známými skupinami.

Jako vhodný derivát D-homoargininu byl pro synthesu všech analogu použit Ií -tert-butyloxykarbonyl HG-nitrohomoarginin. p-Methylfenylalaninový a p-ethylfenylalaninový zbytek byl zaveden ve formě racemátu, Chránící skupiny z postranních řetězců byly odštěpeny současně při odštěpování peptidového- řetězce z; nosiče kapalným fluorovodíkem. Oxidace SA-skupin a následná cyklisace byly provedeny roztokem ferrikyanidu. Látky byly- čištěny vysokotlakou, kapalinovou chromatografií (dále- jen HPLC),. přičemž byly- peptidy i

s. D a L-aminokyselinou v poloze- vzájemně odděleny. Ϊ

Získané látky byly charakterizovány tenkovrstvou chromatografií (dále. jen TLC) na silica deskách (.Silufol, .Kavalier): v následujících systémech; 2-butanol~98% kys, mravencí-voda. (10 : 3 : 8) či. 1-butanol-kys.octová-pyridinvoda. (15' s.. 3 : 10 : 6) elektroforesou na papíře, v 1 M kys. octové nebo v pyridin-octanovém pufru (pH. 5,7) na Whatman.

MM. papíře, po 1 hod. při spádu 2Ó V/cm. Aminokyselinová analy saby la^pr o vedena nar aminokyselino vém.-analy sát ořu —------T 339- nebo. D - 500 (Durrum Corp. TJ.S.A,), Analytická HPLC byla provedena na koloně' s náplní Separon SIX-C-18 nebo Vydac 218 TP 5í' preparativní' byla provedena v modulární' sestavě (Knauer) na koloně plněné Sepharonem S6Z — C18.

Biologická aktivita peptidů byla stanovena na krysách; uterotonická (agonická či antagonistická) dle Holtonové , (Holton J.: Brit. J, Pharmacol. 3, 328,. 1948) v Munsickove úpravě (Endocrinology 66, 451, 1960), inhibiční. aktivi- i ta. byla vyjádřena hodnotou pAg (Eggena P.. a kol.: G,. Gen. Physiol.. 56, 250, 1970), presorická aktivita byla stanovena na despinalisovaných krysích samcích dle Krejčího a kol.

Brit... J.„?.harm...Chemother. 30, 497, 1967) a antidiuretická dle. Burna (Bum a kol., Biol. Standarde, Oxford íniv, Press, London. 1950).· Jako standard v antidiuretickém testu byl použit [deamino ^7nD^^řa5?3^-=V8L'³’^o’P^re'^3Í31*~^^řeilied_Jbi‘^0ÍOw·gických aktivit je uveden v Tabulce.

Předmětem, vynálezu, jsou analogy vasopresinu obecného. vzorce.

Cys-X-Phe-Gln-Asn-Cys-PTo-D-Ear-GlyNH_n I_1 kde- Σ' je. L-Q-methyltyrosin

L-p-ethylfenylalanin D-p-ethylfenylalanin. L-p-methylf eny lalanin- nebo D-p-methylfenylalaniu.

1¾ ϊ

I látka. I látka. II' látka III. látka IV’ látka. V

Dále je? předmětem vynálezu způsob přípravy těchto látek,, j.ehož podstatou, je,, že- peptidy jsou syntetizovány na pevné fázi'.- z- hydroxybenztriazolových esterů BOC-aminokyselin,. načež: po ukončení syntézy se peptidy z pryskyřice, uvolni kapalným fluorovodíkem, a, dojde, k odštěpení chránících, skupin,. z;, pnatTRnnính řetezců,, a poté. vzniklé lineární peptidy se.· cyklisují. za. přítomnosti, ferrikyanidu draselného a, provede se rozdělení' isomerů. s ITa. D-p-methylfenylalaninem. Či. Ira. D-p-ethylfenylalaninem. v posici. 2, pomocí vysokotlaké- kapalinové chromatografie..

V následujícím, je. příprava, látek. I. až. V doložena na příkladech provedení.

Sghema synthetlckého- postupu

Cyklus, připojení chráněné aminokyseliny při výstavbě peptidového. řetězce, na· nosiči, lze popsat schématem,.

T, Odštěpení BOC-skupiny 40 ml 50 % trifluoroctové kyseliny v dichlormetanu obsahující 2 % anisol po dobu 2 min,, opakovaně po 30 min,

2.. Bromytí diohlormetanem (3 x 40 ml, 1 promytí 30 sek,.)

3, · Promytí 30 % dioxanem v dichlormetanu (3 x. 40 ml, promytí - 3.0 sekund)

4, Promytí dichlormetanem (3 x 40 ml, 1 promytí 30 sek.)

5, Neutralizace 10 % triethylaminu. (40 ml) v dichlormetanu (40 ml,, cyklus 2 min,).

6. Promyti di chlormetanem /2. χ- 4 ml, cyklus 30 sek./.

7. Neutralisace přidáním 40 ml 10 % tri ethylaminfc< v 40 X di chlormetanu. /cyklus 2 min,/..

8\ Promyti trich l ormetanem 60 x 40 ml, cyklus 30 sek.

9. Přidáni hydroxybenzotriazotového esteru BOC-chráněné aminokyseliny v dichlormetanu. /cyklus 30 min./.

10., Promyti 50 % EtOH v di ch lormetanu /3 x 40 ml, cyklus 30 sek. /

11, Promyti di ch l ormetanem / 3 x 15 ml, cyklus. 1 min./.

T2_e Promyti dichlormethanem /3 x 15 ml, cyklus 1 min./.

Příprava^ pryskyřice s navázaným heptapeptidem

Berathydrytaminová pryskyřice /4,46 g, 0,56 mmot/g/ byla rozmíchána, v di chlormetanu a po promyti 5 X triethylaminetn v di ch lormetanu a dimethylformamidu byla smíchána s 3 molární m přebytkem BOC-Gly-OBt._t Reakce byla přerušena po 30 min. a pryskyřice byla· promyta následovně dimethylf armami dem /3 x 20 ml/ a d1chlormetanem /3 χ 20 ml/. Poté byt aplikován postup uvedený v přikladu 1. BOC aminokyseliny ve formé aktivnich esterů /v 3 molárnim· přebytku/ byly napojovány na aminoskupinu vázané aminokyseliny v následujícím sledu. BOC-O-Har/NO2/-OH, BOC-Pro-OH, BOC-Cys/4-We-Bx.l/OH, BOC«Asn-OH, BOC-Gln-OH a BOC-Phe-OH. V případě vazby ím&h^argini nu, cysteinu a f en^la lani nu, byl. z důvodu urychlené reakce přidáván katatysátor /4-dimethylami nopy ri di n, 50 mg/.

Přiklad 1

Příprava [_2“0“Methyltyrosin, 8-D-homoargininj vasopresin /látka vzorce 1/

Na pryskyřici s navázaným heptapeptidem /1,7 g,

0,48 mmolu/ byly dle uvedeného návodu navázány BOC-Tyr/Me/OH a B0C-Cys/4-Me-Bzl/OH. Pryskyřice s navázaným nonapeptidem /1,8 g/ byla podrobena působeni kapalného HF /20 ml, 60 min.

□ O °C/ v přítomnosti 1/0 ml anisolu a 1,2 ethandithiolu /1 ml/.

Poté byl. HF vyfoukán.,

Uvolněný nonapept.id spolu s pryskyřici byl po odstraněni

HF smíchán s etherem,, odfiltrován a prornyt. ethylacetátem.

Valný peptid byl, postupně extrahován kys.. octovou, 50 X kyselinou, octovou, vodou a nakonec Lyofilisován /výtěžek 0,69 g/. Ly of i l i sát. byl rozpuštěn ve vodě /700 ml/ a pHroztoku bylo upraveno 0,1' N Na OH na hodnotu, 7,0.„ K roztoku byl přidán ferrikyanid draselný /0,01 M/ do trvalého žlutého^ zbarveni., Během, oxidace /20 min/ bylo? pH udržováno na hodnotě· 7,2 roztokem NaQH /0,1 N/, poté.- bylo; sníženo kys. octovou na. hodnotu 4,5. Produkt byl poté adsorbovánna sloupec Amberlitu CG-50 1,. kolona byla promyta 0,25 X kyselinou octovou, a produkt byl eluován 50 X. kyselinou octovou /60 ml/, zlyofi li sován /353: mg/ a čištěn na koloně Vydax 218 TP 5 elucí methanolem /lineární gradient od 20 X do 40 X Me0H-0,05 X TFA/,. Lyofilisaci bylo získáno 160 mg. Elementární analysa, pro: ^C48^H67^N13°12.^S2 ^{x 3} TFA.,2H₂0 vy* počteno·!· 43,26 X C,. 5,18 X- H, 14,01 X Nr nalezeno 42,92: X C, 4,92' X H, 14,31 X N„

Aminolyselinovou analysou byly zjištěny následující hodnoty: Asp: T,00., Glu? 1,00, Pro: 0,75, Gly: 0,99,

Cys: 1,8, Tyr/Me/ 1,1 , Phe: 1,07, Har: 1,05.,................

Příklad 2

Příprava; [^2-p-ethyl-L-fenylalanin, 8-D-homoargininJ vaso— presinu / látky vzorce 1.1/

Pryskyřice /1,35 g, 0,5 mmol/ s navázaným heptapeptidem byla ponechána reagovat /viz shora/ s 1,1 ekvivalentu BOC-tf. 3i-Phe/p<£t/-OH 24 hod a poté. ještě s 1 ekvivalentem v přítomnosti dimethylaminopyridinu po 30 min a posléze s BOC-Cys /4-Me-Bz1/OH. Po odstraněni BOC - chránící skupiny byla pryskyřice smíchána s HF /15 ml, 60 min, 0 °C/ v přítomnosti 2 ml amisolu. Volný nonapeotid spolu s oryskyřici byl po odstraněni HF míchán s etherem/ odfiltrován, promyt ethylacetátem a volný peptid byl poté extrahován kyselinou octovou, 50 % kyselinou octovou,, vodou a nakonec lyofilisován’ 0.,í M NaOH na hodnotu 7,0«. K roztoku byl přidáván 0,01 M ferrikyanid draselný do trvalého žlutého zbarveni. Během' oxidace- /20 min/ byl.o: pH udržováno na hodnotě 7,2 při dá váním; 0,1 M NaOH a nakonec pH upraveno, kyselinou octovou, na. hodnotu: 4,5. Roztok peptidů byl adsorbován na koloně Amberlitu. CG-50 I; kolona, byla poté promyta^; 0,25 kys. octovou a produkt: byt eluován 50 % kyselinou octovou, lyofi lisován /185 mg/ a; Čištěn APLC na koloně; Sepharonu SGX-C18 Lineárním gradientem MeOH^; /20-70 X/, 0,1 2 TFA.

První vrchol charakterizovaný pohyblivostí k‘» 2,2,

MeOH-0,05 2 TFA /6:4/ a; k*» 7,47 MeOH - 0,05 2 TFA /5:5/ odpovidá. ana logu s. p-ethyl-L-f eny lá táni nem v poloze 2.

Pro x 4· TFA . 2Η₂0 /1€02,5/ vypočteno

42,79 2 C, 4,97 2 H, 13,11 2. N; nalezeno: 42,85 X C-,

5,05. 2 H, 13,37 2 N., Aminokyselinovou analysou nalezeno Asp 0,99, Glu 1,00, Pro 1,12, Gly 1,0T, Cys. /stanoveno jako kyselina, cysteová/ 2,12, 4-Et-Phe 0,78, Phe-í,02, Har-0,80. Výtěžek 18 mg.

'P-ř-i-k:l-a-d>-3---------- -------------- ------—------------—

Příprava [^2-p-ethy4-0-f eny la tanin, 8-0-homoa rgi ni nj vasopresinu. / látky vzorce III/

Látka byla připravena dle přikladu 2, ve směsi s lát· kou II .. Oddělena byla od:^r ni při HPLC na koloně Sepharonu SGX - C 18, tak jak jr popsáno v přikladu 2. Při aplikaci těneárniho konc. gradientu MeOH - 0,05 2 TFA /20-70 2/ byla látka /7/ eluována v druhém vrcholu a je charakterisována náéfeddujicimi parametry k*= 3,60, MeOH - 0,05. 2 TFA /6:4/; = 19,57 MeOH - 0,05 2 TFA /5:5/. Pro ^C49^H71^N15°11^S2 ^{x 4 TFA /156ó}'^4/ vypočteno 43,71 2 C,

4,83 X H, 13,41 2 N, nalezeno 43,74 X C, 5,16 2 H, 13,,52 2 N.. Aminokyselinovou analysou nalezeno: Asp 1,-00, Glu - 0,98,

Pro - 1,05, Gly 1,12,. Cys /stanoveno Jako kys. cysteová/ ^VOZ^etNiPhT“076‘8~Phě“1705~Har - 078'5;

Přiklad 4

Příprava [J-p-methyl-L-fenylaLanin, 8-0-homoargininJ vasopresinu /látky vzorce IV/

Pryskyřice¹ s,e zakotveným· heptapeptidem /3,4 g,

0,96 mmolu/ byla- zpracována dle schématu S 1,1 ekvivalentem BOC-LyD-Phe /p-Me/OH po 18 hodin, a. poté ještě- s 0,5 ekvivalentu po; 4 hodiny.. Jako. další byla připojena aminokyselina BOC-Cys; /4 Me-Bc£/-QH. Pryskyřice* s navázaným chráněným peptidem' zpracována postupem- uvedeným v při kladu. 2'._f I; kolony Amberlitu CG-50I eluci 50. X5 CHjCOOH byl.o získáno 614 mg surového produktu, který byt j Lyof i li sován^ a- dále tištěn HPLC na koloně Vydac. 218 TP 5 etud konc.„ lineárním- gradientem MeOH - 0,05 X TFA od; 25 X< do 60 %· konc.„ MeOH. Jako prvý byl eluován 40, mg ^*2-p-methyl-L-f eny lá táni n,/8-0-homoargini n^J vasopresin, jehož charakteristiky j sou. nás ledu j í ci k’- 3,18 MeOH - 0,05 X 55:-45, Pro ^48^7^ 3^ ₂ ^S2 x 3TFA 2H₂0 /1474,4/,, vypočteno 43,99- £ C> 5,20. X H,. 14,2.5 X- N._r nalezeno. 44,19 X' C,. 4,96 X: H, 14-,41 X> N„

Aminokyselinovou analysou nalezeno: Asp; 1,08*,. Glu T,01,, Pro 0,87, Gly 1,08.,, Cys /stanoveno: jako kys._: cystéová/ 2‘,04,.

Z4-Me-Phe-0,7,. Phe - 0,92, Har 1,01.. _______

Příklad 5

Příprava; [2-p-methyl-O-fenylalanin,. 8-0-homoargininJ vaso— « presinu /látka, vzorce V/ i

; Látka byla připravena ve směsi s látkou/V, odděLena byla od ni HPLC, na koloně- Vydac 2.18 TP 5 eluci koncentracnim lineárním gradientem MeOH — 0,05 X TFA od 25 % - 60 X koncentrace MeOH,. Látka V byla etuována jako druhá v pořadí i

/16,2. mg/ a její charakteristiky jsou. následující; k*~ 5,18, MeOH - 0,05 X. TFA 55:45, Pro ^C48^H67^N13°12^S2 * ^{3,5 TFA x 1 H}2° /1522,4 vyoocteno- 43,39 X C, 5,00 X H, 13,80 X nalezeno 43,24 X C, 4,78. X H, 14,13 X N„ Aminokyselinovou analysou bylo nalezeno: Agp 0,89, Glu 1,02,. Pro 1,00,. Gly 1,05, Cys /Stanoveno jako kys.cysteová/ 2,03,4-Me-Phe 0,88,Phe 1,00,

Har 1,08r

Tabulka Přehled některých biologických aktivit i

	0-	a.	ú.	1 1 0. 1
-<O |			>-	>-	>	> 1
Jť 1	a.		<	<	<	< 1
Ui |	>	o	o	o	a	o i
	<	c.	3	3	3	3 |
-w *	a	«
4> 1	3	>	X	X	X	X |
t> (0 i		o
□ 1	X	c.	T·*	r*		. I
|		w	%	X		χ ΐ
3 > |	τ“·	-H	o	a	o	O I
«r»- |		(A				1
-Μ -M |	)	Φ	v	V	v	\Z i
C JÍ 1	(	c
< «. |
							-1
><0 |	o	Ol.			ra	ra- i
M- |	c.	E	ΙΛ	tn	E	E |
u <e- i			V.	%	s.	1
	>	3-	Ό	Ό	3	3 1	i - ' · Ί
U *p® i	o	í*4r				Μ- I
O > 1	c		II	11
o* **° 1	<0				•4·	«4 1
t> -M ,	+*	a	(M	(Ví.	O	O 1	|T’- M
CJef |	os		<	<	V	* 1
Qo «: |		C3	O.	ítt	o	O t
	£..						r / l,
							k -r-z
							> , -------
<e i
1			O·	ΙΛ	ΙΛ	UY |
U 1	ra	Γ-	•4	r*	oo	00 1
..··»·.„	—e.—	----		--	_______v_	~ . . . *?·_|	_______ J___________
C « 1	X	N-	r-	03	Ό	Ό.· 1
O *» |	3
-H ' |	tM.	II	u	II	II	II 1
O) > ,
U ·*»' 1	o	(M	(V	(V.	(V	(V 1
« -Μ |	%	<	<	<	<	< 1
-«-> -X |	a	Q.	a	a.	a	a i
3; <o i							c
							<Λ
							φΛ
							u
							a.
							o
γ l							ot
·*» |							«
£ 1							>-
0» 1				I-Í			o
HJ <Q 1			I-t	w	>		c
β jí i		M 4	HH		M	> 1
C +» l							E-
N -rtj |							<0
O =í i							Φ.
							3'
							i—i
							c.
	c	oP	n	Γ—		í	c T·
	, .« .	. A .	(.	oo. ...	... .	. . .. ,|	. . .ra .
	o	<0	n	u	Π	*0 1	L
	t_	X.	X	(β	X	X 1	<
	a	1	1	X	|	1 I	1
	o	Q	a	1	a	a |	a
	«	*	%	a		V t	1
	fl*	I c	OJ c.	c	04 C	04 C f	ί CO . f
c t	>-	(V	di	<v	4»	4) |
I		t_ 01	X 01	4*. 01	X 01	X οι· 1
C 1		x a>	a. as	X. «1	0. 4»	CL 01 |	II.
» 1	oo	1- t.	+t fc=	0. fc,	4» (.	Ol C |
►U 1	t.	a	uj a	=h a	ε a	ε a i	a
3 1	<e	o o	1 o	Ul O	o	o I	>
o i	X	ε «	CL VI	a oi’	a ví	a oi i	<
v	t	i n	1 a	I «	i m	i *e 1	a
C/J i		uSj’		U±4>		i	3

p a- τ ε n τ α· v É

Claims (3)

1. NÁROKY . .1 i

   Λ '<ě «

   1. Analogy vasapresinu obecného vzorce.

   C’ySi - X -Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Hat—GlyNH-.

   1___I kde- X' je L-O-methyLtyrosin l_-p-ethy Lf enyí al.anin D-p-ethylfenylalanin L-p-methylfenylalanin nebo D-p-methylfenylalanin he-roiý
2. 2’. Způsob přípravy analogů obecného vzorce podle* bodu/i vyznačený . tím, že se metodou na. pevné¹ fázi v uvedeném sledu vystaví řetězec z- hydroxybenztriazolových esterů, BQOaminokyselin, načež; po ukončení syntézy* se: peptidy z; pryskyřice uvolní kapalným’ fluorovodíkem: za. současného odštěpení..· chránících skupin z. postranních řetězců, a. potě vzniklé^ lineární, peptidy se cyklisují -z& přítomnosti, ferrikyanidu draselného* a provede¹ se? rozdělení isomerů e Lra·. D-p-methylfenylalaninem či L- a D~

   -----P-ethy lf eny lalaninem v posici. 2 pomocí vysokotlaké kapalinové chromatograf ie·.
3. 3‘. Způsob podle 2, vyznačený tím, že jako pevná fáze. se užívá- benzhydrylaminová pryskyřice..