CZ278375B6

CZ278375B6 - Vasopressin analogs

Info

Publication number: CZ278375B6
Application number: CS894860A
Authority: CZ
Inventors: Zdenko Ing Csc Prochazka; Ivo Rndr Csc Blaha; Jirina Rndr Csc Slaninova; Miroslava Ing Zertova; Jiri Ing Csc Velek; Jana Mudr Csc Skopkova; Michal Ing Csc Lebl; Tomislav Rndr Drsc Barth; Lenka Rndr Maletinska
Original assignee: Ustav Organicke Chemie A Bioch
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1989-08-18
Publication date: 1993-12-15
Also published as: CA2022865A1; CZ486089A3

Description

Vynález se týká nových analogů vasopresinu.

Kombinace záměn aminokyselin v poloze 2 a 8 peptidového řetězce 8-L-arginin vasopresinu je jedním z nejproduktivnějších přístupů v kvalitativních a kvantitativních obměnách biologických vlastností tohoto typu peptidu /K. Jošt a kol: Handbook of Neurohypophyseal hormone analogs, CRC Presš, Boča Raton, U.S.A., 1987/. Zachováni volné aminoskupiny na cysteinu v poloze 1 peptidu dává možnost další obměny, především ve smyslu změny doby účinku, a to při substituci této skupiny aminoacylovým či peptidovým zbytkem, kdy dojde k vytvoření prekursorové formy základních peptidů.

Byly připraveny a studovány účinky analogů vasopresinu s D-homoargininem v poloze 8, kde byly dále modifikovány vhodnými substitucemi v poloze 2. '

Synthesa těchto látek byla provedena na pevné fázi za použití benzhydrylaminové pryskyřice postupným napojováním aminokyselin chráněných obecně známými skupinami. Jako vhodný derivát D-homoargininu byl pro synthesu všech analogů použit N a-tert-butyloxykarbonyl NG-nitrohomoarginin, p-Methylfenylalaninový a p-ethylfenylalaninový zbytek byl zaveden ve formě racemátu. Chrániči skupiny z postranních řetězců byly odštěpeny současně při odštěpování peptidového řetězce z nosiče kapalným fluorovodíkem. Oxidace SA-skupin a následná cyklisace byly provedeny roztokem ferrikyanidu. Látky byly čištěny vysokotlakou kapalinovou chromatografií (dále jen HPLC), přičemž byly peptidy s D a L-aminokyselinou v poloze vzájemně odděleny.

Získané látky byly charakterizovány tenkovrstvou chromatograf ií (dále jen TLC) na silica deskách (Silufol, Kavalier) v následujících systémech: 2-butanol- 98% kys. mravenčí-voda (10 : 3 :8) či 1-butanol-kys.octová-pyridin-voda (15 :3 : 10 : 6) elektroforesou na papíře v 1 M kys. octové nebo v pyridin-octanovém pufru (pH 5,7) na Whatman 3 MM papíře po 1 hod při spádu 20 V/cm. Aminokyselinová analysa byla provedena na aminokyselinovém analysátoru T 339 nebo D - 500 (Durrum Corp. U.S.A.). Analytická HPLC byla provedena na koloně s náplní Separon SIX-C-18 nebo Vydac 218 TP 5; preparativní byla provedena v modulární sestavě (Knauer) na koloně plněné Sepharonem S6X - C18.

Biologická aktivita peptidů byla stanovena na krysách: uterotonická (agonická či antagonistická) dle Holtonové (Holton J.: Brit. J. Pharmacol. 3, 328, 1948) v Munsickově úpravě (Endocrinology 66, 451, 1960), inhibiční aktivita byla vyjádřena hodnotou pA₂ (Eggena P. a kol.: G. Gen. Physiol. 56, 250, 1970), presorická aktivita byla stanovena na despinalisovaných krysích samcích dle Krejčího a kol. Brit. J. Pharm. Chemother. 30, 497, 1967) a antidiuretická dle Burna (Burn a kol., Biol. Standards, Oxford Univ. Press, London 1950). Jako standard v antidiuretickém testu byl použit (deamino¹, D-arginin⁸]-vasopresin. Přehled biologických aktivit je uveden v Tabulce.

-1CZ 278375 B6

Předmětem vynálezu jsou analogy vasopresinu obecného vzorce

Cys-X-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Har-GlyNH₂ kde X je L-O-methyltyrosin

L-p-ethylfenylalanin

D-p-ethylfenylalanin L-p-methylfenylalanin nebo D-p-methylfenylalanin

látka I
látka	II
látka	III
látka	IV
látka	V

Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy těchto látek, jehož podstatou je, že peptidy jsou syntetizovány na pevné fázi z hydroxybenztriazolových esterů BOC-aminokyselin, načež po ukončení syntézy se peptidy z pryskyřice uvolní kapalným fluorovodíkem a dojde k odštěpení chránících skupin z postranních řetězců, a poté vzniklé lineární peptidy se cyklisují za přítomnosti ferrikyanidu draselného a provede se rozdělení isomerů s La D-p-methylfenylalaninem či L- a D-p-ethylfenylalaninem v posici 2 pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie.

V následujícím je příprava látek dech provedení.

I až V doložena na příklaSchéma synthetického postupu

Cyklus připojení chráněné aminokyseliny při výstavbě peptidového řetězce na nosiči lze popsat schématem.

1.Odštěpení BOC-skupiny 40 ml 50 % trifluoroctové kyseliny v dichlormetanu obsahující 2 % anisol po dobu 2 min. opakovaně po 30 min.

2. Promytí dichlormetaném (3 x 40 ml, 1 promytí 30 sek.)

3. Promytí 30 % dioxanem v dichlormetanu (3 x 40 ml, 1 promytí - 30 sekund).

4. Promytí dichlormetanem (3 x 40 ml, 1 promytí 30 sek.).

5. Neutralisace 10 % triethylaminu (40 ml) v dichlormetanu (40 ml, cyklus 2 min.).

6. Promytí dichlormetanem (2 x 4 ml, cyklus 30 sek.).

7. Neutralisace přidáním 40 ml 10 % triethylaminu v 40 % dichlormetanu (cyklus 2 minuty).

8. Promytí trichlormetanem 60 x 40 ml, cyklus 30 sek.

9. Přidání hydroxybenzotriazolového esteru BOC-chráněné aminokyseliny v dichlormetanu (cyklus 30 min.).

10. Promytí 50 % EtOH v dichlormetanu (3 x 40 ml, cyklus 30 sek.).

11. Promytí dichlormetanem (3 x 15 ml, cyklus 1 min.).

12. Promytí dichlormethanem (3 x 15 ml, cyklus 1 min.).

-2CZ 278375 B6

Příprava pryskyřice s navázaným heptapeptidem

Benzhydrylaminová pryskyřice (4,46 g, 0,56 mmol/g) byla rozmíchána v dichlormetanu a po promytí 5% triethylaminem v dichlormetanu a dimethylformamidu byla smíchána s 3 molárním přebytkem BOC-Gly-OBt. Reakce byla přerušena po 30 min. a pryskyřice byla promyta následovně dimethylformamidem (3 x 20 ml) a dichlormetanem (3 x 20 ml). Poté byl aplikován postup uvedený v příkladu 1. BOC aminokyseliny ve formě aktivních esterů (v 3 molárním přebytku) byly napojovány na aminoskupinu vázané aminokyseliny v následujícím sledu. BOC-D-Har(NO₂)-OH, BOC-Pro-OH, BOC-Cys-(4-Me-BzL) OH, BOC-Asn-OH, BOC-GLn-OH a BOC-Phe-OH. V případě vazby homoargininu, cysteinu a fenylalaninu, byl z důvodu urychlené reakce přidáván katalysátor (4-dimethyl-aminopyridin, 50 mg).

Příklad 1

Příprava [2-O-Methyltyrosin, 8-D-homoarginin] vasopresin (látka vzorce I)

Na pryskyřici s navázaným heptapeptidem (1,7 g, 0,48 mmolu) byly dle uvedeného návodu navázány BOC-Tyr(Me)OH a BOC-Cys(4-Me-BzL)OH. Pryskyřice s navázaným nonapeptidem (1,8 g) byla podrobena působení kapalného HF (20 ml, 60 min., 0 °C) v přítomnosti 1,0 ml anisolu a 1,2 ethandithiolů (1 ml). Poté byl HF vyfoukán. Uvolněný nonapeptid spolu s pryskyřicí byl po odstranění HF smíchán s etherem, odfiltrován a promyt ethylacetátem. Volný peptid byl postupně extrahován kys. octovou, 50% kyselinou octovou, vodou a nakonec lyofilisován (výtěžek 0,69 g). Lyofilisát byl rozpuštěn ve vodě (700 ml) a pH roztoku bylo upraveno 0,1 N NaOH na hodnotu 7,0. K roztoku byl přidán ferrikyanid draselný (0,01 M) do trvalého žlutého zbarvení. Během oxidace (20 min) bylo pH udržováno na hodnotě 7,2 roztokem NaOH (0,1 N), poté bylo sníženo kys. octovou na hodnotu 4,5. Produkt byl poté adsorbován na sloupec Amberlitu CG-50 I, kolona byla promyta 0,25% kyselinou octovou a produkt byl eluován 50% kyselinou octovou (60 ml), zlyofilisován (353 mg) a čištěn na koloně Vydac 218 TP 5 elucí methanolem (lineární gradient od 20 % do 40 % MeOH-0,05 %TFA). Lyofilisací bylo získané 160 mg. Elementární analysa, pro ^C48^H67^N13°12^S2 ^{x 3} T?A.2H₂O vypočteno: 43,26 % C, 5,18 % H, 14,01 % N: nalezeno 42,92 % C, 4,92 % H, 14,31 % N.

Aminolyselinovou analysou byly zjištěny následující hodnoty: Aps: 1,00, Glu: 1,00, Pro: 0,75, Gly: 0,99, Cys: 1,8, Tyr(Me) 1,1, Phe: 1,07, Har: 1,05.

Příklad 2

Příprava [2-p-ethyl-L-fenylalanin, 8-D-homoarginin] vasopresinu (látky vzorce II) .

Pryskyřice (1,35 g, 0,5 mmol) s navázaným heptapeptidem byla ponechána reagovat (viz shora) s 1,1 ekvivalentu BOC-L, D-Phe(p-Et)-OH 24 hod a poté ještě s 1 ekvivalentem v přítomnosti dimethylaminopyridinu po 30 min a posléze s BOC-Cys (4-Me-Bzl)OH.

-3CZ 278375 B6

Po odstranění BOC - chránící skupiny byla pryskyřice smíchána s HF (15 ml, 60 min, 0 °C) v přítomnosti 2 ml amisolu. Volný nonapeptid spolu s pryskyřicí byl po odstranění HF míchán s etherem, odfiltrován, promyt ethylacetátem a volný peptid byl poté extrahován kyselinou octovou, vodou a nakonec lyofilisován'0,1 M NaOH na hodnotu 7,0. K roztoku byl přidáván 0,01 M ferrikyanid draselný do trvalého žlutého zbarvení. Během oxidace (20 min) bylo pH udržováno na hodnotě 7,2 přidáváním 0,1 M NaOH a nakonec pH upraveno kyselinou octovou na hodnotu 4,5. Roztok peptidu byl absorbován na koloně Amberlitu CG-50 I; kolona byla poté promyta 0,25% kys. octovou a produkt byl eluován 50% kyselinou octovou, Lyofilisován (185 mg) a čištěn APLC na koloně Sepharonu SGX-C18 lineárním gradientem MeOH (20 - 70 %), 0,1 % TFA. První vrchol charakterizovaný pohyblivostí k* = 2,2 MeOH - 0,05 % TFA (6 : 4) a k'= 7,47 MeOH - 0,05 % TFA (5 : 5) odpovídá analogu s p-ethyl-L-fenylalaninem v poloze 2.

Pro ^c49^h71ⁿ15°11^S2 ^{x 4 TFA}· ' 2H₂O (1602,5) vypočteno 42,79 % C, 4,97 % H, 13,11 % N; nalezeno: 42,85 % C, 5,05 % H, 13,37 % N. Aminokyselinovou analysou nalezeno Asp 0,99, Glu 1,00, Pro 1,12, Gly 1,01, Cys (stanoveno jako kyselina cysteová) 2,12, 4-Et-Phe 0,78, Phe-1,02, Har-0,80. Výtěžek 18 mg.

Příklad 3

Příprava [2-p-ethyl-D-fenylalanin, 8-D-homoarginin] vasopresinu (látky vzorce III)

Látka byla připravena dle příkladu 2, ve směsi s látkou II. Oddělena byla od ní při HPLC na koloně Sepharonu SGX - C 18, tak jak je popsáno v příkladu 2. Při aplikaci lineárního konc. gradientu MeOH - 0,05 % TFA (20 až 70 %) byla látka III eluována v druhém vrcholu a je charakterisována následujícími parametry k’ = 3,60, MeOH - 0,05 % TFA (6 : 4); =19,57 MeOH - 0,05 % TFA (5 : 5). pro C49H₇₁N₁₅0iiS₂ x 4 TFA (1566,4) vypočteno 43,71 % C,' 4,83 % H, 13,41 % N, nalezeno 43,74 % C, 5,16 % H, 13,62 % N. Aminokyselinovou analysou nalezeno: Asp 1,00, Glu - 0,98,

Pro - 1,05, Gly 1,12, Cys (stanoveno jako kys. cysteová) 2,02, 4Et-Phe 0,68, Phe 1,05, Har - 0,85.

Příklad 4

Příprava [2-p-methyl-L-fenylalanin, 8-D-homoarginin] vasopresinu (látky vzorce IV)

Pryskyřice se zakotveným heptapeptidem (3,4 g, 0,96 mmolu) byla zpracována dle schématu s 1,1 ekvivalentem BOC-L,D-Phe (p-Me)OH po 18 hodin, a poté ještě s 0,5 ekvivalentu po 4 hodiny. Jako další byla připojena aminokyselina BOC-Cys (4-Me-Bcl)-OH. Pryskyřice s navázaným chráněným peptidem zpracována postupem uvedeným v příkladu 2. Z kolony Amberlitu CG-50I elucí 50 % CH3COOH bylo získáno 614 mg surového produktu, který byl lyofilisován a dále čištěn HPLC na koloně Vydac 218 TP 5 elucí konc. lineárním gradientem MeOH - 0,05 % TFA od 25 % do 60 % konc. MeOH.

-4CZ 278375 B6

Jako prvý byl eluován 40 mg [2-p-methyl-L-fenylalanin, 8-D-homoarginin] vasopresin, jehož charakteristiky jsou následující:

k'. - 3,18 MeOH - 0,05 % 55 : 45, Pro C₄₈H₆₇N₁₃O₁₂ ^S2 ^{x 3TFA 2H}2° (1474,4), vypočteno 43,99 % C, 5,20 % H, 14,25 % N. Nalezeno 44,19 % C, 4,96 % H, 14,41 % N.

Aminokyselinovou analysou nalezeno: Asp 1,08, Glu 1,01,-Pro 0,87, Gly 1,08, Cys (stanoveno jako kys·. cysteová) 2,04, 4-Me-Phe-O,7, Phe - 0,92, Har 1,01.

Příklad 5

Příprava [2-p-methyl-D-fenylalanin, 8-D-homoarginin] vasopresinu (látka vzorce V)

Látka byla připravena ve směsi s látkou IV, oddělena byla od ní HPLC, na koloně Vydac 218 TP 5 elucí koncentračním lineárním gradientem MeOH - 0,05 % TFA od 25 % až 60 % koncentrace MeOH. Látka V byla eluována jako druhá v pořadí (16,2 mg) a její charakteristiky jsou následující: k' - 5,18, MeOH - 0,05 %TFA : 45, Pro ^c4g^H67^Ni3°i2^s2 ^{x 3,5} TFA ^{x 1 H}2° (¹⁵²²/⁴ vypočteno 43,39 % C, 5,00 % H, 13,80 % N; nalezeno 43,24 % C, 4,78 % H, 14,13 % N. Aminokyselinovou analysou bylo nalezeno: Asp 0,89, Glu 1,02, Pro 1,00, Gly 1,05, Cys (stanoveno jako kys. cysteová) 2,03,4-Me-Phe 0,88, Phe 1,00, Har 1,08.

Tabulka Přehled některých biologických aktivit

Sloučenina	Označení, látka	Uterotonická aktivita	Presorická aktivita	Antidiuretická aktivita
o [D-Har ] vasopresin		.0,9 IU/mg	nestanoveno	1 % dDAVP
[O-Me Tyr²“,D-Har⁸] vasopresin	I	pA₂ = 7,7	0,04 IU/mg	nestanoveno
[L-p-EtPhe²,D-Har⁸] vasopresin	II	pA₂ = 7,40	pA₂ = 6,5	< 0,1* dDAVP
[D-pEtPhe²,D-Har⁸] vasopresin	III	pA₂ = 8,15	pA₂ = 6,5	< 0,1 1 dDAVP
[L-p MePhe²,D-Har⁸] vasopresin	IV	pA₂ i 6,85	0,04 IU/mg	< 0,1 * dDAVP
[D-p MePhe²,D-Har⁸]	V	pA₂ = 6,85	0,04 IU/mg	< 0,1 * dDAVP

vasopresin dDAVP = [8-D-Arginin] deaminovasopresin

-5CZ 278375 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Analogy vasopresinu obecného vzorce

Cys - X -Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Har-GlyNH₂ kde X je L-O-methyltyrosin

L-p-ethylfenylalanin D-p-ethylfenylalanin L-p-methylfenylalanin nebo D-p-methylfenylalanin
2. Způsob přípravy analogů obecného vzorce podle nároku 1, vyznačený tím, že se metodou na pevné fázi v uvedeném sledu vystaví řetězec z hydroxybenztriazolových esterů BOC-amino-kyselin, načež po ukončení syntézy se peptidy z pryskyřice uvolní kapalným fuorovodíkem za současného odštěpení chránících skupin z postranních řetězců, a poté vzniklé lineární peptidy se cyklisují za přítomnosti.ferrikyanidu draselného a provede se rozdělení isomerů s L- a D-p-methylfenylalaninem či La D-p-ethylfenylalaninem v posici 2 pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že jako pevná fáze se užívá benzhydrylaminová pryskyřice.

Konec dokumentu