CZ278375B6 - Vasopressin analogs - Google Patents
Vasopressin analogs Download PDFInfo
- Publication number
- CZ278375B6 CZ278375B6 CS894860A CS486089A CZ278375B6 CZ 278375 B6 CZ278375 B6 CZ 278375B6 CS 894860 A CS894860 A CS 894860A CS 486089 A CS486089 A CS 486089A CZ 278375 B6 CZ278375 B6 CZ 278375B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- vasopressin
- ethylphenylalanine
- methylphenylalanine
- boc
- cys
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Vynález se týká nových analogů vasopresinu.
Kombinace záměn aminokyselin v poloze 2 a 8 peptidového řetězce 8-L-arginin vasopresinu je jedním z nejproduktivnějších přístupů v kvalitativních a kvantitativních obměnách biologických vlastností tohoto typu peptidu /K. Jošt a kol: Handbook of Neurohypophyseal hormone analogs, CRC Presš, Boča Raton, U.S.A., 1987/. Zachováni volné aminoskupiny na cysteinu v poloze 1 peptidu dává možnost další obměny, především ve smyslu změny doby účinku, a to při substituci této skupiny aminoacylovým či peptidovým zbytkem, kdy dojde k vytvoření prekursorové formy základních peptidů.
Byly připraveny a studovány účinky analogů vasopresinu s D-homoargininem v poloze 8, kde byly dále modifikovány vhodnými substitucemi v poloze 2. '
Synthesa těchto látek byla provedena na pevné fázi za použití benzhydrylaminové pryskyřice postupným napojováním aminokyselin chráněných obecně známými skupinami. Jako vhodný derivát D-homoargininu byl pro synthesu všech analogů použit N a-tert-butyloxykarbonyl NG-nitrohomoarginin, p-Methylfenylalaninový a p-ethylfenylalaninový zbytek byl zaveden ve formě racemátu. Chrániči skupiny z postranních řetězců byly odštěpeny současně při odštěpování peptidového řetězce z nosiče kapalným fluorovodíkem. Oxidace SA-skupin a následná cyklisace byly provedeny roztokem ferrikyanidu. Látky byly čištěny vysokotlakou kapalinovou chromatografií (dále jen HPLC), přičemž byly peptidy s D a L-aminokyselinou v poloze vzájemně odděleny.
Získané látky byly charakterizovány tenkovrstvou chromatograf ií (dále jen TLC) na silica deskách (Silufol, Kavalier) v následujících systémech: 2-butanol- 98% kys. mravenčí-voda (10 : 3 :8) či 1-butanol-kys.octová-pyridin-voda (15 :3 : 10 : 6) elektroforesou na papíře v 1 M kys. octové nebo v pyridin-octanovém pufru (pH 5,7) na Whatman 3 MM papíře po 1 hod při spádu 20 V/cm. Aminokyselinová analysa byla provedena na aminokyselinovém analysátoru T 339 nebo D - 500 (Durrum Corp. U.S.A.). Analytická HPLC byla provedena na koloně s náplní Separon SIX-C-18 nebo Vydac 218 TP 5; preparativní byla provedena v modulární sestavě (Knauer) na koloně plněné Sepharonem S6X - C18.
Biologická aktivita peptidů byla stanovena na krysách: uterotonická (agonická či antagonistická) dle Holtonové (Holton J.: Brit. J. Pharmacol. 3, 328, 1948) v Munsickově úpravě (Endocrinology 66, 451, 1960), inhibiční aktivita byla vyjádřena hodnotou pA2 (Eggena P. a kol.: G. Gen. Physiol. 56, 250, 1970), presorická aktivita byla stanovena na despinalisovaných krysích samcích dle Krejčího a kol. Brit. J. Pharm. Chemother. 30, 497, 1967) a antidiuretická dle Burna (Burn a kol., Biol. Standards, Oxford Univ. Press, London 1950). Jako standard v antidiuretickém testu byl použit (deamino1, D-arginin8]-vasopresin. Přehled biologických aktivit je uveden v Tabulce.
-1CZ 278375 B6
Předmětem vynálezu jsou analogy vasopresinu obecného vzorce
Cys-X-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Har-GlyNH2 kde X je L-O-methyltyrosin
L-p-ethylfenylalanin
D-p-ethylfenylalanin L-p-methylfenylalanin nebo D-p-methylfenylalanin
látka I | |
látka | II |
látka | III |
látka | IV |
látka | V |
Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy těchto látek, jehož podstatou je, že peptidy jsou syntetizovány na pevné fázi z hydroxybenztriazolových esterů BOC-aminokyselin, načež po ukončení syntézy se peptidy z pryskyřice uvolní kapalným fluorovodíkem a dojde k odštěpení chránících skupin z postranních řetězců, a poté vzniklé lineární peptidy se cyklisují za přítomnosti ferrikyanidu draselného a provede se rozdělení isomerů s La D-p-methylfenylalaninem či L- a D-p-ethylfenylalaninem v posici 2 pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie.
V následujícím je příprava látek dech provedení.
I až V doložena na příklaSchéma synthetického postupu
Cyklus připojení chráněné aminokyseliny při výstavbě peptidového řetězce na nosiči lze popsat schématem.
1.Odštěpení BOC-skupiny 40 ml 50 % trifluoroctové kyseliny v dichlormetanu obsahující 2 % anisol po dobu 2 min. opakovaně po 30 min.
2. Promytí dichlormetaném (3 x 40 ml, 1 promytí 30 sek.)
3. Promytí 30 % dioxanem v dichlormetanu (3 x 40 ml, 1 promytí - 30 sekund).
4. Promytí dichlormetanem (3 x 40 ml, 1 promytí 30 sek.).
5. Neutralisace 10 % triethylaminu (40 ml) v dichlormetanu (40 ml, cyklus 2 min.).
6. Promytí dichlormetanem (2 x 4 ml, cyklus 30 sek.).
7. Neutralisace přidáním 40 ml 10 % triethylaminu v 40 % dichlormetanu (cyklus 2 minuty).
8. Promytí trichlormetanem 60 x 40 ml, cyklus 30 sek.
9. Přidání hydroxybenzotriazolového esteru BOC-chráněné aminokyseliny v dichlormetanu (cyklus 30 min.).
10. Promytí 50 % EtOH v dichlormetanu (3 x 40 ml, cyklus 30 sek.).
11. Promytí dichlormetanem (3 x 15 ml, cyklus 1 min.).
12. Promytí dichlormethanem (3 x 15 ml, cyklus 1 min.).
-2CZ 278375 B6
Příprava pryskyřice s navázaným heptapeptidem
Benzhydrylaminová pryskyřice (4,46 g, 0,56 mmol/g) byla rozmíchána v dichlormetanu a po promytí 5% triethylaminem v dichlormetanu a dimethylformamidu byla smíchána s 3 molárním přebytkem BOC-Gly-OBt. Reakce byla přerušena po 30 min. a pryskyřice byla promyta následovně dimethylformamidem (3 x 20 ml) a dichlormetanem (3 x 20 ml). Poté byl aplikován postup uvedený v příkladu 1. BOC aminokyseliny ve formě aktivních esterů (v 3 molárním přebytku) byly napojovány na aminoskupinu vázané aminokyseliny v následujícím sledu. BOC-D-Har(NO2)-OH, BOC-Pro-OH, BOC-Cys-(4-Me-BzL) OH, BOC-Asn-OH, BOC-GLn-OH a BOC-Phe-OH. V případě vazby homoargininu, cysteinu a fenylalaninu, byl z důvodu urychlené reakce přidáván katalysátor (4-dimethyl-aminopyridin, 50 mg).
Příklad 1
Příprava [2-O-Methyltyrosin, 8-D-homoarginin] vasopresin (látka vzorce I)
Na pryskyřici s navázaným heptapeptidem (1,7 g, 0,48 mmolu) byly dle uvedeného návodu navázány BOC-Tyr(Me)OH a BOC-Cys(4-Me-BzL)OH. Pryskyřice s navázaným nonapeptidem (1,8 g) byla podrobena působení kapalného HF (20 ml, 60 min., 0 °C) v přítomnosti 1,0 ml anisolu a 1,2 ethandithiolů (1 ml). Poté byl HF vyfoukán. Uvolněný nonapeptid spolu s pryskyřicí byl po odstranění HF smíchán s etherem, odfiltrován a promyt ethylacetátem. Volný peptid byl postupně extrahován kys. octovou, 50% kyselinou octovou, vodou a nakonec lyofilisován (výtěžek 0,69 g). Lyofilisát byl rozpuštěn ve vodě (700 ml) a pH roztoku bylo upraveno 0,1 N NaOH na hodnotu 7,0. K roztoku byl přidán ferrikyanid draselný (0,01 M) do trvalého žlutého zbarvení. Během oxidace (20 min) bylo pH udržováno na hodnotě 7,2 roztokem NaOH (0,1 N), poté bylo sníženo kys. octovou na hodnotu 4,5. Produkt byl poté adsorbován na sloupec Amberlitu CG-50 I, kolona byla promyta 0,25% kyselinou octovou a produkt byl eluován 50% kyselinou octovou (60 ml), zlyofilisován (353 mg) a čištěn na koloně Vydac 218 TP 5 elucí methanolem (lineární gradient od 20 % do 40 % MeOH-0,05 %TFA). Lyofilisací bylo získané 160 mg. Elementární analysa, pro C48H67N13°12S2 x 3 T?A.2H2O vypočteno: 43,26 % C, 5,18 % H, 14,01 % N: nalezeno 42,92 % C, 4,92 % H, 14,31 % N.
Aminolyselinovou analysou byly zjištěny následující hodnoty: Aps: 1,00, Glu: 1,00, Pro: 0,75, Gly: 0,99, Cys: 1,8, Tyr(Me) 1,1, Phe: 1,07, Har: 1,05.
Příklad 2
Příprava [2-p-ethyl-L-fenylalanin, 8-D-homoarginin] vasopresinu (látky vzorce II) .
Pryskyřice (1,35 g, 0,5 mmol) s navázaným heptapeptidem byla ponechána reagovat (viz shora) s 1,1 ekvivalentu BOC-L, D-Phe(p-Et)-OH 24 hod a poté ještě s 1 ekvivalentem v přítomnosti dimethylaminopyridinu po 30 min a posléze s BOC-Cys (4-Me-Bzl)OH.
-3CZ 278375 B6
Po odstranění BOC - chránící skupiny byla pryskyřice smíchána s HF (15 ml, 60 min, 0 °C) v přítomnosti 2 ml amisolu. Volný nonapeptid spolu s pryskyřicí byl po odstranění HF míchán s etherem, odfiltrován, promyt ethylacetátem a volný peptid byl poté extrahován kyselinou octovou, vodou a nakonec lyofilisován'0,1 M NaOH na hodnotu 7,0. K roztoku byl přidáván 0,01 M ferrikyanid draselný do trvalého žlutého zbarvení. Během oxidace (20 min) bylo pH udržováno na hodnotě 7,2 přidáváním 0,1 M NaOH a nakonec pH upraveno kyselinou octovou na hodnotu 4,5. Roztok peptidu byl absorbován na koloně Amberlitu CG-50 I; kolona byla poté promyta 0,25% kys. octovou a produkt byl eluován 50% kyselinou octovou, Lyofilisován (185 mg) a čištěn APLC na koloně Sepharonu SGX-C18 lineárním gradientem MeOH (20 - 70 %), 0,1 % TFA. První vrchol charakterizovaný pohyblivostí k* = 2,2 MeOH - 0,05 % TFA (6 : 4) a k'= 7,47 MeOH - 0,05 % TFA (5 : 5) odpovídá analogu s p-ethyl-L-fenylalaninem v poloze 2.
Pro c49h71n15°11S2 x 4 TFA· ' 2H2O (1602,5) vypočteno 42,79 % C, 4,97 % H, 13,11 % N; nalezeno: 42,85 % C, 5,05 % H, 13,37 % N. Aminokyselinovou analysou nalezeno Asp 0,99, Glu 1,00, Pro 1,12, Gly 1,01, Cys (stanoveno jako kyselina cysteová) 2,12, 4-Et-Phe 0,78, Phe-1,02, Har-0,80. Výtěžek 18 mg.
Příklad 3
Příprava [2-p-ethyl-D-fenylalanin, 8-D-homoarginin] vasopresinu (látky vzorce III)
Látka byla připravena dle příkladu 2, ve směsi s látkou II. Oddělena byla od ní při HPLC na koloně Sepharonu SGX - C 18, tak jak je popsáno v příkladu 2. Při aplikaci lineárního konc. gradientu MeOH - 0,05 % TFA (20 až 70 %) byla látka III eluována v druhém vrcholu a je charakterisována následujícími parametry k’ = 3,60, MeOH - 0,05 % TFA (6 : 4); =19,57 MeOH - 0,05 % TFA (5 : 5). pro C49H71N150iiS2 x 4 TFA (1566,4) vypočteno 43,71 % C,' 4,83 % H, 13,41 % N, nalezeno 43,74 % C, 5,16 % H, 13,62 % N. Aminokyselinovou analysou nalezeno: Asp 1,00, Glu - 0,98,
Pro - 1,05, Gly 1,12, Cys (stanoveno jako kys. cysteová) 2,02, 4Et-Phe 0,68, Phe 1,05, Har - 0,85.
Příklad 4
Příprava [2-p-methyl-L-fenylalanin, 8-D-homoarginin] vasopresinu (látky vzorce IV)
Pryskyřice se zakotveným heptapeptidem (3,4 g, 0,96 mmolu) byla zpracována dle schématu s 1,1 ekvivalentem BOC-L,D-Phe (p-Me)OH po 18 hodin, a poté ještě s 0,5 ekvivalentu po 4 hodiny. Jako další byla připojena aminokyselina BOC-Cys (4-Me-Bcl)-OH. Pryskyřice s navázaným chráněným peptidem zpracována postupem uvedeným v příkladu 2. Z kolony Amberlitu CG-50I elucí 50 % CH3COOH bylo získáno 614 mg surového produktu, který byl lyofilisován a dále čištěn HPLC na koloně Vydac 218 TP 5 elucí konc. lineárním gradientem MeOH - 0,05 % TFA od 25 % do 60 % konc. MeOH.
-4CZ 278375 B6
Jako prvý byl eluován 40 mg [2-p-methyl-L-fenylalanin, 8-D-homoarginin] vasopresin, jehož charakteristiky jsou následující:
k'. - 3,18 MeOH - 0,05 % 55 : 45, Pro C48H67N13O12 S2 x 3TFA 2H2° (1474,4), vypočteno 43,99 % C, 5,20 % H, 14,25 % N. Nalezeno 44,19 % C, 4,96 % H, 14,41 % N.
Aminokyselinovou analysou nalezeno: Asp 1,08, Glu 1,01,-Pro 0,87, Gly 1,08, Cys (stanoveno jako kys·. cysteová) 2,04, 4-Me-Phe-O,7, Phe - 0,92, Har 1,01.
Příklad 5
Příprava [2-p-methyl-D-fenylalanin, 8-D-homoarginin] vasopresinu (látka vzorce V)
Látka byla připravena ve směsi s látkou IV, oddělena byla od ní HPLC, na koloně Vydac 218 TP 5 elucí koncentračním lineárním gradientem MeOH - 0,05 % TFA od 25 % až 60 % koncentrace MeOH. Látka V byla eluována jako druhá v pořadí (16,2 mg) a její charakteristiky jsou následující: k' - 5,18, MeOH - 0,05 %TFA : 45, Pro c4gH67Ni3°i2s2 x 3,5 TFA x 1 H2° (1522/4 vypočteno 43,39 % C, 5,00 % H, 13,80 % N; nalezeno 43,24 % C, 4,78 % H, 14,13 % N. Aminokyselinovou analysou bylo nalezeno: Asp 0,89, Glu 1,02, Pro 1,00, Gly 1,05, Cys (stanoveno jako kys. cysteová) 2,03,4-Me-Phe 0,88, Phe 1,00, Har 1,08.
Tabulka Přehled některých biologických aktivit
Sloučenina | Označení, látka | Uterotonická aktivita | Presorická aktivita | Antidiuretická aktivita |
o [D-Har ] vasopresin | .0,9 IU/mg | nestanoveno | 1 % dDAVP | |
[O-Me Tyr2“,D-Har8] vasopresin | I | pA2 = 7,7 | 0,04 IU/mg | nestanoveno |
[L-p-EtPhe2,D-Har8] vasopresin | II | pA2 = 7,40 | pA2 = 6,5 | < 0,1* dDAVP |
[D-pEtPhe2,D-Har8] vasopresin | III | pA2 = 8,15 | pA2 = 6,5 | < 0,1 1 dDAVP |
[L-p MePhe2,D-Har8] vasopresin | IV | pA2 i 6,85 | 0,04 IU/mg | < 0,1 * dDAVP |
[D-p MePhe2,D-Har8] | V | pA2 = 6,85 | 0,04 IU/mg | < 0,1 * dDAVP |
vasopresin dDAVP = [8-D-Arginin] deaminovasopresin
-5CZ 278375 B6
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (3)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Analogy vasopresinu obecného vzorceCys - X -Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-D-Har-GlyNH2 kde X je L-O-methyltyrosinL-p-ethylfenylalanin D-p-ethylfenylalanin L-p-methylfenylalanin nebo D-p-methylfenylalanin
- 2. Způsob přípravy analogů obecného vzorce podle nároku 1, vyznačený tím, že se metodou na pevné fázi v uvedeném sledu vystaví řetězec z hydroxybenztriazolových esterů BOC-amino-kyselin, načež po ukončení syntézy se peptidy z pryskyřice uvolní kapalným fuorovodíkem za současného odštěpení chránících skupin z postranních řetězců, a poté vzniklé lineární peptidy se cyklisují za přítomnosti.ferrikyanidu draselného a provede se rozdělení isomerů s L- a D-p-methylfenylalaninem či La D-p-ethylfenylalaninem v posici 2 pomocí vysokotlaké kapalinové chromatografie.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačený tím, že jako pevná fáze se užívá benzhydrylaminová pryskyřice.Konec dokumentu
Priority Applications (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CS894860A CZ278375B6 (en) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | Vasopressin analogs |
EP90115171A EP0412508B1 (de) | 1989-08-07 | 1990-08-07 | Vasopressin-Analoga,ihre Herstellung und ihre pharmazeutische Verwendung |
AU60288/90A AU6028890A (en) | 1989-08-07 | 1990-08-07 | Analogues of 8-d-homoargine vasopressin |
AT90115171T ATE124704T1 (de) | 1989-08-07 | 1990-08-07 | Vasopressin-analoga,ihre herstellung und ihre pharmazeutische verwendung. |
DE59009367T DE59009367D1 (de) | 1989-08-07 | 1990-08-07 | Vasopressin-Analoga,ihre Herstellung und ihre pharmazeutische Verwendung. |
JP2210127A JP2818617B2 (ja) | 1989-08-07 | 1990-08-07 | 8―d―ホモアルギニンバソプレッシン類似体 |
CA 2022865 CA2022865A1 (en) | 1989-08-18 | 1990-08-08 | Analogues of 8-d-homoarginine vasopressin |
US08/111,815 US5486596A (en) | 1989-08-07 | 1993-08-25 | Analogues of 8-D-homoarginine vasopressin |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CS894860A CZ278375B6 (en) | 1989-08-18 | 1989-08-18 | Vasopressin analogs |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ486089A3 CZ486089A3 (en) | 1993-08-11 |
CZ278375B6 true CZ278375B6 (en) | 1993-12-15 |
Family
ID=5392290
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CS894860A CZ278375B6 (en) | 1989-08-07 | 1989-08-18 | Vasopressin analogs |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CA (1) | CA2022865A1 (cs) |
CZ (1) | CZ278375B6 (cs) |
-
1989
- 1989-08-18 CZ CS894860A patent/CZ278375B6/cs not_active IP Right Cessation
-
1990
- 1990-08-08 CA CA 2022865 patent/CA2022865A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2022865A1 (en) | 1991-02-19 |
CZ486089A3 (en) | 1993-08-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2679786B2 (ja) | 非ペプチド結合を有するペプチド合成方法 | |
US4481139A (en) | Peptide antagonists of substance P | |
EP0119705B1 (en) | Octapeptide vasopressin antagonists | |
Pietta et al. | Preparation and use of benzhydrylamine polymers in peptide synthesis. II. Synthesis of thyrotropin releasing hormone, thyrocalcitonin 26-32, and eledoisin | |
US4211693A (en) | Peptides with para-substituted phenylalanine | |
EP0106404B1 (en) | Peptides | |
EP0037516A1 (en) | N-omega substituted derivatives of 1-Desamino-vasopressin analogs | |
Manning et al. | Synthesis and some pharmacological properties of potent and selective antagonists of the vasopressor (V1-receptor) response to arginine-vasopressin | |
US4684622A (en) | Compositions and methods for producing vasodilation and antioxytocic activity | |
US4599324A (en) | V1-vasopressin antagonists | |
CZ278375B6 (en) | Vasopressin analogs | |
Walter et al. | Synthetic metabolites of neurohypophyseal hormones.[Des-9-glycinamide] oxytocin and [des-9-glycinamide, des-8-leucine] oxytocin | |
US4444682A (en) | Method of sulfation | |
US5486596A (en) | Analogues of 8-D-homoarginine vasopressin | |
CA1249397A (en) | Process for preparing des-proline vasopressin antagonists | |
Žertová et al. | The analogs of 8-D-homoarginine-vasopressin with p-substituted phenylalanine in position 2; Synthesis and some biological properties | |
Žertová et al. | Strong uterotonic inhibitors–analogs of 1-deamino-8-D-homoarginine-vasopressin with p-substituted phenylalanine in position 2 | |
CZ278584B6 (en) | Vasopressin analogs, and process for preparing thereof | |
JP2818617B2 (ja) | 8―d―ホモアルギニンバソプレッシン類似体 | |
EP0056274A1 (en) | Indole derivatives and a method for production of peptides | |
WO1994006453A1 (en) | Bradykinin antagonists containing aliphatic amino acids in the 5-position | |
GAZIS et al. | Synthesis and biological activities of oxytocin and lysine vasopressin analogs containing glutamic acid γ‐hydrazide in position 4 | |
FI77874B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nya, terapeutiskt anvaendbara peptider. | |
Bratby et al. | Amino-acids and peptides. Part 42. Synthesis of a protected docosa peptide having the sequence of mast-cell degranulating peptide | |
US4587045A (en) | Intermediates for preparing octapeptide vasopressin antagonists |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20000818 |