CZ48095A3

CZ48095A3 - Composition for treating alzheimer's disease

Info

Publication number: CZ48095A3
Application number: CZ95480A
Authority: CZ
Inventors: Thomas F Woolf
Original assignee: Warner Lambert Co
Priority date: 1992-09-10
Filing date: 1993-09-08
Publication date: 1995-12-13
Also published as: WO1994005296A3; NZ256940A; US5466696A; HU9500704D0; HUT70979A; DE69331546D1; HU217845B; NO307955B1; KR950703339A; AU669586B2; PT659082E; ATE212845T1; WO1994005296A2; DK0659082T3; DE69331546T2; AU5290593A; JPH08501105A; NO950909L; CA2141425A1; EP0659082B1

Description

Dosavadní stav techniky

N-Substituované akridiny byly navrženy pro použití při léčbě stařecké demence, jako např. Alzheimerovy nemoci. Tyto látky jsou popsány v patentech U.S. 4,631,573; 4,695,573; 4,754,050; 4,816,456; 4,835,275; 4,839,364; 4,999,430 a v britské patentové přihlášce 2,091,329.

Na pacientech trpících Alzheimerovou nemocí byly prováděny klinické zkoušky za použití takrinu neboli monohydrátu monohydrochloridu 1,2,3,4-tetrahydrogen-9-akridinaminu (THA). V sérech pacientů, kterým byl THA podáván, byl stanoven rychlý vznik THA metabolitů. Bylo rovněž zjištěno, že u některých pacientů dochází po podání THA ke zvýšení hladiny jaterních enzymů, která může být údajně regulována úpravou medikace. W.K.Summers, T.H.Tachiki a A.King: Tacrine In The Treatment Of Alzheimer's Disease, Eur.Neur. 29 (dodatek3), str. 28-32 (1989). Bylo zaznamenáno několik.THA metabolitů. C.A.Truman, J.M.Ford, C.J.C Roberts: Comparison of the Chromatographic Characteristics

4.

of Metabolites of Tacrine Hydrochloride in Huraan Sérum and Urine with those of In Vitro Metabolic Products From

Hepatic Microsomes, Biochemical Pharmacology, 42.díl, č.4, str. 956-959 (1991). THA je ve zvířatech a v lidském organismu značně metabolizován na několik monohydroxy- a dihvdroxy-metabolitů, z nichž některé jsou vylučovány jako deriváty glukuronidu.

Monooxidace chemických látek je přičítána cytochromům P450 (P450). Tyto monooxygenázové enzymy obsahující hemoprotein vykazují snížené spektrální maximum absorpce oxidu uhelnatého v blízkosti 450 nm. Bylo zjištěno, že tyto enzymy katalyzují různé oxidační reakce včetně hydroxylace endogenních a exogenních sloučenin. M.R.Jachau: Substrates, Specificities and Functions of the P450 Cytochromes, Life Sciences, 47.díl, str. 2385-2394 (1990).

Byl proveden rozsáhlý výzkum za účelem stanovení mechanismu, kterým mohou cytochromy P450 katalyzovat reakce, při nichž se uplatňuje přenos kyslíku. B.Těsta a P.Jenner: Inhibitors Of Cytochrome P-450s and Their Mechanism of Action, Drug Metabolism Reviews, 12(1)1-117 (1981); F.P. Guengerich: Cytochrome P450: Advances and Prospects, Faseb J., 6.díl, str.667-668 (1992); K.Brosen, M.Murray a C.F.Reidy: Recent Developments In Hepatic Drug Oxidations For Clinical Pharmacokinetics, Clin.Pharmacokinet., 18(3) str. 220-239 (1990); a M.Murray a G.F.Reidy: Selectivity in the Inhibition of Mammalian Cytochrome P-450 By Chemical Agents, Pharmacological Reviews, 42, str.85-101 (1990)

Murray a Reidy ve výše uvedené publikaci dále uvádějí, že cytochromy P450 jsou všudypřítomné enzymy nalezené v endoplazmatickém retikulu stejně tak jako v mitochondriálních frakcích savčích buněk. Cytochromy P450 tvoří multigenní skupinu enzymů, sestávající z téměř 150 do současné doby identifikovaných isoforem. T.D.Porter a M.J.

Coon: Cytochrome P450:Multiplicity of Isoforms, Substrates, and Catalytic and Regulátory Mechanisms, J.Biol. Chem.,

266.díl, str.13469-13472 (1991). Reakční cyklus cytochromu P450 probíhá ve stručnosti následujícím způsobem: původní vazba molekuly substrátu (RH) s železitou formou cytochromu vede k vytvoření binárního komplexu a ke změně spinové rovnováhy železitého enzymu ze stavu s nízkým spinem do stavu s vysokým spinem. Bylo dokázáno, že tato konfigurace přijímá daleko snadněji elektron z flavoproteinové

- reduktázy za vzniku komplexu železnatý cytochrom P450 - substrát. Veškerý cytochrom P450 však nevykazuje vztah mezi složkou vysokého spinu a redukčním poměrem. Bylo zjištěno, že při regulaci redukčního poměru hraje roli několik faktorů, včetně charakteru P450 substrátu, topografie kom•s íí plexu enzym-substrát a potenciálů oxidace schopných atomů.

Molekulární kyslík se váže na komplex železnatý cytochrom P450 - substrát za vzniku železnatého dioxidového komplexu, který je následně redukován druhým elektronem z P450 reduktázy ( nebo možná v některých případech z redukovanéí ho nikotinamidadenindinukleotidu přes cytochrom b5 a jeho reduktázu). Štěpení dioxidové vazby v redukovaném dioxidovém komplexu vede k inzerci jednoho atomu kyslíku do substrátu, redukci druhého atomu kyslíku na vodu a k opětovnému vytvoření železitého hemoproteinu.

V mimojaterních tkáních včetně tkáně mozkové, adrenální, ledvinové a v tkáních varlat, vaječníků, plic a kůže byly popsány jednotlivé členy skupiny enzymů P450 a přidružené smíšené funkce oxidáz. Jednotlivé'cytochromy P450 byly taktéž charakterizovány vzhledem ke své induktivitě skupinami chemických činidel. S ohledem na regulační procesy zvýšené mRNA transkripce a expresy enzymatické aktivity byla intenzivně studována indukce specifických P450 enzymů, hlavně podskupiny P450 1A1 a 1A2. Bylo zjištěno, že látky jako beta-naftaflavon (beta-NF), 3-methylcholantren (3-MC), arochlor 1254 (ACLR) a 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) jsou látkami, které byly zařazeny jako induktory P450 enzymů nesoucích designovanou P450 1A podskupinu. V současné době byly několika laboratorními pracovišti charakterizovány dva specifické druhy P450 enzymů označené jako 1A1 (nehepatický) a 1A2 (hepatický). Látky, které indukují hepatickou podskupinu enzymů P450 1A a zejména konstituční 1A2 enzymy, zahrnují 3-MC, komponenty cigaretového kouře, beta-NF, TCDD, zatímco induktory podskupiny 1A2 jsou ACLR, dále isosafrol a pižmové xyleny. M.Murray a G.F.Reidy: Selectivity In The Inhibition Of Mammalian Cytochromes P450 By Chemical Agents, Pharmacological Revews, 42, str. 85-101 (1990); a F.P.Guengerich: Characterization of Human Microsomal Cytochrome P-450

.1

Enzymes, Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. , 29.díl, str. 241264 (1989).

Předmětem vynálezu je zlepšení metabolické stability N-substituovaných akridinů v tělních tekutinách odvozených od krve, plasmy, mozku, jater atd.

Předmětem vynálezu je zajištění stabilní koncentrace N-substituovaných akridinů v tekutinách těl savců.

Předmětem vynálezu je dále popsat a použít N-substituované akridiny ve spojení s inhibitory cytochromu P450 podskupiny enzymů ΙΑ (1A1 a 1A2).

Předmětem vynálezu je dále popsat N-substituované akridiny podávané společně s naftyridinem.

Předmětem vynálezu je dále popsat N-substituované akridiny podávané společně s xantinem.

Předmětem vynálezu je dále popsat N-substituované akridiny podávané společně s fenoxyaminoalkanem.

Předmětem vynálezu je dále popsat N-substituované akridiny podávané společně s karbamoylimidazolem.

Předmětem vynálezu je dále popsat N-substituované akridiny podávané společně s guanidinimidazolem, např. cimetidinem (N-cyano-N'-methyl-N''-/2//(5-methyl-1Himidazol-4-yl)methyl/thio/ethyl/guanidinem).

Předmětem vynálezu je dále popsat N-substituované akridiny podávané společně s chinolinem, např. chloroquinem (7-chloro-4-(4-diethylamino-l-methylbutylamino) chinolinem) a primaquinem (8-(4-amino-l-methylbutylamino)-6-methoxychinolinem).

Předmětem vynálezu je dále popsat N-substituované akridiny podávané společně s trifuoromethyloximetherem, např. flovoxaminem, známým jako 5-methoxy-l-/4-(trifluoro methyl)-fenyl/-l-pentanon 0-(2-aminoethyl)oxim.

Žádný z výše uvedených odkazů nepopisuje způsob udržení stability, t.j. inhibice metabolismu N-substituovaných akridinů, tak, aby mohly být vhodně použity jako činidla pro léčení stařecké demence.

Podstata vynálezu

Výše uvedené cíle jsou splněny dále specifikovanými znaky vynálezu.

Vynález se týká způsobu inhibice N-substituovaných akridinů současným podáním účinného množství oxidázu inhibujícího inhibitoru P450 podskupiny 1A.

Další provedení vynálezu zahrnuje současné podání N-substituovaného akridinů s účinným oxidázu inhibujícím množstvím naftyridinu.

Další provedení vynálezu zahrnuje současné podání N-substituovaného akridinů s účinným oxidázu inhibujícím množstvím xantinu.

Další provedení vynálezu zahrnuje současné podání N-substituovaného akridinů s účinným oxidázu inhibujícím množstvím fenoxyaminoalkanu.

Další provedení vynálezu zahrnuje současné podání N-substituovaného akridinů s účinným oxidázu inhibujícím množstvím karbamoylimidazolu.

Další provedení vynálezu zahrnuje současné podání

N-substituovaného akridinu s účinným oxidázu inhibujícím množstvím guanidinamidazolu. v fc | Další provedení vynálezu zahrnuje současné podání

I ί N-substituovaného akridinu s účinným oxidázu inhibujícím , množstvím chinolinu.

Další provedení vynálezu zahrnuje současné podání

N-substituovaného akridinu s účinným oxidázu inhibujícím množstvím trifluoromethyloximetheru.

g* Dalším znakem vynálezu je použití výše uvedených ί sloučenin nebo kompozic pro výrobu farmaceutických kompozic pro výše uvedené způsoby léčení. Kompozice jsou poskytovány těm savcům, kteří je potřebují.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 představuje navrženou metabolickou mapu takrinu v lidském organismu.

Obrázek 2 představuje navržené schéma nevratné vazby takrinu v mikrosomech lidských jater.

Vynalez se týká omezení míry metabolismu nebo zamezení metabolismu N-substituovaných akridinů. Bylo uvedeno, že jsou N-substituované akridiny metabolizovány monooxygenázovými enzymy P450 (cytochrom P450) a zejména enzymy typu 1A2.

Cytochromy P450, které metabolizují N-substituované akridiny nebo aminoakridiny, jsou takové látky, které jsou indukovány jako isofravol, 3-MC, komponenty cigaretového kouře, beta-NF, TCDD a ACLR. Tyto cytochromy P450 patřící do podskupiny 1A, což jsou hemoprotein obsahující oxygenázy, mají svou enzymatickou aktivitu zvýšenou nebo indukovanou výše uvedenými chemickými látkami. Bylo by tudíž žádoucí, aby tyto enzymy P450 1A2 lokalizované v játrech byly hemoproteiny, jejichž aktivitu je nutno inhibovat, aby bylo zabráněno metabolismu uvedených amino akridinů. Přihlašovatel proto charakterizuje příslušné oxygenázy jak obecnou terminologií (cytochrom P450), tak také materiály, které způsobují nebo indukují účinek těchto enzymů. Byla zveřejněna charakterizace specifické aminokyselinové sekvence pro podskupinu P450 1A u krys a u člověka. P.Souček a I.Gut: Cytochromes P-450 In Rats; Structures, Functions, Properties and Relevant

Human Forms, Xenobiotica, 22.díl, str. 83-103 (1992).

N-Substituovanými akridiny, kterých se vynález týká a jejichž metabolismus má být omezen či eliminován, mohou být akridiny popsané v patentu U.S. 4,816,456 a mající obecný vzorec 1,

(1) ve kterém

R^ je zvolen z množiny obsahující atom vodíku, hydroxyskupinu, methylovou skupinu, methoxyskupinu, ethylovou skupinu a ethoxyskupinu;

R-L a R2 mohou společně tvořit dvojnou vazbu;

R3 a R4 mohou společně tvořit dvojnou vazbu, nebo ^R1 ’ ^R2' ^R3 ^{a R}4 Představují atomy vodíku;

R5 a Rg jsou zvoleny z množiny obsahující atom vodíku, hydroxyskupinu, methoxyskupinu a ethoxyskupinu;

R7 buč neznamená žádnou skupinu, nebo znamená N-oxy skupinu, alkylovou skupinu obsahující 1-20 uhlíkových atomů nebo je zvolen z množiny obsahující skupiny obecných vzorců, /~\

R-N(R),— R-Η H-R—OH \_/ r\ r\ lí •R—Η N—R, R Η H—R—O—C—R, nebo v_/

ve kterých

R je nezávisle zvolen jako alkylová skupina obsahující 1-20 uhlíkových atomů;

a jejich farmaceuticky přijatelné soli.

N-Substituované akridiny mohou být taktéž charakterizovány jako látky popsané v patentu U.S. 4,999,430 a mající obecný vzorec 2,

O

ve kterém

X je zvolen z· množiny obsahující atom kyslíku a skupinu CH2;

R představuje aikylovou skupinu obsahující 1-20 uhlíkových atomů a -(CH2)_n~fenylovou skupinu, přičemž n je nula nebo celé číslo od 1 do 20;

nebo jejich farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinami .

N-Substituované akridiny mohou být taktéž charakterizovány jako látky popsané v patentech U.S. 4,631,286 a U.S. 4,695,573 a mající obecný vzorec 3,

(3) ve kterém n je 1, 2 nebo 3;

X je zvolen z množiny obsahující atom vodíku, nižší aikylovou skupinu, nižší alkoxyskupinu, atom halogenu, hydroxyskupinu, nitroskupinu, trifluormethylovou skupinu, skupinu -NHCOR₂, ve které R₂ je nižší alkylové skupina nebo skupina vzorce -NR^R^, ve které R₂ a R^ jsou nezávisle atom vodíku nebo nižší alkylové skupina;

R a Rp jsou nezávisle atom vodíku, nižší alkylové skupina, di(nižsí alkyl)amino(nižší alkyDová skupina, aryl(nižší alkyDová skupina, diaryKnižší alkyl)ová skupina, furyl(nižší alkyl)'ová skupina, thienyl(nižší alkyDová skupina, aryl(nižší alkyDová skupina s můstkovou skupinou tvořenou kyslíkem, diaryKnižší alkyDová skupina s můstkovou skupinou tvořenou kyslíkem, furyl(nižší alkyl)ová skupina s můstkovou skupinou tvořenou kyslíkem, thienyl(nižší alkyDová skupina s můstkovou skupinou tvořenou kyslíkem, aryl(nižší alkoxy)skupina, přičemž arylová skupina může být nesubstituovaná nebo substituovaná nižší aikylovou skupinou, nižší alkoxyskupinou, atomem halogenu, hydroxyskupinou, trifluoromethylovou skupinou nebo difenyl(nižší alkyljovou skupinou, nesubstituovaná nebo substituovaná dif enyl ( nižší alkyDovou skupinou, přičemž substituenty na fenylové skupině mohou být nižší alkylová skupina, nižší alkoxyskupina, atom halogenu, hydroxyskupina nebo trifluormethylová skupina;

je skupina -CsO nebo skupina -CÍRjJOH, přičemž Rg je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina; je skupina -CH^- nebo skupina C-C(Rg)(Ry), přičemž Rg a Ry jsou nezávisle atom vodíku nebo nižší alkylová skupina; nebo

Y a Z představují společně skupinu CRg-CH, přičemž C(Rg) a CH odpovídá Y, respektive Z;

nebo příslušný optický antipod nebo farmaceuticky přijatelná adiční sůl s kyselinou.

V následující části budou popsány inhibitory cytochromu P450, které jsou použitelné v rámci vynálezu, i když lze předpokládat, že v rámci vynálezu může být použit ve spojení s výše popsanými N-substituovanými akridiny jakýkoliv inhibitor cytochromu P450 typu 1A2.

První skupinou P450 inhibitorů, které mohou být použity, jsou naftyridiny popsané v patentu U.S.4,359,578, mající obecný vzorec 4,

HH N

,í?

ífct· ve kterém

X je atom halogenu, zvláště fluoru, je vinylová skupina nebo ethylová skupina a

R2 je atom vodíku nebo nižší alkylová skupina a příslušné farmaceuticky použitelné soli.

Příprava výše uvedených naftyridinů je popsána v preparativních příkladech patentu U.S. 4,359,878 počínaje řádkou 16, sloupec 5, a konče řádkou 61, sloupec 8.

Potenciální terapeutický režim by mohl zahrnovat dávkování enoxacinu (400 až 800 mg denně) po dobu 1 až 2 dnů (stabilní koncentrace enoxacinu v plazmě), a to před započetím takrinové terapie při následném současném podávání takrinu a enoxacinu ve formě směsné kompozice nebo ve formě individuálních dávek. Enoxacin je popsán v 11.vydání Merck Index (1989), odkaz č.3540, jako 1-ethyl-6-fluoro-l,4-dihydro-4-oxo-7-(1-piperazinyl)-1,8-naftyridin-3-karboxylová kyselina.

Druhou skupinou vhodných P450 inhibitorů jsou xantiny popsané v britské přihlášce 2091249, mající obecný vzorec 5,

(5) ve kterém r! a R^ představují nezávisle alkylovou skupinu, obsahující od 1 do 6 (výhodně nejvýše 4) uhlíkových atomů,

R představuje cyklohexylovou skupinu, furylovou skupinu, tetrahydrofurylovou skupinu nebo thienylovou skupinu, a příslušné farmaceuticky přijatelné soli, vzniklé např. reakcí s alkalickým kovem nebo organickou bází obsahující dusík.

Příprava výše uvedených xantinových derivátů je popsána v britském patentu 2,091,249 na str. 1, řádek 38, až po str.2., řádek 44. Na stejném místě jsou rovněž uvede ny preparativní příklady.

Potenciální terapeutický režim by mohl zahrnovat dávkování preferovaného xantinu, furafyllinu (lH-purin2,6-dion,3-(2-furanylmethyl)-3,7-dihydro-l,8-dimethyl) po dobu 1 až 2 dnů (stabilní koncentrace furafyllinu v plazmě), a to před započetím takrinové terapie (20-160 mg denně) a při následném současném podávání takrinu a furafyllinu ve formě směsné kompozice nebo ve formě individuálních dávek.

Dalšími inhibitory cytochromu P450 typu 1A2 jsou fenoxyaminoalkany popsané v patentu U.S. 3,659,019, které mají obecný vzorec 6,

sP •Tř

>A ve kterém

R je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující až 3 uhlíkové atomy;

R^ je atom vodíku nebo alkylová skupina obsahující nebo 2 uhlíkové atomy; a

R2až Rgjsou identické nebo se mohou navzájem lišit, přičemž mohou být zvoleny z množiny obsahující atom vodíku a alkylovou skupinu s 1 až 5, výhodně však 1 až 2, atomy uhlíku; výhodně však nejméně jeden z R·^ až Rg představuje jiný atom než atom vodíku a v případě, že představují Rj_ i R₄ methylovou skupinu, nejméně jeden ze zbývajících substituentů R, R2, R5 a Rg představuje jiný atom než atom vodíku;

nebo netoxické, farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinami.

Způsob přípravy těchto sloučenin je tu U . S.3,659,019, konkrétně ve sloupci 2 popsán v patena 3. Na témže místě jsou také uvedeny preparativní příklady.

Potenciální terapeutický režim by mohl zahrnovat dávkování výhodným fenoxyaminoalkanem, např. mexiletinem (100 - 800 mg denně) po dobu 1 až 2 dnů (stabilní koncentrace mexiletinu v plazmě), a to před započetím podávání výhodného aminoakridinu, jmenovitě takrinu (20 - 160 mg denně) s následným současným podáváním takrinu a mexiletinu ve formě směsné kompozice nebo ve formě individuálních dávek. Mexiletin je popsán v 11. vydání Merck Index, odkaz č. 6094, jako 1-(2,6-dimethylfenoxy)-2-propanamin.

Čtvrtým žádoucím inhibitorem cytochromu P450 typu 1A2 je karbamoylimidazol obecného vzorce 7,

II —HH(R₅) -NH(R,) (7) ve kterém je alkylová skupina obsahující 1 až 20 uhlíkových atomů, výhodně nižší alkylová skupina obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, nejvýhodněji skupina -CH ;a je nezávisle alkylová skupina obsahující 1 až 20 uhlíkových atomů, výhodně nižší alkylová skupina obsahující 1 až 4 uhlíkové atomy, nejvýhodněji skupina -CH^.

Způsob přípravy těchto sloučenin je popsán v Chemical Abstracts 55 23501Í (1961) - N.B.Vinogradova a N.U. Khromov-Borisov, Zhur.Obshchei Khim. 31; a v Chemical Abstracts 63 11538d (1965) - N.B.Vinogradova a N.U.Khromov Borisov, Med.Prom.SSSR 19(6), 7-13 (1965).

Potenciální terapeutický režim by mohl zahrnovat dávkování výhodným karbamoylimidazolem, např. ethimizolem (100 - 800 mg denně) po dobu 1-2 dnů (stabilní koncentrace ethimizolu v plazmě),a to před započetím podávání výhodného aminoakridinu, jmenovitě takrinu (20-160 mg denně) a následným současným podáváním takrinu a ethimizolu ve formě směsné kompozice nebo ve formě individuálních dávek. Ethimizol je znám jako 1-ethy1-4,5-bis (methylkarbamoyl)imidazol.

Dalším inhibitorem cytochromu P450 typu 1A2 je výhodně heterocyklický guanidin obecného vzorce 8,

_(CHj)_k-Y — ₍cH₂)_m-NH-C

NHR, (8) ve kterém

A je zvolen tak, aby společně s vyznačeným atomem uhlíku tvořil nenasycené heterocyklické jádro, které obsahuje nejméně jeden atom dusíku a může obsahovat další heteroatom, např. atom síry nebo atom kyslíku. Uvedené heterocyklické jádro je imidazolový, pyrazolový, pyrimidinový, pyrazinový, pyridazinový, thiazolový, thiadiazolový, benzimidazolový nebo 5,6,7,8-tetrahydroimidazo/l,5-a/ pyrimidinový kruh;

je atom vodíku, nižší alkylové skupina, hydroxylová skupina, trifluormethylová skupina, benzylová skupina, atom halogenu, aminoskupina nebo skupina

X2 je atom vodíku nebo v případě, že X představuje nižší alkylovou skupinu, nižší alkylové skupina nebo atom halogenu;

k je 0 až 2 a m je 2 nebo 3 za předpokladu, že součet k a m je nebo 4;

Y je atom kyslíku, atom síry nebo skupina NH

E je Ní^;

Rj je atom vodíku, nižší alkylové skupina nebo di(niž ší alkyl)amino(nižší alkyl)ová skupina;

,„4*

^r2 je atom vodíku, nitroskupina nebo kyanoskupina nebo příslušná farmaceuticky přijatelná adiční směs s kyselinou.

Y je výhodně atom kyslíku nebo atom síry, nejvýhodněji atom síry.

A je výhodně zvolen tak, aby byl atom dusíku přilehlý k vyznačenému atomu uhlíku a výhodněji tak, aby tvořil s vyznačeným uhlíkovým atomem imidazolový, thiazolový nebo isothiazolový kruh.

Xy je výhodně atom vodíku, methylová skupina, atom bromu, aminoskupina nebo hydroxylová skupina a

X2 je atom vodíku.

V jedné skupině výhodných sloučenin podle vynálezu představuje Y atom síry, k je 1, m je 2 a Rj_ je methylová skupina. Jako mimořádně výhodné se jeví sloučeniny N-kyano-N'-methyl-N' '-/2-((4-methyl-5-imidazolyl)-methylthio)-ethyl/guanidin, N-kyano-N'-ethyl-N''-/2/-((4-methyl5-imidazoly1)methylthio)ethyl/guanidin, N-k.yano-N'-methylN''-/2-((4-bromo-5-imidazolyl)-methyl-thio)ethyl/guanidin , N-k yano-N'-methyl-N -/2-(2-thiazolylmethylthio)ethyl/guanidin a N-kyano-N'-methyl-N''-/2-(3-isothiazolylmethylthio)ethyl/-guanidin.

Příprava výše uvedených sloučenin je popsána v patentu U.S. 3,950,333 a zejména ve zde uvedených preparativních příkladech.

R2 je atom vodíku, nitroskupina nebo kyanoskupina nebo příslušná farmaceuticky přijatelná adiční směs s kyselinou.

Y je výhodně atom kyslíku nebo atom síry, nejvýhodněji atom síry.

A je výhodně zvolen tak, aby byl atom dusíku přilehlý k vyznačenému atomu uhlíku a výhodněji tak, aby tvořil s vyznačeným uhlíkovým atomem imidazolový, tniazolový nebo isothiazolový kruh.

X2 je atom vodíku.

V jedné skupině výhodných sloučenin podle vynálezu představuje Y atom síry, k je 1, m je 2 a R]_ je methylová skupina. Jako mimořádně výhodné se jeví sloučeniny N-kyano-N'-methyl-N''—/2 —((4-methyl-5-imidazolyl)-methylthio)-ethyl/guanidin, N-k yano-N'-ethyl-N''-/2/-((4-methyl5-imidazolyl Jmethylthio) ethyl/guanidin , N-k.yano-N'-methylN''-/2-((4-bromo-5-imidazolyl)-methyl-thio)ethyl/guanidin , N-kyano-N'-methyl-N -/2-(2-thiazolylmethylthio)ethyl/ guanidin a N-kyano-N'-methyl-N-/2-(3-isothiazolylmethylthio)ethyl/-guanidin.

Potenciální terapeutický režim by mohl zahrnovat dávkování výhodného heterocyklického guanidinu, např. cimetidinu (100-800 mg denně) po dobu 1 až 2 dnů (stabilní koncentrace cimetidinu v plazmě), a to před započetím podávání výhodného aminoakridino, jmenovitě takrinu (20-160 mg denně) a následným současným podáváním takrinu a cimetidinu ve formě směsné kompozice nebo ve formě individuálních dávek.

Dalším výhodným inhibitorem cytochromu P450 typu 1A2 je chinolin obecného vzorce 9,

Y

X ve kterém

Y je aminová skupina substituovaná amino(nižší alkyl)ovou skupinou, (nižší alkyl)amino(nižší alkyl) ovou skupinou, di-(nižší alkyl)amino(nižší alkyl)ovou skupinou, (nižší alkyl)aminoskupinou, di(nižší alkyl)aminoskupinou, nižší alkylovou skupinou substituovanou šestičlenným dusíkatým heterocyklickým kruhem, hydroxy(nižší alkyl)ovou skupinou, hydroxyarylovou skupinou, halogenovanou nižší alkylovou skupinou;

X je nižší alkylová skupina, nižší alkoxyskupina, thio(nižší alkyl)ová skupina, hydroxy(nižší alkyl) ová skupina, arylová skupina, atom halogenu(např. atom chloru, bromu nebo jodu) nebo (nižší alkyl)merkaptanová skupina;

Y může být bu<3 v kruhu A nebo v kruhu B a X může být přítomen v jednom nebo v obou kruzích. Nejvýhodněji není uhlíkový atom, v chinolinovém kruhu v poloze alfa vzhledem k atomu dusíku, substituován jiným atomem než atomem vodíku.

Chinoliny a způsob jejich přípravy jsou popsány v patentu U.S.2,233,970 , a to zejména v preparativních příkladech a na straně 1, počínaje řádkou 35 v levém sloupci a konče řádkou 40 ve sloupci pravém. Vizte rovněž 11. vydání Merck Index, vydané Merck Co.(1989), odkaz číslo 21634 7751 a Elderfield a kol., J.Am.Chem.Soc.,

68, 1525 (1946); zlepšený postup: Elderfield a kol., ibid, 77, 4816 (1955); Review: Olenick in Antibiotics, 3.díl,

J.W.Corcoran, F.E.Hahn, Springer-Verlag, New York 1975, str. 516 - 520. Výhodnými látkami jsou chloroquin a primaquin.

Potenciální terapeutický režim by mohl zahrnovat dávkování výhodného chinolinu, např. chloroquinu nebo primaquinu (100 - 800 mg denně) po dobu 1 až 2 dnů (stabilní koncentrace chloroquinu nebo primaquinu v plazmě), a to před započetím podáváni výhodného aminoakridinu, jmenovitě takrinu (20 - 160 mg denně) a následným současným podáváním takrinu a chloroquinu nebo primaquinu ve formě směsné kompozice nebo ve formě individuálních dávek.

Dalším inhibitorem cytochromu P450 typu 1A2 je tri fluoromethyloximether obecného vzorce 10 cf₃

-C=N —O —CH₂ —CH₂ —NH₂

I (CH^—R (10) a jeho farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinami ve kterých

R je kyanová skupina, kyanomethylová skupina, metho xymethylová skupina nebo ethoxymethylová skupina.

Výhodnou látkou je fluvoxamin. Další výhodné látky jsou 5-methoxy-4'-trifluoromethyl-valerofenon 0-(2-amino ethyl)oximmaleát (1:1); 5-ethoxy-4'-trifluoromethylvalerofenon O-(2-aminoethyl)oximfumarát (1:1); 4-kyano4'-trifluoromethylbuťyrofenon O-(2-aminoethyl)oximhydrochlorid; 5-kyano-4'-trifluoromethylvalerofenon O-(2aminoethyl)oximhydrochlorid (1:1); 5-kyano-4'-trifluo23 romethylvalerofenon 0-(2-aminoethyl)oximhydrochlorid; 5-kyano-4'-trifluoromethylvalerofenon 0-(2-aminoethyl) oximhydrochlorid; 5-methoxy-4'-trifluoromethylvalerofenon 0-(2-aminoethyl)oximmaleát (1:1); 5-ethoxy-4'~ trifluoromethylvalerofenon 0-(2-aminoethyl)oximfumarát (1:1); 5-kyano-4'-trifluoromethylvalerofenon 0-(2-amino ethyl)oximhydrochlorid (1:1); 5-ethoxy-4'-trifluoromethylvalerof enon 0-(2-aminoethyl)oximfumarát (1:1).

Oximethery a způsob jejich přípravy jsou popsány v patentu U.S. 4,085,225, a to zejména v preparativních příkladech. Vizte rovněž 11.vydání Merck Index, vydaný Merck Company, (1989), odkaz číslo 4138, V.Claassen a kol., Inhibition of 5-HT uptake, Brit.J.Pharmacol. 60, 505 (1977); G.J.De Jong, HPLC determ in plazma, J.Chro matog. 183, 203 (1980); B.Saletu a kol., Quantitative EEG, psychometric and pharmacokinetic studies in man,

J.Nerol Transm. 49, 63 (1980); J.E.De Wilde, D.P.Doogan Use In Endogenous Depress, J.Affective Disord.4, 249 (1982); J.Maj a kol., Effects on Clonidine-induced Depression in Míce, J.Neurči.Transm. 55, 19 (1982); Review: Brit.J.Clin.Pharmacol. 15, dodatek 3, 347S-450S (1983); P.Benfield, A.Ward,Review of pharmacology, clinical efficacy, Drugs 32, 313 (1986). Fluvowamin je také diskutován v literatuře jako potenciální inhibitor cytochromu P450 typu 1A2;Biochemical Pharm., 45.díl, č.6 str. 1211-1214 (1993) v článku K.Brosen-a a kol.Fluvoxamine Is A Potent Inhibitor Of Cytochrome P450 1A2.

Potenciální terapeutický režim by mohl zahrnovat dávkování v .hodným trifluoromethyloximetherem, např. fluvoxaminem (10 až 800 mg denně) po dobu 1 až 2 dnů (stabilní koncentrace fluvoxaminu v plazmě), a to před započetím podávání výhodného aminoakridinu, jmenovitě takrinu (20-160 mg denně) a následným současným podáváním takrinu a fluvoxaminu ve formě směsné kompozice nebo ve formě individuálních dávek.

V následujících příkladech provedení vynálezu jsou díly myšleny díly hmotnostní a stupni stupně Celsia (pokud není uvedeno jinak).

=4* .1 f

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - Metabolismus takrinu in vivo

U lidských dobrovolníků mužského pohlaví byla provedena jednodávková farmakokinetická a metabolická dispoziční studie, přičemž těmto dobrovolníkům byl podán ve dvou dávkových hladinách /^⁴C/takrin,hydrochlorid. Zdravým dobrovolníkům mužského pohlaví byl perorálně podán /¹⁴C/takrin,hydrochlorid ve formě 10-mg (lOO^Ci) orální dávky a o 1 měsíc později ve formě 40-mg (lOO^Ci) orální dávky. Před aplikací a 48 hodin po aplikaci byly odebrány vzorky plazmy a červených krvinek. Před uvedenou aplikací a 96 hodin po ní byly odebrány vzorky moči a stolice. Vzorky moči a plazmy byly analyzovány přímo kapalnou scintilační spektrometrií, zatímco červené krvinky a vzorky stolice byly před měřením solubilizovány. V plazmě byl stanoven takrin, 1-hydroxytakrin, 2-hydroxytakrin a 4-hydroxytakrin vyhodnocením za použití vysokotlaké kapalinové chromatografie a fluorescenčního stanovení. Metabolický profil moči byl stanoven vysokotlakou kapalinovou chromatografií za použití detekce radioaktivního záření. Metabolity byly identifikovány vysokotlakou kapalinovou chromatografií, hmotnostní spektrometrií a za použití fotodiodového seskupení .

Po perorálním podání 10-mg dávky /^⁴C/takrin,hydrochloridu činily střední kumulativní urinární a fekální výtěžky 56,5%, respektive 23,2% původní dávky. Střední totální výtěžek činil 79,4 %. Po podání 40-mg dávky činily střední kumulativní urinární a fekální výtěžky 54,1 %, respektive 20,8 % původní dávky. Střední totální výtěžek činil 74,9 %.

Čas k dosažení maxima koncentrace (tmax) takrinu a každého metabolitů, pokud jde o radioaktivitu plazmy, činil přibližně 2 hodiny po podání obou dávek takrinu.

Plocha pod křivkou střední celkové radioaktivity v plazmě (čas 0 k poslední detekovatelné koncentraci) (AUC(0-tldc)) stoupala proporcionálně k dávce, zatímco střední hodnoty AUC(0-tldc) pro 1-hydroxytakrin, 2-hydroxytakrin a takrin stoupaly více než úměrně této dávce. Střední hodnota AUC (0-tldc) pro takrin, 1-, 2- a 4-hydroxytakrin zahrnovala přibližně 3 % a 4 % z celkové střední radioaktivity v plazmě pro 10-mg, respaktive 40-mg dávku. U všech dobrovolníků se ukázalo, že rychlost eliminace 1-hydroxytakrinu z plazmy je limitována rychlostí jeho tvorby.

Profil radioaktivity v moči (vysokotlaková kapalinová chromatografie) v průběhu 24 hodin po aplikaci dávky ukazuje, že takrin je extenzivně metabolizován, přičemž jsou vyměšována pouze stopová množství nemetaboiizovaného takrinu. V chromatogramech byla zjištěna přítomnost několika polárně radioaktivních složek, činící v případě urinární radioaktivity 67 % (33 % z dávky), zatímco po podání 10-mg nebo 40-mg dávky takrinu činila množství 1-, 2- a 4-hydroxytakrinu méně než 5 %, respektive 1 % a 0,5 % dávky. V metabolických profilech těchto dávkových hladin neexistují žádné zjevné rozdíly a žádný jednotlivý metabolít není obsažen v množství větším než 5 % dávky. Obrázek 1 znázorňuje navrženou metabolickou mapu takrinu v lidském organismu. V rámci téže studie byly zjištěny rozdíly mezi kuřáky cigaret a nekuřáky v souvislosti se sníženou exkrecí a nižšími koncentracemi 1-hydroxytakrinu v plazmě. Bylo zjištěno, že lidské hepatické enzymy P450 1A2 jsou indukovatelné komponenty cigaretového kouře. D.Sesardic, A.R.Boobis, R.J.

- Z7 Edwards a D.S.Davies; A Forra of Cytochrome P450 in Man, Orthologous to Form d in the Rat, Catalyses the O-deethylation of Phenacetin and is Inducible by Cigarette Smoking, ίί Br. J. Clin. Pharmac., 26.díl, str. 363 - 372 (1988).

Cimetidin je inhibitorem enzymů P450, včetně enzymů

P450 1A2. A.Somogyi a M.Muirhead: Pharmacokenetic Interactions of Cimetidine, Clin. Pharmacokin., 12.díl, str.

321 - 366 (1987). V klinické interakční studii účinné látky zahrnující podání 40 mg-dávky takrinu a 300 mg-dávky cimetidinu čtyřikrát denně byly pozorovány ve srovnání * s podáním takrinu samotného o přibližně 40 % vyšší kona ' . centrace takrinu v plazmě.

Současné podání nárazové 158 mg-dávky theofylinu a opakovaných 20 mg-dávek takrinu ve formě kapsle vedlo . k přibližně dvojnásobnému zvýšení poločasu eliminace theofylinu. Hlavní způsob eliminace theofylinu zahrnuje metabolismus prostřednictvím P450 1A2. Μ.E.Campbell, D.M.Grant, T.Inaba a W.Kalow: Biotransformation of Caffeine, Paraxanthine, Theophylline, and Theobromine by Polycyclic | Aromatic Hydrocarbon-Inducible Cytochrome(s) P-450 in

* Human Liver Microsomes, Drug Metab. Dispos., 15.díl, str.

\ 237 - 249 (1987). V důsledku toho potenciálním výkladem klinické interakce theofylinu a takrinu je konkurenční

i.'*· t interakce se stejnými enzymy P450 1A2.

Příklad 2 - Metabolismus takrinu in vitro

Za použití lidské a krysí hepatické tkáně byla provedena in vitro série metabolických studií za účelem zjif štění charakteru metabolismu takrinu, jakož i zjištění účinku jednotlivých indukčních a inhibičních činidel na dispozici takrinu. Byly provedeny inkubace 14C-takrinu (0,5^*M) po dobu 1 hodiny s mikrosomálními preparáty (přibližně 1 ^UM P450) v přítomnosti NADPH (0,5 mM) a gene rujícího systému obsahujícího glukózo-6-fosfát (4,0 mM), 2,0 mM chloridu hořečnatého a 1 díl glukózo-6-fosfát-dehydrogenázy při teplotě 37*C v prostředí 0,1 M pufru fosforečnanu draselného (pH 7,4). Celkový reakční objem byl 3 ml. Reakce byly zastaveny zmrazením v kapalném dusíku nebo ve směsi suchý led - aceton. Produkty inkubace byly analyzovány vysokotlakou kapalinovou chromatografií s radioaktivní detekcí biotransformace produktů takrinu a nemetabolizovaného takrinu, a to po precipitaci mikrosomálního proteinu methanolem nebo ethanolem (3 objemy). Výsledky jsou shrnuty v tabulce 1. V lidských hepatických preparátech B a C byl takrin za těchto inkubačních podmínek kompletně metabolizován během 60 minut. Hlavním dete kovaným produktem byl 1-hydroxytakrin, při zjištění menších množství 2- a 4-hydroxytakrinových regioisomerů.

Při inkubaci za použití lidského jaterního preparátu D bylo dosaženo pouze částečné přeměny takrinu. Výsledky s krysími jaterními mikrosomy ukázaly ve srovnání s lidskými preparáty více produkovaného 1-hydroxytakrinu. Inkubace s krysími mikrosomy z krys, kterým byl předběžně podán fenobarbital (PB), mají pouze minimální vliv na tvorbu 1-rhydroxytakrinu, což vede k názoru, že tvorba to29

hoto metabolitu není ovlivňována cytochromy podskupiny P450 2B (cytochromy P450 IIB nebo CYP2B). D.J.Waxman a L.Axaroff: Phenobarbital induction of cytochrome P-450 Gene Expression, Biochem.J., 281.díl, str.577 - 592 (1992); výše uvedená publikace P.Součka a I.Guta. Isoniazid (I), induktor cytochromu P450 2E1 (cytochrom P450 IIEl nebo CYP2E1) (výše uvedená publikace D.J.Waxman-a a L.Axaroff-a; R.C.Lind, A.J.Gadolfi, P.de la M.Hall:

Isoniazid Potentiation of a Guinea Pig Model of Halothane-Associated Hepatotoxicity, J.Toxicol 10(3), str.

161 - 165 (1990); S.A.Rice, L.Sbordone, R.I.Mazze: Metabolism by Rat Hepatic Microsomes of Fluorinated Ether Anesthetics Following Isoniazid Administration, Anesthetology 53, str.489 - 493 (1980)), výrazně zvyšuje tvorbu 1-hydroxytakrinu ve srovnání s kontrolními krysími jaterními mikrosomy. Po inkubacích s MC (P450 1A1 (CYP1A1) a P450 1A2 (CYP1A2) induktor) indukovaly krysí jaterní mikrosomy ve srovnání s kontrolními subjekty méně 1-hydroxytakrinu, což je odrazem indukce sekvenčního metabolismu (viz navržená metabolická mapa - obr.l). Množství 1-hydroxytakrinu, detekovaného po 1 hodině inkubace s MC-indukovanými krysími mikrosomy, bylo stejné jako množství pozorované v lidských preparátech B a C. V doplňkové studii bylo zjištěno, že metabolismus 1-hydroxytakrinu cytochromy P4501A2 je inhibován koinkubací s takrinem, což ukazuje na to, že sekvenční metabolismus tak30 řinu je rovněž rnediován tímto specifickým P450 .

Tabulka 1. Takrin a metabolity přítomné v deproteinizované mikrosomální supernatantní frakci po 60 minutách inkubace 14C-takrinu (0,5^M) katalyzované lidskými a krysími jaterními mikrosomy (1 P450) v přítomnosti

NADPH-regenerujícího systému při teplotě 37°C

Ekvivalenty	takrinu	(nmol)
	POLAP UNKS	2 - OH j	.-OH	UNKS	4-OH	TAK
Neindukovaný krysí preparát
hmot./NASH	0.022	0 . 0 S 3	0.994	ND	-	ND
hmot. /bez fAE	ND	ΝΌ	ND	ND	ND	1.22
PB-indukovaný krysí preparát
hrot./tPOH	0.026	0.144	1.15	-	-	ND
hrot./bez bPDEH	ND	ND	ND	ND	ND	1.20
I-indukovaný krysí preparát
hrot./ ΓΦΠΉ	0.0 S 3	-	1.57	-	-	ND
brot./tez ΙΆΕΕΗ	ND	ND	ND	ND	NT	1.14
MC-indukovaný
krysí preparát hrot./NASH	0.009	-	0.750	0.091	0.013	ND
hrot./bez Γ®ΕΕΗ	ND	ND	ND	ND	ND	1.1 s
Lidský preparát B
hrot./ 1ΆΕΡΗ	0.039	—	0.750	Q . 146	0.039	ND
hrot./bez NASH Lidský preparát C	ND	ND	ND	ND	ND	— . J
hrot./ NASH	C . 035	0.095	0.5 5 S	0.139	-	ND
hrot./bez i«SH	ND	ND'	ND	ND	ND	1.07
Lidský preparát
hrot./NASH		ND	0.201	ND	ND	0.303
hrot./cez IAZSH	'OD	ND	ND	ND	ND	1.036
Pb = Fenobarbital

I = Isoniazid

MC = 3-Methylcholanthren

NADPH = Nicotinamidadenindifosfáthydrid ND = nedetekovatelné

Příklad 3 - Navrhované schéma ireversibilní vazby takrinu na lidský jaterní mikrosomální protein

Ireversibilní (neextrahovatelná, pravděpodobně kovalentní) vazba radioaktivity vázané s takrinem byla měřena mírně modifikovanou metodou Martin-a a Garner-a.

C.N.Martin a R.C.Garner: Covalent Binding In Vitro and In Vivo, Biochemical Toxicology: A Practical Approach, Eds.K.Snell a B.Mullock, IRL, Wash.D.C., str.109 - 126 (1987). Výsledky po úplné extrakci jsou uvedeny v tabulce 2. Je zřejmé, že vysoký procentuální obsah takrinu byl metabolicky aktivován na reaktivní meziprodukt, schopný se vázat na mikrosomální protein. MC-indukovaný krysí preparát vykazoval ve srovnání s kontrolním krysím preparátem téměř trojnásobné zvýšení vazby. Předběžné zpracování PB a I mělo na uvedenou vazbu malý či žádný efekt. Vazba radioaktivity vázané s takrinem k mikrosomálnímu proteinu není proto zvýšena indukcí enzymů P450 2B, respektive enzymů P450 2E1. Inkubace 14C-takrinu zahrnující glutathion (GSH) mají za následek dramatické snížení ireversibilní vazby, zatímco inkubace s epoxid-hydrolázou tuto vazbu pouze mírně snižuje. GSH ani EH neprodukují detekovatelné množství aduktů s uvedeným reaktivním meziproduktem. Pokusy detekovat hydroxylaminový meziprodukt v poreakčních inkubačních preparátech s a bez kyseliny askorbové byly neúspěšné. Tyto údaje nepodporují ani epoxidový, ani hydroxylaminový mechanismus aktivace takrinu na reakčni produkty schopné ireversibilní nebo kovalentní vazby. Časová studie provedená v průběhu 1 hodiny uka zuje, že takrin je rychle metabolizován nejen na 1-hydro xytakrin, ale rovněž na 7-hydroxytakrin. Hladiny 7-hydro xytakrinu průběžně stupají a klesají. Ukazuje se tudíž, že 7-hydroxytakrin je metabolickým meziproduktem, který je dále metabolizován na předpokládané reaktivní produkty, schopné se ireversibilně vázat na mikrosomální protein. Na základě všech těchto informací je potenciální mechanismus zodpovědný za uvedenou vazbu uveden na obr. 2 Nejpravděpodobnějšími chemickými produkty schopnými realizovat pozorovanou ireversibilní vazbu k mikrosomálnímu proteinu jsou reaktivní chinonmetidy vzniklé buá ze 7-hydroxytakrinu nebo z 1,7-dihydroxytakrinu.

Tabulka 2. Ireversibilní proteinová vazba radioak-. tivity vázané s 14C-takrinem (0,5^Μ), katalyzovaná lidskými a krysími jaterními mokrosomy (l^M P450 ) v přítomnosti NADPH-regenerujícího systému po 60 minutách inkubace při teplotě 37°C (N=3).

Ekvivalenty takrinu ireversibilně vázaného na 1 mg mikrosomálního proteinu (nmoly)

Neindukovaný krysí preparát s NADPH 0.041 bez NADPH 0.003

PB-indukovaný krysí ^PWfei 0.03 4 bez NADPH 0.002

I-indukovaný krysí preparát s NADPH 0 042 bez NADPH 0 . 003

I4C-indikovaný krysí preparát s NADPH 0.135 bez NADPH 0.003

Lidský preparát B s NADPH 0.207 bez NADPH 0 . C03

Lidský preparát C s NADPH 0.22 = bez NADPH 0.003

Lidský preparát D s NADPH 0.027 bez NADPH 0 . 0· 0 3 . 001

0.006

0.004

0.010

0.014

0.005

0.002

5.97 + 0.66

4.49 + 0.65

4.62 + 0.73

14.5+ 0.37

26.9 + 4.09

25.6+ 1.21

2.96 - 0.30

Procentická vazba = celkový počet molárních ekvivalentů vázaného takrinu dělený celkovým substrátem krát 100

PB = Fenobarbital

I = Isoniazid

MC = 3-Methylcholanthren

Tabulka 3. Vliv glutathionu (GSH) (5 mM) a epoxidhydrázy lidských jater (EH) (100 j^g) na ireversibilní proteinovou vazbu 14C-takrinu (0,5^xM), katalyzovanou lidským jaterním preparátem B a MC-indukovanými krysími jaterními mikrosomy (1 Μ P450) v přítomnosti NADPH-regenerujícího systému po 60 minutách inkubace při teplotě 37°C (N=3).

Ekvivalenty takrinu ireversibilně vázaného k 1 mg mikrosomálního proteinu (nmoly)

MC-indukovaný krysí preparát

NADPH	0,139 +	0,010	--
S GSH	0,058 +	0,005	58,3
S EH	0,116 +	0,007	16,6
Lidský preparát B
NADPH	0,207 +	0,014	--
s GSH	0,031 +	0,001	85,0
S EH	0,134 +	0,026	35,3
Vypuštění NADPH z	inkubační	směsi má	za následek

zjištění žádné detekovatelné ireversibilní vazby radioaktivity vázané s 14C-takrinem k mikrosomálnímu proteinu.

MC = 3-Methylcholanthren

Příklad 4 - Stanovení provedené za účelem zjištění, zda je takrin substrátem pro polymorfní enzym P450 2D6

Byla provedena řada pokusů za účelem zjištění potenciálu takrinu jako substrátu pro polymorfní enzym P450 2D6. U.A.Mayer, J.Gut, T.Krombach, C.Skoda, U.T.Meier a T.Catin: The Molecular Mechanisms of Two Common Polymorphisms of Drug Oxidation - Evidence for Functional Changes in Cytochrome P-450 Isozymes Catalysing Bufuralol and Mephenytoin Oxidation, Xenobiotica, 16.díl, str. 449 464 (1986). Mikrosomy připravené z neporušené lidské jaterní tkáně v případě maximálně 60-minutové inkubace se samotným 14C-takrinem nebo 14C-takrinem koinkubovaným s chinidinem, vykazovaly výsledky shrnuté v tabulce 4. Chinidin je inhibitorem P450 2D6 enzymu. K.Brosen a L.F.Gram:

Quinidine Inhibits the 2-Hydroxylation of Imipramine and Desipramine but not the Demethylation of Imipramine, Eur.J.Clin.Pharmacol., 37.díl, str.155 - 160 (1989).

Tabulka 4 _nMoly na 3 ml inkubačního produktu_

Takrin 1-Hydroxytakrin

Chinidin - + - +

Čas (min)

0	2,13	2,02	0	0
5	1,24	1,22	0,416	0,383
10	0,831	0,816	0,716	0,606
20	0,302	0,401	1,03	1,067
40	0	0,037	1,34	1,192
60	0	0,033	1,43	1,209

Takrin byl metabolizován hlavně na 1-hydroxytakrin, přičemž byl pozorován rovněž 7-řiydroxytakrin při inkubačních dobách 40 minut. Přítomnost chinidinu neinhibovala konverzi takrinu na 1-hydroxytakrin. Ani ireversibilní vazba takrinu na lidské jaterní mikrosomální proteiny nebyla touto koinkubací ovlivněna. Proto není metabolismus •I ani ireversibilní vazba takrinu na mikrosomální protein jR katalyzována enzymy P450 2D6.

Přiklad 5 - Za účelem demonstrování inhibicní aktivity l' byl testován enoxacin, což je 1,8-naftyridin k

Za účelem ověření hypotézy, že vysoká afinita (Km menší než 5 ^xM) saturovatelné složky metabolismu takrinu v lidských jaterních mikrosomech je způsobena enzymem P450 1A2 byla provedena časová studie současné koinkubace 14Ctakrinu (0,5<^Μ) a enoxacinu (5 0 , který je selektivním inhibitorem P450 1A2. T.Hasgawa, M.Nadai, T.Kuzuya, I.Muraoka, R.Apichartpichean, K.Takagi a K.Miyamoto:

The Possible Mechanism of Interaction between Xanthines and Quinolone, J.Pharm. Pharmacol., 42.díl, str. 767 772 (1990). Výsledky této studie jsou shrnuty v tabulce 5. Ve všech časových úsecích byl rozsah ireversibilní vazby inhibován až o 73 %. Kromě toho byla výrazně inhibována rychlost biotransformace takrinu (pětkrát až šestkrát). Specifický inhibitor P450 1A2 tudíž nejen snižuje míru ireversibilní vazby, ale rovněž inhibuje celkový stupeň biotransformace takrinu. V separační studii byl rovněž zkoušen účinek různých koncentrací enoxacinu (8, 20 a 50(4x11) na rozsah ireversibilní vazby. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 6. Největší inhibice ireversibilní vazby a⁷biotransformace takrinu bylo dosaženo při současné inkubaci s 50 ^M enoxacinu.

Vzhledem k tomu, že bylo zjištěno, že 1-hydroxytakrin se váže ireversibilně (neextrahovatelně, pravděpodobně kovalentně) k lidskému mikrosomálnímu proteinu, byla zkoumána úloha P450 1A2 v metabolickém aktivačním stupni společnou inkubací 14C-l-hydroxytakrinu s různý37 mi koncentracemi enoxacinu (8, 20 a 50<4tM) . Tabulka 6 shrnuje výsledky potvrzující inhibiční účinek enoxacinu na vazbu 1-hydroxytakrinu, který podporuje zahrnutí P450 1A2 do jeho aktivačního schématu.

Tabulka 5. Účinek 50jaM enoxacinu na ireversibilní vazbu radioaktivity vázané s takrinem na lidský mikrosomální (l^t/M P450) protein v přítomnosti NADPH-regenerujícího systému při teplotě 37°C.

Ekvivalenty takrinu ireversibilně vázané k 1 mg mikrosomálního proteinu

Procentická

		Čas(min)	(nmol)	inhibice
	Takrin	5	0,022 + 0,005
		10	0,048 + 0,006
		20	0,096 + 0,006
Λ		45	0,148 + 0,024
		5	0,009 + 0,002	59,1
		10	0,017 + 0,003	64,5
		20	0,026 + 0,002	72,9
		45	0,052 + 0,006	64,9

N=3

SD

Tabulka 6. Ireversibilní vazba radioaktivity vázané s 14C-takrinem nebo 14C-l-hydroxytakrinem na lidský mikrosomální protein (1 (WA cytochromu P450 ) v přítomnosti různých koncentrací enoxacinu a NADPH-regenerujícího systému po předchozí dvacetiminutové inkubaci při teplotě 37°C.

Ekvivalenty takrinu nebo 1-hydroxytakrinu ireversibilně vázané k 1 mg mikrosomálního proteinu

Takrin (0,3<ýH4)

Enoxacin

0,0	0,040	+	0,001	—
8,0	0,036	+	0,008	14,4
20,0	0,028	J-	0,001	29,8
50,0	0,023	4-	0,002	43,4

1-Hydroxytakrin (0,5^u-M)

0,0	0,018	+	0,001	—
8,0	0,017	+	0,001	8,2
20,0	0,014	+	0,001	22,2
50,0	0,009	+	0,001	51,7

Odstranění NADPH z inkubační směsi mělo za následek skutečnost, že nedošlo ke vzniku ireversibilní vazby radioaktivity vázané s 14C-takrinem nebo 14C-l-hydroxytakrinem k mikrosomálnímu proteinu

N=3 SD ί

*

Příklad 6

V rámci studie s MC-indukovanými krysími hepatocyty byla zkoumána schopnost ostatních P450 1A2 inhibitorů, zejména furafylinu a ethimizolu, inhibovat ireversibilně vazbu 14C-takrinu a 14C-l-hydroxytakrinu. Výsledky vyjádřené v % vazby radioaktivity vázané k takrinu, jak byly stanoveny v inkubačních produktech samotného takrinu, jsou shrnuty v tabulce 7. Nejúčinnějším inhibitorem ireversibilní vazby pro takrin i pro 1-hydroxytakrin byl furafylin, zatímco účinek ethimizolu a enoxacinu byl menší. Tyto údaje podporují předpoklad, že i ostatní specifické P450 1A2 inhibitory kromě enoxacinu mohou ovlivnit rychlost jak metabolismus takrinu a 1-hydroxytakrinu, tak i odpovídající ireversibilní vazbu.

Tabulka 7. Účinek enoxacinu, ethimizolu a glutathionu na ireversibilní vazbu radioaktivity vázané s 14Ctakrinem a 14C-l-hydroxytakrinem k hepatocytům z MC-indukovaných krysích samečků

Hodnoty procenticA ké kontroly

Takrin (10<5<M) + Enoxacin (50^vM) 78,9 + Ethimizol (50_<λ<Μ) 80,1 + Furafylin (ůO^M) 31,6 + Glutathion (5 mM) 62,6

Hodnoty procentické kontroly

1-Hydroxytakrin (10<*vM) + Enoxacin (10 jaM) 79,8 + Ethimizol (50 £iM) 65,6 + Furafylin (50 μΜ) 31,7 + Glutathion (5 mM) 49,1

Příklad 7

V krysích jaterních mikrosomech byla zkoumána (Back a kol., 1983) antimalariální činidla chloroquin a primaquin, přičemž bylo zjištěno, že jsou tyto látky inhibitory aktivity ethoxyresorufin-O-deetylázy. D.J.Back, H. S.Purba, C.Staiger, M.L.Orme, A.M.Breckenridge: Inhibition of Drug Metabolism by the Anti Malarial Drugs Chloroquine and Primaquine in the Rat, Biochem. Pharmacol.,

32.díl, str. 257 - 264 (1983). Ethoxyresorufin-O-deethylace je selektivně katalyzována enzymy P450 1A2. C.Gleizes, C.Eeckhoutte, T.Pinau, M.Alvinerie a P.Galtier: Inducing Effect of Oxfendazole on Cytochrome P450 1A2 in Rabbit Liver, Biochem.Pharmacol., 41.díl, str. 1813 1820 (1991). Inkubace 14C-takrinu (5_<Λ4Η) a chloroquinu (100<ΛιΜ) v primárních suspenzích krysích hepatocytů měla za následek inhibici jak ireversibilní vazby takrinu, tak i jeho metabolismu. Tabulka 8 uvádí závislost inhibice vazby na čase.

Tabulka 8. Účinek chloroquinu (100 na ireversibilní vazbu radioaktivity vázané s takrinem na krysí hepatocyty.

čas (min)	počet nmolů ekvivalentů takrinu vázaných na mg hepatického proteinu
Takrin	Takrin+Chloroquin
5	0,020	0,005
15	0,037	0,012
30	0,061	0,016
60	0,128	0,034
90	0,183	0,039
120	0,294	0,041
180	0,377	0,046

N=2

Kompozice podle vynálezu mohou být připraveny a podávány v různých orálních a parenterálních dávkových formulích. Kompozice podle vynálezu mohou být tudíž podávány injekčně, to jest intravenózně, intramuskulárně, intrakutánně, subkutánně, intraduodenálně nebo intraperitoneálně. Kompozice podle vynálezu mohou být také po42 dávány inhalačně, například intranazálně. Navíc mohou být kompozice podle vynálezu podávány transdermálně.

Pro přípravu farmaceutických kompozic z kompozic podle vynálezu mohou být použity farmaceuticky přijatelné nosiče, které jsou buá pevné nebo kapalné. Pevné přípravky zahrnují prášky, tablety, dražé, kapsle, sáčky, čípky a disperguovatelné granule. Pevným nosičem může být jedna nebo více látek, které mohou působit také jako ředidla, ochucovadla, pojivá, konzervační prostředky, činidla desintegrující tablety nebo jako zapouzdrovací látky.

V prášcích je nosičem jemně rozdružená pevná látka, která je ve směsi s jemně rozdruženou účinnou látkou.

V tabletách je účinná látka smíchána s nosičem, který vykazuje nezbytné vazebné vlastnosti, a je vylisována do požadovaného tvaru avelikosti.

Prášky a tablety obsahují výhodně od pěti nebo deseti do sedmdesáti procent účinné látky. Vhodnými nosiči jsou uhličitan hořečnatý, stearát hořečnatý, talek, cukr, laktóza, pektin, dextrin, škrob, želatina, tragant, methylcelulóza, natrium-karboxymethylcelulóza, nízkotající vosk, kakaové máslo a podobně. Výraz přípra vek zde zahrnuje formulaci účinné sloučeniny se zapouzdřovacím činidlem jako nosičem poskytujícím kapsli, ve které je účinná látka, případně s ostatními nosiči, obklopena nosičem, který je s ní takto sdružen. Stejnětak *V»<

jsou zahrnuty sáčky a pastilky. Tablety, prášky, kapsle, dražé, sáčky a pastilky mohou být použity jako pevné dávkové formy vhodné pro perorální podání.

Při přípravě čípků je nejprve roztaven nízkotající vosk, jako například směs glyceridů mastných kyselin nebo kakaové máslo, a v takto roztaveném vosku je poté mícháním homogenně dispergována účinná látka. Roztavená homogenní směs je následně nalita do vhodně dimenzované formy, ve které se nechá vychladnout, v důsledku čehož ztuhne.

Kapalné přípravky zahrnují roztoky, suspenze a emulze, například vodné nebo vodně-propylenglykolové roztoky. V případě parenterálních injekcí mohou být kapalné přípravky formulovány ve formě roztoku ve vodně-polyethylenglykolovém roztoku.

Vodné roztoky vhodné pro perorální použití mohou být připraveny rozpuštěním účinné látky ve vodě a přidáním vhodných barviv, ochucovadel, stabilizačních činidel a zhutňovadel.

Vodné suspenze vhodné pro perorální použití mohou být vyrobeny disperzí jemně rozdružené účinné látky ve vodě obsahující viskózní materiál, jakým je přírodní nebo syntetická guma, pryskyřice, methylcelulóza, natrium-karboxymethylcelulóza a řada dalších dobře známých suspendačních činidel.

Rovněž jsou zahrnuty pevné přípravky, které mohou být bezprostředně před použitím převedeny na kapalné přípravky pro perorální podání. Tyto kapalné formy zahrnují roztoky, suspenze a emulze. Tyto přípravky mohou obsahovat kromě účinné látky také barviva, ochucovadla, stabilizační činidla, pufry, umělá nebo přírodní sladid la, dispergační činidla, zhutňovadla, solubilizační činidla a podobně.

Farmaceutický přípravek je výhodně formulován do jednotkové dávkovači formy. V takové formě je přípravek rozdělen do jednotkových dávek obsahujících příslušné množství účinné látky. Jednotková dávkovači forma může být obsažena v obalu, který takto obsahuje vymezené množství přípravku, přičemž tímto obalovým přípravkem mohou být tablety v tobolkách, kapsle a prášky v lékovkách nebo ampulích. Jednotkovou dávkovači formou může být rovněž kapsle, tableta, sáček nebo pastilka samotná nebo může být příslušný počet některé z těchto forem ob sažen v odpovídajícím obalu.

Množství účinné látky v prostředku s jednotkovou dávkou může být různé a může být nastaveno v závislosti na charakteru podání a potenci konkrétní použité účinné látky. Tato kompozice může v případě potřeby též obsahovat jiná kompatibilní terapeutická činidla.

V rámci terapeutikého použití mohou být sloučeniny podle vynálezu podávány v předem předepsaných dávkách. Dávky se ale mohou lišit podle konkrétní použité slouče niny, potřeb pacienta a závažnosti léčeného stavu. Stanovení příslušné dávky pro danou konkrétní situaci je v možnostech odborníka. Obecně se při léčení zahajuje

I ''“v.

menšími dávkami, které jsou nižší než optimální dávka dané sloučeniny. Potom se dávka pozvolna zvyšuje až k dosažení optimálního účinku účinné látky za daných podmínek. Celková denní dávka může být případně rozdělena na několik dílčích denních dávek.

Vzhledem k tomu, že zde popsané formy vynálezu představují výhodné provedení, jsou možná i mnohá další provedení. Nebylo účelem zde uvádět všechny možné ekvivalentní formy a modifikace vynálezu. Je samozřejmé, že zde popsané formy mají pouze ilustrační, a nikoliv omezující charakter a že zde popsané formy je možno obměňovat, přičemž i takto obměněné formy spadají do rozsahu vynálezu.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Kompozice pro léčení Alzheimerovy nemoci vyznačená tím, že obsahuje N-substituovaný akridin zvolený z množiny obsahující sloučeniny vzorce 1, 2 a 3 a účinné oxidázu inhibující množství inhibitoru

P450 1A2.
2. Kompozice podle nároku 1 vyznačená tím, že obasahuje N-substituovaný akridin zvolený z množiny obsahující sloučeniny vzorce 1, 2 a 3 a účinné množství inhibitoru oxidázy P450 1A2, jejíž enzymatická aktivita je indukována beta-naftaflavonem, 3-methylcholanthrenem, arochlorem, 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxinem a isosafrolem.
3. Kompozice podle nároku 1 nebo 2 vyznačená tím, že inhibitorem oxidázy je naftyridin vzorce 4.
4. Kompozice podle nároku 1 nebo 2 vyznačená tím, že inhibitorem oxidázy je xanthin vzorce 5.
5. Kompozice podle nároku 1 nebo 2 vyznačená tím, že inhibitorem oxidázy je fenoxyaminoalkan vzorce 6.
6. Kompozice podle nároku 1 nebo 2 vyznačená tím, že inhibitorem oxidázy je karbamoylimidazol vzorce 7.
7. Kompozice podle nároku 1 nebo 2 vyznačená tím, že inhibitorem oxidázy je heterocyklický guanidin vzorce 8.
8. Kompozice podle nároku 1 nebo 2 vyznačená tím, že inhibitorem oxidázy je chinolin vzorce 9.
9. Kompozice podle nároku 1 nebo 2 vyznačená tím, že inhibitorem oxidázy je trifluoromethyloximether vzorce 10.
10. Kompozice podle nároku 1 vyznačená tím, že akridin má vzorec 1.
11. Kompozice podle nároku 1 vyznačená tím, že akridin má vzorec 2.
12. Kompozice podle nároku 1 vyznačená tím, že akridin má vzorec 3.
13. Kompozice podle nároku 2 vyznačená tím, že akridin má vzorec 1.
14. Kompozice podle nároku 2 vyznačená tím, že akridin má vzorec 2.
15. Kompozice podle nároku 2 vyznačená tím, že akridin má vzorec 3.
16. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že inhibitor má vzorec 4, přičemž X znamená atom fluoru.
17. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, „ „ . 2 ze inhibitor má vzorec 5, pricemz R znamena furylovou skupinu.
18. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, _ „ „ o ze inhibitor ma vzorec 5, pricemz R znamena tetrahydrof urylovou skupinu.
19. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že inhibitor má vzorec 6, přičemž R a znamenají atom vodíku.
20. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že inhibitor má vzorec 6, přičemž R^ , R^ a FL znamenají atom vodíku.
21. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, i že inhibitor má vzorec 7, přičemž R a R^ znamenají

Í nižší aikylovou skupinu.
22. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že inhibitorem je látka vzorce 8, přičemž heterocyklické jádro obsahuje nejméně jeden dusíkatý heterocyklický kruh mající 5 nebo 6 členů v kruhu.
23. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že inhibitorem je látka vzorce 8, přičemž heterocykliV ckým jádrem je imidazolový kruh.

►
24. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že inhibitorem je látka vzorce 9, přičemž Y je v kruhu B a X znamená atom chloru.
25. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že inhibitorem je látka 9, přičemž Y je v kruhu A a ,4 alkoxyskupina je rovněž substituována v kruhu A.
26. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že inhibitorem je sloučenina vzorce 10, přičemž R znamená kyanovou skupinu.
27. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený že inhibitorem je sloučenina vzorce 10, přičemž R tím '4 znamená kyanomethylovou skupinu.
28. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený že inhibitorem je sloučenina vzorce 10, přičemž znamená methoxymethylovou skupinu.
29. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený že inhibitorem je sloučenina vzorce 10, přičemž znamená ethoxymethylovou skupinu.
30. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený že inhibitorem je furafylin.
31. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený že inhibitorem je mexiletin.
32. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený že inhibitorem je enoxacin.
33. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený že inhibitorem je ethimizol.
34. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznačený že inhibitorem je chloroquin.

tím,

R tím,

R tím, tím, tím, tím, tím,

Způsob podle nároku 1 nebo 2 že inhibitorem je primaquin.

vyznačený tím,
35.
36. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznače že inhibitorem je cimetidin.
37. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznače že inhibitorem je glutathion.
38. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznače že inhibitorem je fluvoxamin.
39. Způsob podle nároku 1 nebo 2 vyznače že N-substituovaným akridinem je takrin.