CZ46094A3 - Activation method of heterologous proteins obtained by genetic technology containing disulfide bridges of eukaryotic origin after expression in prokaryotic organisms - Google Patents

Description

ZPŮSOB AKTIVACE GENETICKOU TECHNOLOGIÍ — _ _

ZÍSKANÝCH HETEROLOGHÍCH BÍLKOVIN S OBSAHEH DISULFIDOVÝCH HUSTKŮ EUKARYOTICKÉHO PŮVODU PO EXPRESI V PROKARYOTICKÝCH ORGANISMECH

OBLAST TECHNIKY

Vynález se týká způsobu aktivace genetickou technologii získaných heterolognlch bílkovin s obsahem disullidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Při expresi heterolognlch bílkovin v prokaryotických organismech vytváří tyto bílkoviny v cílových buňkách Často inaktivní, nesnadno rozpustné agregáty, tzv. relraktivnl tělíska (reíractile bodies), která jsou mimoto zneči&těna bílkovinami/ vlastními cílovým buňkám; Je pravděpodobné, Se tvorba těchto tělisek je důsledkem vysoké koncentrace bílkovin v buňce při expresi. Je známo, že při tvorbě velkých množství enzymů v buňce dojde v důsledku tohoto stavu v buňce ke shlukování enzymů na nerozpustné, vysokomolekulární a z větěl Části neúCinné Částice. Než je možno tyto bílkoviny užit např. k léCebným účelům, je zapotřebí je Čistit a převést z neúCinné formy na formu účinnou.

Podle známých postupů je možno dosáhnout aktivace různým způsobem v několika stupních, jak bylo například popsáno v publikacích B.fi.Jaenicko, FEBS Federation of European Biochemicia Soci©ties, sv. 52 (1979) 187 až 198, R.Budolph, Biochěmistry Ifl (1979) 5572 až 5575.

- 2V prvním stupni se dosáhne rozpustnosti bílkovin pl*idáním silného denaturačnlho prostředku, např. guanidin-hydrochloridu nebo močoviny ve vysoké koncentraci/ nebo přidáním silné kyselých činidel, např. směsi glycinu a kyeeliny fosforečné. Jako dalBl pomocná látka padají v úvahu reakční činidla, která obsahuji skupiny SH-, například dithioerythritol nebo EDTA, zejména při renaturaci LDH, Jakmile je bílkovina znečistěná bílkovinami cílových bunék, je nutno provést v následujícím stupni čiStěnl běžným způsobem, například chromatografil na gelu nebo na iontoméniči. Pak se získaný materiál silné zředí, čímž se snlžl koncentrace denaturačnlho činidla. Při použiti guanidinhydrochloridu je nutno vzorec zředit až na hodnoty nižSl než 0,5 mol/1. V případě enzymů s volnými SHskupinámi je účelné přidat činidlo, které tyto skupiny chrání, jak bylo popsáno například v publikaci

B.B.Jaenicke, Journal Polymer Science, sv. C 16 (1967) 2143 až 2160.

V Evropské patentové přihláSce č. 114 506 je popsán postup pro ifiolaci, čistění a aktivaci heterolognlho produktu exprese at bakteriálních kultur. K aktivaci se užije roztoků refraktivních tělísek v silném denaturačním činidle, které se a) přímo převedou na roztoky ve slabSlm denaturačnlm činidle a pak se tyto roztoky oxidují k zajištěni zpětné tvorby disulfidových můstků,

b) bílkovina se podrobí sulfonaci, načež se převede do roztoku ve slabSlm denaturačnlm činidle a S-sulfonátové skupiny se převedou na redukovanou a oxidovanou formu, například působením GSH/GSSG za vzniku skupin -S-S-,nebo se c) roztok ve slabém denaturačnlm činidle přímo zpracovává působením reakčníhó činidla sulfhydrylového typu, např. směsí GSH/GSSG. Typickým příkladem, u něhož dochází ke svrchu uvedeným problémům, je t-PA.

- 3Hlavní složka bilkovinové matric· krve je polymerní íibrin. Tato bílkovina se rozpouétí působením plasminu, který se tvoří z plasminogenu aktivací tzv. aktivátory plasminogenu, například působením t-PA (tkáňový aktivátor plasminogenu, tissue-type plasminoven activator). Enzymatická účinnost přírodního nebo venetickou technologií z eukaryotických organismů získaného t-PA je v nepřítomnosti íibrinu nebo Btépných produktů íibrinu (FSF) velmi nízká, je véak možno ji zvýéit přidáním svrchu uvedených stimulátorů, a to více než desetkrát. Tato tzv. stimulovatelnost účinnosti je velkou výhodou t-PA ve srovnání s jinými známými aktivátory plasminovenu, jako je například urokinasá nebo streptokinasa, jak bylo popsáno např. v publikacích M. Heylaerts a dalžl, J. Biol. Chem. 25Ζ» (1982) 2912 až 2019, Nieuwenhiuzen a dalttí, Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 až 35.

Zásadné je možno vytvořit nevlykosilováný produkt typu t-PA také v prokaryotických organismech genetickou manipulací při použiti c-DNA. Při použití tohoto produktu véak nepadá v úvahu stimulovatelnost účinnosti jako v případe t-PA z eukaryotických organismů. Příčinou je patrné ta skutečnost, že různé podmínky, zejména redukce a oxidace, se natolik liél v prokaryotické buňce a v eukaryotické buňce, z niž pochází gen, že se od počátku tvoří neúčinný produkt, což patrné spočívá ve Spatné tvorbé můstku SS, které přírodní molekula obsahuje, nebo se tyto můstky vůbec netvoří, popřipadé jsou vázány nevhodným způsobem. Při léčebném použiti t-PA véak ee nepožaduje pouze enzymatická účinnost t-PA, avéak také enzymatická stimulovatelnost tohoto produktu jako taková. Na skutečnost, že buňky prokaryotických organismů obvykle nevytváří účinné bílkoviny, jejichž původem jsou eukaryotické organismy, se poukazuje například také v publikaci The AMBO Journal 4. č. 3 (1985) 755 až 780.

-4V Evropské patentové přihláttce ΰ. 93 6^9 se při aktivace t-PA bunéčné pelety, získané z E. coli, uvedou do suspenze v guanidinhydrochloridu o koncentraci 6 mol/1, rozrutti se ultrazvukem, získaný materiál se inkubuje a pak se dialyBuje 4 hodiny proti roztoku tris-HCL o pH 8,0 ve smési s chloridem sodným, kyselinou ethylendi-* amintetraoctovou s prostředkem Tween 80. Po dýalýze se materiál odstředí, přičemž v supernatantu je možno prokázat aktivátor plasminogenu. Tímto způsobem získaný t-PA je proteolyticky účinný, není ho vttak možno stimulovat Stépnými produkty po působení kyanidu ^roou na íibrin (BrCN-FSP), jak bylo popsáno v publikací J.H.Verheijen, Thromb. Haemostas,·48, (3), 260-269 (1982),

Pro aktivaci denaturovaných bílkovin není v literatuře popsán žádný vtteobecntt použitelný postup. To platí zejména pro t-PA, protože přírodní bílkovina má velmi složitou stavbu. Obsahuje volnou thielovou skupinu a 17 SS-můstků, které jsou teoreticky spojeny na 2,2 x 10²° způsoby, přičemž pouze jediná z téchto struktur odpovídá přírodnímu stavu. Způsoby pro aktivaci t-PA, které jsou známé z literatury, vedou k získáni proteolyticky účinného t-PA, který vttak nevykazuje žádnou méřitelnou stimulovatelnost. Není znám žádný postup aktivace, který by vedl k získání stimulovatelného t-PA.

Vynález si klade za úkol navrhnout způsob úplné aktivace genetickou technologií získaných heterolognlch bílkovin s obsahem disullidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech.

Předmětem vynálezu je způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech rozrušením buněk, solubilizací za denaturačních a redukčních podmínek s následnou reaktivací za oxidačních podmínek v přítomnosti GSH/GSSG, přičemž se v reaktivačním stupni jako denaturační činidlo užije arginin nebo guanidinhydrochlorid v konpentraci v rozmezí 0,1 až 1,0 mol/1, s výhodou v rozmezí 0,25 až 0,8 mol/i a/nebo alespoň jedna sloučenina obecného vzorce I

R₂ - CO - NRR₁ (I), kde

R a R-j. znamenají atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 4 atomech uhlíku, a

R₂ znamená atom vodíku, zbytek NHR^ nebo alkylový zbytek o 1 až 3 atomech uhlíku, v koncentraci v rozmezí 0,5 až 4 mol/1, s výhodou 1 až 3,5 mol/1, a reaktivace se provádí při pH 8 až 12, při koncentraci GSH 0,1 až 20 mmol/1 a při koncentraci GSSG 0,01 až 3 mmol/1, vyznačený tím, že se v reaktivačním stupni postup provádí v přítomnosti koncentrace denaturačního činidla, při níž ještě nedochází k denaturaci.

Výhodná provedení způsobu podle vynálezu budou dále popsána.

Z denaturačních činidel je možno při provádění způsobu podle vynálezu užít činidla, běžně užívaná pro aktivaci za oxidačních podmínek,nebo argininu. Výhodným denaturačním činidlem je guanidinhydrochlorid, močovina nebo deriváty téchto látek. Dal Siní vhodným Činidlem je arginin. Je rovnéž možno použit smési svrchu uvedených denaturaCních Činidel.

S výhodou se aktivační stupeň provádí také za Přítomnosti cizorodé bílkoviny, která není proteolyticky účinná, s výhodou albumin ze sera skotu (BSA), například v množství 1 až 3 mg/ml. Přídavek BSA má za následek malé zvýSenl výtéžku a současné stabilizaci bílkovin (pravděpodobné chrání proti denaturaci povrchu a/nebo proti proteolytickému odbourávání) .

Další podmínky způsobu podle vynálezu odpovídají podmínkám reaktivace, známým z literatury. Aktivace (inkubace) trvá s výhodou 20 až 48 hodin při teploté místnosti. Poločas aktivace je za přítomnosti 0,5 mmol/1 redukovaného GSH a oxydováného GSSG glutationu v rozmezí Přibližné 10 až 15 hodin při teploté 20« C.

Při další inkubaci, například 48 hodin za reoxidaCnlch podmínek obvykle stimulovatelnost klesá v důsledku CNDr-FSP. Aktivační stupeň se s výhodou provádí za přítomnosti kyseliny ethylendiamintetraoctové, s výhodou v koncentraci 1 mmol/1.

Stupné aktivačního postupu reoxidace a aktivace nebo předcházející a následující stupné, například rozrušení bunék, rozpouštění a popřipadé jeden nebo vétéí stupeň aktivace a/nebo následující Ciéténi je možno provádět podle známého stavu techniky, tak jak byl popsán například v Evropských patentových přihláškách C 114 506 a 93 619.

Z hlediska vysokých výtéžků a dobré aktivace je však účelné provádět jednotlivé stupné nebo véechny stupné s ohledem na svrchu popsané pomlnky postupu.

- 7_

ZvláSte je možno provádět stupně způsobu podl· vynálezu, spočívající v aktivaci směsi, získané rozruSenlm buněk bez předchozí denaturace a/nebo redukce, výtěžky jsou vSak dosti nízké. K expresi ss používá prokaryotických organismů, s výhodou P. putida a zejména E. coli, způsob podle vynálezu je vSak možno provádět i v dalBlch prokaryotických organismech, jako jsou například Bacilli, v nichž je rovněž možno dosáhnout exprese požadované bílkoviny.

Bozruéení buněk je možno provádět známými způsoby, například působením ultrazvuku, dispergováním za zvýšeného tlaku nebo působením lysozymu. Jako proetředí pro suspenzi se s výhodou použije roztok puíru, který dovoluje nastavení neutrálního až slabé kyselého pH, například 0,1 mol/1 tris-HCl. Po rozruSení buněk se nerozpustné součásti těchto buněk, tzv. reíraktivní tělíska,oddělí libovolným způsobem, s výhodou energickým odstředěním při delBí době odstřeďování, nebo filtrací. Po promyti látkami, které neroruSují t-PA, avBak pokud možno rozpouštějí cizorodé buneCné bílkoviny, jako je například voda, popřípadě fosfátový pufr s případným obsahem mírných smáčedel, jako je triton, se sraženina nebo peleta podrobí solubilizaci za redukčních podmínek. Solubilizace se provádí v alkalickém pH, zejména při pH 8,6 ± 0,4 za přítomnosti redukčního Činidla ze skupiny merkaptanů a denaturačního činidla.

Jako denaturační činidlo je možno užít činidla, známá z literatury, například z Evropské patentové přihlášky Č.114 506 pro solubilizaci, zejména běží o guanidinhydrochlorid nebo o močovinu. Guanidinhydrochlorid se s výhodou užije v koncentraci 6 mol/1, močovina v koncentraci 8 mol/1. Stejne dobře je možno užít sloučeniny obecného vzorce I,

Βχ - CO - NBRi kde

R a Ri znamenají atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 4 atomech uhlíku* a

Rx znamená, atom vodíku* zbytek NHBt nebo alkylový zbytek o 1 až 3 atomech uhlíku.

Jako redukční činidla ze skupiny merkaptanA je možno použít například redukovaný glutathion GSH nebo

2-merkaptoethanol, například koncentraci 50 až 400 mmol/1 dithioethreitonu a/nebo dithrioerythritol (DTE) nebo dithiothreitol (DTT) například v koncentraci 80 až 400 mmol/1. Solubilizace se 8 výhodou provádí při teplot# místnosti po dobu jedné nebo větělho počtu hodin* s výhodou dvě hodiny. K zábraně oxidace redukčního Činidla vzduěným kyslíkem mAže být účelné přidat k reakční směsi jeětě EDTA. Kromě solubilizace a redukce má tento stupeň také čisticí účinek* protože větéina materiálu* který není zkřížen imunologicky s t-PA, zejména cizorodých bílkovin* nepřichází do roztoku.

Po solubilizaci a před aktivací je možno zařadit běžné čisticí stupně. Z čisticích postupA přicházejí v úvahu např. steřícká chromatografie (SEC) za přítomnosti guanidinhydrochloridu nebo močoviny, nebo iontoměniče za přítomnosti močoviny nebo jejího derivátu. Je možno také užít nespecifickou reoxidaci* které je možno zábránit například 2-merkaptoethanolem nebo nastavením pH na hodnotu 4*5 nebo nižéí* jak bylo popsáno v publikaci R.Rudolph* Blochem. Soc. Traneactions X3 (1985) 308 až 311. Jakmile je solubilizační stupeň ukončen* je zapotřebí použitý DTE případně odstranit v čisticím stupni.

Čištění je možno provádět například na gelu Sepha— dex G 100 za přítomnosti guanidinhydrochloridu a redukčního Činidla, například glutathions GSH při pH 1 až 4, tímto způsobem je možno oddělit velké množství cizorodé bílkoviny, nebo je možno oddélit denaturaCnl a redukční prostředek odstraněním solí na gelu Sephadex G 25 v 0,01 mol/1 kyselině chlorovodíkové nebo 0,1 mol/1 kyselíné octové. Oddělené denaturačního/redukčního Činidla je možno uskutečnit také dialýzou.

Daléí Čisticí stupeň může následovat po reaktivaCním stupni. Toto CiStěnl ss zpravidla provádí dialýzou nebo izolací aktivovanbého t-PA, například afinitní chro— matograíií, např. na Lys-Sepharose.

Způsobem podle vynálezu je tedy možné aktivovat t-PA z prokaryatických organismů tak, žs ss nejen dosáhne aktivace na obvyklou biologickou účinnost, nýbrž navíc se dosáhne stimulovátelnosti ve svrchu uvedeném významu, a to v množství, které převyšuje daleko stimulovatelnost t-FA při faktoru vyšším než 10, někdy až 50.

Další bílkovinou z eukaryotických organismů, které je možno aktivovat způsobem podle vynálezu po expresi v prokaryatických organismech, je 0-interíeron.

Praktické provedení způsobu podle vynálezu bude osvětleno v následujících příkladech. Nenl-li uvedeno jifiro nak, vztahují se es*centuálni údaje na hmotnostní procento a teplotní údaje na stupně Celsia.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Přiklad 1

a) Příprava refraktilních tělísek

100 g vlhké buněfiné hmoty E. coli v 1,5 litrech tris/HCl o koncentraci 0,1 mol/1, pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA ee 10 sekund homogenizuje na zařízení Ultra-Turray a pak ee přidá 0,25 mg/ml lyeozymy,. Po 30 minutách inkubace při teplote místnosti ee směs znovu homogenizuje a zchladl na teplotu 3° C. Buňky ee rozruSl dispergováním za vysokého tlaku 550 kg/cm*. Pak ee přidá 300 ml trie-HCl o koncentraci 0,1 mol/1 při pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA. Po odstředěni (Servali GSA, 2 hodiny při 13 000 otáCkách za min.,

000 g, 4° C) ee peleta smlBl s 1,2 litry trie-HCl o koncentraci 0,1 mol/1 při pH 6,5, 20 mmol/1 EDTA a 2,5 X Triton-X-100 a pak ee homogenizuje. Pak ee materiál opakované odstředí (Servali GSA, 30 min. při 13 000 ot./min., 27 000 g, 4° C)_f/se\peieta)smlsi e 1,3 litry trie-HCl o pH 6,5 a koncentraci 0,1 mol/1 a 20 mmol/1 EDTA b 0,5 X Triton-X-100 a materiál ee homogenizuje. Pak ee materiál jeété jednou odstředí (Servali GSA, 30 min. při 13 000 ot/min., 27 000 g, 4° C) a pelety se homogenizují v 1 litru tris-/HCl o koncentraci 0,1 mol/1 při pH

6,5 a 20 mmol/1 EDTA, toto odstředění ee provádí třikrát.

Obsah t-PA v refraktilních télíokách ee ve výsledném materiálu zjlétuje při použití SDS-PAGE, pásy e obsahem t-PA oe identifikují způsobem Westem-blotting” a kvantitativně se stanoví den·!tometricky.

11Při použiti tohoto způsobu je možno prokázat silný pás s obsahem t-ΡΆ a molekulovou hmotnosti přibližn# 60 jednotek. Podlí t-PA v celkové bílkovin# relraktilnlch tělisek je přibližně 21 X.

b) SolubilizaceZredukce relraktivnlch tělisek

Reíraktivní těliska s koncentraci bílkovin 1 až 5 m?/ml se inkubujl v 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 8,6, 6 mol/1 9uanidinhydrochloridu, 0,15 až 0,4 mol/1 DTE a 1 mmol/1 EDTA po dobu 2 až 3 hodin při teplot# místnosti. Pak se nerozpustný materiál, například bunědné Iragmenty a pod., oddělí odstředěním (například Servali 34, minut při teplot# 4® C, při 15 000 až 20 000 otáčkách/ minutu a při 35 000 až 50 000 9). Hodnota pH superaatantu se upraví koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 3. Denaturačnl a redukční prostředky se oddělí dialýzou proti 0,01 mol/1 kyseliny chlorovodíkové Při teplot# 40 C.

c) Seoxidace/aktivace

Reoxidace/aktivace se provádí při řed#ní 1 : 50 až 1 : 200 v roztoku, který obsahuje 0,1 moi/1 tris/HCl o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mgr/ml BSA, 0,5 mol/1 l-ar?!ninu, 2 mmol/1 GSH a 0,2 mmol/1 GSSG. Po 17 až 24 hodinách aktivace při teplot# přibližn# 20 o C se stanoví údinnost ve srovnáni s údinnostl nativního 9lykosylovaného t-PA z eukaryotických orgranismCl a výtěžek této látky.

Výtěžek, vztažený na celkový obsah bílkoviny v relraktivnlch těliskách,se pohybuje v rozmezí :

2,5 ± 0,5 * stimulovatelnost je 10 i 5.

— 12 —

Výtážek, vztažený na podíl t-PA v reíraktivních tělískách,je přibližná 12 X.

d) Beoxidače/aktivace bez oddálení denaturaCního/redukCnlho Činidla

Beíraktivní tálíska se inkubují při koncentraci bílkovin 1,25 mg/ml ve smási, kt<rá obsahuje 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 8,6, 6 mol/1 guanidinhydrochloridu, 0,2 mol/1 DTE a 1 mmol/1 EDTAS 2 hodiny při teplotá místnosti. Okamžitá potom se provádí reoxidače pPi Pedání 1 : 100 v roztoku, který obsahuje 0,1 mol/1 tris/HCl o pH

10,5 , 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,3 mol/1 1-arglninu a taková množství 6SSG, jaká je uvedeno v následující tabulce. Mimo to se stanoví v aktivaCní smási zbytek koncentrace guanidinhydrochloridu, který je 0,06 mol/1 a DTE, s hodnotou 2 mmol/1.

Závislost výtéžku aktivace na koncentraci GSSG při aktivaci bez odddlení denaturačníha/redukčního činidla.

GSSG Výtéžek * Stimulovatelnost (mmol/1) (X) (faktor)

0,2	0
1	0,13	4,0
5	1,49	1,4
6	1,28	5,4
7	1,04	5,8
9	0,98	5,2
10	1,77	10,0
15	0	-
20	0	-
Výtéžek	s čárkou « výtéžek účinného t-PA	, vztaženo
celkový	obsah bílkoviny v refraktivních	télískách.

Přiklad 2

V následujících tabulkách je shrnut vliv různých parametrů způsobu podle vynálezu na aktivaci a stimulovat el nost t-ΡΆ. V těchto reoxidaCnlch pokusech byla solubilisovaná, redukovaná bílkovina užita bez předběžného

CiStění.

Redukovaná bílkovina v 0,01 mol HC1 byla aktivována ředěním 1 : 10 až 1 : 500 v reoxidačním pufru. Aktivace byla prokazována při teplot9 místnosti po inkubaci 22 až 48 hodin při táže teplotě.

ÚCinnost reoxidováné bílkoviny se vztahuje na standardní reoxidaci, která je pokládána za 100 X v roztoku s obsahem

0,1 mol/1 trie/HCl o pH 10,5 * 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 1-argininu + 1, mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH (redukovaný glutathion) + 0,5 mmol/1 GSSG (glutathiondijul^id).

Stimulovatelnost se vypočítává jako K+CNBrFSP^^-CNBrFSP způsobem, popsaným v publikaci W.

Nieuwenhuizon a dal&l, Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 až 533. Účinnost v * a stimulovatelnost jako faktor se stanoví způsobem podle publikace J.H. Verheijen Thromb. Haemostas. 48(3), 266-269 (1982).

Výsledky :

1. Závislost výtěžku aktivace na přísadách 1-argininu & guani di nhydrochlori du

15—

Beakce ve smtfsi

0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1, nunol/1 EDTA msr/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG

a) 1-arginin

1-arsrinin účinnost etimulovatelnoet (mol/1) (*) (faktor)

0	4	2,5
0,25	98	7,5
0,5	100	21,9
0,75	27	16,3
1,0	23	3,5

Při tomto pokusu je nutno uvážit, že i-arvinin působí inhibici t-ΡΆ. Pokles výttfžku aktivace při vySSÍ koncentraci táto látky je tedy nutno přičíst inhibici.

b) Guanidin-hydrochlorid (Gdn.HCl) (Gdn.HCl) účinnost (mol/1) (X) li

0,25

0,5	53
0,75	58
1,0	12

2. Závislost výtěžku aktivace na přidáni močoviny nebo jejich deriváte

Beoxidace ve směsi 0,1 mol/1 tris o pH 10,5, mmol/1 EDTA, 1 mgr/ml BSA, 5 mmol/1 GSH, a 0,2 mmol/1 GSSG.

a) Močovina

močovina (mol/1)	účinnost (*)
0,	i
0,5	20
1	59
1,5	126
2	162
2,5	141
3	72
4	12

b) Methylmočovina

methylmočovina	účinnost
(mol/1)	(*)
0,5	22
1	174
1,5	313
2	375
2,5	332
3	215
4	12
5	0

c) Ethylmočovina

•thylmočovina	účinnost
(mol/1)	(*)
0,5	46
1	212
1,5	323
2	300

2,5 107

19

d) Dimethyl močoví na dimethylmočovina účinnost (mol/1) (*) stimulovate1nost (faktor)

0,5	167	8,8
1	256	8,9
1,5	283	9,4
2	177	7,7
2,5	78	8,9
3	23	9,9
4	4	8,6
5	2	3,5

3. Závislost výtčžku aktivace na přidání amidů alifatických kyselin :

Reoxidace se provádí ve smési 0,1 mol/1 tris o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mgr/ml BSA, 5 mmol/1 GSH a 0,2 mmol/1 GSSG.

a) Formamid

1ormamid	účinnost
(mol/1) l	(*)
0	42
0,5	59
1	175
1,5	245
2	325
2,5	423
3	444
4	416
5	341
b) Methyl1ormamid
methy1formamid	účinnost
(mol/1)	(*)
0,5	100
1	135
1,5	304

20’

2	389
2,5	466
3	452
4	425
5	121
c) Acetamid
acetamid	účinnost
(mol/1)	(*)
0,5	72
1	134
1,5	207
2	261
2,5	204
3	237
4	198
5	141

- 21“

d) Propionamid propionamid účinnost

(mol/1)	(*)
0,5	95
1	99
1,5	207
2	261
2,5	204
3	237
4	198
5	141
c) Bu tyr amid
butyramid	účinnost
(mol/1)	(*)
0,5	55
1	52
1,5	17
2	0

0.

- 224. Závislost výtažku aktivace na hodnotě pH

Beoxidace se provádí ve smási

0,1 mol/1 tris/HCl + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 1-argrinin + 1 mgr/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG

PH	účinnost (*)	stimulovatelnost (faktor)
7	1	-
8	22	3,0
9	89	13,6
10	105	20,3
11	95	21,3

5. Závislost výtěžku na koncentraci GSH/GSSG

Beoxidace se provádí ve Brnesi

0,1 mol/1 tris-HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 1-arginin + 1 mg/ml BSA

a) + 1 mmol/1 GSH

GSSG (mmol/1)	účinnost (*)	stimulovatelnost (faktor)
0,1	239	14,9
0,2	273	15,3
0,5	193	13,3
1	198	12,5
5	17	2,1
10	0	-
20	0	-
b) + 0,2 mmol/1	GSSG
GSH	účinnost	stimulovatelnost
(mmol/1)	(*)	(faktor)
0,05	15	2,2
0,1	40	3,8
0,2	112	6,8
0,5	142	7,4
1	273	6,8
5	260	7,9
10	143	6,3
20	55	5,1

—

6. Závislost· výtěžku aktivace na koncentraci bílkoviny při reoxidaci (ředěni i : 20 až i : 500)

	Beoxidace se provádí ve směsi
	0,1 mol/1 tris/HCl o	pH	10,5
+	1 mmol/1 EDTA
+	1 mg/,1 BSA
+	0,5 mol/1 l-ar?inin
+	0,5 mmol/1 GSH
+	0,5 mmol/1 GSSG

zředěni účinnost stimulovatelnost (X) (faktor)

10	29	15,3
20	45	25,4
50	69	37,9
100	100	37,9
200	79	52,7
500	29	28,7

7. Závislost výtěžku aktivace na přidání BSA

Beoxidace βθ provádí ve směsi

0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol 1-argininu + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG —

BSA (mg/ml) účinnost («)

47

0,5 83

100

102

52

Na obr. 1 a 2 je znázorněný účinnost při přidáni a bez přidáni CNBr-FSP ve standardním pokusu po 17 hodinách reoxidace při teplotě místnosti, ve směsi 0,1 mol/1 trie/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTa +0,5 mol 1-argininu + 1 mg/ml BSA +0,5 mmol/1 GSH +0,5 mmol/1 GSSG.

Na obr. 1 a 2 znamená křivka A účinnost za přítomnosti CNBr-FSP a křivka B účinnoet bez CNBr-FSP.

Přiklad 3

Aktivace 0-interíeronu, získaného genetickým inženýrstvím

Βθfrakturní tělíska byla zlekána svrchu uvedeným zpŮBobem. Redukce/solubilizace těchto tělísek byly uskutečněny následujícím způsobem :

peleta byla inkubovány 3 hodiny při teplotě 25° C v 10 ml směsi 9,1 mol tris/HCl o pH 8,6, 6 mol/1 Gdn/HCl, 1 mmol/L EDTA a 0,2 mol/1 DTE a po 30 minutách byla směs odstředěna při teplotě 4« C a při 48 000 g a pH super26 natantu bylo upraveno na hodnotu 3 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Pak byla prováděna filtrace na gelu Sephadex G25 F v 0,01 mol/1 HCl.

Eluát byl sledován při 280 nm a byla stanovena extinace, koncentrace bílkovin a reaktivita.

Aktivace standardu (100%) se provádí ve směsi s obsahem 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG a 0,25 mol/1 1-argininu.

a) Závislost aktivace na Čase

Eluát se zředí v poměru 1 : 50 směsi, která obsahuje 0,1 mol/1 trie/HCl o pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG a 0,25 mol/1 1-argininu.

doba aktivace 08innost <h) (X)

15

15

2

b) závielost výtěžku aktivace na přidáni 1-argininu

Eluát se zředí v poměru 1 : 50 směsi s obsahem 0,1 mol/1 trie/HCl o pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA,5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG a pak se směs aktivuje 20 hodin při teplotě 0° C.

Závislost, aktivace na množství 1-arsrininu

1-arginin účinnost

(N)	(X)
0,	8
0,25	8
0,5	15
0,75	15

c) Závislost výtěžku aktivace na množství močoviny

Byl užit roztok z odstavce b), aktivace byla prováděna 17 hodin při teplotě 0° C.

Závielost aktivace na močovině močovina (M) účinnost (X)

13

0,5 100

200

1,5 100

d) Závislost výtěžku aktivace na množství formamidu

Aktivace se provádí ve stejné směsi jako v odstavci b), vzorky se sledují po 17 hodinách aktivace Při teplotě 0° C.

Závislost aktivace na Íormamidu iormamid (M) účinnost (X)

13

13

13

0

0

e) Závislost výtěžku aktivace na redox-pulru

Eluát se zředí v poměru 1 '· 50 směsi s obsahem 0,1 M tris/HCl o pH 8,5, 1 mmol EDTA a 0,25 N 1-argininu a vzorky se sleduji po 17 hodinách aktivace při teplotě 0® C.

Závislost aktivace na poměru GHS/GSSG

GSH (mM) GSSG (nM) účinnost (X)

i	0,5	6
5	0,5	13
10	0,5	25
20	0,5	25

5	0*1	13
5	0,5	13
5	1*0	13
5	5	6
Závislost	výtěžku aktivace na	koncentraci	bílkoviny
Eluát	byl zředěn v poměru	1 : 10 až 1	: 100 směsí

s obsahem 0,1 M tris/HCl o pH 8,5, 1 mM EDTA* 5 mM GSH* 0*5 mM GSSG a 0*25 m 1-argininu* Btanovení se provádí po aktivaci 17 hodin při teplotě 0® C.

Závislost aktivace cp cp (mg/ml) účinnost (X)

0*018	13
0*036	13
0,072	13
0*108	8
0*180	10

g) Závislost výtěžku aktivace na přidáni BSA

Eluát se zředí v poměru 1 : 50 Bměsl s obsahem 0*1 M tris/HCl o pH 8*5, 1 mM EDTA, 5 mM GSH, 0*5 mM GSSG a 0*25 M 1-argininu a výsledek se odečítá po 17 hodinách aktivace při teplotě 0° C.

účinnost (X)

Závislost aktivace na BSA

BSA (mg/ml)

h) Závielost výtěžku aktivace na pH

Eluát se zředí v poměru 1 '· 50 Bměsí s obsahem 0,1 M tris/HCl, 1 mM EDTA, 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG a 0,25 M 1-argininu a výsledek se odečítá po 17 hodinách aktivace při teplotě 0« C.

Závislost aktivace na pH pH účinnost (X)

6.5 0

7.5 6

8.5 13

9.5 50

10,5 100

V 4

PATENTOVÉ

Claims (5)

1. NÁROKY

   1. Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech rozrušením buněk, solubilizací. za denaturačních a redukčních podmínek s následnou reaktivací za oxidačních podmínek v přítomnosti GSH/GSSG, přičemž se v reaktivačním stupni jako denaturační činidlo užije arginin nebo guanidinhydrochlorid v koncentraci v rozmezí 0,1 až 1,0 mol/1, s výhodou v rozmezí 0,25 až 0,3 mol/1 a/nebo alespoň jedna sloučenina obecného vzorce I

   R₂ - CO - NRR_X (I), kde

   R a R^ znamenají atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až

   4 atomech uhlíku, a

   R₂ znamená atom vodíku, zbytek NHR^ nebo alkylový zbytek o 1 až 3 atomech uhlíku, v koncentraci v rozmezí 0,5 až 4 mol/1, s výhodou 1 až

   3,5 mol/1, a reaktivace se provádí při pK 3 až 12, při koncentraci GSH 0,1 až 20 mmol/1 a při koncentraci GSSG 0,01 až 3 mmol/1, vyznačující se tím, že se v reaktivačním stupni postup provádí v přítomnosti koncentrace denaturačního činidla, při níž ještě nedochází k denaturaci.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že se postup provádí v přítomnosti guanidinhydrochloridu a/nebo sloučeniny obecného vzorce I jako denaturačního činidla.
3. 3. Způsob podle nároku 2,vyznačující se t í m, že se guanidinhydrochlorid užije v koncentraci 6 mol/1 a sloučenina obecného vzorce I v koncentraci 8 mol/1. »
4. 4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačuj ící se t i m, že se postup provádí v přítomnosti DTE, beta-merkaptoethanolu, cysteinu nebo GSH.
5. 5. Způsob podle nároků 1 až 4, vyznačuj ící se t í m, že se čištění a oddělení denaturačního činidla provádí sterickou chromatografií nebo dialýzou.