CZ403598A3

CZ403598A3 - Chitináza-materiál and methody

Info

Publication number: CZ403598A3
Application number: CZ984035A
Authority: CZ
Inventors: Patrick W. Gray
Original assignee: Icos Corporation
Priority date: 1996-06-14
Filing date: 1997-06-16
Publication date: 1999-07-14
Also published as: EP0918870A1; CN1236393A; WO1997047752A1; BR9709721A; AU731203B2; US6372212B1; CA2257829A1; NO985806L; PL337060A1; AU3397897A; IL127568A0; US20030017570A1; NO985806D0; SK169798A3; HUP0001644A2; JP2001510325A; HUP0001644A3

Description

Purifikované a izolované polynukleotidové sekvence kódující lidskou chitinázu. Materiál a metody týkající se rekombinantí produkce lidské chitinázy a s ní souvisejících látek, o kterých se předpokládá, že mohou být použitelné při léčení fungálních infekcí nebo při vývoji látek použitelných při tomto.

• ···

7>

• · · · • · · · · • · · · · · • · · · • · · · · · · · • · • ·

Chitináza - materiál and methody

Oblast techniky

Předkládaný vynález se obecně vztahuje k enzymu lidské chitináze a speciálně k nově purifikovaným a izolovaným polynukleotidům kódujícím lidskou chitinázu. Dále k chitinázovým látkám kódovaným těmito polynukleotidy, k metodám rekombinantní produkce chitinázových látek a k protilátkám specifickým proti chitináze.

Dosavadní stav techniky

Chitin je lineární homopolymér skládající se z Nacetylglukosaminových jednotek spojených β-(1,4) vazbou. Tento polysacharid je po celulose druhou nejrozšířenější organickou látkou. Exoskeleton členovců je složen z chitinu. Dále vnější buněčná stěna hub a ostatních parazitů obsahuje chitin, který zde zastává důležitou strukturní a ochranou roli. Rozložení buněčné stěny a membrán plísní a hub je používáno jako úspěšná terapeutická strategie proti houbám, plísním a parazitům. Například antifungální aktivita Amphotericinu B a fluconazolu vyplývá z působení na membránové steroidy. Navzdory existenci antifungálních terapií jsou fungální infekce stále více zodpovědné za nemoci ohrožující život (Georgopapadakou et al., Trends Microbiol., 3:98-104 (1995)). Druhy hub, plísní a parazitů odpovědných za tyto nemoci jsou zejména Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Coccidioides a Pneumocystis. Tyto patogeny jsou zvláště nebezpečné u pacientů se sníženou imunitou jako jsou pacienti s AIDS, pacienti podstupující chemoterapii a pacienti při transplantaci orgánů.

Chitin je degradován enzymem chitinázou. Chitinázy byly nalezeny u rostlin, mikroorganismů a živočichů. Bakteriální chitinázy pomáhají zajistit zdroje uhlíku pro růst bakterií. Hmyz produkuje chitinázy za účelem rozložení kutikuly. U rostlin mají chitinázy zřejmě ochranou roli proti parazitickým houbám. Chitinázy byly klonovány z mnoha bakterií, např. Serratia marcescens (Jones et al., EMBO J., 5:467-473 (1986)), rostlin, např.tabáku (Heitz et al., • o · · · · · · · 9 • 999 999999 999 999

9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9 9 9

Mol. Gen. Genet., 245:246-254 (1994)) a hmyzu, např. vosy (Krishnan et al., J.Biol. Chem., 269:20971-20976 (1994)).

Několik proteinů s nízkou homologií (méně než 40% aminokyselinové homologie) k bakteriálním, hmyzím a rostlinným chitinázám bylo identifikováno u savců. Jsou to např. protein z lidské chrupavky gp-39 (C-gp39) (Hakala et al., J.Biol.Chem., 268: 25803-25810 (1993)), lidský glykoprotein YKL-40 (Johansen et al.,

Eur.J.Cancer, 31A: 1437-1442 (1995)), ovčí estrogenem indukovaný, ovidukt specifický protein (DeSouza et. al., Endocrinology, 136: 2485-2496 (1995)), resp. lidský a hovězí nebo též sekreční protein z aktivovaných myších makrofágů (Chang et al., Genbank M94584). Aktivita degradující chitin však nebyla u těchto proteinů popsána. Funkce těchto proteinů není známá, předpokládá se ale, že se podílejí na procesu přeměny tkání. Hakala et al., (viz. předchozí text), popsal, že C-39 je detekovatelný v synoviálních vzorcích a vzorcích chrupavky u pacientů s revmatickou artritidou, nikoliv však u zdravých lidí. Recklies et al., (Arthritis Rheumatism, 36 (9 SUPPL.):S 190 (1993)) popsal lokalizaci proteinu C-gp39. Našel tento protein ve zvláštní populaci buněk povrchových vrstev chrupavky. Johansen et al. (viz. předchozí text) ukázal, že měření hladiny YKL40 v séru má hodnotu potenciálního markéru míry rozvinutí metastatické choroby a přežití pacientů s opakující se rakovinou prsa.

Escott et al., (Infect. Immun., 63: 4770-4773 (1995)) popsal enzymatickou chitinázovou aktivitu v lidských leukocytech a v lidském séru. Overdijk et al., (Glycobiology, 4: 797-803 (1994)) popsal izolaci chitinázy (4-methylumbelliferyl-tetra-Nacetylchitotetraoside hydrolázy) z lidského séra a jater krys. Renkema et al., J.Biol.Chem., 270: 2198-2202 (únor 1995) připravil lidskou chitotriosidázu ze sleziny pacientů trpících Gaucherovou chorobou (Gaucher disease). Jejich preparát vykazoval chitinázovou aktivitu a v článku je popsána krátká aminokyselinová sekvence proteinové části preparátu (22 koncových aminokyselinových zbytků a 21 zbytků tryptického fragmentu). Funkce lidské chitinázy je též neznámá, ale vztah k patofyziologii Gaucherovy choroby je v článku navrhován. V pozdější publikaci stejné skupiny (Boot et al.,

J.Biol.Chem. 270 (44): 26252-26256 (listopad 1995)) je popsáno klonování cDNA lidského makrofága kódující produkt, který vykazuje chitinázovou aktivitu. Částečná aminokyselinová sekvence publikovaná touto skupinou v článku z února 1995 odpovídá části dedukované aminokyselinové sekvence produktu cDNA lidského makrofága (viz. též International Patent Publication No. WO 96/40940).

Vzhledem k zvyšujícímu se výskytu fungálních infekcí ohrožujících život u jedinců se sníženou imunitou existuje zde potřeba identifikace a izolace polynukleotidové sekvence kódující lidskou chitinázu, potřeba vývoje mareriálů a metod použitelných k rekombinantní produkci enzymu a k výrobě látek sloužících k detekci chitinázy v plasmě.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu jsou nově purifikované a izolované polynukleotidy (např. DNA a RNA, jak normální tak antisence vlákno) kódující lidskou chitinázu nebo její fragmenty a analoga, metody rekombinantní produkce chitinázových polypeptidů, jejich fragmentů a analog, purifikované a izolované chitinázové fragmenty a analoga, protilátky proti těmto polypeptidům, fragmentům a analogům a farmaceutické směsi obsahující tyto polypeptidy, fragmenty, analoga nebo protilátky.

Zvláště chráněny jsou: purifikované a izolované polynukleotidy kódující aminokyselinovou sekvenci lidské chitinázy SEQ ID NOS:2 nebo 4, zvláště aminokyseliny 1 až 445. Poté dále DNA obsahující nukleotidy SEQ ID NOS: 1 nebo 3 kódující proteiny, zvláště nukleotidy 65 až 1402 SEQ ID NOS: 1 a nukleotidy 90 až 1427 SEQ ID NOS: 3. Poté dále purifikované a izolované polynukleotidové sekvence kódující aminokyselinové sekvence SEQ ID NOS: 14 nebo 15, purifikované a izolované polynukleotidy kódující lidskou chitinázu. Tyto polynukleotidy jsou vybrány ze skupiny obsahující: a) dvojpramennou DNA obsahující části kódující protein popsané v SEQ ID NOS: 1 nebo v SEQ ID NOS: 3, b) DNA, která za stringentních podmínek hybridizuje s nekódujícím pramenem DNA z bodu a), c)DNA, která by z důvodů redundance genetického kódu hybridizovala za stringentních podmínek s nekódujícím pramenem sekvence DNA a) nebo b). Dále vektory obsahující výše zmíněné DNA , zvláště expresní vektory, kde • ·

je DNA účinně navázána na DNA kontrolující expresi. Dále buňky stabilně transformované nebo transfikované těmito DNA a takovým způsobem, který dovoluje expresi lidské chitinázy v dané hostitelské buňce. Chráněny jsou dále metody produkce lidské chitinázy používající pěstování takovýchto hostlitelských buněk v živném médiu a izolace lidské chitinázy ze zmíněných hostitelských buněk nebo ze zmíněného živného média. Dále purifikované a izolované polynukleotidy produkované těmito metodami, purifikované a izolované polypeptidy obsahující aminokyselinovou sekvenci lidské chitinázy SEQ ID NOS: 2 nebo 4, zvláště aminokyseliny 1 až 445 této sekvence, dále fragment lidské chitinázy postrádající aminokyselinové zbytky 1 až 72 z C - konce přirizené lidské chitinázy, zvláště pak fragment lidské chitinázy SEQ ID NO: 14. Dále poté analog lidské chitinázy SEQ ID NO: 15, hybridní buněčné linie produkující monoklonální protilátky, které specificky reagují s některým z výše popsaných polypeptidů a také monoklonální protilátky produkované těmito hybridními liniemi.

Předložené sekvence DNA tohoto vynálezu zahrnují jak genomické a cDNA sekvence tak i částečně či cele chemicky syntetizované sekvence DNA. Nukleotidové sekvence dvou lidských cDNA kódujících předpokládané alelické varianty lidské chitinázy a zahrnující nekódující 5' a 3' sekvence jsou ukázány v SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 3. Tyto sekvence DNA a sekvence DNA, které hybridizují s nekódujícím vláknem těchto DNA za standardních stringentních podmínek nebo které by hybridizovalyv důsledku redundance genetického kódu jsou v tomto vynálezu uvažovány. Předložené DNA tohoto vynálezu obsahují kódující region lidské chitinázy (korespondující s nukleotidy 2 až 1402 SEQ ID NO: 1 nebo s nukleotidy 27 až 1427 SEQ ID NO: 3) a předpokládanou kódující sekvenci hotové, sekretované lidské chitinázy - proteinu bez svých signálních sekvencí (nukleotidy 65 až 1402 SEQ ID NO: 1 nebo nukleotidy 90 až 1427 SEQ ID NO: 3).

Vzorové stringentní hybridizační podmínky jsou následující: hybridizace při 42°C v 50% formamidu a promytí při 60°C v 0,1 x SSC, 0,1% SDS. Ti, kteří jsou znalí oboru vědí, že se vyskytují odlišnosti od těchto podmínek v závislosti na délce a obsahu GC nukleotidů sekvence, která je hybridizována. Standardní postupy

používané v oboru jsou vhodné pro stanovení přesných hybridizačnních podmínek (viz Sambrook at al., 9.47-9.51 v Molekular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Dvě aminokyselinové sekvence lidské chitinázy jsou ukázány na SEQ ID NOS: 2 a 4. Sekvence SEQ ID NO: 2 je kódována nukleotidivou sekvencí SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 4 je kódována nukleotidovou sekvencí SEQ ID NO: 3. Předložené polynukleotidy tohoto vynálezu zahrnují, vedle polynukleotidů popsaných výše, polynukleotidy, které kódují aminokyseliny -21 až 445 SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 4 a které se liší od polynukleotidů popsaných v uvedených odstavcích pouze díky dobře známé degenerovanosti genetického kódu. Podobně je tomu v dalším případě. Vzhledem k tomu, že 21 aminokyselin (pozice -21 až -1) SEQ ID NOS: 2 a 4 obsahují signální peptid, který se odštěpí při vzniku finálního proteinu lidské chitinázy, obsahují upřednostňované polynukleotidy kódované polypeptidy obsahující aminokyseliny 1 až 445 SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 4.

Vedle mnoha dalších použití polynukleotidů předkládaného vynálezu, dají se polynukleotidy použít jako hybridizační próba k identifikaci a izolaci genomické DNA kódující lidskou chitinázu. Dále poté k identifikaci a izolaci genů jiného než lidského původu kódující proteiny homologní k lidské chitináze, k identifikaci lidských proteinů a proteinů jiného původu než lidského, které jsou podobné lidské chitináze (včetně těch, které se pravděpodobně podílejí na remodelaci) a k identifikaci těch buněk, v kterých probíhá exprese lidské chitinázy a k identifikaci biologických podmínek za kterých je tento protein exprimován.

Z jiné stránky zahrnuje vynález biologické kopie (resp. kopie izolovaných sekvencí DNA vytvořené in vivo nebo in vitro) sekvencí DNA vynálezu. Dále jsou chráněny samostatně se replikující rekombinantní konstrukty jako jsou plasmidy nebo vektory z virové DNA inkorporující chitinázové polynukleotidy včetně některé z DNA popsaných výše. Předkládané vektory zahrnující expresní vektory ve kterých je inkorporovaná cDNA kódující chititinázu účinně spojena s endogení nebo heterológní kontrolní sekvencí exprese a transkripčním terminátorem. Takovéto expresní vektory mohou dále obsahovat sekvence DNA kódující polypeptidy operabilně spojené se sekvencemi DNA kódujícími chitinázu. Takovéto vektory mohou být

exprimovány a vytvořit tak fůzní proteiny obsahující polypeptid o který máme zájem.

Podle jiné stránky vynálezu jsou prokaryotické nebo eukaryotické hostitelské buňky stabilně tranformovány nebo transfikovány sekvencemi DNA popsanými ve vynálezu s cílem exprese chitinázových produktů v těchto buňkách. Hostitelské buňky exprimující chitinázové produkty mohou sloužit k rozličným užitečným účelům. Takovéto buňky vytvářejí hodnotný zdroj imunogenů pro vývoj protilátek specificky imunoreagujících s chitinázou. Hostitelské buňky popsané ve vynálezu jsou použitelné při metodách velkokapacitní produkce chitinázy, při které jsou buňky pěstovány ve vhodném živném médiu a požadované polypeptidické produkty jsou izolovány např. imunoafinitní purifikací z buněk nebo z média, v kterém jsou buňky pěstovány.

Chitinázové produkty mohou být získány izolacemi z přírodních buněčných zdrojů nebo mohou být chemicky syntetizovány. Jsou ale přednostně produkovány rekombinantními technikami zahrnujícími prokaryontní nebo eukaryontní hsotitelské buňky popsané v tomto vynálezu. Chitinázové produkty popsané v tomto vynálezu mohou být polypeptidy plné délky, jejich fragmenty či analoga, v tomto vynálezu jsou uvažovány chitinázové produkty mající celou nebo část aminokyselinové sekvence popsané v SEQ ID NO: 2 nebo v SEQ ID NO: 4. V SEQ ID NO: 14 je ukázán jeden fragment postrádající oproti finálnímu proteinu 72 aminokyselinových zbytků na C-konci. Bylo stanoveno, že těchto 72 aminokyselinových zbytků z C-konce není kritických pro chitinázovou enzymaticku aktivitu. Příklad 5 ilustruje produkci tohoto C-koncového fragmentu. Vnesení stop kodonu za kodon pro aminokyselinu 373 mělo za následek vznik rekombinantního chitinázového fragmentu o velikosti 39kDa, který si, v porovnání s rekombinantní lidskou chitinázou plné délky, podržel podobnou specifickou aktivitu.

Analoga mohou obsahovat chitinázová analoga, v kterých jsou jedna nebo více specifických (to znamená přírodně kódovaných) aminokyselin vyjmuty, nahrazeny nebo přidány jedna nebo více nespecifických aminokyselin a to: 1) bez ztráty jedné nebo více enzymatických aktivit nebo imunologických charakteristik specifických pro chitinázu, nebo 2) se specifickou ztrátou určité

biologické aktivity chitinázy. Příklad 3 ilustruje produkci takového analoga (SEQ ID NO: 15). V tomto analogu je prolin v pozici 370 nahrazen serinem a 72 aminokyselinových zbytků na C-konci je vyjmuto. Je též přepokládáno, že použití savčích hostitelských buněk zajistí postranslační modifikace (např.: myristolace, glykosylace, zkrácení, lipidace a fosforylace na tyrosinu, treoninu či šeřinu), které mohou být potřeba k dosažení optimální biologické aktivity rekombinantních expresních produktů popsaných v tomto vynálezu.

Proteiny nebo jiné molekuly, které se váží na chitinázu mohou být použity k modulaci její aktivity. Látkami obsaženými v tomto vynálezu jsou také protilátky, od nich odvozené látky (např. monoklonální a polyklonální protilátky, jednořetězcové protilátky, chimérické protilátky, CDR protilátky (CDR grafted) apod.) a další vazebné proteiny specifické pro chitinázu. Proteiny nebo další molekuly (např. malé molekuly), které se specificky váží na chitinázu mohou být identifikovány s použitím chitinázy izolované z plazmy, rekombinantní chitinázy, obměněných chitináz nebo s použitím buněk produkujících takové produkty. Vazebné proteiny jsou využitelné ke změnám aktivity chitinázy, jako látky v imunizačních směsích. S použitím známých imunologických postupů jsou tyto látky využitelné také k purifikaci chitinázy, k detekci a kvantifikaci chitinázy v tekutinách a vzorcích tkání.

Antiidiotypické protilátky proti protilátkám specifickým proti chitináze jsou ve vynálezu také uvažovány.

Vědecká hodnota informací přinesených v tomto vynálezu objevem aminokyselinové sekvence a sekvence DNA je zřejmá. Jeden z mnoha příkladů: znalost sekvence cDNA chitinázy umožňuje izolaci (hybridizaci DNA/DNA) sekvence genomické DNA kódující chitinázu a chitinázové expresní kontrolní a regulační sekvence jako jsou promotory, operátory apod.. DNA/DNA hybridizační postupy, prováděné se sekvencí DNA popsanou ve vynálezu za stringentních podmínek standardních v oboru, by měly taktéž umožnit izolaci DNA kódujících lidské alelické varianty chitináz a další strukturně příbuzné lidské proteiny sdílející jednu nebo více biochemických a (nebo) imunologických vlastností chitinázy. Dále by tyto postupy měly umožnit izolaci proteinů homologních s chitinázou z jiných druhů než z člověka. Informace o sekvenci DNA poskytované v tomto vynálezu • · • · · · · · *··· • · · · · * ···· • · · · · ···· · ··· ··· ······ · · ····· ·· · ·· ·· také umožňují vývoj (s použitím homologních rekombinaci nebo pomocí „knockout strategií (viz např. Kapecchi, Science 244: 1288-1292, 1989)) hlodavců, kteří nejsou schopni exprimovat funkční chitinázu, kteří overexprimuji chitinázu nebo kteří exprimují odlišnou variantu chitinázy. Vhodně označené polynukleotidy obsažené ve vynálezu lze použít k hybridizačnímu stanovení s cílem detekovat schopnost buněk syntetizovat chitinázu. Polynukleotidy obsažené ve vynálezu mohou být základem pro diagnostické metody použitelné k identifikaci genetických změn (genetické změny) v chitinázovém lokusu, které představují základ chorobného stavu či stavů. Díky vynálezu jsou také dostupné anti-sence polynukleotidy, které jsou důležité k regulaci exprese chitinázy buňkami, které ji obvykle exprimují.

Cílem vynálezu je aplikace chitinázových preparátů popsaných ve vynálezu savcům, zvláště pak lidem, s cílem zlepšení chrorobných stavů způsobených parazity, kteří obsahují chitin jako např. houbami a plísněmi. Fungální infekce (mykosy) např. candidiosa, aspergilosa, coccidioidomykosa, blastomykosa, paracoccodioidomykosa, histoplasmosa, cryptococcosa, chromoblastomykosa, sporottrichosa, mucormyosa a dermatofytosa se mohou manifestovat jako akutní či chronické. U imunokompromisních hostitelů způsobují patogení plísně vážné, často fatalní nemoci. Pacienti trpící rakovinou, pacienti, kteří byli ošetřováni chemoterapií, jedinci se sníženou imunitou, jedinci nakažení HIV snadno podléhají mykosam způsobeným plísněmi Candida, Aspergillus, Pneumocystis carinii a dalšími. Amphotericin B a fluconazol jsou užitečná terapeutika proti fungálním infekcím, toxicita těchto látek však způsobuje vážné nepříznivé vedlejší účinky, které limitují jejich použitelnost. Úmrtnost na systémovou candidiaosu je větší než 50% a to navzdory ošetření Amphotericinem B. Je proto potřeba látka potlačující růst hub a plísní in vivo. Takovýto produkt může být použit jako samotná látka nebo v kombinaci s současně schválenými konvenčními antifungicidními přípravky.

Protože rostoucí houby a plísně vyžadují k přežití syntézu chitinu, mohla by být inhibice této syntézy rekombinantni lidskou chitinázou použitelná k omezení a plísňových infekcí in vivo. Modely plísňových infekcí u zvířat jsou popsány dále v příkladech 8 až 14 a byly popsány v oboru.

• 444 • 4 4

Ve vynálezu jsou zvláště brány v úvahu chitinázové směsi pro použití v metodách ošetření savců náchylných k plísňovým infekcím nebo trpících plísňovými infekcemi. Tyto metody zahrnují aplikaci chitinázy savcům v množství dostatečném k podpoře endogení chitinázové aktivity. V úvahu je bráno, že chitináza může být aplikována s ostatními konvenčními antifungálními látkami včetně amphotericinu B a strukturně příbuzných látek nystatinem a imaricinem, 5-fluorocytosinem, azolovými deriváty jako jsou flukonazol, ketokonazol, clotrimazol, mikonazol, ekonazol, butokonazol, oxikonazol, sulkonazol, terkonazol, itrakonazol a tiokonazol, allylaminy-thiokarbamaty jako jsou tolnaftat, naftifin, terbinafin, dále griseofulvinem, ciclopiroxolaminem, haloproginem, undecylenovou kyselinou a benzoovou kyselinou (viz např. Goodman & Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9^th ed., McGrawHill, New York (1996)).

Chitinázy mohou zvýšit účinnost těchto konvenčních protiplísnových přípravků pravděpodooně tím, že jsou plísně po jejich použití citlivější na působení těchto konvenčních přípravků a to dokonce i v situacích, kde samotná chitináza nemá inhibiční účinnek na růst plísní. Snížením množství konvenčních protiplísňových látek potřebného k dosažení terapeutického účinku, mohou chitinázy dovolit používat tyto látky v méně toxických dávkách. Davies a Pope (Nátuře, 173: 235-236 (1978)) např. popisují, že aplikace mykoláz (enzymů, které degradují buněčnou stěnu hub) v kombinaci s běžně neúčinnými dávkami antifungálních látek myším infikovaných Aspergillus měla synergický účinek. Bylo pozorováno, že kombinace fungální chitinázy a laminarinázy byla ůčinější v napadání buněčných stěn hub než jednotlivé enzymy působící samostatně.

Ve vynálezu se tudíž uvažuje o použití chitinázy v přípravě léků s profylaktickým nebo terapeutickým účinkem proti fungálním infekcím a dále s použitím chitinázy v přípravě léků, které by byly podávány společně s jinými antifungálními látkami.

Terapeutickofarmaceutické složení, uvažované ve vynálezu zahrnuje chitinázu a fyziologicky vhodné rozpouštědlo či nosič a může také obsahovat jiné antifungální látky. Níže uváděné velikosti dávek by byly dostatečné k podpoře endogení chitinázové aktivity.

Pro obecné úvahy o dávkách viz. Remington: The Science and Practise ···♦ • · • · · · ·

of Pharmacy, 19^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). Dávky se budou pohybovat mezi cca 1 pg/kg do 100 mg/kg tělesné váhy a přednostně mezi cca 0,1 až 20 mg/kg tělesné dávky. Terapeutické složení popsané ve vynálezu může být aplikováno různými způsoby v závislosti na infekci, která je ošetřována, včetně aplikace, subkutánní, vnitrosvalové, intravenózní, intrapulmonární, transdermální, intratekálni, místně, ústně nebo čípkem.

Ve vynálezu se také uvažuje o tom, že overexprese chitinázy při Gaucherově nemoci nebo v místech zánětu (např. při revmatické artritidě) by mohla mít zhoubné vlivy na extracelulární matrix a u takovýchto nemocí mohou mít inhibitory chitinázové aktivity terapeutický účinek, např. snížením, přeměnou nebo zničenním extracelulární matrix.

cDNA lidské chitinázy, popisovaná ve vynálezu, byla izolována z cDNA knihovny makrofága. Je známo, že makrofágy hrají důležitou roli při revmatické artritidě (Feldman et al., Cell, 85:307-310 (1996)) a produkty makrofágů jako jsou TNF-oí mají za následek rozvoj nemoci. Protein s homologií k lidské chitináze - C-gp39 - byl detekován v synoviu a chrupavce pacientů s revmatickou artritidou. Zatímco přirozeným substrátem lidské chitinázy je prvděpodobně chitin z patogeních organizmů, může enzym vykazovat aktivitu také při použití endogenních makromolekul, které tvoří přirozený extracelulární matrix. Předpokládá se například, že hyaluronová kyselina, důležitá součást extracelulární matrix obsahuje jádro chitinových oligomerů (Semino et al., Proč.Nať 1 Acad. Sci, 93: 4548-4553 (1996); Varki, Proč.Nať 1 Acad. Sci, 93: 4523-4525 (1996)). Chitinázy mohou být proto zahrnuty v procesu degradace extracelulární matrix u nemocí jako je revmatická artritida. Role chitinázy může být stanovena měřením hladin chitináz a/nebo efektu aplikace chitináz či inhibice chitináz v synoviu izolovaného z artitických kloubů. Endogenní hladiny chitináz mohou být měřeny enzymatickým testem nebo pomocí protilátek. Viskozita sinovia může být měřena před a po ošetření chitinázou. Snížení viskozity ve spojení s chitinázou by odpovídalo teorii endogeního chitinázového substrátu. Modifikace chitinázové aktivity by mohla proto modulovat postup ničení kloubů během revmatické artritidy.

Ve vynálezu je také uvažováno o metodách plošného vyhledávání inhibitorů aktivity chitináz, které by mohly být použitelné způsobem, popsaným v předcházejím odstavci. Metoda pro plošné vyhledávání látek, které inhibují chitinázu je popsána například v WO 95/34678 publikovaném 21. prosince 1995.

Dále je ve vynálezu uvažováno o metodách měření endogeních hladin chitináz např. pro diagnostiku Gaucherovy choroby. Hollak et al. (J.Clin.Invest., 93:1288-1292 (1994)) ve své zprávě píše, že hladina chitinázy v plazmě je diagnostickým markérem Gaucherovy choroby. Předpokládá se, že se rekombinantní proteiny, tak jak jsou popsány v tomto vynálezu, využijí více než lidské preparáty, s kterými jsou spojeny problémy s výtěžností a kontaminací dalšími nečistotami či infekčními látkami.

Příklady provedení vynálezu

Další stránky a přednosti předkládaného vynálezu budou pochopeny po úvaze nad následujícími ilustrativními příklady.

Příklad 1 popisuje izolaci lidských klonů cDNA chitinázy z lidských makrofágových cDNA knihoven. Příklad 2 určuje způsob exprese chitinázových genů v různých lidských tkáních. Příklad 3 popisuje rekombinantní expresi lidských chitinázových genů v prokaryotických buňkách a purifikaci výsledného enzymu. Příklad 4 poskytuje postup rekombinantní produkce lidské chitinázy v kvasinkách. Příklad 5 popisuje rekombinantní expresi genu lidské chitinázy v savčích buňkách a purifikaci výsledného proteinu. Příklad 6 popisuje produkci polypeptidových analogů lidské chitinázy syntézou peptidů nebo metodami rekombinantní produkce. Příklad 7 poskytuje protokol pro přípravu monoklonálních protilátek, které specificky imunitně reagují s lidskou chitinázou. Příklad 8 popisuje test na měření katalycké aktivity chitinázy. Příklad 9 popisuje stanovení antifungální aktivity lidské chitinázy in vitro. Příklad 10 popisuje stanovení antifungální aktivity lidské chitinázy in vivo na myším modelu a příklady 11 až 14 popisují králičí modely invazivní aspergilózy, rozšířené kandiózy, Candida ophthalmitis a Candida endokarditis.

• ·*· • fl * fl • fl • · · flflfl • fl · • · ···· • fl flfl • flfl · • flfl · fl flflfl flflfl • · • fl flfl

Přikladl: Izolace klonů cDNA chitinázy cDNA knihovovna byla připravena z makrofágů odvozených z monocytů periférni krve podle postupu popsaného v práci Tjoelkera et al., Nátuře, 374: 549-552 (1995). Klony z knihovny byly náhodně vybrány a plasmidová DNA byla purifikována z individuálních klonů. Sekvence asi 300 až 500 bázi z konce DNA každého z klonů byla stanovena na automatickém sekvenátoru (Model 373, Applied

Biosystems, Foster City, CA) s použitím príméru JHSP6, který hybridizuje s plasmidovým vektorem pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA), který sousedí s klonovacím místem cDNA:

JHSP6 5'- GACACTATAGAATAGGGC - 3' (SEQ ID NO:5)

Nukleotidové a aminokyselinové sekvence (z nukleotidové odvozená) těchto klonů cDNA byly srovnány se sekvencemi v nukleotidových a peptidových sekvenčních databázích za účelem stanovení podobnosti se známými geny. Porovnání sekvencí bylo provedeno pomocí BLAST Network Service of the National Center for Biotechnology Information s použitím srovnávacího algorithmu publikovaného v Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Klon MO-911 vykazoval signifikantní homologii s několika různými sekvencemi, včetně prekurzoru sekrečního proteinu YM-1 myšího makrofága (Genbank accession no. M94584), proteinu lidské chrupavky gp-39 (Hakala et al . , viz výše), glykoproteinu vejcovodů ovcí, krav a lidí (DeSouza et al., viz výše) a chitináz z parazitů (Oncocerca, Genbank accession no. U14639), vos (Chelonus, Genbank accession no U10422), rostlin (Nicotiana, Genbank accession no. X77111) a bakterií (Serratia, Genbank accession no. Z36295). Nejvyžší pozorovaná homologie byla k savčím genům, kódujícím proteiny s chitinázovou homologii, ale bez demonstrované chitinázové aktivity. Další sekvenční analýza MO-911 ukázala, že obsahuje část kódující oblasti homologa lidské chitinázy.

Sekvence DNA klonu pMO-218 (vloženého 7. Června 1996 za podmínek „Budapest Treaty with the American Typ culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A. pod číslem (Accession No.) 98077) je ukázána v SEQ ID NO:1 a kódovaná aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ OD NO:2. MO-218 zřejmě zahrnoval celý kódující region cDNA lidské chitinázy (nukleotidy 2 až 1402 SEQ ID NO:1), který obsahuje pravděpodobnou signální *· « * • · · • · · « • · · · • ·· ·* ·· 99

9 9 Λ

9 9 9

999 999

9 9

99 99 sekvenci ο jednadvaceti aminokyselinách následovanou 445 kódovanými aminokyselinami (aminokyselinové zbytky 1 až 445 SEQ ID NO:2). Dvaadvacet aminokyselin následujících za pravděpodobnou signální sekvencí přesně odpovídá aminokoncové sekvenci purifikované chitotriosidázy popsané v práci Renkemy et al. (viz výše). Renkema et al. také popsal jednadvacetiaminokyselinovou sekvenci z tryptického fragmentu lidské chitotriosidázy, která přesně odpovídá zbytkům 157 až 177 MO-2118 (SEQ ID N0:2). Boot et al. (viz výše) popsal klonování cDNA lidské chitotriosidázy, která obsahuje kódující sekvence přesně identické se sekvencemi MO-218. Sekvence MO-218 se liší od sekvence Boota et al. dodatečnými čtrnácti nukleotidy na 5' konci a změnou nukeotidů na nukleotidu 330 v kódující oblasti.

Aby se potvrdilo, že MO-218 skutečně obsahuje celou kódující oblast cDNA byla připravena sonda P-l značená ³²P (TGGGATCATCAGCAGGACCATGAAACCTGCCCAGGCCACAGACCGCACCAT, SEQ ID NO: 6), která odpovídá doplňkovým nukleotidům 2 až 52 MO-218 (SEQ ID NO:1). Sonda P-l byla navržena tak, aby hybridizovala s klony, které jsou alespoň tak dlouhé jako 5' konec MO-218. Sonda byla hybridizována s částí (přibližně 30 000 klonů) cDNA knihovny lidských makrofágů popsanou dříve. Hybridizační podmínky byly následující: 40% formamid, hybridizační pufr (5x SSPE, lOx Denhardťs, 100 gg/ml denaturované spermové DNA z lososa a 2% SDS) při 42°C přes noc. Filtry byly promyty a tři klony, které hybridizovaly byly vybrány na sekvenční analýzu. Nejdelší klon byl označen pMO-13B (vložen 7. Června 1996 za podmínek „Budapest Treaty with the American Typ culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852,

U.S.A. pod číslem (Accession No.) 98078). Sekvence DNA pMO-13B je ukázána v SEQ ID NO: 3 a kódující aminokyselinová sekvence je ukázána v SEQ ID NO:4. Tento klon obsahuje 25 dodatečných nukleotidů na 5' konci ve srovnání s MO-218. Dále obsahuje MO-13B (SEQ ID NO: 3) jednu nukleotidovou substituci na nukleotidu 330 (což odpovídá nukleotidu 305 MO-218, SEQ ID NO:1), která mění kódovanou aminokyselinu na pozici 80 hotového proteinu z glycínu (v SEQ ID NO:2) na serin (SEQ ID NO:4).

• · · · • · · r · · · > · · · • · · · · · • · ·· ··

Příklad 2: Způsob exprese genu chitinázy v lidských tkáních

K identifikaci tkání, ve kterých je exprimována lidská chitináza byla provedena analýza pomocí nothern blotů. Hromadné nothern bloty lidských tkání (Clontech, Palo Alto, CA) byly hybridizovány s celou kódující oblastí MO-218 za standardních stringentních podmínek (podle laboratorního manuálu firmy Clontech). Největší hybridizace byla pozorována u plicní tkáně (+++) a vaječníků (+++), mnohem menší hybridizace (+) byla pozorována u tymusu a placenty. Velikost hybridizující mRNA byla 2kb pro plíce, vaječníky a tymus, což dobře odpovídá velikosti klonované cDNA (1,6 kb nebo 1,8 kb včetně polyA konce). Velikost hybridizované mRNA placenty byla značně menší - 1,3 kb. Chitinázová hybridizace nebyla pozorována u sleziny, prostaty, varlat, tenkého střeva, tračníku, periférních krevních leukocytů, srdce, mozku, jater, kosterních svalů, ledvin nebo pankreatu. Exprese chitinázy v plicích je v souladu s její ochranou rolí proti patogením organismům, které obsahují chitin, protože plíce představují hlavní cestu vstupu fungálních patogenů.

Příklad 3: Produkce rekombinantní lidské chitinázy v bakteriálních buňkách

Finální kódující oblast MO-218 byla naplánována pro expresi v E.coli jako analog zkrácený o C-konec. Pro vytvoření fragmentu DNA vhodného k expresi bylo použito PCR s použitím primeru odpovídajícího nukleotidům 65 až 88 MO-218 cDNA chitinázy, před kterým byl inicializační metioninový kodon a místo pro restrikční endonukleázu Xbal (5'- TACATCTAGAATTATGGCAAAACTGGTCTGCTACTTCACC-3', SEQ ID NO:7) a dále primer kódující nukleotidy 1163 až 1183 MO-218 následovaný stopkodonem a místem HindlII (5' AGATCTAACCTTAGGTGCCTGAAGACAAGTATGG-3', SEQ ID N0:8). Primer obsahuje dále v kódující sekvenci na místě nukleotidové báze 25 adenin, zatímco sekvence MO-218 obsahuje na odpovídající nukleotidové pozici guanin. Následkem toho obsahuje výsledná část DNA thymin místo cytosinu na pozici odpovídající nukleotidu 1172 sekvence MO-218 a kódovaná část chitinázy, ukázaná v SEQ ID NO:15, je také analog, který obsahuje serin v hotovém proteinu na pozici 370 místo prolinu kódovaného MO-218. Výsledný fragment DNA byl štěpen s pomocí Xbal a • · · ·

HindiII a klonován do plasmidu pAraBAD (který je také znám pod označením pAraCB).

Plasmid pAraCB byl připraven následovně: plasmid pUC19 byl modifikován tak, aby obsahoval arabinozový promotor a následně, aby obsahoval kódující sekvenci AKAP 79 . Arabinozový promotor (Wilcox et al., Gene, 34: 123-128 (1985), Wilcox et al., Gene, 18:157-163 (1982)) a gen araC byly amplifikovány pomocí PCR z arabinozového operonu BAD Salmonella ryphimurium jako část EcoRI/Xbal s primery araC-2 (SEQ ID NO:9) a arab-1 (SEQ ID NO:10):

AraC-2 TACAGAATTCTTATTCACATCCGGCCCTG SEQ ID NO:9

Arab-1 TACATCTAGACTCCATCCAGAAAAACAGGTATGG SEQ ID NO:10

Primer araC-2 kóduje místo EcoRI (podtrženo) a terminační kodon (kurzíva) pro produkt genu araC. Primer arab-1 kóduje pravděpodobně vazebnou doménu pro ribozomy (kurzíva) a restrikční místo Xbal (podtrženo). PCR s těmito primery produkuje 1,2 kb velký fragment, který byl štěpen EcoRI a Xbal a subklonován do pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) , který byl předtím štěpen stejnými dvěma enzymy. Výsledný plasmid byl označen araCB a obsahoval polylinkerový region (SEQ ID NO:11) obklopený na 5' konci restrikčním místem Xbal (podtrženo) a na 3' konci místem HindlII (kurzíva).

AraCB polylinker TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT SEQ ID NO: 11

Transformanti obsahující výsledný expresní plasmid (pAraMO218) byli indukováni arabinozou a pěstováni při 37°C. Tyto transformanti produkovali inkluzivní tělíska obsahující 39 kDa protein, který byl zkrácenou formou chitinázy (byla vyprojektována tak, aby obsahovala 373 namísto 445 aminokyselin). Tato část chitinázy obsahuje čtyři cysteinové zbytky, zatímco chitináza plné délky obsahuje deset cysteinových zbytků. Inkluzivní tělíska byla oddělena od kultury E.coli a podrobena SDS-PAGE elektroforéze. Proužek o velikosti 39 kDa byl přenesen na PVDF membránu a aminokyselinový konec byl sekvenován. Většina (okolo dvou třetin) vzorku obsahovala sekvenci odpovídající aminokyselinovému konci lidské chitinázy. Zbytek vzorku odpovídal kontaminujícímu proteinu E.coli - porinu. Rekombinantní • · · • · · · • · · · • · · ·· · • · ·· ·· příprava chitinázy z E coli byla použitená pro produkci polyklonálních a monoklonálních protilátek (popsáno níže v příkladu 7).

Jestliže byli transformanti obsahující Ara-chitinázový expresní plasmid pěstováni při 25°C, nebyly inkluzivní tělíska pozorovány a exprese rekombinantního produktu se snížila z asi deseti procent celkových buněčných proteinů na asi jedno procento. Tento materiál produkovaný při 25°C nicméně vykazoval katalytickou aktivitu chitinázy.

Příklad 4: Produkce rekombinantní lidské chitinázy v kvasinkách

Tento příklad obsahuje ukázkové postupy rekombinantní exprese lidské chitinázy v kvasinkách a purifikace výsledného rekombinantního proteinu. Kódující oblast lidské chitinázy je vnesena do vektorů pro expresi v Saccharomyces cerevisiae s použitím buď PCR nebo spojovacích oligonukleotidů (linker oligonucleotides). Vektory jsou navržené tak, že kódují fůzní polypeptid obsahující sekreci zprostředující sekvenci (secretion mediating leader) a kódující oblast lidské chitinázy odpovídající aminkyselinovému konci přirozené molekuly. Sekreční signální peptidy zahrnují např. SUC2 nebo ekvivalentní leadry s funkčními místy pro signální peptidázy nebo s pre-pro-alfa faktory nebo jinými komplexními leadry skládajícími se z pre nebo signálního peptidu a pro nebo spacer regionu, který nese místo pro štěpení KEX2. DNA, kódující signální sekvenci, může být získána buď syntézou oligonukleotidů nebo pomocí PCR. DNA, kódující pre-pro alfa faktor leadr, je získána pomocí PCR. Použité primery obsahují nukleotidy 1 až 20 genu alfa mating faktoru a dále nukleotidy komplementární k nukleotidům 255 až 235 tohoto genu (Kurjan and Herskowitz, Cell, 3:933-943 (1982)). Kódující sekvence pre-pro-alfa leadru a kódující sekvence lidské chitinázy jsou ligovány do plasmidu obsahující kvasinkový promotor alkoholdehydrogenázy (ADH2). Tímto způsobem řídí promotor expresi fúzního proteinu. Jak učil Rose a Broach (Meth. Enz., 185: 234-279, D.Goeddel, ed., Academie Press, lne., San Diego, CA (1990)), vektor dále zahrnuje dále od klonovacího místa trankripční terminátor ADH2, kvasinkový replikační počátek „2-mikron, selektovatelný markér např. TRPÍ, CUP1 nebo LEU2 (či LEU2-d) nebo jiný ekvivalentní gen.

• 9 : . : ::.:. . ··· ·« ·..’ : ··* ·

Dále vektor obsahuje kvasinkové geny REP1 a REP2, gen pro betalaktamázu E.coli a replikační počátek E.coli. Geny pro betalaktamázu a TRPÍ poskytují možnost selekce v bakteriích respektive v kvasinkách. Geny REP1 a REP2 kódují proteiny hrající roli při replikaci počtu kopií plasmidu.

Mohou být také zvoleny jiné fůzní body uvnitř kódující oblasti chitinázy. Může být použito krácení kódující sekvence za účelem zvýšení homogenity produktu, zvýšení specifické aktivity nebo změny substrátové speccificity.

DNA konstrukty popsané v předcházejícím paragrafu jsou transformovány do kvasinkových buněk s použitím známých metod, např. s použitím octanu litného (Stearns et al, Meth. Enz., viz výše, pp. 280-279) či jiných rovnocenných metod. ADH2 promotor je indukován vyčerpáním glukózy v růstovém mediu (Price et al., Gene, 55:287 (1987)). Pre-pro alfa sekvence či jiné leader sekvence ovlivňují sekreci fůzniho proteinu, uvolňování hotového peptidu lidské chitinázy z buněk. Signální peptidový leader je zpracován signální peptidázou nebo jako v případě pre-pro alfa vyjmutím příslušné oblasti KEX2 preoteázou (Bitter et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 81: 5330-5334 (1984)) .

Chitináza obsahuje ve své přirozené aminokyselinové sekvenci dvě dvojbázické sekvence v pozicích 107-108 (Lys-Arg) a 209-210 (Arg-Lys), které mohou být odříznuty proteázou KEX2 během sekrece.

Ke stabilizaci a (nebo) zvýšení hladiny produktu sekretovaného z buněk mohou být tyto sekvence mutovány tak, aby potenciální místa proteolýzy byla eliminována (jak ukázal Gillis et al., Behring Insst. Mitt., No.83:1-7, 1988). Chitináza může být také exprimována bez modifikací dvojbázických sekvencí, ale v hostitelských buňkách, které jsou KEX2 deficientní. Takovéto hostitelské buňky mohou být získány buď plošným vyhledáváním (screening) mutantů neobsahující KEX2 proteázu nebo manipulací s genomickým KEX2 lokusem pomocí genových metod nahrazujících či rozrušujících geny (gene replacement/gene disruption techniques (Orr-Weaver et al., Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 78: 6354-6358 (1981)).

Rekombinantní chitináza může být sekretována z Saccharomyces cerevisiae s použitím podobných vektorů obsahujících alternativní promotory PRB1, GAL4, TPI čí jiné vhodně silné promotory nesoucí fragmenty nebo promotory vytvořené fůzí s jednou z mnoha leader sekvencemi (Sleep et al., Bio/Technol., 8:42-46 (1990)). Další vhodní expresní hostitelé jsou vedle Saccharomyces cerevisiae také K1 uyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris a členové rodů Hansenula nebo Aspergillus. Analogické rekombinantní expresní systémy pro tyto kvasinky zahrnují organismus a jeho vhodný autonomě replikovaný vektor (např. Falcone et al., Plasmid, 15':248252 (1988)) nebo násobné integrované expresní kazety. Tyto systémy se také spoléhají na signální sekvence či leadery popsané výše zprostředkovávající sekreci do media.

Vyloučená rekombinantní lidská chitináza je purifikována z kvasinkového růstového média např. metodou použitou k purifikaci chitinázy z bakteriálních a savčích buněčných supernatantů (viz příklad 3 výše a příklad 5 níže).

Přirozená forma rekombinantní chitinázy může být také exprimována v cytoplasmě buněk saccharomyces cerevisiae nebo analogických hostů a purifikována ze zlyzovaných hostitelských buněk. Protein může být znovu sbalen během procesu purifikace za účelem dosažení vhodné výše specifické aktivity.

Příklad 5: Produkce rekombinantní lidské chitinázy v savčích buňkách

A. Exprese v COS buňkách

Byly izolovány klony MO-218 a MO-13B, které obsahovaly lidskou chitinázovou cDNA plné délky 3' až promotor CMV pRC/CMV. Třetí plasmid, který odpovídá stejnému C-koncovému fragmentu exprimovanému v bakteriálních buňkách v příkladu 3 (viz výše) byl připraven následovně: plasmid MO-218 byl amplifikován technikou PCR s použitím oligonukleotidového primeru 218-1 (CGCAAGCTTGAGAGCTCCGTTCCGCCACATGGTGCGGTCTGTGGCCTGGG, SEQ ID NO: 12), který obsahoval místo pro Hind III a nukleotidy 2 až 23 MO-218 chitinázové cDNA SEQ ID NO:1. Dále byl použit komplementární primer T-END (GACTCTAGACTAGGTGCCTGAAGGCAAGTATG, SEQ ID NO:13), který obsahoval nukleotidy 1164 až 1183 MO-218, stop kodon a místo Xbal. Amplifikovaná DNA byla purifikována elektroforeticky, rozštěpena Xbal a HindlII a klonována do vektoru pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA), který byl taktéž předem rozštípán stejnými restrikčními • · · · enzymy. Spojky (junctions) výsledného klonu byly sekvenovány s použitím přístroje Model 373 (Applied Biosystems, Foster City,

CA). Výsledná sekvence předpokládaného proteinu, tak jak byl sestrojen je ukázána v SEQ ID NO:14.

Všechny tři plasmidy byly transfikovány do buněk COS metodou DEAE transfekce (viz Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Po třech dnech při 37°C byla buněčná média testována na chitinázovou aktivitu in vitro jak je popsáno níže v příkladu 8. Každá z kultur produkovala významné množství chitinázové aktivity (600-800mU/ml/min) a podobné množství bylo pozorováno pro každý konstrukt.

Rekombinantní lidská chitináza byla purifikována následovně: pět dní po transfekcí COS buněk plasmidem pRc/CMV-M0-13B byla obohacená média z kultur sebrána a naředěna stejným objemem vody. Takto naředěná média byla aplikována na kolonu Q-Sepharosy Fast Flow (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), která byla ekvilibrována v 25 mM Tris, 10 mM chloridu sodném, 1 mM EDTA při pH 8,0. Přibližně 95% chitinázové aktivity prošlo skrze kolonu a nenavázalo se na nosič. Frakce, která prošla přes Q-Sepharosu byla upravena tak, aby koncentrace síranu amonného byla 1,2 M. Tato frakce byla poté nanesena na kolonu Butyl-Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia), která byla ekvilibrována v roztoku obsahujícím 25 mM Tris, 1,2 M síran amonný, 1 mM EDTA při pH 8,0. Protein byl eluován pomocí obráceného gradientu síranu amonného v rozmezí koncentrací od 1,2 M do 0 M v roztoku 25 mM Trisu při pH 8,0. Při nízké koncentraci solí byl eluován jeden absorbční vrchol při 280 nm odpovídající chitinázové aktivitě. Pomocí SDS-PAGE bylo stanoveno, že čistota frakce tomuto vrcholu odpovídající byla více než 85% a obsahovala přibližně 60% chitinázové aktivity. Poté byl vyměněn pufr na 20 mM Tris, 150 mM chlorid sodný, pH 8,0. Protein byl dále zkoncentrován s použitím membrány 10 000 MWCO (Ultrafree 10K, Millipore Corp., Bedford, MA). Výsledný preparát byl poté testován na enzymatickou a antifungální aktivitu in vitro tak, jak je popsáno v příkladech 8 a 9 (viz níže). Rekombinantní preparát měl chitotriosidázovou aktivitu (90 nm/min na mg proteinů).

• · » * ^w • .. · • · 9 9 9999 9 99« «99

B. Exprese v buňkách CHO

Gen chitinázy byl vnesen do pDEFl (konstrukce pDEFl je popsána v příkladu 4 U.S.Appliction Seriál No. 08/847,218 filed May 1/1997; zde je zahrnut odkazem) vyjmutím 1,77 kb HindlII/Xbal fragmentu obsahujícího gen chitinázy plné délky z pRc/CMV/MO-13B a ligaci tohoto fragmentu s pDEFl štěpeným pomocí HindlII/Xbal. Tímto způsobem vznikl plasmid pDEFl/CTN.l. 1,77 kb HindlII/Xbal fragment obsahující gen pro chitinázu byl také ligován do pHDEFl štěpeným pomocí HindlII/Xbal. Takto vznikl plasmid pHDEFl/CTN.1. Plasmid pHDEFl je stejný jako pDEFl až na dva rozdíly: 1) v pHDEFl je 19 párů bází (fragment Pmel/SalL) pDEFl nahrazeno 2kb fragmentem Ehel/SalL odvozeným z pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad) a obsahujícím hydromycin rezistentní gen 2) 212 párů bází dlouhý fragment Nhel/Asp718 nacházející se v pDEFl je v pHDEFl nahrazen 120 bp fragmentem Nhel/Asp718 obsahujícím zkrácený promotor SV40, který kontroluje expresi genu pro dihydrofolátreduktázu (DHFR). Tento 120 bp fragment Nhel/Asp718 byl připraven následujícím postupem: nejdříve byl 171 bp fragment amplifikován pomocí PCR. Jako primery byly použity oligonukleotidový primer 94-26 (5'TGATACGGTACCGCCCCATGGCTGACTA - 3', SEQ ID NO:16), který obsahoval nové místo pro Asp718 a primer 94-27 (5' - GCAAGTTTGGCGCGAAATCG 3' , SEQ ID NO:17). Jako templát byla použita DNA z pDCl (popsán v příkladu 4 U.S. Application Seriál NO. 08/847,218 filed May 1, 1997), která nesla kazetu SV40-DHFR. Nakonec byl tento 171 bp PCR fragment štěpen pomocí Nhel a Asp718.

DHFR negativní linie DG44 buněk CHO (Chinese hamster ovary, ovarium čínského křečka) byla transfikována plasmidem pDEFl/CTN.l tak jak je to popsáno v příkladu 5 U.S. Application Seriál No. 08/847,218 filed May 1, 1997. Buněčná linie CHO DG44 byla také transfikována plasmidem pHDEFl/CTN.1. Po transfekci následovala selekce následným modifikovaným postupem. Nejdříve byly buňky selektovány pouze na rezistenci k hygromycinu v mediích (DMEM/F-12 doplněné 2-10% dialyzovaného FBS) obsahujících hygromycin (800mg/litr) (Calbiochem, San Diego), hypoxantin a tymidin (média pro přítomnost těchto látek nebyla selektivní pro gen DHFR). Po selekci tranfikovaných buněk, které byly rezistentní k hygromycinu, byly buňky dále selektovány na expresi genu DHFR jejich pěstováním • · · · v médiích postrádajících hypoxantin a tymidin. Dalším krokem byla selkce DHFR pozitivních a hygromycin rezistentních CHO buněk v médiu obsahujícím napřed lOnM, poté 20nM a nakonec 50nM metotrexatu, výsledkem čehož byly buňky exprimující vysoké hladiny chitinázy.

Overexprimovaná rekombinantní lidská chitináza (rH-chitináza) byla ze supernatantu pHDEFl/CTN.l transfikovaných CHO buněk purifikována následujícím způsobem: supernatant byl před použitím iontoměničové chromatografie zředěn 1:3 pufrem A (20mM Tris, pH 7.0). Aniont - iontoměničová kolona naplněná nosičem Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech lne., Piscataway, NJ) byla ekvilibrována pufrem A a supernatant na ni byl nanesen v množství 151 na 11 nosiče. rH - chitináza, která se nacházela ve frakci prošlé přes kolonu Q-Sepharosy, byla před rozdělením kationt iontoměničovou chromatografií upravena tak, aby obsahovala 5% polyetylenglykolu (PEG) 400 (Mallinckordt Baker, lne., Phillipsburg, NJ) a 30 mM octan sodný při pH 4,3. Kationt - iontoměničová kolona naplněná CM-Sepharosou Fast Flow (Pharmacia Biotech lne., Pisscataway, NJ) byla ekvilibrována 30 mM octanem sodným, 5%

PEG 400, pH 4,3 (pufr B). Vzorek rH - chitinázy byl nanesen na kolonu CM sepharosy v množství 1 mg na ml iontoměniče. rH chitináza byla eluována z kolony pufrem C (40mM Tris, 5% PEG 400, pH 7,5). Vzorek rH - chitinázy byl dále připraven na rozdělení chromatografií využívající hydrofóbní interakce přídavkem (NH₄)₂SO₄tak, aby výsledná koncentrace byla 1,5M. Kolona naplněná Macro-Prep Methyl HIC Support (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) byla ekvilibrována pufrem D (20 mM Tris, 5% PEG 400, pH 7) obsahujícím

1,5 M (NH₄)₂SO₄. Vzorek obsahující rH - chitinázu byl nanesen na kolonu Macro-Prep Methyl v množství 1 mg na 1 ml nosiče. Kolona byla promyta pufrem D obsahujícím 1,1 M (NH₄)₂SO₄a rH - chitináza byla eluována pufrem D obsahujícím 0,2 M (NH₄)₂SO₄. Purifikovaný protein byl přenesen membránovou filtrací do pufru E (150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,0).

Příklad 6

Produkce analogů a fragmentů lidské chitinázy

Rekombinantní techniky jako jsou ty, které byly popsány v předcházejících příkladech mohou být využity k přípravě

polypeptidových analogů nebo fragmentů lidské chitinázy. Přesněji to znamená, že polynukleotidy kódující lidskou chitinázu jsou modifikovány tak, aby s použitím dobře známých technik (jako například místně řízená mutageneze nebo polymerázová řetězová reakce), kódovaly užitečná polypeptidová analoga. C-koncové a Nkoncové delece mohou být také připraveny například vypuštěním příslušné části polynukleotidové kódující sekvence (obecně viz Sambrook (viz výše), kapitola 15). Modifikované polynukleotidy jsou exprimovány rekombinantně a rekombinantní polypeptidová analoga nebo fragmenty jsou purifikovány tak jak je posáno v předcházející příkladech.

Aminokyselinové zbytky kritické pro aktivitu lidské chitinázy byly identifikovány například sledováním homologií k dalším chitinázám a nahrazením alaninů v nativní lidské chitináze. Cysteiny jsou často kritické pro funkční integritu proteinů, protože mají schopnost tvořit disulfidické můstky a fixovat tak sekundárnní strukturu. K objasnění otázky zdali je jakýkoliv z cysteinů v lidské chitináze kritický pro její enzymatickou aktivitu, byl každý cystein mutován individuálně na serin.

Byl připraven na C-konci zkrácený fragment proteinu lidské chitinázy o velikosti 39 kDa, jak je popsáno výše v příkladech 3 a 5, vnesením stop kodonu za kodon pro aminokyselinu 373. Tento 39 kDa fragment postrádá dvaasedmdesát aminokyselinových zbytků na C-konci finálního proteinu, včetně šesti cysteinů. Tento protein si nicméně ponechal podobnou specifickou enzymatickou aktivitu v porovnání s rekombinantní lidskou chitinázou celkové délky. Tento výsledek naznačuje, že scházejících dvaasedmdesát C-koncových zbytků, včetně výše uvedených šesti cysteinů, není nezbytných pro enzymatickou aktivitu.

Další C-koncové delece mohou být připraveny například odštěpením 3' konce zkrácené kódující sekvence popsané v příkladu 3 exonukleázou III působící po různě dlouhou dobu a poté ligaci zkrácené kódující sekvence do DNA plasmidu kódujícího stop kodony ve všech třech čtecích rámcích. N-koncové delece jsou připraveny podobným způsobem odštěpením 5' konce kódující sekvence a poté ligaci odštěpeného fragmentu do plasmidu obsahujícího sekvenci promotoru a počáteční metionin bezprostředně navazující na místo

4444 • · 4 4 4« : .: .

.:.·..· ·..· : ··* ·· promotoru. Tato N koncová deleční analoga nebo fragmenty mohou být také exprimovány jako fůzní proteiny.

Vedle toho lze polypeptidová analoga lidské chitinázy připravit částečnou nebo úplnou chemickou syntézou peptidů s použitím technik známých v oboru (viz například syntéza IL-8 v Clark-Lewis et al., J.Biol Chem, 266:23128-23134 (1991), syntéza IL-3 v Clark-Lewis et al, Science, 231:134-139 (1986) a syntéza ligací v Dawson et al., Science, 266:776-779 (1994). Takovéto syntetické metody také dovolují selektivní vnášení nových nepřirozených aminokyselin a další chemické modifikace.

Biologické aktivity, zahrnující enzymatické, antifungální a aktivity remodelující extracelulární matrix polypeptidových analogů lidské chitinázy jsou stanoveny technikami uznávanými v oboru jako například technikou popsanou v příkladech 8 až 14

Příklad 7

Příprava monoklonálních protilátek proti lidské chitináze

Monoklonální protilátky proti lidské chitináze mohou být připraveny dvěma následujícími postupy (opakovanou nebo jednorázovou inokulací). Při prvním postupu je myši opakovaně injikována rekombinantní lidská chitináza (např. 10-20 pg emulgované v kompletním Freundovu adjuvans) získaná jak bylo popsáno v příkladech 3 až 6. Před fůzí je myši podána poslední dávka lidské chitinázy v PBS a po čtyřech dnech je myš usmrcena a její slezina vyjmuta. Ze sleziny umístěné v 10 ml média RPMI 1640 bez séra je připravena jedna buněčná suspense rozmělněním sleziny mezi konci dvou podložních mikroskopických skel ponořenými v RPMI 1640 médiu bez séra obsahujícím 2 mM L-glutaminu, 1 mM pyruvat sodný,

100 jednotek/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu (Gibco,

Kanada). Suspense buněk je filtrována přes sterilní sítko (70-mesh, Nitex, Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) a dvakrát promyta centrifugací při 200g po dobu 5 minut a resuspendováním peletu v 20 ml RPMI bez séra. Splenocyty ze tří nativních Balb/c myší jsou připraveny obdobným způsobem a použity jako kontrola. Myelomové buňky NS-1 jsou tři dny před fůzí pěstovány v log fázi v RPMI médiu s 11 % fetálního hovězího séra (FBS) (Hyclone Laboratories, lne., • · · · ·* · · · · · · · · · φ ··· <····· · · · ·· · • · · · · · ·*· ·· ·· · ·· ··

Logan,Utah), centrifugovány při 200g po dobu 5 minut a pelet dvakrát promyt, jak bylo popsáno v předchozím odstavci.

x 10⁸ slezinných buněk je smícháno s 2,0 x 10⁷ NS-1 buněk, suspense je centrifugována a supernatant odsát. Pelet buněk je uvolněn poklepáváním zkumavky, přidán 1 ml PEG 1500 o teplotě 37°C (50 % v 75 ml Hepesu, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) a suspense míchána po dobu jedné minuty, poté je během dalších 7 minut přidáno 7 ml RPMI bez séra. Po přidání dalších 8 ml RPMI média jsou buňky 10 minut centrifugovány při 200g. Supernatant je odstraněn a pelet resuspendován ve 200 ml RPMI obsahujícího 15 % FBS, 100 μΜ hypoxanthin sodný, 0,4 μΜ aminopterin, 16 μΜ tymidin (HAT) (Gibco), jednotek/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10⁶ splenocytů/ml, suspense je rozdělena do deseti 96-ti jamkových kultivačních desek s rovným dnem (Corning, Corning New York).

100 μΐ média v jamkách desek pro fúzování je druhý, čtvrtý a šestý den po fůzi nahrazeno čerstvým médiem. Vazba myšího IgG k lidské chitináze je hodnocena osmý den následujícím způsobem pomocí ELISA. Desky Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA) jsou 2 hodiny při 37 °C potahovány lidskou chitinázou zředěnou 25 mM Tris, pH 7,5 v koncentraci 100 ng/jamku. Potahovací roztok je odsát a nahrazen blokovacím roztokem v objemu 200 μΐ/jamku [0,5 % želatina z rybí kůže (Sigma) zředěná CMF-PBS] a desky jsou inkubovány 30 minut při 37°C, třikrát promyty PBS s 0,05 % Tween 20 (PBST).

Poté je naneseno 50 μΐ supernatantu z kultur. Po 30 minutové inkubaci při 37°C a promytí jak bylo popsáno výše, je naneseno 50 μΐ konjugátu křenové peroxidázy s kozími antimyšími IgG (fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zředěného v poměru 1:3500 v PBST. Desky jsou inkubovány jak bylo výše popsáno, čtyřikrát promyty PBST a poté je přidáno 100 μΐ substrátu obsahujícího 1 mg ofenyldiaminu (o-phenylene diamine) (Sigma) a 0,1 μΐ/ml 30 % H₂O₂ v 100 mM citrátu, pH 4,5. Barevná reakce je po 5 minutách zastavena přidáním 50 μΐ 15 % H₂SO₄. Absorbance je měřena při 490 nm speciálním spektrofotometrem na čtení mikrotitračních destiček (plate reader) (Dynatech). Vybrané fůzní jamky (fusion wells) jsou dvakrát klonovány rozředěním do 96-ti jamkových desek a po pěti dnech vizuálně vyhodnoceny na základě počtu kolonií na jamku.

a · • · • «

·· ·** • · · · • · · ·

999 999

9

99

U monoklonálních protilátek produkovaných hybridomy jsou určeny izotypy pomocí Isostrip systému (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) .

Druhý možný postup využívající imunizaci jednorázovou injekcí do sleziny může být prováděn podle Spitze (Methods Enzymol., 121: 33-41 (1986)). Slezina zvířete je obnažena a do ní je injikována rekombinantní lidská chitináza (např. 10-20 pg v PBS v koncentraci kolem 0.02 - 0.04 % s adjuvans s obsahem oxidu hlinitého či bez něj) získaná jak bylo popsáno v příkladech 3 až 6. Poté je slezina vrácena do peritoneální dutiny a zvíře uzavřeno zašitím. Po třech dnech je myš usmrcena, slezina vyjmuta a připravena suspense slezinných buněk. Suspense je dvakrát promyta RPMI 1640 s přídavkem 3 % fetálního telecího séra (FCS) a resuspendována v 25 ml stejného média. Myelomové buňky (NS-O) jsou odebírány v době logaritmické růstové fáze, jednou promyty a přidány k suspensi slezinných buněk v 50-ti ml zkumavce v poměru 3:1 nebo 2:1 (slezinné buňky : myelomové buňky). Směs je peletována přibližně při 450 g (1500 rpm) , supernatant odsát a pelet uvolněn poklepáváním zkumavky. Fůze je prováděna 1 minutu při pokojové teplotě za stálého míchání přidáním 1 ml polyetylenglykolu (PEG) 1500. Směs je inkubována další minutu, poté je během jedné minuty přidán 1 ml RPMI o teplotě 30 - 37 °C, dalších 5 ml RPMI během tří minut a dalších 10 ml RPMI během dalších tří minut. Suspense buněk je centrifugugována a resuspendována přibližně ve 200 ml selekčního média HAT obsahujícího RPMI 1640 s 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 20 % FCS, 100 mM hypoxanthinu, 0,4 mM aminopterinu a 16 mM thymidinu. Buněčná suspense je rozdělena na 1 ml objemy do kultivačních desek a inkubována při 37 °C ve vlhké atmosféře: 5 % CO₂ - 95 % vzduchu, po dobu 8-10 dní. Supernatanty jsou odsávány a do jamek k buňkám doplňován 1 ml média HAT každé 2 až 3 dny podle růstu buněk. Supernatanty ze souběžných jamek jsou testovány na specifické protilátky a pozitivní jamky dále klonovány.

Příklad 8

Katalytická aktivita rekombinantní chitinázy

Chitotriosidázová (chitinázová) aktivita byla měřena pomocí fluorescenčního substrátu 4-methylumbelliferyl-p-D-N,W',N''25 • 4*4 • * 4···

4» • « • 4 4 « • 999 44« » · «

V ·« t· triacetylchitotriosa (4 MU - chitotrioside, Sigma Chemical, St. Luis, MO) v pufru podle Mcllvaina (Hollak et al., viz výše). 10 μΐ vzorky rekombinantního produktu byly smíchány s 10 μΐ hovězího sérumalbumínu (10 mg/ml), 15 μΐ fluorescenčního substrátu (2,71 mM) a 65 μΐ pufru (0,1 M kyselina citrónová, 0,2 M fosforečnan sodný, pH 5,2) v celkovém objemu 100 μΐ. Reakce probíhala 15 min při 37°C a byla poté zastavena přidáním 2 ml 0,3 M glycin/NaOH pufru (pH 10,6). Fluorescenční štěpný produkt 4-metylumbelliferon byl monitorován fluorimetrem (SLM-AMINCO Instruments, lne., Rochester, NY) při 450 nm. Pro získání standardní křivky bylo potřebné smíchat několik koncentrací substrátu s přebytkem bakteriální chitinázy tak, aby bylo zajištěno úplné rozštěpení substrátu. Známé množství 4-MU pak bylo korelačně vztaženo k fluorescenčnímu signálu naměřenému fluorimetrem a pomocí lineární regrese byla sestavena standardní křivka. Signál produkovaný zředěnou rekombinantní chitinázou byl poté použit k interpolaci nm množství substrátu rozštěpeného enzymem v průběhu reakce. Tato hodnota pak byla vydělena koncentrací proteinů, aby se získal poměr nm/min na mg proteinů (stanoven pomocí A₂8o a vypočteného molárního extinkčního koeficientu).

Rekombinantní lidská chitináza, produkovaná COS buňkami (tak jak je popsáno v příkladu 5A) vykazovala chitotriosidázovou aktivitu 90 nm/min na mg proteinů.

Příklad 9

Anitifungální aktivita rekombinantní chitinázy in vitro

Inhibiční působení rekombinantní lidské chitinázy na růst plísní a hub in vitro byl testován v předběžném pokusu. Dvě houby: Candida albicans a Aspergillus fumigatis jsou závažnými patogeny pacientů s poruchami imunity. Candida a Aspergillus byly pěstovány v RPMI růstovém médiu při 37°C do vzniku přibližně 10 000 - 50 000 jednotek kolonií (CFU - colony forming units) na ml.

Rekombinantní lidská chitináza (produkovaná COS buňkami, jak je popsáno v příkladu 5A) byla přidána ke kulturám v koncentracích 0; 2,8; 11,25; nebo 45 μg/ml. Růst hub byl hodnocen za 24 hodin podle zakalení kultur. Při tomto postupu a za těchto nefyzíologických podmínek rostly všechny kultury srovnatelnou rychlostí nezávisle na koncentraci chitinázy. Koncentrace testovaných hub však byla mnohem • · · • · · · · • · · · · · • · · ·· · vyšší, než zátěž během houbové infekce in vivo. V odlišných podmínkách mohou být získány odlišné výsledky, např. při nižším obsahu houby nebo při testování lidské chitinázy v kombinaci s jinými antifungálními prostředky. Lze očekávat, že chitináza je za fyziologických podmínek in vivo účinnější.

V dalších pokusech byla antifungální aktivita rekombinantni lidské chitinázy (získané v COS buňkách, jak je popsáno v příkladu 5A) hodnocena pomocí difúzního testu v agaru, v tekutém živném médiu podle Národní komise pro klinické laboratorní standardy (National Commitee on Clinical Laboratory Standards) a testem inhibice buněčných stěn podle Selitrennikoffa, Antimicrob. Agents Chemother., 23: 757-765 (1983).

V difúzním agarovém testu bylo přibližně lxlO⁶ buněk/ml Candida albícans (ATCC no. 90028) inokulováno do 1,5 % agaru (RPMI 1640 médium pufrováno 2-(N-morpholino)propansulfonic acid (MOPS), pH 7,0). Disk obsahující 50 μg vzorku (A: rekombinantni lidská chitináza, B: kontrola - pufr, C: kontrola - protein, D: bakteriální lyzát s chitinázovou aktivitou nebo známá antifungální látka) byl položen na agar a byla měřena zóna inhibice růstu. Výsledky jsou vyjádřeny v následující v tabulce 1.

• · · • · ·» • · · · · · 1111 1 1111 1111 1 111 111 111111 1 · ····· 1· · ·v ··

Tabulka 1

vzorek³ (50 pg/disk)	Candida albicans růst^b	Aspergilus fumigatus růst
A: rH-chitináza	+	+
B: kontrola - pufr	+	+
C: kontrola - protein	+	+
D: Bakteriální lyzát s chitinázovou aktivitou	+	+^c
amphotericin B (400 ng/disk)	-	-

^aVzorky: A- rH chitináza připravená z COS buněk podle příkladu 5A ve 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20mM Tris, pH 7,5; B - pufr (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 7,5); C - inaktivní protein PAF - AH (zředěný ze zásobního roztoku 2mg/ml); D - lyzát ze Serratia marcescens (SIGMA #C-7809) s chitinázovou aktivitou.

^bHodnocení růstu; (+) - normální růst, žádná inhibice růstu nebyla pozorována; (-) - inhibice růstu houby, inhibiční zóna pozorována.

^cVzorek D stimuloval růst Aspergillus fumigatus.

Při zkoušce v tekutém médiu byl 50 gg/ml vzorek (A: rekombinantni lidská chitináza, B: kontrola - pufr, C: kontrola protein, D: bakteriální lyzát s chitinázovou aktivitou nebo známá antifungální látka) přidán s testovanou houbou o určité koncentraci do RPMI 1640 média pufrovaného MOPS, pH 7,0. Vzorky byly inkubovány při 35°C a třepání při 120 rpm po dobu 48 hodin, poté byl hodnocen růst podle zakalení suspense. Přibližné koncentrace hub byly následující; 2,5x 10⁴ buněk/ml u Candida albicans (ATCC no. 90028);

x 10⁴ buněk/ml Candida albicans - polyen rezistentní (ATCC no. 38247); 1 x 10⁴ buněk/ml Aspergillus fumigatus (ATCC no. 16424);

x 10⁴ buněk/ml Neurospora crassa (ATCC no. 18889); a 1 x 10⁴

4 4 4 4 buněk/ml Saccharomyces cerevisiae (ATCC no. 26108). Výsledky jsou prezentovány v následující tabulce 2.

I « · · · ♦ • · · · » » · · ···· · ··· ··· • * · · · · · • ·· ·» · «· ··

Tabulka

Saccharomyces cerevisiae růst	CM	CM			r—1 Č CD Zt 1—1	1— β Ol zt	0.125 gg/ml	z
Neurospora crassa růst					1—i ε Cp 3. LD O	1—1 S \ tn Zt 00	r—1 s θ' zt •šT kO Λ	z
Aspergillus fumigatus růst	ΓΌ	KT			1 ε Oi 3. CM	z	i^-1 Č \ θ' zi. ko r—i	0.5 pg/ml
C. albicans polyen rezistentní růst	CM	CsJ	co		1—1 £ o> zt kO t—1 Λ	r—1 a θ' =t <0 Γ^-1	0.06 pg/ml	1—1 ε Oi 3. CM
Candida albicans růst	Os]	CM			Γ—1 X θ' 3. ID O	r—1 £i θ' 3. iO O	1—\| ε Oi 3. CM	Z
Vzorek (50 gg/ml)	A: rH- chitináza	B: kontrola - pufr	C: kontrola - protein	D: bakteriální lyzát s chitinázovou aktivitou	CQ 3 G •H o -H Cl Φ 4-1 0 X! Φ 0 0 Ch 0 l-l	3 Γ—1 0 N cd c O -hí 3 «-1 Ό O m O M	3 G •H tn O 4-1 >1 O 0 Cl 0 3 r—1 ΨΜ 1 lO 0 iT> O M	3 r—1 O N co G 0 o •H ε o in u w

O

CM ι-H u

Íú

Z o

lD <D >

LT)

O

Ό fO r—1

Λ!

\rd >μ

Ch

O t—1

P

O

Ch

Λ!

>0)

G

Λ co o

U

N '03

G

Φ >

(ti μ

Ch •rd >M cu íú

N 'ftf •rd +J •H x:

υ

BC

Cl >Ί

Cl

O

N >

n>

O > 3

w	O	-P
	N		CO
	'3		-3
1	G		μ
	Ή
IC\|	4-1		ο'Ρ
	•H
Ch	X!		LO
	υ		CM
G
•H	CO		Ή
Φ			O
4->	---		Ή
O	σι		•o
Cl	o		cti
Ch	03		P
	[~~		Ή
Ή	1		>
C	o		O
>	=B=		Ch
•H			P
•P			O

fú	0		4-1
£	l-l		co
•H	ca		•3
1			μ
1	co		l
O	G
	Φ		τ—1
«S	O
	co
iT)	Φ		>1
	O		p
Γ-	μ		3
	3		0
K	ε		p
Λ			4-1
	H		co
w	4J		»3
•H	<d		μ
P	Cl
	Cl		'í>1
	CD		c
2	ca		P
S			'3
	φ		>N
O	N
CN	4J		1
	>id		0
	N
Ε-»			..
Q	r—1
W			Φ
	1		μ
2			Ό
ě	Q		Λί
			co
3—1	• *.
			'Φ
v	r—I		>
I^-1	ε		0
u			4-1
rd	O>		CO
Z	ε		»3
	CM		μ
			·
s	3
	Λί		3
0	O		4-1
lO	4-1		CO
i—1	N		“3
	O		μ
	μ
P			Ή
	o		G
0	X3		Φ
0	Ή		O
	G		O
1	P		C
	O		P
m	co		O
	'fd		x:
	N
Lf)			'Φ
	Φ		>
	N	•	0
		3	P
		O	0
0	G	4-1	«
	>Φ	Ή	η
	P	>
cn	Φ	•H
Ή	>μ	4-1
P	N
		<d

kontroly, 2 - růst odpovídající 50 % růstu kontroly, 3 - růst odpovídající 75 % růstu kontroly, 4 - růst ekvivalentní růstu kontroly, 5 - růst větší než kontrola.

• · · · ·· ^cIC₉₀: nejnižší koncentrace při které ještě látka inhibuje růst organismu alespoň o 90 %, odpovídající přinejmenším růstovému skóre

0.

^dIC5₀: nejnižší koncentrace při které ještě látka inhibuje růst organismu alespoň o 50 %, odpovídající přinejmenším růstovému skóre .

os-1 test používající celých buněk, při kterém jsou identifikovány inhibitory biosyntézy buněčné stěny houby, byl proveden podle Selitrennikoffa, (viz výše), s použitím inokula z 1.5xlO^s protoplastů/ml uchycených v agaru (medium N podle Vogela, 7.5 % sorbitol, 1.5 % sacharosa, 10 pg/ml nikotinamid a 1 % agar) inkubovaného 72 h při 25°C. V kulturách byly sledovány změnu růstu a morfologie po umístění disků obsahujících 50 pg vzorku (A : rekombinantní lidská chitináza, B: kontrola - pufr, C: kontrola protein, D: bakteriální lyzát s chitinázovou aktivitou nebo známá antifungální látka) na agarové médium.

os-1 buňky jsou zmutovaným kmenem Neurospora crassa, který při inkubaci v určitých podmínkách při 37°C roste ve formě protoplastů bez buněčné stěny, ale regeneruje ji ve vhodných podmínkách při změně teploty na 22°C. Vzorky inhibující růst houby jsou považovány za inhibitory růstu hub a vzorky, které brání regeneraci buněčné stěny, ale nezabíjejí buňky, jsou považovány za specifické inhibitory buněčné stěny. Výsledky jsou prezentovány v následující tabulce 3.

• · · · · ·« · · · ·· ·· · ··· · · · · • · · · · ♦ ···· • · · · · ···· · ··· ··· ·#···<· · · • · · ·« ·· · « · · ·

Tabulka 3

Vzorek³ (50 gg/disk)	Růst buněk/ morfologie¹³	Regenerace buněčné stěny^c
A: rH - chitináza	+ protoplasty	10 mm“
B: kontrola - pufr	+ protoplasty	5 mm^d
C: kontrola - protein	+ hyfy	+
D: bakteriální lyzát	+	-
s chitinázovou aktivitou	protoplasty	7 mm“
nikkomycin Z (lpg/	+	-
disk)	protoplasty	30 mm“
amphotericin B (400	-	+
ng/ disk)	zbytky buněk	10 mm®

^aVzorky: A - rH-chitináza připravená z COS buněk podle příkladu 5A ve 150 mM NaCl, lmM EDTA, 20 mM Tris, pH 7,5; B - pufr (150 mM NaCl, lmM EDTA, 20 mM Tris, pH 7,5); C - inaktivní protein PAF-AH (zředěný ze zásobního roztoku 2 mg/ml); D - lyzát ze Serratia marcescens s chitinázovou aktivitou (SIGMA #C - 7809).

^bBodové hodnocení růstu (růstové skóre): (+) - normální růst, žádná inhibice růstu nebyla pozorována; (-) - inhibice růstu houby, inhibiční zóna pozorována.

^cBodové hodnocení regenerace buněčné stěny: (+) - normální regenerace buněčné stěny; (-) - inhibice regenerace buněčné stěny.

^rRadiální měření inhibované regenerace buněčné stěny ze středu disku.

®Radiální měření inhibovaného růstu ze středu disku.

Výsledky těchto testů prokázaly, že chitinázové vzorky specificky inhibovaly růst buněčné stěny v os-1 testech na celých buňkách a měly slabě antifungální efekt při testech v tekutém médiu.

9· * ·

Příklad 10

Fugicidní aktivita rekombinantní chitinázy in vivo v myších Farmakokinetiky rekombinantní lidské chitinázy v myších byly stanoveny následujícím způsobem. Samičím myším Balb/c starým 6-8 týdnů byla injikována rekombinantní lidská chitináza intravenózně do ocasní žíly v dávkách 0,5 mg/kg, 5,0 mg/kg a 50 mg/kg. Myši byly vykrveny 0,01, 0,25, 1, 8 a 24 hodin po injekci pro každou dávku (pro každý termín odběru a dávku byla použita dvě zvířata). Vzorky séra pak byly analyzovány na chitinázovou aktivitu a koncentraci. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 4.

Tabulka 4

Dávka	AUC	Vss	cL	MRT	Poločas	Cmax
(mg/kg)	(pg/ml/h)	(ml/kg)	(ml/h/kg)	(h)	(h)	(gg)
0,5	31,24	12,03	16,01	0,75	. 0,74	22,30
5, 0	278,50	13, 61	17,95	0,76	1,38	162,84
50,0	2505,83	52,92	19, 95	2,65	2,33	1179,19

AUC: plocha pod křivkou pro čas nekonečno (area under curve to time infinity)

Vss: distribuční objem v ustáleném stavu (steady statě volume of distribution) cL: odstraňování (clearance)

MRT: doba středního pobytu molekuly v celém těle (total body mean residence time)

Cmax: maximální koncentrace v séru

Pro testování účinnosti antifungálních látek bylo zavedeno několik živočišných modelů (viz Louie et al., Infect. Immun. 62: 2761-2772, 1994; Kinsman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 37: 1243-1246, 1993; Nakajima et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 39: 1517-1521, 1995; Tonetti et al., Eur. J. Immunol. 25: 1559-1565, 1995; Denning a Stevens, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 35: 1329-1333, 1991; viz též Stevens, J. Mycol. Med. 6 (suppl. I): 7-10, 1996). Hostitelská zvířata jsou infikována houbou a jejich přežití je měřeno při aplikaci různých dávek chitinázy v průběhu celého pokusu. V experimentech je ·· • · · · · ···· · «·· ··· ··»··· · · • · · ·· ·· · *4» · · chitináza použita buď jako jediný terapeutický prostředek nebo se použije v kombinaci s konvenční antifungální látkou jako je Amphotericin B a flukonazol, aby bylo možné zjistit, jestli chitináza nezvyšuje účinek této látky. Konkrétně u myší je akutní kandidóza vyvolána intraperitoneální nebo intravenózní aplikací 10x10® CFU Candida albicans. Terapeutická látka je podána předem nebo 1 až 5 hodin po inokulaci patogenem. Počet přeživších jedinců je stanoven po pěti dnech. Navíc je možné po usmrcení myši stanovit přítomnost houby v určitých orgánech jako je mozek, ledviny, plíce, játra a slezina. Jinou možností je aplikace nízkých dávek houby, např. Aspergillus (8-10 x 10⁶ CFU) nebo Candida (1 x 10⁶ CFU) a hodnocení přežití v delším časovém úseku, např. po 45 dnech. Dlouhodobou antifungální/fungistatickou aktivitu samotné chitinázy nebo její kombinace s jinými antifungálními léky je možno hodnotit, pokračuje-li se s terapií po dobu jednoho a více týdnů (např. 11 dní) a sledováním zvířat po několik týdnů, např. 18 dní až 1 měsíc. Účinná antifungální látka zvyšuje dlouhodobé přežívání zvířat a snižuje obsah houby v krvi a orgánech.

Příklad 11

Aktivita chitinázy in vivo na modelu invazivní aspergilózy u králíka

Účinnost chitinázy samotné či v kombinaci s jinou konvenční antifungální látkou byla sledována na imunosupresivním modelu invazivní aspergilózy u králíka, který je již přes deset let používán pro hodnocení různých antifungálních terapií. Viz např., Andriole et al., Clin. Infect. Dis. 14 (Suppl. 1): S134-S138 (1992). Studie byla provedena podle Pattersona et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37: 2307-2310 (1993) nebo George et al., J. Infect. Dis.

168: 692-698 (1993). První den je králíkům intravenózně podán cyklophosphamid (200 mg), za účelem vyvolání leukopenie, dále je po celou dobu experimentu denně aplikován subkutánně triamcinolon acetonid (10 mg). Druhý den, tj. 24 hodin po imunosupresi, je zvířatům intravenózně injikováno přibližně 10⁶ (letální napadení) nebo 10⁵ (subletální napadení) konidií A. fumigatus. Antifungální terapie (samotnou chitinázou nebo v kombinaci s jinou konvenční antifungální látkou, např. amphotericinem B, flukonazolem nebo 534 • » fluorocytosinem) je zahájena 24 hodin po injekci patogena nebo 48 hodin před ní (profylaxe) a pokračuje se s ní 5 až 6 dni nebo do smrti zvířete. Dávkování běžných antifungálních látek je např. 1,5 nebo 0,5 mg/kg/den intravenózně pro amphotericin B, 60 nebo 120 mg/kg/den orálně pro flukonazol a 100 mg/kg/den orálně pro 5fluorocytosin. Kontrolní králíci nejsou ošetřeni žádnou antifungální látkou.

Při pitvě jsou odebírány vzorky tkání pro kultivaci kultury houby a histopatologické vyšetření jater, sleziny, ledvin, plic a mozku. Mohou být také odebírány vzorky srdce, moči a krve.

V určitých intervalech jsou odebírány vzorky krve, ve kterých je stanovován počet bílých krvinek a cirkulující sacharidový antigen Aspergillus metodou ELISA. Účinnost ošetření testovanou látkou je hodnocena ze tří hledisek: snížení míry mortality, snížení počtu organismů Aspergillus kultivovaných z cílových orgánů (množství houby) a snížení hladiny cirkulujícího antigenu Aspergillus. Účinná antifungální látka snižuje mortalitu a množství houby.

Na tomto modelu je též možno hodnotit plicní aspergilózu podle Chilvers et al., Mycopathologia 108: 163-171 (1989), kdy jsou imunosupresivní králíci infikováni intratracheálně konidiemi Aspergillus fumigatus a v tekutině získané při následném bronchoalveolárním výplachu 1., 2., 4., 7. a 10. den po infekci je detekována houba, stanoven chitin, stanoven počet bílých krvinek a je proveden histopatologický rozbor pro zjištění rozsahu infekce plic. Účinné antifungální látky snižují rozsah infekce nebo omezují zánět plic.

Příklad 12

Aktivita chitinázy in vivo na modelu králíka s rozšířenou kandidózou

Účinek samotné chitinázy nebo její kombinace s jiným běžným antifungálním prostředkem je testován na modelu králíka s rozšířenou kandidózou podle Rouse et al., Antimicrob. Agents Chemother. 36: 5658 (1992). Bílí novozélandští králíci jsou systémově infikováni přibližně 3xl0⁶ blastosporami Candida albicans. Antifungální terapie je započata 48 hodin po napadení Candida (nebo profylakticky před ním) a pokračuje se s ní např. po dobu čtyř dnů. Přežívající zvířata

se usmrtí a množství houby je stanoveno na srdečních chlopních s připojenými zbytnělinami (aortic valve with attached vegetation), plicích, ledvinách a slezině. Stanoveni množství houby a histopatologická vyšetření mohou být prováděna na těchto i dalších orgánech jako jsou játra, mozek a srdce. Mohou být také provedeny odběry krve a moči. Hodnocen je účinek antifungální terapie na mortalitu, obsah cirkulující houby a její přítomnost ve tkáních (tissue fungal burden).

Králíci jsou inokulováni (Bayer et al., Antimicrob. Agents Chemother. 19: 179-184 (1981)) intraperitoneálně přibližně 5 x 10⁸CFU Candida albicans. Čtyři dny po intraperitoneální inokulaci je z každého zvířete získán peritoneální aspirát a kultivován. Zvířata pozitivní na přítomnost houby v aspirátu jsou náhodně uspořádána do kontrolních a pokusných skupin. Antifungální ošetření je zahájeno sedm dní po inokulaci patogenem. Oči všech králíků jsou hodnoceny pomocí nepřímé oftalmoskopie, protože rozšířená kandidóza může způsobovat Candida endophtalmitis. Zvířata jsou usmrcena 7., 11. a

14. den po zahájení terapie a jejich břišní dutina je vyšetřena na přítomnost peritonitidy a intraabdominálního abscesu. V očích jsou hodnoceny makroskopické léze. Vzorky tkáně z peritoneálního abscesu, všech dalších viditelných abscesů, ledvin, jater, slezin, a očních struktur jsou zváženy, homogenizovány v mozkosrdečním bujónu (brain heart infusion broth), mnohonásobně zředěny a kultivovány pro stanovení CFU na gram tkáně. Ledvinové a peritoneální abscesy jsou také fixovány 10 % neutrálním formaldehydem a histopatologicky vyšetřeny. Pro stanovení obsahu houby a hodnocení její morfologie jsou řezy barveny pomocí periodové kyseliny-Schiffova činidla. Hodnotí se účinek testovaných léčiv na zvýšení přežívání a snížení obsahu houby.

Příklad 13

Aktivita chitinázy in vivo na modelu králíka a houbové endopftamitidy

Účinnost samotné chitinázy nebo její kombinace s jinými antifungálními prostředky je hodnocena na modelu králičí endophtalmitidy (Candida endophtalmitis) podle Park et al., ·«··· ·· · ·· • · 9 9 9 9 9 9 9 • · · · · « 9 · 9

9 9 9 9 9999 9 999

9 9 9 9 9 9

9 99 9 9 9 9 9

Antimicrob. agents Chemother. 39: 958-963 (1995). Novozélandští bílí králíci (albíni) o hmotnosti 2 až 2,5 kg jsou infikováni intravitrální inokulací kolem 1,000 CFU Candida albicans. Po pěti dnech je endophtalmitida potvrzena nepřímou oftalmoskopií a popsána jako mírné až silné zamlžení sklivce s částečným nebo celkovým zastíněním větším než 50 % retinální a choroidální vaskulatury. Stupeň zakalení sklivce je klasifikován pomocí stupnice a také vzhled fundusu může být klasifikován a fotograficky dokumentován. Králíci jsou pak náhodně rozděleni do skupin s odlišným způsobem léčení: samotná chitináza po dobu 2 až 4 týdnů, chitináza v kombinaci s dalším běžným antifungálním prostředkem (např. amphotericinem B, flukonazolem nebo 5-fluorocytosinem) po dobu 2 až 4 týdnů, nebo žádné ošetření (kontrola). Dávkování antifungálních prostředků je flukonazol - orálně - 80 mg/kg/den a 5-fluorocytosin orálně - 100 mg/kg každých 12 hodin.

Účinek léčení je hodnocen 2 až 4 týdny po terapii nepřímou oftalmoskopií, kvantitativním stanovením obsahu houby a histopatologicky. Pro kvantitativní stanovení obsahu houby jsou oči vyjmuty, zváženy a odvážená část z každého vzorku je homogenizována a kultivována na agarových plotnách (brucella agar - 5% koňská krev) 48 hodin při 35°C v 5 až 10 % CO₂. Homogenizované vzorky mohou být též před nanesením na plotny zředěny 10 až 100 -krát sterilním fyziologickým roztokem. Kolonie jsou spočítány a celkové CFU v oku se vypočítá na základě výsledku vztaženého ke změřeným částem vzorku. Účinek léčby se hodnotí podle celkového intraokulárního obsahu houby. Pro histopatologii jsou typické oči vyjmuty, fixovány formalinem v plastové nádobě a nařezány na 5 μη části. Řezy jsou obarveny hematoxylin-eosinem nebo Gomoriho metheaminovým barvením stříbrem (Gomori methenamine silver stain) a pomocí světelého mikroskopu jsou sledovány záněty, vláknité struktury a části houby. Účinek antifungálních látek je hodnocen na základě snížení mortality, obsahu houby nebo zánětů souvisejících s houbovou infekcí.

Jinou možností je též využití modelu králičí endophtalmitidy {Aspergillus endophtalmitis) podle Jain et al., Doc. Ophthalmol. 69: 227-235 (1988) . Novozélandští bílí králíci jsou inokulováni do jednoho oka asi 40 sporami Aspergillus fumigatus. Jejich • 99 kontralaterální (kontrolní) oko je inokulováno sterilním inokulem.

Po ošetření testovanou látkou (chitinázou samotnou nebo v kombinaci s jiným antifungálním prostředkem) může být na očích králíků sledován klinický obraz, mohou být sledovány elektroretinogramy, může být použita nepřímá oftalmoskopie, stanoveno kvantitativní množství houby a provedena histopatologie. Klinicky patrná endophtalmitida se obvykle vyvine 3 až 7 dní po inokulaci.

Příklad 14

Aktivita chitinázy in vivo na modelu králičí houbové endokarditidy

Účinek chitinázy samotné nebo v kombinaci s jinými běžnými antifungálními prostředky je stanoven na modelu králičí endokarditidy (Candida endokarditis) podle Witt a Bayer, Antimicrob. Agents Chemother. 35: 2481-2485 (1991). Viz též Lomgman et al., Rev.Infect. Dis. 12 (Suppl. 3): S294-298 (1990). Sterilní trombotická endokarditida je u novozélandských bílých králíků vyvolána zavedením přes chlopně sterilního polyetylenového katetru (o vnitřním průměru 0,86 mm), který se ponechá na místě po dobu studia. Infekční endokarditis je vyvolána 48 hodin po katetrizaci intravenózní injekcí kolem 2 x 10¹ blastospor C.albícans. Možné je také použití C.parapsilosis. Antifungální terapie (samotnou chitinázou nebo v kombinaci s jinou běžnou antifungální látkou) je zahájena 24 hodin před nebo 60 hodin po napadení houbou. Terapie se provádí po dobu 9 až 12 dnů. Dávkování běžných antifungálních prostředků je 1 mg/kg/den intravenózně u amphotericinu B, 50 mg/kg/den nebo 100 mg/kg/den intravenózně nebo intraperitoneálně pro flukanazol. Kontrolním králíkům není podáván žádný antifungální prostředek. Po usmrcení jsou srdce králíků vyjmuta a pozice zavedeného katetru překontrolována. Srdeční zbytnění jsou z každého zvířete vyjmuty, spojeny, zváženy a homogenizovány v 1 ml sterilního fyziologického roztoku. Homogenát je mnohonásobně rozředěn a kvantitativně kultivován na kvasničném draselnodextrosovém agaru při 35°C 48 hodin. Za zbytnění bez nálezu kultur jsou považována ta, která obsahují méně než 2 logi₀ CFU/g na základě průměrné váhy zbytnění.

> 4 4 4 » 4 4 4

4 4 4 4

Je zřejmé, že popsaného vynálezu, která jsou popsána odborníci odhalí další obměny a modifikace výše Proto jsou kladena na vynález pouze ta omezení, v přiložených patentových nárocích.

• 44 4

Μ 4 444 4444 • 4 4444 4444 · 4 4 4 *444 4 444 444

444444 4 4

SEZNAM SEKVENCÍ (1) GENERAL INFORMATION:

(i) ŽADATEL: ICOS CORPORATION (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Chitináza - materiál and methody (iii) POČET SEKVENCÍ: 17 (iv) POŠTOVNÍ ADRESA:

(A) ADRESÁT: Marshall, 0'Toole, Gerstein, Murray & Borun (B) ULICE: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) MĚSTO: Chicago (D) STÁT: Illinois (E) ZEMĚ: United States of America (F) ZIP (PSČ): 60606-6402 (v) FORMA VHODNÁ PRO POČÍTAČOVÉ ZPRACOVÁNÍ:

(A) TYP MEDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC compatible (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (vi) SOUČASNÉ ÚDAJE O ŽÁDOSTI:

(A) ČÍSLO ŽÁDOSTI:

(B) DATUM REGISTRACE:

(C) KLASIFIKACE:

(vii) PŘEDCHÁZEJÍCÍ ÚDAJE O ŽÁDOSTI:

(A) ČÍSLO ŽÁDOSTI: US 08/663,618 (B) DATUM REGISTRACE: 14-JUN-1996 (viii) INFORMACE O PRÁVNÍM ZÁSTUPCI/AGENTOVI:

(A) JMÉNO: Rin-Laures, Li-Hsien (B) ČÍSLO REGISTRACE: 33,547 (C) REFERENCE/POČET SOUDNÍCH PŘÍPADŮ: 27866/33994 (ix) TELEKOMUNIKAČNÍ INFORMACE:

(A) TELEFÓN: 312/474-6300 (B) TELEFAX: 312/474-0448 (C) TELEX: 25-3856 • · *· · ··«··· · • · · · · · · · ·· ·· (2) INFORMACE o SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1636 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 2..1399 (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat_peptide (B) UMÍSTĚNÍ: 65..1399 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:1:

C ATG GTG CGG TCT GTG GCC TGG GCA GGT TTC ATG GTC CTG CTG ATG 4 6

Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met -21 -20 -15 -10

ATC Ile

CCA TGG

GGC Gly

TCT Ser

GCT Ala

GCA AAA CTG GTC

TGC Cys 5

TAC Tyr

TTC Phe

ACC Thr

AAC Asn

TGG Trp 10

94

Pro -5

Trp

Ala 1

Lys

Leu

Val

GCC

CAG

TAC

AGA

CAG

GGG

GAG

GCT

CGC

TTC

CTG

CCC

AAG

GAC

TTG

GAC

142

Ala

Gin

Tyr

Arg

Gin 15

Gly

Glu

Ala

Arg

Phe 20

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu 25

Asp

CCC

AGC

CTT

TGC

ACC

CAC

CTC

ATC

TAC

GCC

TTC

GCT

GGC

ATG

ACC

AAC

190

Pro

Ser

Leu

Cys 30

Thr

His

Leu

Ile

Tyr 35

Ala

Phe

Ala

Gly

Met 40

Thr

Asn

CAC

CAG

CTG

AGC

ACC

ACT

GAG

TGG

AAT

GAC

GAG

ACT

CTC

TAC

CAG

GAG

238

His

Gin

Leu 45

Ser

Thr

Glu

Trp 50

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu 55

Tyr

Gin

Glu

TTC

AAT

GGC

CTG

AAG

ATG

AAT

CCC

AAG

CTG

AAG

ACC

CTG

TTA

GCC

286

Phe

Asn 60

Gly

Leu

Lys

Met 65

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys 70

Thr

Leu

Ala

ATC

GGA

GGC

TGG

AAT

TTC

GGC

ACT

CAG

AAG

TTC

ACA

GAT

ATG

GTA

GCC

334

Ile 75

Gly

Trp

Asn

Phe 80

Gly

Thr

Gin

Lys

Phe 85

Thr

Asp

Met

Val

Ala 90

ACG

GCC

AAC

CGT

CAG

ACC

TTT

GTC

AAC

TCG

GCC

ATC

AGG

TTT

CTG

382

Thr

Ala

Asn

Arg 95

Gin

Thr

Phe

Val

Asn 100

Ser

Ala

Ile

Arg

Phe 105

Leu

CGC

AAA

TAC

AGC

TTT

GAC

GGC

CTT

GAC

CTT

GAC

TGG

GAG

TAC

CCA

GGA

430

Arg

Lys

Tyr

Ser 110

Phe

Asp

Gly

Leu

Asp 115

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr 120

Pro

Gly

AGC

CAG

GGG

AGC

CCT

GCC

GTA

GAC

AAG

GAG

CGC

TTC

ACA

ACC

CTG

GTA

478

Ser

Gin

Gly 125

Ser

Pro

Ala

Val

Asp 130

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr 135

Thr

Leu

Val

CAG

GAC

TTG

GCC

AAT

GCC

TTC

CAG

GAA

GCC

CAG

ACC

TCA

GGG

AAG

526

• ·*· ·· · ·· · · ·* • · · « · « • · · · · · >·· • · » · · · »*· »♦ ·« · » · · · • · · ·» ·

Gin Asp 140

Leu

Ala

Asn

Ala

Phe 145

Gin

Glu

Ala

Gin 150

Thr

Ser Gly Lys

GAA

CGC

CTT

CTG

AGT

GCA

GCG

GTT

CCA

GCT

GGG

CAG

ACC

TAT

GTG

574

Glu

Arg

Leu

Ser

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

155

160

165

170

GAT

GCT

GGA

TAC

GAG

GTG

GAC

AAA

ATC

GCC

CAG

AAC

CTG

GAT

TTT

GTC

622

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

Asp

Lys

Ile

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

175

180

185

AAC

CTT

ATG

GCC

TAC

GAC

TTC

CAT

GGC

TCT

TGG

GAG

AAG

GTC

ACG

GGA

670

Asn

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

Phe

His

Gly

Ser

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

190

195

200

CAT

AAC

AGC

CCC

CTC

TAC

AAG

AGG

CAA

GAA

GAG

AGT

GGT

GCA

GCC

718

His

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Glu

Ser

Gly

Ala

205

210

215

AGC

CTC

AAC

GTG

GAT

GCT

GTG

CAA

CAG

TGG

CTG

CAG

AAG

GGG

ACC

766

Ser

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

Val

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

220

225

230

CCT

GCC

AGC

AAG

CTG

ATC

CTT

GGC

ATG

CCT

ACC

TAC

GGA

CGC

TCC

TTC

814

Pro

Ala

Ser

Lys

Leu

Ile

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

235

240

245

250

ACA

CTG

GCC

TCC

TCA

GAC

ACC

AGA

GTG

GGG

GCC

CCA

GCC

ACA

GGG

862

Thr

Leu

Ala

Ser

Asp

Thr

Arg

Val

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

255

260

265

TCT

GGC

ACT

CCA

GGC

CCC

TTC

ACC

AAG

GAA

GGA

GGG

ATG

CTG

GCC

TAC

910

Ser

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

270

275

280

TAT

GAA

GTC

TGC

TCC

TGG

AAG

GGG

GCC

ACC

AAA

CAG

AGA

ATC

CAG

GAT

958

Tyr

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

Ile

Gin

Asp

285

290

295

CAG

AAG

GTG

CCC

TAC

ATC

TTC

CGG

GAC

AAC

CAG

TGG

GTG

GGC

TTT

GAT

1006

Gin

Lys

Val

Pro

Tyr

Ile

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

300

305

310

GAT

GTG

GAG

AGC

TTC

AAA

ACC

AAG

GTC

AGC

TAT

CTG

AAG

CAG

AAG

GGA

1054

Asp

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

315

320

325

330

CTG

GGC

GGG

GCC

ATG

GTC

TGG

GCA

CTG

GAC

TTA

GAT

GAC

TTT

GCC

GGC

1102

Leu

Gly

Ala

Met

Val

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Phe

Ala

Gly

335

340

345

TTC

TCC

TGC

AAC

CAG

GGC

CGA

TAC

CCC

CTC

ATC

CAG

ACG

CTA

CGG

CAG

1150

Phe

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

Arg

Tyr

Pro

Leu

Ile

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

350

355

360

GAA

CTG

AGT

CTT

CCA

TAC

TTG

CCT

TCA

GGC

ACC

CCA

GAG

CTT

GAA

GTT

1198

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu

Leu

Glu

Val

365

370

375

• *·*· ·♦ 9 ·· ·· ·· · · « · »··» • · · · · · ···· • · « * »···· F ··« ·»«

	• · · · · « ··· ·· »· r	«
CCA AAA CCA GGT CAG CCC TCT GAA CCT GAG CAT	GGC CCC AGC CCT GGA	1246
Pro Lys Pro Gly Gin Pro Ser Glu Pro Glu His	Gly Pro Ser Pro Gly
380 385	390
CAA GAC ACG TTC TGC CAG GGC AAA GCT GAT GGG	CTC TAT CCC AAT CCT	1294
Gin Asp Thr Phe Cys Gin Gly Lys Ala Asp Gly	Leu Tyr Pro Asn Pro
395 400 405	410
CGG GAA CGG TCC AGC TTC TAC AGC TGT GCA GCG	GGG CGG CTG TTC CAG	1342
Arg Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala	Gly Arg Leu Phe Gin
415 420	425
CAA AGC TGC CCG ACA GGC CTG GTG TTC AGC AAC	TCC TGC AAA TGC TGC	1390
Gin Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn	Ser Cys Lys Cys Cys
430 435	440
ACC TGG AAT TGAGTCGCTA AAGCCCCTCC AGTCCCAGCT TTGAGGCTGG Thr Trp Asn 445	1439
GCCCAGGATC ACTCTACAGC CTGCCTCCTG GGTTTTCCCT	GGGGGCCGCA ATCTGGCTCC	1499
TGCAGGCCTT TCTGTGGTCT TCCTTTATCC AGGCTTTCTG	CTCTCAGCCT TGCCTTCCTT	1559
TTTTCTGGGT CTCCTGGGCT GCCCCTTTCA CTTGCAAAAT	AAATCTTTGG TTTGTGCCCC	1619
TCTTCCCAAA AAAAAAA		1636

(2)	INFORMACE o	SEQ	ID NO:2:
	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
	(A)	DÉLKA: 466 aminokyselin
	(B)	TYP: aminokyselina
	(D)	TOPOLOGIE: lineární
	(ii) TYP MOLEKULY: protein
	(xi) POPIS	! SEKVENCE: SEQ ID NO:2:
Met	Val Arg Ser	Val	Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met Ile
-21	-20		-15 -10
Pro	Trp Gly Ser	Ala	Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala
-5			15 10
Gin	Tyr Arg Gin	Gly	Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro
	15		20 25
Ser	Leu Cys Thr	His	Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His
	30		35 40
Gin	Leu Ser Thr	Thr	Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gin Glu Phe
	45		50 55
Asn	Gly Leu Lys	Lys	Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile
60			65 70 75
Gly	Gly Trp Asn	Phe	Gly Thr Gin Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr

85 90 • ·

Ala Asn Asn Arg Gin Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg 95 100 105

Lys Tyr Ser Phe Asp Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser 110 115 120

Gin Gly Ser Pro Ala Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gin 125 130 135

Asp Leu Ala Asn Ala Phe Gin Gin Glu Ala Gin Thr Ser Gly Lys Glu

140 145 150 155

Arg Leu Leu Leu Ser Ala Ala Val Pro Ala Gly Gin Thr Tyr Val Asp

160 165 170

Ala Gly Tyr Glu Val Asp Lys Ile Ala Gin Asn Leu Asp Phe Val Asn 175 180 185

Leu Met Ala Tyr Asp Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His 190 195 200

Asn Ser Pro Leu Tyr Lys Arg Gin Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser 205 210 215

Leu Asn Val Asp Ala Ala Val Gin Gin Trp Leu Gin Lys Gly Thr Pro

220 225 230 235

Ala Ser Lys Leu Ile Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr

240 245 250

Leu Ala Ser Ser Ser Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser 255 260 265

Gly Thr Pro Gly Pro Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr 270 275 280

Glu Val Cys Ser Trp Lys Gly Ala Thr Lys Gin Arg Ile Gin Asp Gin 285 290 295

Lys Val Pro Tyr Ile Phe Arg Asp Asn Gin Trp Val Gly Phe Asp Asp

300 305 310 315

Val Glu Ser Phe Lys Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gin Lys Gly Leu

320 325 330

Gly Gly Ala Met Val Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe 335 340 345

Ser Cys Asn Gin Gly Arg Tyr Pro Leu Ile Gin Thr Leu Arg Gin Glu 350 355 360

Leu Ser Leu Pro Tyr Leu Pro Ser Gly Thr Pro Glu Leu Glu Val Pro 365 370 375

Lys Pro Gly Gin Pro Ser Glu Pro Glu His Gly Pro Ser Pro Gly Gin

380 385 390 395

Asp Thr Phe Cys Gin Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg

400 405 410 • · · ·

Glu

Arg

Ser

Ser 415

Phe

Tyr

Ser

Cys

Ala 420

Ala

Gly Arg

Leu

Phe 425

Gin

Ser

Cys

Pro 430

Thr

Gly

Leu

Val

Phe 435

Ser

Asn

Ser Cys

Lys 440

Cys

Thr

Trp

Asn 445

(2)

INFORMACE o

SEQ

ID ]

NO: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1656 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) UMÍSTĚNÍ: 27..1424 (ix) VLASTNOSTI:

(A) JMÉNO/KLÍČ: mat peptid (B) UMÍSTĚNÍ: 90..1424 (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:3:

GCTGCAGCCT GCCGCTGAGC TGCATC ATG GTG CGG TCT GTG GCC TGG GCA GGT 53

Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly -21 -20 -15

TTC Phe

ATG Met

GTC CTG CTG ATG ATC

CCA TGG GGC

TCT Ser

GCT Ala

GCA AAA CTG GTC

101

Val -10

Leu

Met

Ile

Pro -5

Trp

Gly

Ala 1

Lys

Leu

Val

TGC

TAC

TTC

ACC

AAC

TGG

GCC

CAG

TAC

AGA

CAG

GGG

GAG

GCT

CGC

TTC

149

Cys

Tyr

Phe

Thr

Asn

Trp

Ala

Gin

Tyr

Arg

Gin

Gly

Glu

Ala

Arg

Phe

5

10

15

20

CTG

CCC

AAG

GAC

TTG

GAC

CCC

AGC

CTT

TGC

ACC

CAC

CTC

ATC

TAC

GCC

197

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

Pro

Ser

Leu

Cys

Thr

His

Leu

Ile

Tyr

Ala

25

30

35

TTC

GCT

GGC

ATG

ACC

AAC

CAC

CAG

CTG

AGC

ACC

ACT

GAG

TGG

AAT

GAC

24 5

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

Gin

Leu

Ser

Thr

Glu

Trp

Asn

Asp

40

45

50

GAG

ACT

CTC

TAC

CAG

GAG

TTC

AAT

GGC

CTG

AAG

ATG

AAT

CCC

AAG

293

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asn

Gly

Leu

Lys

Met

Asn

Pro

Lys

55

60

65

CTG

AAG

ACC

CTG

TTA

GCC

ATC

GGA

GGC

TGG

AAT

TTC

AGC

ACT

CAG

AAG

341

Leu

Lys

Thr

Leu

Ala

Ile

Gly

Trp

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

70

75

80

• 0 • « · · • ·

TTC ACA

GAT Asp

ATG Met

GTA Val

GCC Ala 90

ACG Thr

GCC AAC AAC

CGT Arg 95

CAG Gin

ACC Thr

TTT Phe

GTC Val

AAC Asn 100

389

Phe 85

Thr

Ala

Asn

TCG

GCC

ATC

AGG

TTT

CTG

CGC

AAA

TAC

AGC

TTT

GAC

GGC

CTT

GAC

CTT

437

Ser

Ala

Ile

Arg

Phe

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

Gly

Leu

Asp

Leu

105

110

115

GAC

TGG

GAG

TAC

CCA

GGA

AGC

CAG

GGG

AGC

CCT

GCC

GTA

GAC

AAG

GAG

485

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

Val

Asp

Lys

Glu

120

125

130

CGC

TTC

ACA

ACC

CTG

GTA

CAG

GAC

TTG

GCC

AAT

GCC

TTC

CAG

GAA

533

Arg

Phe

Thr

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

Phe

Gin

Glu

135

140

145

GCC

CAG

ACC

TCA

GGG

AAG

GAA

CGC

CTT

CTG

AGT

GCA

GCG

GTT

CCA

581

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

Arg

Leu

Ser

Ala

Val

Pro

150

155

160

GCT

GGG

CAG

ACC

TAT

GTG

GAT

GCT

GGA

TAC

GAG

GTG

GAC

AAA

ATC

GCC

629

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

Asp

Lys

Ile

Ala

165

170

175

180

CAG

AAC

CTG

GAT

TTT

GTC

AAC

CTT

ATG

GCC

TAC

GAC

TTC

CAT

GGC

TCT

677

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

Phe

His

Gly

Ser

185

190

195

TGG

GAG

AAG

GTC

ACG

GGA

CAT

AAC

AGC

CCC

CTC

TAC

AAG

AGG

CAA

GAA

725

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

His

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Glu

200

205

210

GAG

AGT

GGT

GCA

GCC

AGC

CTC

AAC

GTG

GAT

GCT

GTG

CAA

CAG

773

Glu

Ser

Gly

Ala

Ser

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

Val

Gin

215

220

225

TGG

CTG

CAG

AAG

GGG

ACC

CCT

GCC

AGC

AAG

CTG

ATC

CTT

GGC

ATG

CCT

821

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Ala

Ser

Lys

Leu

Ile

Leu

Gly

Met

Pro

230

235

240

ACC

TAC

GGA

CGC

TCC

TTC

ACA

CTG

GCC

TCC

TCA

GAC

ACC

AGA

GTG

869

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

Thr

Leu

Ala

Ser

Asp

Thr

Arg

Val

245

250

255

260

GGG

GCC

CCA

GCC

ACA

GGG

TCT

GGC

ACT

CCA

GGC

CCC

TTC

ACC

AAG

GAA

917

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Ser

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

265

270

275

GGA

GGG

ATG

CTG

GCC

TAC

TAT

GAA

GTC

TGC

TCC

TGG

AAG

GGG

GCC

ACC

965

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

Lys

Gly

Ala

Thr

280

285

290

AAA

CAG

AGA

ATC

CAG

GAT

CAG

AAG.

GTG

CCC

TAC

ATC

TTC

CGG

GAC

AAC

1013

Lys

Gin

Arg

Ile

Gin

Asp

Gin

Lys

Val

Pro

Tyr

Ile

Phe

Arg

Asp

Asn

295

300

305

CAG

TGG

GTG

GGC

TTT

GAT

GTG

GAG

AGC

TTC

AAA

ACC

AAG

GTC

AGC

1061

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

Thr

Lys

Val

Ser

310

315

320

• ·

TAT Tyr 325

CTG Leu

AAG Lys

CAG AAG GGA CTG GGC GGG

GCC Ala

ATG Met 335

GTC Val

TGG Trp

GCA Ala

CTG Leu

GAC Asp 340

1109

Gin

Lys

Gly 330

Leu

Gly

TTA

GAT

GAC

TTT

GCC

GGC

TTC

TCC

TGC

AAC

CAG

GGC

CGA

TAC

CCC

CTC

1157

Leu

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

Arg

Tyr

Pro

Leu

345

350

355

ATC

CAG

ACG

CTA

CGG

CAG

GAA

CTG

AGT

CTT

CCA

TAC

TTG

CCT

TCA

GGC

1205

Ile

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Gly

360

365

370

ACC

CCA

GAG

CTT

GAA

GTT

CCA

AAA

CCA

GGT

CAG

CCC

TCT

GAA

CCT

GAG

1253

Thr

Pro

Glu

Leu

Glu

Val

Pro

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Ser

Glu

Pro

Glu

375

380

385

CAT

GGC

CCC

AGC

CCT

GGA

CAA

GAC

ACG

TTC

TGC

CAG

GGC

AAA

GCT

GAT

1301

His

Gly

Pro

Ser

Pro

Gly

Gin

Asp

Thr

Phe

Cys

Gin

Gly

Lys

Ala

Asp

390

395

400

GGG

CTC

TAT

CCC

AAT

CCT

CGG

GAA

CGG

TCC

AGC

TTC

TAC

AGC

TGT

GCA

1349

Gly

Leu

Tyr

Pro

Asn

Pro

Arg

Glu

Arg

Ser

Phe

Tyr

Ser

Cys

Ala

405

410

415

420

GCG

GGG

CGG

CTG

TTC

CAG

CAA

AGC

TGC

CCG

ACA

GGC

CTG

GTG

TTC

AGC

1397

Ala

Gly

Arg

Leu

Phe

Gin

Ser

Cys

Pro

Thr

Gly

Leu

Val

Phe

Ser

425

430

435

AAC

TCC

TGC

AAA

TGC

ACC

TGG

AAT

TGAGTCGCTA AAGCCCCTCC

1444

Asn

Ser

Cys

Lys

Cys

Thr

Trp

Asn

440 445

AGTCCCAGCT	TTGAGGCTGG	GCCCAGGATC	ACTCTACAGC	CTGCCTCCTG	GGTTTTCCCT	1504
GGGGGCCGCA	ATCTGGCTCC	TGCAGGCCTT	TCTGTGGTCT	TCCTTTATCC	AGGCTTTCTG	1564
CTCTCAGCCT	TGCCTTCCTT	TTTTCTGGGT	CTCCTGGGCT	GCCCCTTTCA	CTTGCAAAAT	1624
AAATCTTTGG	TTTGTGCCCC	TCAAAAAAAA	AA			1656

(2) INFORMACE o SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 466 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 4:

Met

Val

Arg

Ser

Val

Ala

Trp

Ala

Gly

Phe

Met

Val

Leu

Met

Ile

-21

-20

-15

-10

Pro

Trp

Gly

Ser

Ala

Lys

Leu

Val

Cys

Tyr

Phe

Thr

Asn

Trp

Ala

-5

1

5

10

Gin

Tyr

Arg

Gin

Gly

Glu

Ala

Arg

Phe

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

Pro

20 25 ·· · ·· ·· • · · · ♦ · « • · · · · · · · « • · · · ···* · ··· ··« • 4 4 » · · ¹

Ser

Leu Cys 30

Thr

His

Leu

Ile

Tyr 35

Ala

Phe

Ala

Gly

Met 40

Thr

Asn

His

Gin

Leu

Ser

Thr

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

45

50

55

Asn

Gly

Leu

Lys

Met

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

Ala

Ile

60

65

70

75

Gly

Trp

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

Thr

80

85

90

Ala

Asn

Arg

Gin

Thr

Phe

Val

Asn

Ser

Ala

Ile

Arg

Phe

Leu

Arg

95

100

105

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

110

115

120

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Leu

Val

Gin

125

130

135

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

Phe

Gin

Glu

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

140

145

150

155

Arg

Leu

Ser

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

160

165

170

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

Asp

Lys

Ile

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

175

180

185

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

Phe

His

Gly

Ser

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

His

190

195

200

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Glu

Ser

Gly

Ala

Ser

205

210

215

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

Val

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

220

225

230

235

Ala

Ser

Lys

Leu

Ile

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

Thr

240

245

250

Leu

Ala

Ser

Asp

Thr

Arg

Val

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Ser

255

260

265

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

270

275

280

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

Ile

Gin

Asp

Gin

285

290

295

Lys

Val

Pro

Tyr

Ile

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

300

305

310

315

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

Leu

320

325

330

Gly

Ala

Met

Val

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

335

340

345

Ser Cys

Asn 350

Gin Gly

Arg Tyr

Pro 355

Leu

Ile

Gin Thr

Leu 360

Arg

Gin

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu

Leu

Glu

Val

Pro

365

370

375

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Ser

Glu

Pro

Glu

His

Gly

Pro

Ser

Pro

Gly

Gin

380

385

390

395

Asp

Thr

Phe

Cys

Gin

Gly

Lys

Ala

Asp

Gly

Leu

Tyr

Pro

Asn

Pro

Arg

400

405

410

Glu

Arg

Ser

Phe

Tyr

Ser

Cys

Ala

Gly

Arg

Leu

Phe

Gin

415

420

425

Ser

Cys

Pro

Thr

Gly

Leu

Val

Phe

Ser

Asn

Ser

Cys

Lys

Cys

Thr

430 435 440

Trp Asn 445 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

GACACTATAG AATAGGGC 18 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 51 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 6:

TGGGATCATC AGCAGGACCA TGAAACCTGC CCAGGCCACA GACCGCACCA T 51 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 40 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden

(D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:7:

TACATCTAGA ATTATGGCAA AACTGGTCTG CTACTTCACC (2) INFORMACE o SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 8:

AGATCTAACC TTAGGTGCCT GAAGACAAGT ATGG 34 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 29 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

TACAGAATTC TTATTCACAT CCGGCCCTG 29 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:10:

TACATCTAGA CTCCATCCAG AAAAACAGGT ATGG 34 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

• ·♦· (A) DÉLKA: 30 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:11:

TCTAGAGTCG ACCTGCAGGC ATGCAAGCTT 30 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 50 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:12:

CGCAAGCTTG AGAGCTCCGT TCCGCCACAT GGTGCGGTCT GTGGCCTGGG 50 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 32 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:13:

GACTCTAGAC TAGGTGCCTG AAGGCAAGTA TG 32 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 373 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:14:

Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gin Tyr Arg Gin Gly 15 10 15

• · · ···«· «

• ·

Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro Ser Leu Cys Thr His 20 25 30

Leu Ile Tyr Ala Phe Ala Gly Met Thr Asn His Gin Leu Ser Thr Thr 35 40 45

Glu Trp Asn Asp Glu Thr Leu Tyr Gin Glu Phe Asn Gly Leu Lys Lys 50 55 60

Met Asn Pro Lys Leu Lys Thr Leu Leu Ala Ile Gly Gly Trp Asn Phe

70 75 80

Gly Thr Gin Lys Phe Thr Asp Met Val Ala Thr Ala Asn Asn Arg Gin

90 95

Thr Phe Val Asn Ser Ala Ile Arg Phe Leu Arg Lys Tyr Ser Phe Asp 100 105 110

Gly Leu Asp Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Gly Ser Gin Gly Ser Pro Ala 115 120 125

Val Asp Lys Glu Arg Phe Thr Thr Leu Val Gin Asp Leu Ala Asn Ala 130 135 140

Phe Gin Gin Glu Ala Gin Thr Ser Gly Lys Glu Arg Leu Leu Leu Ser

145 150 155 160

Ala Ala Val Pro Ala Gly Gin Thr Tyr Val Asp Ala Gly Tyr Glu Val

165 170 175

Asp Lys Ile Ala Gin Asn Leu Asp Phe Val Asn Leu Met Ala Tyr Asp 180 185 190

Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Tyr 195 200 205

Lys Arg Gin Glu Glu Ser Gly Ala Ala Ala Ser Leu Asn Val Asp Ala 210 215 220

Ala Val Gin Gin Trp Leu Gin Lys Gly Thr Pro Ala Ser Lys Leu Ile

225 230 235 240

Leu Gly Met Pro Thr Tyr Gly Arg Ser Phe Thr Leu Ala Ser Ser Ser

245 250 255

Asp Thr Arg Val Gly Ala Pro Ala Thr Gly Ser Gly Thr Pro Gly Pro 260 265 270

Phe Thr Lys Glu Gly Gly Met Leu Ala Tyr Tyr Glu Val Cys Ser Trp 275 280 285

Lys Gly Ala Thr Lys Gin Arg Ile Gin Asp Gin Lys Val Pro Tyr Ile 290 295 300

Phe Arg Asp Asn Gin Trp Val Gly Phe Asp Asp Val Glu Ser Phe Lys

305 310 315 320

Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gin Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Val

325

335

330 « ·

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

340

345

350

Arg

Tyr

Pro

Leu

Ile

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

355

360

365

Leu

Pro

Ser

Gly

Thr

370 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 373 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

(xi)

pop:

[S SEKVENCE:

SEQ

ID 1

NO:15:

Ala

Lys

Leu

Val

Cys

Tyr

Phe

Thr

Asn

Trp

Ala

Gin

Tyr

Arg

Gin

Gly

1

5

10

15

Glu

Ala

Arg

Phe

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

Pro

Ser

Leu

Cys

Thr

His

20

25

30

Leu

Ile

Tyr

Ala

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

Gin

Leu

Ser

Thr

35

40

45

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asn

Gly

Leu

Lys

50

55

60

Met

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

Ala

Ile

Gly

Trp

Asn

Phe

65

70

75

80

Gly

Thr

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

Thr

Ala

Asn

Arg

Gin

85

90

95

Thr

Phe

Val

Asn

Ser

Ala

Ile

Arg

Phe

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

100

105

110

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

115

120

125

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Leu

Val.

Gin

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

130

135

140

Phe

Gin

Glu

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

Arg

Leu

Ser

145

150

155

160

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

165

170

175

Asp

Lys

Ile

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

180

185

190

Phe

His

Gly

Ser

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

His

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

195

200

205

* · 4 · • · · · · «·· <4444

Lys

Arg 210

Gin Glu

Glu Ser

Gly 215

Ala

Ala Ala

Ser

Leu 220

Asn

Val

Asp

Ala

Val

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Ala

Ser

Lys

Leu

Ile

225

230

235

240

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

Thr

Leu

Ala

Ser

245

250

255

Asp

Thr

Arg

Val

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Ser

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

260

265

270

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

275

280

285

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

Ile

Gin

Asp

Gin

Lys

Val

Pro

Tyr

Ile

290

295

300

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

305

310

315

320

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

Leu

Gly

Ala

Met

Val

325

330

335

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

340

345

350

Arg

Tyr

Pro

Leu

Ile

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

355

360

365

Leu Ser Ser Gly Thr 370 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 28 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: oligonucleotidový primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:16:

TGATACGGTA CCGCCCCATG GCTGACTA 28 (2) INFORMACE o SEQ ID NO:17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

·· · ·· (A) DÉLKA: 20 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET ŘETĚZCŮ: jeden (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: jiná nukleová kyselina (A) POPIS: primer (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:17:

GCAAGTTTGG CGCGAAATCG

7(/ /ύ ·♦··

PATENOVE NÁROKY

Claims

• ♦ . ♦ * • ·

1. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2 lidské chitinázy.
2. Polynukleotid - DNA - podle nároku 1.
3. DNA podle nároku 2 obsahující protein kódující nukleotidy SEQ ID NO:1.
4. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódující aminokyseliny 1 až 445 SEQ ID N0:2.
5. Polynukleotid - DNA - podle nároku 4.
6. DNA podle nároku 5 obsahující nukleotidy 65 až 1402 SEQ ID NO: 1.
7. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:4 lidské chitinázy.
8. Polynukleotid - DNA - podle nároku 7.
9. DNA podle nároku 8 obsahující protein kódující nukleotidy SEQ ID NO:3.
10. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódující aminokyseliny 1 až 445 SEQ ID NO:4.
11. Polynukleotid - DNA - podle nároku 10.
12.DNA podle nároku 11 obsahující nukleotidy 90 až 1427 SEQ ID NO: 3.
13.Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódující lidskou chitinázu, vybraný ze skupiny čítající:

• ··· • · • · · · · • · ·

a) dvojpramennou DNA obsahující část sekvence ukázané v SEQ ID NO:3 kódující protein

b) DNA, která hybridizuje za stringentních podmímnek s nekódujícím vláknem DNA uvedené v bodu a)

c) DNA, která by, díky redundanci genetického kódu, hybridizovala za stringentních podmínek s nekódujícím vláknem sekvence DNA uvedených v bodech a) nebo b).
14. Polynukleotid - DNA - podle nároku 13.
15. Vektor obsahující DNA podle nároků 2,3,5,6,8,9,11,12 či 14.
16. Vektor podle nároku 15, který je expresním vektorem, a v kterém je DNA operativně spojena s kontrolou exprese sekvence DNA.
17. Hostitelská buňka stabilně tranformovaná či transfikována DNA podle nároků 2,3,5,6,8,9,11,12,nebo 14 způsobem dovolujícím expresi lidské chitinázy v uvedených hostitelských buňkách.
18. Metoda produkce lidské chitinázy obsahující pěstování hostitelské buňky podle nároku 17 na živném mediu a izolaci lidské chitinázy z řečených hostitelských buněk či řečeného živného média.
19. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid produkovaný metodami podle nároku 18.
20. Purifikovaný, izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:2 lidské chitinázy.
21. Purifikovaný, izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:4 lidské chitinázy.

····
22 . Purifikovaný, izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci 1 až 445 SEQ ID NO:2 lidské chitinázy.
23 . Purifikovaný, izolovaný polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci 1 až 445 SEQ ID NO:4 lidské chitinázy.
24. Polypeptidový fragment lidské chitinázy postrádající 1 až asi 72 C-koncových aminokyselinových zbytků finální lidské chitinázy.
25. Polypeptidový fragment lidské chitinázy SEQ ID NO:14
26. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid obsahující polynukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:14
27. Polynukleotid - DNA - podle nároku 26.
28 . Polypeptidový analog SEQ ID NO:15 kódující lidskou chitinázu.
29 . Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:15.
30. Hybridní buněčné linie produkující monoklonální protilátky, které specificky reagují s polypeptidy podle nároků 19,20,21,22,23 či 28.
31. Monoklonální protilátky produkované hybridními buněčnými liniemi podle nároku 30.
32. Farmaceutické směsi obsahující polypeptidy podle jakýchkoliv nároků 19 až 25 či podle nároku 28.

• ·4 · <4 · ·> · · • · · · • · · ♦ · • · · • 4 * • 4 ·· • · · ·

4 · · · ··· ·*«