SK169798A3 - Chitinase materials and methods - Google Patents

Description

Predkladaný vynález sa všeobecne vzťahuje k enzýmu ludskej chitináze a špeciálne k novo purifikovaným a izolovaným polynukleotidom kódujúcim ludskú chitinázu. Ďalej k chitinázovým látkam kódovaným týmito polynukleotidmi, k metódam rekombinantnej produkcie chitinázových látok a k protilátkam špecifickým proti chitináze.

Doterajší stav techniky

Chitín je lineárny homopolymér skladajúci sa z N-acetylglukózamínových jednotiek spojených β-(1,4) väzbou. Tento polysacharid je po celulóze druhou najrozšírenejšou organickou látkou. Exoskeletón stavovcov je zložený z chitínu. Ďalej vonkajšia bunková stena hub a ostatných parazitov obsahuje chitín, ktorý tu zastáva dôležitú štruktúrnu a ochrannú úlohu. Rozloženie bunkovej steny a membrán plesní a hub je používané ako úspešná terapeutická stratégia proti hubám, plesniam a parazitom. Napríklad antifungálna aktivita Amphotericinu B a fluconazolu vyplýva z pôsobenia na membránové steroidy. Navzdory existencii antifungálnych terapií sú fungálne infekcie stále viac zodpovedné za choroby ohrozujúce život (Georgopapadakou et al., Trends Microbiol., 3:98-104 (1995)). Druhy hub, plesní a parazitov zodpovedných za tieto choroby sú najmä Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Coccidioides a Pneumocystis. Tieto patogény sú osobitne nebezpečné u pacientov so zníženou imunitou ako sú pacienti s AIDS, pacienti podstupujúci chemoterapiu a pacienti pri transplantácii organov.

Chitín je degradovaný enzýmom chitinázou. Chitinázy boli nájdené u rastlín, mikroorganizmov a živočíchov. Bakteriálne chitinázy pomáhajú zaistiť zdroje uhlíka pre rast baktérií.

Hmyz produkuje chitinázy za účelom rozloženia kutikuly. Pri rastlinách majú chitinázy zrejme ochrannú úlohu proti parazitickým hubám. Chitinázy boli klonované z mnohých baktérií, napr. Serratia narcescens (Jones et al., EMBO J., 5:467-473 (1986)), rastlín, napr. tabaku (Heitz et al., Mol. Gen. Genet., 245:246-254 (1994)) a hmyzu, napr. osy (Krishnan et al., J. Biol. Chem., 269:20971-20976 (1994)).

Niekoľko proteínov s nízkou homológiou (menej ako 40 % aminokyselinovej homológie) k bakteriálnym, hmyzím a rastlinným chitinázam bolo identifikovaných u cicavcov. Sú to napr. proteín z ľudskej chrupky gp-39 (C-gp39) (Hakala et al., J. Biol.Chem., 268: 25803-25810 (1993)), ľudský glykoproteín YKL40 (Johansen et al., Eur.J.Cancer, 31A: 1437-1442 (1995)), ovčí estrogénom indukovaný, ovidukt špecifický proteín (DeSouza et. al., Endocrinology, 136: 2485-2496 (1995)), resp. ľudský a hovädzí alebo tiež sekrečný proteín z aktivovaných myších makrofágov (Chang et al., Genbank M94584). Aktivita degradujúca chitín však nebola pri týchto proteínoch opísaná. Funkcia týchto proteínov nie je známa, predpokladá sa ale, že sa podieľajú na procese premeny tkanív. Hakala et al., (pozri predchádzajúci text), opísal, že C-39 je detekovatelný v synoviálnych vzorkách a vzorkách chrupky u pacientov s reumatickou artritídou, nie však u zdravých ľudí. Recklies et al., (Arthritis Rheumatism, 36 (9 SUPPL.):S 190 (1993)) opísal lokalizáciu proteínu C-gp39. Našiel tento proteín v osobitnej populácii buniek povrchových vrstiev chrupky. Johansen et al. (pozri predchádzajúci text) ukázal, že meranie hladiny YKL-40 v sére má hodnotu potenciálneho markéru miery rozvinutia metastatickej choroby a prežitia pacientov s opakujúcou sa rakovinou prsníka.

Escott et al., (Infect. Immun., 63: 4770-4773 (1995)) opísal enzymatickú chitinázovú aktivitu v ľudských leukocytoch a v ľudskom sére. Overdijk et al. (Glycobiology, 4: 797-803 (1994)) opísali izoláciu chitinázy (4-metylumbelliferyl-tetraN-acetylchitotetraozid hydrolázy) z ľudského séra a pečene potkanov. Renkema et al., J.Biol.Chem., 270: 2198-2202 (február 1995) pripravili ľudskou chitotriozidázu zo sleziny pacientov trpiacich Gaucherovou chorobou (Gaucher disease).

Ich preparát vykazoval chitinázov aktivitu a v článku je opísaná krátka aminokyselinová sekvencia proteínovej časti preparátu (22 koncových aminokyselinových zvyškov a 21 zvyškov tryptického fragmentu). Funkcia ľudskej chitinázy je tiež neznáma, ale vzťah k patofyziológii Gaucherovej choroby je v článku navrhovaný. V neskoršej publikácii rovnakej skupiny (Boot et al., J.Biol.Chem. 270 (44): 26252-26256 (november 1995)) je opísané klonovanie cDNA ľudského makrofágu kódujúce produkt, ktorý vykazuje chitinázovú aktivitu, čiastočná aminokyselinová sekvencia publikovaná touto skupinou v článku z februára 1995 zodpovedá časti dedukovanej aminokyselinovej sekvencie produktu cDNA ľudského makrofágu (pozri tiež International Patent Publication No. WO 96/40940).

Vzhľadom na zvyšujúci sa výskyt fungálnych infekcií ohrozujúcich život jedincov so zníženou imunitou existuje tu potreba identifikácie a izolácie polynukleotidovej sekvencie kódujúcej ľudskú chitinázu, potreba vývoja materiálov a metód použiteľných na rekombinantnú produkciu enzýmu a na výrobu látok slúžiacich k detekcii chitinázy v plazme.

Podstata vynálezu

Predmetom predkladaného vynálezu sú novo purifikované a izolované polynukleotidy (napr. DNA a RNA, ako normálne tak antisence vlákno) kódujúce ľudskú chitinázu alebo jej fragmenty a analógy, metódy rekombinantnej produkcie chitinázových polypeptidov, ich fragmentov a analógov, purifikované a izolované chitinázové fragmenty a analógy, protilátky proti týmto polypeptidom, fragmentom a analógom a farmaceutické zmesi obsahujúce tieto polypeptidy, fragmenty, analógy alebo protilátky.

Osobitne chránené sú: purifikované a izolované polynukleotidy kódujúce aminokyselinovú sekvenciu ľudskej chitinázy SEQ ID NO:2 alebo 4, najmä aminokyseliny 1 až 445. Potom ďalej DNA obsahujúce nukleotidy SEQ ID NO: 1 alebo 3 kódujúce proteíny, najmä nukleotidy 65 až 1402 SEQ ID NO: la nukleotidy 90 až 1427 SEQ ID NO: 3. Potom ďalej purifikované a izolované polynukleotidové sekvencie kódujúce aminokyselinové sekvencie SEQ ID NO: 14 alebo 15, purifikované a izolované polynukleotidy kódujúce ľudskú chitinázu. Tieto polynukleotidy sú vybrané zo skupiny obsahujúcej: a) dvojprameňovú DNA obsahujúcu časti kódujúce proteín opísané v SEQ ID NO: 1 alebo v SEQ ID NO: 3, b) DNA, ktorá za stringentných podmienok hybridizuje s nekódujúcim prameňom DNA z bodu a), c)DNA, ktorá by z dôvodov redundancie genetického kódu hybridizovala za stringentných podmienok s nekódujúcim prameňom sekvencie DNA a) alebo b). Ďalej vektory obsahujúce hore uvedené DNA, najmä expresné vektory, kde je DNA účinne naviazaná na DNA kontrolujúcu expresiu.

Ďalej bunky stabilne transformované alebo transfektované týmito DNA a takým spôsobom, ktorý dovoľuje expresiu ľudskej chitinázy v danej hostiteľskej bunke. Chránené sú dalej metódy produkcie ľudskej chitinázy používajúce pestovanie takýchto hostiteľských buniek v živnom médie a izolácia ľudskej chitinázy z uvedených hostiteľských buniek alebo z uvedeného živného média. Ďalej purifikované a izolované polynukleotidy produkované týmito metódami, purifikované a izolované polypeptidy obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu ľudské chitinázy SEQ ID NO: 2 alebo 4, najmä aminokyseliny 1 až 445 tejto sekvencie, ďalej fragment ľudskej chitinázy postrádajúci aminokyselinové zvyšky 1 až 72 z C-konca prirodzenej ľudskej chitinázy, osobitne potom fragment ľudskej chitinázy SEQ ID NO: 14. Ďalej potom analóg ľudskej chitinázy SEQ ID NO: 15, hybridné bunkové línie produkujúce monoklonálne protilátky, ktoré špecificky reagujú s niektorým z hore opísaných polypeptidov a tiež monoklonálne protilátky produkované týmito hybridnými líniami.

Predložené sekvencie DNA tohto vynálezu zahŕňajú ako genomické a cDNA sekvencie tak i čiastočne alebo úplne chemicky syntetizované sekvencie DNA. Nukleotidové sekvencie dvoch ľudských cDNA kódujúcich predpokladané alelické varianty ľudskej chitinázy a zahŕňajúce nekódujúce 5' a 3' sekvencie sú ukázané v SEQ ID NO: la SEQ ID NO: 3. Tieto sekvencie DNA a sekvencie DNA, ktoré hybridizujú s nekódujúcim vláknom týchto DNA za štandardných stringentných podmienok alebo ktoré by hybridizovali v dôsledku redundancie genetického kódu sú v tomto vynálezu uvažované. Predložené DNA tohto vynálezu obsahujú kódujúci región ľudskej chitinázy (korešpondujúci s nukleotidmi 2 až 1402 SEQ ID NO: 1 alebo s nukleotidmi 27 až 1427 SEQ ID NO: 3) a predpokladanú kódujúcu sekvenciu hotovej, sekrétovanej ľudskej chitinázy - proteínu bez svojich signálnych sekvencií (nukleotidy 65 až 1402 SEQ ID NO: 1 alebo nukleotidy 90 až 1427 SEQ ID NO: 3).

Vzorové stringentné hybridizačné podmienky sú nasledujúce: hybridizácia pri 42^eC v 50% formamide a premytie pri 60’C v 0,1 x SSC, 0,1% SDS. Tí, ktorí sú znalí odboru vedia, že sa vyskytujú odlišnosti od týchto podmienok v závislosti od dĺžky a obsahu GC nukleotidov sekvencie, ktorá je hybridizovaná. Štandardné postupy používané v odbore sú vhodné pre stanovenie presných hybridizačných podmienok (pozri Sambrook at al., 9.479.51 v Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

Dve aminokyselinové sekvencie ľudskej chitinázy sú ukázané na SEQ ID NO: 2 a 4. Sekvencia SEQ ID NO: 2 je kódovaná nukleotidivou sekvenciou SEQ ID NO: la SEQ ID NO: 4 je kódovaná nukleotidovou sekvenciou SEQ ID NO: 3. Predložené polynukleotidy tohto vynálezu zahŕňajú, popri polynukleotidoch opísaných hore, polynukleotidy, ktoré kódujú aminokyseliny -21 až 445 SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4 a ktoré sa líšia od polynukleotidov opísaných v uvedených odsekoch len vďaka dobrej známej degenerovanosti genetického kódu. Podobne je to v ďalšom prípade. Vzhľadom na to, že 21 aminokyselín (pozícia -21 až -1) SEQ ID NO: 2 a 4 obsahujú signálny peptid, ktorý sa odštiepi pri vzniku finálneho proteínu ľudskej chitinázy, obsahujú uprednostňované polynukleotidy kódované polypeptidmi obsahujúcimi aminokyseliny 1 až 445 SEQ ID NO: 2 alebo SEQ ID NO: 4.

Popri mnohých ďalších použitiach polynukleotidov predkladaného vynálezu, dajú sa polynukleotidy použiť ako hybridizačná próba na identifikáciu a izoláciu genómickej DNA kódujúcej ľudskú chitinázu. Ďalej potom na identifikáciu a izoláciu génov iného ako ľudského pôvodu kódujúcich proteíny homológne k ľudskej chitináze, na identifikáciu ľudských proteínov a proteínov iného pôvodu ako ľudského, ktoré sú podobné ľudskej chitináze (vrátane tých, ktoré sa pravdepodobne podieľajú na remodelácii) a na identifikáciu tých buniek, v ktorých prebieha expresia ľudskej chitinázy a na identifikáciu biologických podmienok za ktorých je tento proteín exprimovaný.

Z inej strany zahŕňa vynález biologické kópie (rešp. kópie izolovaných sekvencií DNA vytvorené in vivo alebo in vitro) sekvencií DNA vynálezu. Ďalej sú chránené samostatne sa replikujúce rekombinantné konštrukty, ako sú plazmidy alebo vektory z vírusovej DNA inkorporujúce chitinázové polynukleotidy vrátane niektorej z DNA opísaných hore. Predkladané vektory zahŕňajúce expresné vektory v ktorých je inkorporovaná cDNA, kódujúca chitinázu, účinne spojená s endogénnou alebo heterológnou kontrolnou sekvenciou expresie a transkripčným terminátorom. Takéto expresné vektory môžu ďalej obsahovať sekvencie DNA kódujúce polypeptidy operabilne spojené so sekvenciami DNA kódujúcimi chitinázu. Takéto vektory môžu byt exprimované a vytvorit tak fúzne proteíny obsahujúce polypeptid o ktorý máme záujem.

Podlá inej strany vynálezu sú prokaryotické alebo eukaryotické hostitelské bunky stabilne transformované alebo transfektované sekvenciami DNA opísanými vo vynáleze s cielom expresie chitinázových produktov v týchto bunkách. Hostitelské bunky exprimujúce chitinázové produkty môžu slúžit na rozličné užitočné účely. Takéto bunky vytvárajú hodnotný zdroj imunogénov pre vývoj protilátok špecificky imunoreagujúcich s chitinázou. Hostitelské bunky opísané vo vynáleze sú použitelné pri metódach veľkokapacitnej produkcie chitinázy, pri ktorej sú bunky pestované vo vhodnom živnom médie a požadované polypeptidické produkty sú izolované napr. imunoafinitnou purifίλή c iou z buniek alebo z média, v ktorom sú bunky pestované.

Chitinázové produkty môžu byť získané izoláciami z prírodných bunkových zdrojov alebo môžu byť chemicky syntetizované. Sú ale prednostne produkované rekombinantnými technikami zahŕňajúcimi prokaryontné alebo eukaryontné hostitelské bunky opísané v tomto vynáleze. Chitinázové produkty opísané v tomto vynáleze môžu byť polypeptidy plnej dĺžky, ich fragmenty alebo analógy. V tomto vynáleze sú uvažované chitinázové produkty majúce celú alebo časť aminokyselinovej sekvencie opísanej v SEQ ID NO: 2 alebo v SEQ ID NO: 4. V SEQ ID NO: 14 je ukázaný jeden fragment postrádajúci oproti finálnemu proteínu 72 aminokyselinových zvyškov na C-konci. Bolo stanovené, že týchto 72 aminokyselinových zvyškov z C-konca nie je kritických pre chitinázovú enzymatickú aktivitu. Príklad 5 ilustruje produkciu tohto C-koncového fragmentu. Vnesenie stop kodónu za kodón pre aminokyselinu 373 malo za následok vznik rekombinantného chitinázového fragmentu s veľkosťou 39 kDa, ktorý si, v porovnaní s rekombinantnou ľudskou chitinázou plnej dĺžky, podržal podobnú špecifickú aktivitu.

Analógy môžu obsahovať chitinázové analógy, v ktorých sú jedna alebo viac špecifických (to znamená prírodné kódovaných) aminokyselín vyberané, nahradené alebo je pridaná jedna alebo viac nešpecifických aminokyselín a to: 1) bez straty jednej alebo viacerých enzymatických aktivít alebo imunologických charakteristík špecifických pre chitinázu, alebo 2) so špecifickou stratou určitej biologickej aktivity chitinázy. Príklad 3 ilustruje produkciu takého analógu (SEQ ID NO: 15). V tomto analóg je prolín v pozícii 370 nahradený serínom a 72 aminokyselinových zvyškov na C-konci je vyberaných. Tiež sa predpokladá, že použitie cicavčích hostiteľských buniek zaistí posttranslačné modifikácie (napr. myristolácie, glykozylácie, skrátenie, lipidácie a fosforylácie na tyrozíne, treoníne alebo seríne), ktoré môžu byť potrebné na dosiahnutie optimálnej biologickej aktivity rekombinantných expresných produktov opísaných v tomto vynáleze.

Proteíny alebo iné molekuly, ktoré sa viažu na chitinázu môžu byť použité na moduláciu jej aktivity. Látkami obsiahnutými v tomto vynáleze sú tiež protilátky, od nich odvodené látky (napr. monoklonálne a polyklonálne protilátky, jednoreťazcové protilátky, chimerické protilátky, CDR protilátky [CDR grafted] apod.) a ďalšie väzbové proteíny - špecifické pre chitinázu. Proteíny alebo ďalšie molekuly (napr. malé molekuly), ktoré sa špecificky viažu na chitinázu môžu byt identifikované pri použití chitinázy izolovanej z plazmy, rekombinantnej chitinázy, obmenených chitináz alebo pri použití buniek produkujúcich také produkty. Väzbové proteíny sú využiteľné na zmeny aktivity chitinázy, ako látky v imunizačných zmesiach.

Pri použití známych imunologických postupov sú tieto látky využiteľné tiež na purifikáciu chitinázy, na detekciu a kvantifikáciu chitinázy v tekutinách a vzorkách tkanív. Antiidiotypické protilátky proti protilátkam špecifickým proti chitináze sú vo vynáleze tiež uvažované.

Vedecká hodnota informácií prinesených v tomto vynáleze objavom aminokyselinovej sekvencie a sekvencie DNA je zrejmá. Jeden z mnohých príkladov: znalosť sekvencie cDNA chitinázy umožňuje izoláciu (hybridizáciou DNA/DNA) sekvencie genómickej DNA kódujúcej chitinázu a chitinázovej expresnej kontrolnej a regulačnej sekvencie ako sú promótory, operátory apod. DNA/DNA hybridizačné postupy, vykonávané so sekvenciou DNA opísanou vo vynáleze za stringentných podmienok štandardných v odbore, by mali rovnako umožniť izoláciu DNA kódujúcich ludské alelické varianty chitináz a ďalšie štruktúrne príbuzné ludské proteíny majúce jednu alebo viacej biochemických a (alebo) imunologických vlastností chitinázy. Ďalej by tieto postupy mali umožniť izoláciu proteínov homológnych s chitinázou z iných druhov ako z človeka. Informácie o sekvencii DNA poskytovanej v tomto vynáleze tiež umožňujú vývoj (pri použití homológnych rekombinácií alebo pomocou knockout stratégií (pozri napr. Kapecchi, Science 244: 1288-1292, 1989)) hlodavcov, ktorí nie sú schopní exprimovať funkčnú chitinázu, ktorí over-exprimujú chitinázu, alebo ktorí exprimujú odlišný variant chitinázy. Vhodne označené polynukleotidy obsiahnuté vo vynáleze je možné použiť na hybridizačné stanovenie s cieľom detekovať schopnosť buniek syntetizovať chitinázu. Polynuklaotidy obsiahnuté vo vynáleze môžu byť základom pre diagnostické metódy použiteľné na identifikáciu genetických zmien (genetickej zmeny) v chitinázovom lokuse, ktoré predstavujú základ chorobného stavu či stavov. Vďaka vynálezu sú tiež dostupné antisense polynukleotidy, ktoré sú dôležité na reguláciu expresie chitinázy bunkami, ktoré ju zvyčajne exprimujú.

Cieľom vynálezu je aplikácia chitinázových preparátov opísaných vo vynáleze cicavcom, najmä potom ľuďom, s cieľom zlepšenia chorobných stavov spôsobených parazitmi, ktorí obsahujú chitín ako napr. hubami a plesňami. Fungálne infekcie (mykózy) napr. candidióza, aspergilóza, coccidioidomykóza, blastomykóza, paracoccodioidomykóza, histoplazmóza, cryptococcóza, chromoblastomykóza, sporotrichóza, mucormyóza a dermatofytóza sa môžu manifestovať ako akútne alebo chronické. Pri imunokompromisných hostiteľoch spôsobujú patogénne plesne vážne, často fatálne ochorenia. Pacienti trpiaci rakovinou, pacienti, ktorí boli ošetrovaní chemoterapiou, jedinci so zníženou imunitou, jedinci nakazení HIV ľahko podliehajú mykózam spôsobeným plesňami Candida, Aspergillus, Pneunocystis carinii a ďalšími. Amphotericin B a fluconazol sú užitočné terapeutiká proti fungálnym infekciám, toxickosť týchto látok však spôsobuje vážne nepriaznivé vedľajšie účinky, ktoré limitujú ich použiteľnosť. Úmrtnosť na systémovú candidiózu je väčšia ako 50 % a to napriek ošetreniu Amphotericinom B. Je preto potrebná látka potlačujúca rast hub a plesní in vivo. Takýto produkt môže byť použitý ako samotná látka alebo v kombinácii so súčasne schválenými konvenčnými antifungálnymi prípravkami. Pretože rastúce huby a plesne vyžadujú na prežitie syntézu chitínu, mohla by byt inhibícia tejto syntézy rekombinantnou ľudskou chitinázou použiteľná na obmedzenie plesňových infekcií in vivo. Modely plesňových infekcií u zvierat sú opísané ďalej v príkladoch 8 až 14 a boli opísané v odbore.

Vo vynáleze sú najmä brané do úvahy chitinázové zmesi na použitie v metódach ošetrenia cicavcov náchylných k plesňovým infekciám alebo trpiacich plesňovými infekciami. Tieto metódy zahŕňajú aplikáciu chitinázy cicavcom v množstve dostatočnom na podporu endogénnej chitinázovéj aktivity. Do úvahy sa berie, že chitináza môže byť aplikovaná s ostatnými konvenčnými antifungálnymi látkami vrátane Amphotericinu B a štruktúrne príbuzných látok nystatinom a imaricinom, 5-fluorocytozínom, azolovými derivátmi ako sú flukonazol, ketokonazol, clotrimazol, mikonazol, ekonazol, butokonazol, oxikonazol, sulkonazol, terkonazol, itrakonazol a tiokonazol, alylamíny-tiokarbamáty ako sú tolnaftát, naftifin, terbinafin, ďalej griseofulvinom, cy11 klopiroxolamínom, haloproginom, undecylénovou kyselinou a benzoovou kyselinou (pozri napr. Goodman & Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9^th ed., McGraw-Hill, New York (1996)).

Chitinázy môžu zvýšiť účinnosť týchto konvenčných protiplesňových prípravkov pravdepodobne tým, že sú plesne po ich použití citlivejšie na pôsobenie týchto konvenčných prípravkov a to dokonca aj v situáciách, kde samotná chitináza nemá inhibičný účinok na rast plesní. Znížením množstva konvenčných protiplesňových látok potrebného na dosiahnutie terapeutického účinku, môžu chitinázy dovoliť používať tieto látky v menej toxických dávkach. Davies a Pope (Náture, 173: 235-236 (1978)) napr. opisujú, že aplikácia mykoláz (enzýmov, ktoré degradujú bunkovú stenu hub) v kombinácii s bežne neúčinnými dávkami antifungálnych látok myšiam infikovaným Aspergillus mala synergický účinok. Bolo pozorované, že kombinácia fungálnej chitinázy a laminarinázy bola účinnejšia v napadaní bunkových stien hub ako jednotlivé enzýmy pôsobiace samostatne.

Vo vynáleze sa preto uvažuje o použití chitinázy v príprave liekov s profylaktickým alebo terapeutickým účinkom proti fungálnym infekciám a ďalej o použití chitinázy v príprave liekov, ktoré by boli podávané spoločne s inými antifungáInými látkami.

Terapeutickofarmaceutické zloženie, uvažované vo vynáleze zahŕňa chitinázu a fyziologicky vhodné rozpúšťadlo alebo nosič a môže tiež obsahovať iné antifungálne látky. Ďalej uvádzané veľkosti dávok by boli dostatočné na podporu endogénnej chitinázovej aktivity. Pre všeobecné úvahy o dávkach pozri Remington: The Science and Practise of Pharmacy, 19^th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). Dávky sa budú pohybovať medzi cca 1 ug/kg do 100 mg/kg telesnej hmotnosti a prednostne medzi cca 0,1 až 20 mg/kg telesnej hmotnosti. Terapeutické zloženie opísané vo vynáleze môže byť aplikované rôznymi spôsobmi v závislosti od infekcie, ktorá je ošetrovaná, vrátane aplikácie, subkutánnej, vnútrosvalovej, intravenóznej, intrapulmonárnej, transdermálnej, intratekálnej, miestnej, ústnej alebo čapíkom.

Vo vynáleze sa tiež uvažuje o tom, že over-expresia chitinázy pri Gaucherovej chorobe alebo v miestach zápalu (napr. pri reumatickej artritíde) by mohla mat zhubné vplyvy na extracelulárnu matrix a pri takýchto chorobách môžu mať inhibítory chitinázovej aktivity terapeutický účinok, napr. znížením, premenou alebo zničením extracelulárnej matrix.

cDNA ľudskej chitinázy, opisovaná vo vynáleze, bola izolována z cDNA knižnice makrofága. Je známe, že makrofágy hrajú dôležitú úlohu pri reumatickej artritíde (Feldman et al., Celí, 85:307-310 (1996)) a produkty makrofágov ako sú TNF-α majú za následok rozvoj choroby. Proteín s homológiou k ľudskej chitináze - C-gp39 - bol detekovaný v synóvie a chrupke pacientov s reumatickou artritídou. Zatiaľ čo prirodzeným substrátom ľudskej chitinázy je pravdepodobne chitín z patogénnych organizmov, môže enzým vykazovať aktivitu tiež pri použití endogénnych makromolekúl, ktoré tvoria prirodzenú extracelulárnu matrix. Predpokladá sa napríklad, že hyalurónová kyselina, dôležitá súčasť extracelulárnej matrix obsahuje jadro chitínových oligomérov (Semino et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 4548-4553 (1996); Varki, Proc. Natl. Acad. Sci., 93: 4523-4525 (1996)). Chitinázy môžu byt preto zahrnuté v procese degradácie extracelulárnej matrix pri chorobách ako je reumatická artritída. Úloha chitinázy môže byť stanovená meraním hladín chitináz a/alebo efektu aplikácie chitináz alebo inhibície chitináz v synóvie izolovanom z artritických kĺbov. Endogénne hladiny chitináz môžu byť merané enzymatickým testom alebo pomocou protilátok. Viskozita sinóvia môže byť meraná pred a po ošetrení chitinázou. Zníženie viskozity v spojení s chi13 tinázou by zodpovedalo teórii endogénneho chitinázového substrátu. Modifikácia chitinázovéj aktivity by mohla preto modulovať postup ničenia kĺbov počas reumatickej artritídy.

Vo vynáleze je tiež uvažované o metódach plošného vyhľadávania inhibítorov aktivity chitináz, ktoré by mohli byť použiteľné spôsobom, opísaným v predchádzajúcom odseku. Metóda pre plošné vyhľadávanie látok, ktoré inhibujú chitinázu je opísaná napríklad vo WO 95/34678 publikovanom 21. decembra 1995.

Ďalej je vo vynáleze uvažované o metódach merania endogénnych hladín chitináz napr. na diagnostiku Gaucherovej choroby. Hollak et al. (J. Clin.Invest., 93:1288-1292 (1994)) v svojej správe píše, že hladina chitinázy v plazme je diagnostickým markérom Gaucherovej choroby. Predpokladá sa, že sa rekombinantné proteíny, tak ako sú opísané v tomto vynáleze, využijú viac ako ľudské preparáty, s ktorými sú spojené problémy s výťažnosťou a kontamináciou ďalšími nečistotami alebo infekčnými látkami.

Príklady rozpracovania vynálezu

Ďalšie stránky a prednosti predkladaného vynálezu budú pochopené po úvahe nad nasledujúcimi ilustratívnymi príkladmi. Príklad 1 opisuje izoláciu ľudských klonov cDNA chitinázy z ľudských makrofágových cDNA knižníc. Príklad 2 určuje spôsob expresie chitinázových génov v rôznych ľudských tkanivách. Príklad 3 opisuje rekombinantnú expresiu ľudských chitinázových génov v prokaryotických bunkách a purifikáciu výsledného enzýmu. Príklad 4 poskytuje postup rekombinantnej produkcie ľudskej chitinázy v kvasinkách. Príklad 5 opisuje rekombinantnú expresiu génu ľudskej chitinázy v cicavčích bunkách a purifikáciu výsledného proteínu. Príklad 6 opisuje produkciu polypeptidových analógov ľudskej chitinázy syntézou peptidov alebo metódami rekombinantnej produkcie. Príklad 7 poskytuje protokol prípravy monoklonálnych protilátok, ktoré špecificky imunitné reagujú s ľudskou chitinázou. Príklad 8 opisuje test merania katalytickej aktivity chitinázy. Príklad 9 opisuje stanovenie antifungálnej aktivity ľudskej chitinázy in vitro. Príklad 10 opisuje stanovenie antifungálnej aktivity ľudskej chitinázy in vivo na myším modele a príklady 11 až 14 opisujú králičie modely invazívnej aspergilózy, rozšírenej kandidózy, Candida ophthalmitis a Candida endokarditis.

Príklad 1

Izolácia klonov cDNA chitinázy cDNA knižnica bola pripravená z makrofagov odvodených z monocytov periférnej krvi podľa postupu opísaného v práci Tjoelkera et al., Náture, 374: 549-552 (1995). Klony z knižnice náhodne vybrané a plazmidová DNA bola purifikovaná z individuálnych klonov. Sekvencie asi 300 až 500 báz z konca DNA každého z klonov bola stanovená na automatickom sekvenátori (Model 373, Applied Biosystems, Foster City, CA) s použitím prajmeru JHSP6, ktorý hybridizuje s plazmidovým vektorom pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA), ktorý susedí s klonovacím miestom cDNA:

JHSP6 5'- GACACTATAGAATAGGGC - 3' (SEQ ID NO:5).

Nukleotidové a aminokyselinové sekvencie (z nukleotidovej odvodená) týchto klonov cDNA boli porovnané so sekvenciami v nukleotidových a peptidových sekvenčných databázach za účelom stanovenia podobnosti so známymi génmi. Porovnanie sekvencií bolo vykonané pomocou BLAST NetWork Service of the National Center for Biotechnology Information s použitím porovnávacieho algoritmu publikovaného v Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Kloň MO-911 vykazoval signifikantnú homológiu s niekoľkými rôznymi sekvenciami, vrátane prekurzoru sekrečného proteínu YM-1 myšieho makrofága (Genbank accession no. M94584), proteínu ľudskej chrupky gp-39 (Hakala et al., pozri hore), glykoproteínu vajcovodov oviec, kráv a ľudí (DeSouza et al., pozri hore) a chitináz z parazitov (Oncocerca, Genbank accession no. U14639), os (Chelonus, Genbank accession no U10422), rastlín (Nicotiana, Genbank accession no. X77111) a baktérií (Serratia, Genbank accession no. Z36295). Nejvyššia pozorovaná homológia bola k cicavčím génom, kódujúcim proteíny s chitinázovou homológiou, ale bez demonštrovanej chitinázovéj aktivity. Ďalšia sekvenčná analýza MO-911 ukázala, že obsahuje čast kódujúcej oblasti homológa ľudskej chitinázy.

Sekvencia DNA klonu pMO-218 (vloženého 7. júna 1996 za podmienok Budapest Treaty with the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A.” pod číslom (Accession No.) 98077) je ukázaná v SEQ ID NO:1 a kódovaná aminokyselinová sekvencia je ukázaná v SEQ OD NO: 2. MO-218 zrejme zahŕňal celý kódujúci región cDNA ľudskej chitinázy (nukleotidy 2 až 1402 SEQ ID N0:l), ktorý obsahuje pravdepodobnú signálnu sekvenciu s 21 aminokyselinami nasledovanú 445 kódovanými aminokyselinami (aminokyselinové zvyšky 1 až 445 SEQ ID NO:2). 22 aminokyselín nasledujúcich za pravdepodobnou signálnou sekvenciou presne zodpovedá aminokoncovej sekvencií purifikovanej chitotriozidázy opísanej v práci Renkemy et al. (pozri hore). Renkema et al. tiež opísali 21 aminokyselinovou sekvenciu z tryptického fragmentu ľudskej chitotriozidázy, ktorá presne zodpovedá zvyškom 157 až 177 MO2118 (SEQ ID NO:2). Boot et al. (pozri hore) opísali klonovanie cDNA ľudskej chitotriozidázy, ktorá obsahuje kódujúce sekvencie presne identické so sekvenciami MO-218. Sekvencia MO-218 sa líši od sekvencie Boota et al. dodatočnými štrnástimi nukleotidmi na 5' konci a zmenou nukleotidov na nukleotide 330 v kódujúcej oblasti.

Aby sa potvrdilo, že MO-218 skutočne obsahuje celú kódujúcu oblasť cDNA bola pripravená sonda P-l značená ³²P (TGGGATCATCAGCAGGACCATGAAACCTGCCCAGGCCACAGACCGCACCAT,

SEQ ID N0:6), ktorá zodpovedá doplnkovým nukleotidom 2 až 52 MO-218 (SEQ ID NO:l). Sonda P-l bola navrhnutá tak, aby hybridizovala s klonmi, ktoré sú aspoň tak dlhé ako 5' koniec MO-218. Sonda bola hybridizovaná s časťou (približne 30 000 klonov) cDNA knižnice ľudských makrofágov opísanou skôr. Hybridizačné podmienky boli nasledujúce: 40% formamid, hybridizačný tlmivý roztok (5x SSPE, lOx Denhardťs, 100 ug/ml denaturovanej spermovej DNA z lososa a 2% SDS) pri 42°C cez noc. Filtre boli premyté a tri klony, ktoré hybridizovali boli vybrané na sekvenčnú analýzu. Najdlhší kloň bol označený pMO-13B (vložený 7. júna 1996 za podmienok Budapešť Treaty with the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A.” pod číslom (Accession No.) 98078). Sekvencia DNA pMO-13B je ukázaná v SEQ ID NO:3 a kódujúca aminokyselinová sekvencia je ukázána v SEQ ID NO:4. Tento kloň obsahuje 25 dodatočných nukleotidov na 5' konci v porovnaní s MO-218. Ďalej obsahuje MO-13B (SEQ ID NO:3) jednu nukleotidovú substitúciu na nukleotide 330 (čo zodpovedá nukleotidu 305 MO-218, SEQ ID NO:1), ktorá mení kódovanú aminokyselinu na pozícii 80 hotového proteínu z glycínu (v SEQ ID NO:2) na serin (SEQ ID NO:4).

Príklad 2

Spôsob expresie génu chitinázy v ľudských tkanivách

Na identifikáciu tkanív, v ktorých je exprimovaná ľudská chitináza bola uskutočnená analýza pomocou northern blotov. Hromadné northern bloty ľudských tkanív (Clontech, Palo Alto, CA) boli hybridizovaná s celou kódujúcou oblasťou MO-218 za štandardných stringentných podmienok (podľa laboratórneho manuálu firmy Clontech). Najväčšia hybridizácia bola pozorovaná u pľúcneho tkaniva (+++) a vaječníkov (+++), oveľa menšia hybridizácia (+) bola pozorovaná u týmusu a placenty. Veľkosť hybridižujúcej mRNA bola 2kb pre pľúce, vaječníky a týmus, čo dobre zodpovedá veľkosti klonovanej cDNA (1,6 kb alebo 1,8 kb vrátane polyA konca). Veľkosť hybridizovanej mRNA placenty bola značne menšia - 1,3 kb. Chitinázová hybridizácia nebola pozorovaná u sleziny, prostaty, vajiec, tenkého čreva, časti hrubého čreva, periférnych krvných leukocytov, srdca, mozgu, pečene, kostrových svalov, obličiek alebo pankreasu. Expresia chitinázy v pľúcach je v súlade s jej ochrannou úlohou proti patogénnym organizmom, ktoré obsahujú chitín, pretože pľúce predstavujú hlavnú cestu vstupu fungálnych patogénov.

Príklad 3

Produkcia rekombinantnej ľudskej chitinázy v bakteriálnych bunkách

Finálna kódujúca oblasť MO-218 bola naplánovaná pre expresiu v E. coli ako analóg skrátený o C-koniec. Na vytvorenie fragmentu DNA vhodného na expresiu bola použitá PCR s použitím prajmeru zodpovedajúceho nukleotidom 65 až 88 MO-218 cDNA chitinázy, pred ktorým bol inicializačný metionínový kodón a miesto pre reštrikčnú endonukleázu Xbal (5'-TACATCTAGAATTATGGCAAAACTGGTCTGCTACTTCACC-3' SEQ ID NO:7) a ďalej prajmer kódujúci nukleotidy 1163 až 1183 MO-218 nasledovaný stopkodónom a miestom HindlII (5'-AGATCTAACCTTAGGTGCCTGAAGACAAGTATGG-3', SEQ ID NO:8). Prajmer obsahuje ďalej v kódujúcej sekvencií na mieste nukleotidovej bázy 25 adenín, zatiaľ čo sekvencia MO-218 obsahuje na zodpovedajúcej nukleotidovej pozícii guanín. Následkom toho obsahuje výsledná časť DNA tymín miesto cytozínu na pozícii zodpovedajúcej nukleotidu 1172 sekvencie MO-218 a kódovaná časť chitinázy, ukázaná v SEQ ID NO:15, je tiež analóg, ktorý obsahuje serín v hotovom proteíne na pozícii 370 miesto pro18 línu kódovaného MO-218. Výsledný fragment DNA bol štiepený s pomocou Xbal a HindlII a klonovaný do plazmidu pAraBAD (ktorý je tiež známy pod označením pAraCB).

Plazmid pAraCB bol pripravený nasledovne: plazmid pUC19 bol modifikovaný tak, aby obsahoval arabinózový promótor a následne, aby obsahoval kódujúcu sekvenciu AKAP 79. Arabinózový promótor (Wilcox et al., Gene, 34: 123-128 (1985), Wilcox et al., Gene, 18:157-163 (1982)) a gén araC boli amplifikované pomocou PCR z arabinózového operónu BAD Salmonella typhimurium ako časť EcoRI/Xbal s prajmermi araC-2 (SEQ ID NO:9) a arab-1 (SEQ ID NO:10):

AraC-2 TACAGAATTCTMTTCACATCCGGCCCTG SEQ ID NO:9

Arab-1 TACATCTAGACTCCATCCAGAAAAACAGGTATGG SEQ ID NO:10

Prajmer araC-2 kóduje miesto EcoRI (podtrhnuté) a terminačný kodón (kurzíva) pre produkt génu araC. Prajmer arab-1 kóduje pravdepodobne väzbovú doménu pre ribozómy (kurzíva) a reštrikčné miesto Xbal (podtrhnuté). PCR s týmito prajmermi produkuje 1,2 kb veľký fragment, ktorý bol štiepený EcoRI a Xbal a subklonovaný do pUCl9 (New England Biolabs, Beverly, MA), ktorý bol predtým štiepený rovnakými dvoma enzýmami. Výsledný plazmid bol označený araCB a obsahoval polylinkerový región (SEQ ID NO:11) obklopený na 5' konci reštrikčným miestom Xbal (podtrhnuté) a na 3 * konci miestom HindlII (kurzíva).

AraCB polylinker TCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT SEQ ID NO:11.

Transformanty obsahujúce výsledný expresný plazmid (pAraMO218) boli indukované arabinózou a pestované pri 37°C. Tieto transformanty produkovali inkluzívne telieska obsahujúce 39 kDa proteín, ktorý bol skrátenou formou chitinázy (bola vyprojektovaná tak, aby obsahovala 373 namiesto 445 aminokyselín). Táto časť chitinázy obsahuje štyri cysteínové zvyšky, zatiaľ čo chitináza úplnej dĺžky obsahuje desať cysteínových zvyškov. Inkluzívne telieska boli oddelené od kultúry E. coli a podrobené SDS-PAGE elektroforéze. Prúžok s veľkosťou 39 kDa bol prenesený na PVDF membránu a aminokyselinový koniec bol sekvenovaný. Väčšina (asi dve tretiny) vzorky obsahovala sekvenciu zodpovedajúcu aminokyselinovému koncu ľudskej chitinázy. Zvyšok vzorky zodpovedal kontaminujúcemu proteínu E. coli - porínu. Rekombinantná príprava chitinázy z E. coli bola použiteľná na produkciu polyklonálnych a monoklonáIných protilátok (opísané ďalej v príklade 7).

Keď boli transformanty obsahujúce Ara-chitinázový expresný plazmid pestované pri 25 · C, neboli inkluzívne telieska pozorované a expresia rekombinantného produktu sa znížila z asi desiatich percent celkových bunkových proteínov na asi jedno percento. Tento materiál produkovaný pri 25C však vykazoval katalytickú aktivitu chitinázy.

Príklad 4

Produkcia rekombinantnej ľudskej chitinázy v kvasinkách

Tento príklad obsahuje ukážkové postupy rekombinantnej expresie ľudskej chitinázy v kvasinkách a purifikácie výsledného rekombinantného proteínu. Kódujúca oblasť ľudskej chitinázy je vnesená do vektorov pre expresiu v Saccharomyces cerevisiae s použitím buď PCR alebo spojovacích oligonukleotidov (linker oligonucleotides). Vektory sú navrhnuté tak, že kódujú fúzny polypeptid obsahujúci sekréciu sprostredujúcu sekvenciu (secretion médiating leader) a kódujúcu oblasť ľudskej chitiná zy zodpovedajúcu aminkyselinovému koncu prirodzenej molekuly. Sekrečné signálne peptidy zahŕňajú napr. SUC2 alebo ekvivalentné leadre s funkčnými miestami pre signálne peptidázy alebo s pre-pro-alfa faktormi alebo inými komplexnými leadermi skladajúcimi sa z pre alebo signálneho peptidu a pre alebo spacer regiónu, ktorý nesie miesto pre štiepenie KEX2. DNA, kódujúca signálnu sekvenciu, môže byť získaná buď syntézou oligonukleotidov alebo pomocou PCR. DNA, kódujúca pre-pro alfa faktor leader, je získaná pomocou PCR. Použité prajmery obsahujú nukleotidy 1 až 20 génu alfa mating faktoru a ďalej nukleotidy komplementárne k nukleotidom 255 až 235 tohto génu (Kurjan a Herskowitz, Celí, 3:933-943 (1982)). Kódujúce sekvencie pre-pro-alfa leadru a kódujúce sekvencie ludskej chitinázy sú ligované do plazmidu obsahujúceho kvasinkový promótor alkohol dehydrogenázy (ADH2). Týmto spôsobom riadi promótor expresiu fúzneho proteínu. Ako učili Rose a Broach (Meth. Enz., 185: 234-279, D.Goeddel, ed., Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990)), vektor ďalej zahŕňa ďalej od klonovacieho miesta transkripčný terminátor ADH2, kvasinkový replikačný počiatok 2-mikrón, selektovatelný markér napr. TRPÍ, CUP1 alebo LEU2 (či LEU2-d) alebo iný ekvivalentný gén. Ďalej vektor obsahuje kvasinkové gény REP1 a REP2, gén pre betalaktamázu E. coli a replikačný počiatok E. coli. Gény pre betalaktamázu a TRPÍ poskytujú možnosť selekcie v baktériách respektíve v kvasinkách. Gény REP1 a REP2 kódujú proteíny, ktoré hrajú úlohu pri replikácii počtu kópii plazmidu.

Môžu byť tiež zvolené iné fúzne body vnútri kódujúcej oblasti chitinázy. Môže byť použité krátenie kódujúcej sekvencie za účelom zvýšenia homogenity produktu, zvýšenie špecifickej aktivity alebo zmena substrátovej špecifickosti.

DNA konštrukty opísané v predchádzajúcom paragrafe sú transformované do kvasinkových buniek pri použití známych metód, napr. pri použití octanu lítneho (Stearns et al, Meth. Enz., pozri hore, str. 279-280) alebo iných rovnocenných metód. ADH2 promótor je indukovaný vyčerpaním glukózy v rastovom médie (Price et al., Gene, 55:287 (1987)). Pre-pro alfa sekvencie alebo iné leader sekvencie ovplyvňujú sekréciu fúzneho proteínu, uvoľňovanie hotového peptidu ľudskej chitinázy z buniek. Signálny peptidový leader je spracovaný signálnou peptidázou alebo ako v prípade pre-pro alfa vyberaním príslušnej oblasti KEX2 preoteázou (Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 5330-5334 (1984)).

Chitináza obsahuje v svojej prirodzenej aminokyselinovej sekvencii dve dvojbázické sekvencie v pozíciách 107-108 , (LysArg) a 209-210 (Arg-Lys), ktoré môžu byť odrezané proteázou KEX2 počas sekrécie. Na stabilizáciu a (alebo) zvýšenie hladiny produktu sekrétovaného z buniek môžu byť tieto sekvencie mutované tak, aby potenciálne miesta proteolýzy boli eliminované (ako ukázal Gillis et al., Behring Inst. Mitt., No.83:1-7, 1988). Chitináza môže byť tiež exprimovaná bez modifikácií dvojbázických sekvencií, ale v hostiteľských bunkách, ktoré sú KEX2 deficientné. Takéto hostiteľské bunky môžu byť získané buď plošným vyhľadávaním (screening) mutantov neobsahujúcich KEX2 proteázu alebo manipuláciou s genómickým KEX2 lokusom pomocou génových metód nahradzujúcich alebo rozrušujúcich gény (gene replacement/gene disruption technigues (Orr-Weaver et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78: 6354-6358 (1981)).

Rekombinantná chitináza môže byť sekrétovaná z Saccharomyces cerevisiae pri použití podobných vektorov obsahujúcich alternatívne promótory PRB1, GAL4, TPI alebo iné vhodne silné promótory nesúce fragmenty alebo promótory vytvorené fúziou s jednou z mnohých leader sekvencií (Sleep et al., Bio/Technol., 8:42-46 (1990)). Ďalšie vhodné expresné hostitelia sú popri Saccharomyces cerevisiae tiež Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris a členové rodov Hansenula alebo Aspergillus. Analogické rekombinantná expresní systémy pre tieto kvasinky zahŕňajú organizmus a jeho vhodný autonómne replikovaný vektor (napr. Falcone et al., Plasmid, 15:248-252 (1988)) alebo násobné integrované expresné kazety. Tieto systémy sa tiež spoliehajú na signálne sekvencie alebo leadre opísané hore sprostredkovávajúce sekréciu do média.

Vylúčená rekombinantná ľudská chitináza je purifikovaná z kvasinkového rastového média napr. metódou použitou na purifikáciu chitinázy z bakteriálnych a cicavčích bunkových supernatantov (pozri príklad 3 hore a príklad 5, ktorý nasleduje).

Prirodzená forma rekombinantnej chitinázy môže byť tiež exprimovaná v cytoplazme buniek Saccharomyces cerevisiae alebo analogických hosťov a purifikovaná zo zlyzovaných hostiteľských buniek. Proteín môže byť opäť zbalený počas procesu purifikácie za účelom dosiahnutia vhodnej výšky špecifickej aktivity.

Príklad 5

Produkcia rekombinantnej ľudskej chitinázy v cicavčí bunkách

A. Expresia v COS bunkách

Boli izolované klony MO-218 a M0-13B, ktoré obsahovali ľudskou chitinázovú cDNA plnej dĺžky 3' až promótor CMV pRC/ CMV. Tretí plazmid, ktorý zodpovedá rovnakému C-koncovému fragmentu exprimovanému v bakteriálnych bunkách v príklade 3 (pozri hore) bol pripravený nasledovne: plazmid MO-218 bol amplifikovaný technikou PCR s použitím oligonukleotidového prajmeru 218-1 ( CGCAAGCTTGAGAGCTCCGTTCCGCCACATGGTGCGGTCTGTGGCCTGGG,

SEQ ID NO:12), ktorý obsahoval miesto pre HindlII a nukleotidy 2 až 23 MO-218 chitinázovej cDNA SEQ ID NO:1. Ďalej bol použitý komplementárny prajmer

T-END (GACTCTAGACTAGGTGCCTGAAGGCAAGTATG, SEQ ID NO: 13), ktorý obsahoval nukleotidy 1164 až 1183 MO-218, stop kodón a miesto Xbal. Amplifikovaná DNA bola purifikovaná elektroforeticky, rozštiepená Xbal a HindlII a klonovaná do vektoru pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA), ktorý bol rovnako vopred rozštiepený rovnakými reštrikčnými enzýmami. Spojky (junctions) výsledného klonu boli sekvenované pri použití prístroja Model 373 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Výsledná sekvencia predpokladaného proteínu, tak ako bol zostrojený, je ukázaná v SEQ ID NO:14.

Všetky tri plazmidy boli transfektované do buniek COS metódou DEAE transfekcie (pozri Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989)). Po troch dňoch pri 37C boli bunkové médiá testované na chitinázovú aktivitu in vitro ako je opísané ďalej v príklade 8. Každá z kultúr produkovala významné množstvo chitinázovej aktivity (600-800 mU/ml/min) a podobné množstvo bolo pozorované pre každý konštrukt.

Rekombinantná ludská chitináza bola purifikovaná nasledovne: päť dní po transfekcii COS buniek plazmidom pRc/CMV-MO13B boli obohatené médiá z kultúr zoberané a nariedené rovnakým objemom vody. Takto nariedené médiá boli aplikované na kolónu Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech, Uppsala, Švédsko), ktorá bola ekvilibrovaná v 25 mM Tris, 10 mM chloridu sodného, mM EDTA pri pH 8,0. Približne 95% chitinázovej aktivity prešlo cez kolónu a nenaviazalo sa na nosič. Frakcia, ktorá prešla cez Q-Sepharose bola upravená tak, aby koncentrácia síranu amónneho bola 1,2 M. Táto frakcia bola potom nanesená na kolónu Butyl-Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia), ktorá bola ekvilibrovaná v roztoku obsahujúcom 25 mM Tris, 1,2 M síran amónny, 1 mM EDTA pri pH 8,0. Proteín bol eluovaný pomocou obráteného gradientu síranu amónneho v rozmedzí koncentrácií od 1,2 M do 0 M v roztoku 25 mM Trisu pri pH 8,0. Pri nízkej koncentrácii solí bol eluovaný jeden absorpčný vrchol pri 280 nm zodpovedajúcej chitinázovej aktivite. Pomocou SDS-PAGE bolo stanovené, že čistota frakcie tomuto vrcholu zodpovedajúca bola viac ako 85 % a obsahovala približne 60 % chitinázovej aktivity. Potom bol vymenený tlmivý roztok na 20 mM Tris, 150 mM chlorid sodný, pH 8,0. Proteín bol ďalej skoncentrovaný pri použití membrány 10 000 MWCO (Ultrafree 10K, Millipore Corp., Bedford, MA). Výsledný preparát bol potom testovaný na enzymatickú a antifungálnu aktivitu in vitro tak, ako je opísané v príkladoch 8 a 9 (ďalej). Rekombinantný preparát mal chitotriozidázovou aktivitu (90 nm/min na mg proteínov).

B. Expresia v bunkách CHO

Gén chitinázy bol vnesený do pDEFl (konštrukcia pDEFl je opísaná v príklade 4 U.S. Appliction Seriál No. 08/847,218 podaný 1. mája 1997; tu je zahrnutý odkazom) vyberaním 1,77 kb HindlII/Xbal fragmentu obsahujúceho gén chitinázy plnej dĺžky z pRc/CMV/M0-13B a ligáciou tohto fragmentu s pDEFl štiepeným pomocou HindlII/Xbal. Týmto spôsobom vznikol plazmid pDEFl/ CTN.l. 1,77 kb HindlII/Xbal. Fragment obsahujúci gén pre chitinázu bol tiež ligovaný do pHDEFl štiepeným pomocou HindlII/ Xbal. Takto vznikol plazmid pHDEFl/CTN.l. Plazmid pHDEFl je rovnaký ako pDEFl až na dva rozdiely: 1) v pHDEFl je 19 párov báz (fragment Pmel/SalL) pDEFl nahradených 2kb fragmentom EheI/ SalL odvodeným z pCEP4 (Invitrogen, Carlsbad) a obsahujúcim hydromycín rezistentný gén 2) 212 párov báz dlhý fragment NheI/ Asp718 nachádzajúci sa v pDEFl je v pHDEFl nahradený 120 bp fragmentom Nhel/Asp718 obsahujúcim skrátený promótor 5V40, ktorý kontroluje expresiu génu pre dihydrofolátreduktázu (DHFR). Tento 120 bp fragment Nhel/Asp718 bol pripravený nasledujúcim postupom: najskôr bol 171 bp fragment amplifikovaný pomocou PCR. Ako prajmery boli použité oligonukleotidový prajmer 94-26 (5'- TGATACGGTACCGCCCCATGGCTGACTA - 3', SEQ ID NO:16), ktorý obsahoval nové miesto pre Asp718 a prajmer 94-27 (5' - GCAAGTTTGGCGCGAAATCG - 3', SEQ ID NO: 17). Ako templát bola použitá DNA z pDCl (písaný v príklade 4 U.S. Application Seriál NO. 08/847,218 podaný 1. mája 1997, 1997), ktorá niesla kazetu 5V40-DHFR. Nakoniec bol tento 171 bp PCR fragment štiepený pomocou Nhel a Asp718.

DHFR negatívna línia DG44 buniek CHO (Chinese hamster ovary, ovárium čínskeho chrčka) bola transfektovaná plazmidom pDEFl/CTN.l tak, ako je to opísané v príklade 5 U.S. Application Seriál No. 08/847,218 podaný 1. mája 1997. Bunková línia CHO DG44 bola tiež transfektovaná plazmidom pHDEFl/CTN.l. Po transfekcii nasledovala selekcia následným modifikovaným postupom. Najskôr boli bunky selektované len na rezistenciu k hygromycínu v médiách (DMEM/F-12 doplnené 2-10% dialyzovaného FBS) obsahujúcich hygromycín (800 mg/liter) (Calbiochem, San Diego), hypoxantín a tymidín (médiá pre prítomnosť týchto látok neboli selektívne pre gén DHFR). Po selekcii tranfektovaných buniek, ktoré boli rezistentné k hygromycínu, boli bunky ďalej selektované na expresiu génu DHFR ich pestovaním v médiách postrádajúcich hypoxantín a tymidín. Ďalším krokom bola selekcia DHFR pozitívnych a hygromycín rezistentných CHO buniek v médie obsahujúcom napred 10 nM, potom 20 nM a nakoniec 50 nM metotrexatu, a výsledkom boli bunky exprimujúce vysoké hladiny chitinázy.

Over-exprimovaná rekombinantná ľudská chitináza (rH chitináza) bola zo supernatantu pHDEFl/CTN.l transfektovaných CHO buniek purifikovaná nasledujúcim spôsobom: supernatant bol pred použitím iónomeničovej chromatografie zriedený 1:3 tlmivým roztokom A (20mM Tris, pH 7,0). Anión - iónomeničová kolóna naplnená nosičom Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) bola ekvilibrovaná tlmivým roztokom A a supernatant na ňu bol nanesený v množstve 151 na 11 nosiče. rH chitináza, ktorá sa nachádzala vo frakcii prešlej cez kolónu Q-Sepharose, bola pred rozdelením katión - iónomeničovou chromatografiou upravená tak, aby obsahovala 5 % polyetylénglykolu (PEG) 400 (Mallinckordt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ) a 30 mM octan sodný pri pH 4,3. Katión - iónomeničová kolóna naplnená CM-Sepharose Fast Flow (Pharmacia Biotech Inc., Pisscataway,

NJ) bola ekvilibrovaná 30 mM octanom sodným, 5 % PEG 400, pH

4,3 (tlmivý roztok B). Vzorka rH - chitinázy bola nanesená na kolónu CM-Sepharose v množstve 1 mg na ml iónomeniča. rH - chltináza bola eluovaná z kolóny tlmivým roztokom C (40 mM Tris, 5 % PEG 400, pH 7,5). Vzorka rH - chitinázy bola ďalej pripravená na rozdelenie chromatografiou využívajúcou hydrofóbne interakcie prídavkom (NH₄)₂SO₄ tak, aby výsledná koncentrácia bola 1,5 M. Kolóna naplnená Macro-Prep Methyl H1C Support (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) bola ekvilibrovaná tlmi vým roztokom D (20 mM Tris, 5% PEG 400, pH 7) obsahujúcim 1,5 M (NH₂)₂SO₄. Vzorka obsahujúca rH - chitinázu bola nanesená na kolónu Macro-Prep Methyl v množstve 1 mg na 1 ml nosiča. Kolóna bola premytá tlmivým roztokom D obsahujúcim 1,1 M (NH₂)₂SO₄ a rH - chitináza bola eluovaná tlmivým roztokom D obsahujúcim 0,2 M (NH₄)₂SO₄. Purifikovaný proteín bol prenesený membránovou filtráciou do tlmivého roztoku E (150 mM NaCl, 20 mM Tris, pH 7,0).

Príklad 6

Produkcia analógov a fragmentov ľudskej chitinázy

Rekombinantné techniky ako sú tie, ktoré boli opísané v predchádzajúcich príkladoch môžu byť využité na prípravu polypeptidových analógov alebo fragmentov ľudskej chitinázy. Presnejšie to znamená, že polynukleotidy kódujúce ľudskú chitinázu sú modifikované tak, aby pri použití dobre známych techník (ako je napríklad miestne riadená mutagenéza alebo polymerázová reťazová reakcia) kódovali užitočné polypeptidové analógy. C-koncové a N-koncové delécie môžu byť tiež pripravené napríklad vypustením príslušnej časti polynukleotidovej kódujúcej sekvencie (všeobecne pozri Sambrook (hore), kapitola 15). Modifikované polynukleotidy sú exprimované rekombinantné a rekombinantné polypeptidové analógy alebo fragmenty sú purifikované tak, ako je to opísané v predchádzajúcich príkladoch.

Aminokyselinové zvyšky kritické pre aktivitu ľudskej chitinázy boli identifikované napríklad sledovaním homológií k ďalším chitinázam a nahradením alanínov v natívnej ľudskej chitináze. Cysteíny sú často kritické pre funkčnú integritu proteínov, pretože majú schopnosť tvoriť disulfidické mostíky a fixovať tak sekundárnu štruktúru. Na objasnenie otázky či je akýkoľvek z cysteínov v ľudskej chitináze kritický pre jej enzymatickú aktivitu, bol každý cysteín mutovaný individuálne na serín.

Bol pripravený na C-konci skrátený fragment proteínu ľudskej chitinázy s veľkosťou 39 kDa, ako je opísané hore v príkladoch 3 a 5, vnesením stop kodónu za kodón pre aminokyselinu 373. Tento 39 kDa fragment postráda 72 aminokyselinových zvyškov na C-konci finálneho proteínu, vrátane šiestich cysteínov. Tento proteín si však ponechal podobnú špecifickú enzymatickú aktivitu v porovnaní s rekombinantnou ľudskou chitinázou celkovej dĺžky. Tento výsledok naznačuje, že schádzajúcich 72 C-koncových zvyškov, vrátane hore uvedených šiestich cysteínov, nie je nezbytných pre enzymatickú aktivitu.

Ďalšie C-koncové delécie môžu byť pripravené napríklad odštiepením 3' konca skrátenej kódujúcej sekvencie opísanej v príklade 3 exonukleázou III pôsobiacou po rôzne dlhý čas a potom ligáciou skrátenej kódujúcej sekvencie do DNA plazmidu kódujúceho stop kodóny vo všetkých troch čítacích rámčekoch. N-koncové delécie sú pripravené podobným spôsobom odštiepením 5' konca kódujúcej sekvencie a potom ligáciou odštiepeného fragmentu do plazmidu obsahujúceho sekvenciu promótoru a počiatočný metionín bezprostredne nadväzujúci na miesto promótoru. Tieto N koncové delečné analógy alebo fragmenty môžu byt tiež exprimované ako fúzne proteíny.

Popri tom je možné polypeptidové analógy ľudskej chitinázy pripraviť čiastočnou alebo úplnou chemickou syntézou peptidov pri použití techník známych v odbore (pozri napríklad syntézu IL-8 v Clark-Lewis et al., J.Biol.Chem., 266:2312823134 (1991), syntézu IL-3 v Clark-Lewis et al, Science, 231: 134-139 (1986) a syntézu ligáciou v Dawson et al., Science, 266:776-779 (1994). Takéto syntetické metódy tiež dovoľujú selektívne vnášanie nových neprirodzených aminokyselín a ďalšie chemické modifikácie.

Biologické aktivity, zahŕňajúce enzymatické, antifungálne aktivity a aktivity remodelujúce extracelulárnu matrix polypeptidových analógov ľudskej chitinázy sú stanovené technikami uznávanými v odbore ako napríklad technikou opísanou v príkladoch 8 až 14.

Príklad 7

Príprava monoklonálnych protilátok proti ľudskej chitináze

Monoklonálne protilátky proti ľudskej chitináze môžu byt pripravené dvoma nasledujúcimi postupmi (opakovanou alebo jednorázovou inokuláciou). Pri prvom postupe je myši opakovane injektovaná rekombinantná ľudská chitináza (napr. 10 - 20 ug emulgovaných v kompletnom Freundovom adjuvans) získaná spôsobom opísaným v príkladoch 3 až 6. Pred fúziou je myši podaná posledná dávka ľudskej chitinázy v PBS a po štyroch dňoch je myš usmrtená a jej slezina vyberaná. Zo sleziny umiestnenej v 10 ml média RPMI 1640 bez séra je pripravená jedna bunková suspenzia rozmelnením sleziny medzi koncami dvoch podložných mikroskopických skiel ponorených v RPMI 1640 médie bez séra obsahujúcom 2 mM L-glutamínu, 1 mM pyruvátu sodného, 100 jednotiek/ml penicilínu a 100 μg/ml streptomycínu (Gibco, Kanada). Suspenzia buniek je filtrovaná cez sterilné sitko (70mesh, Nitex, Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) a dva- 29 krát premytá centrifugáciou pri 200 g počas 5 minút a resuspendovaním pelety v 20 ml RPMI bez séra. Splenocyty z troch natívnych Balb/c myší sú pripravené obdobným spôsobom a použité ako kontrola. Myelomové bunky NS-1 sú tri dni pred fúziou pestované v log fáze v RPMI médie s 11 % fetálneho hovädzieho séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Inc., Logan, Utah), centrifugované pri 200 g počas 5 minút a peleta dvakrát premytá, ako to bolo opísané v predchádzajúcom odseku.

x 10® slezinných buniek je zmiešaných s 2,0 x 10⁷ NS-1 buniek, suspenzia je centrifugovaná a supernatant odsáty. Peleta buniek je uvoľnená poklepávaním skúmavky, pridaný 1 ml PEG 1500 s teplotou 37*C (50 % v 75 ml Hepese, pH 8,0) (Boehringer Mannheim) a suspenzia miešaná počas jednej minúty, potom je počas ďalších 7 minút pridaných 7 ml RPMI bez séra.

Po pridaní ďalších 8 ml RPMI média sú bunky 10 minút centrifugované pri 200 g. Supernatant je odstránený a peleta resuspendovaná v 200 ml RPMI obsahujúceho 15 % FBS, 100 μΜ hypoxantín sodný, 0,4 μΜ aminopterín, 16 μΜ tymidín (HAT) (Gibco), 25 jednotiek/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1,5 x 10⁶ splenocytov/ml, suspenzia je rozdelená do desiatich 96 jamkových kultivačných platní s rovným dňom (Corning, Corning New York).

100 μΐ média v jamkách platní pre fúzovanie je druhý, štvrtý a šiesty deň po fúzii nahradených čerstvým médiom.

Väzba myšieho IgG k ľudskej chitináze je hodnotená ôsmy deň nasledujúcim spôsobom pomocou ELISA. Platne Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA) sú 2 hodiny pri 37*C potahované ľudskou chitinázou zriedenou 25 mM Tris, pH 7,5 v koncentrácii 100 ng/jamku. Poťahovací roztok je odsáty a nahradený blokovacím roztokom v objeme 200 μΐ/jamku [0,5 % želatína z rybej kože (Sigma) zriedená CMF-PBS] a platne sú inkubované 30 minút pri 37*C, trikrát premyté PBS s 0,05 % Tween 20 (PBST). Potom je nanesených 50 μΐ supernatantu z kultúr. Po 30 minútovej inkubácii pri 37*C a premytí ako bolo opísané hore, je nanesených μΐ konjugátu chrenovej peroxidázy s kozími antimyšími IgG (fc) (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) zriedeného v pomere 1:3500 v PBST. Platne sú inkubované spôsobom opísaným hore, štyrikrát premyté PBST a potom je pridaných 100 μΐ substrátu obsahujúceho 1 mg o-fenyldiamínu (Sigma) a 0, 1 μΐ/ml 30 % ^H2°2 ^{v 100} mM citrátu, pH 4,5. Farebná reakcia je po 5 minútach zastavená pridaním 50 μΐ 15 % H₂sO₄. Absorbancia je meraná pri 490 nm špeciálnym spektrofotometrom na čítanie mikrotitračných platní (Dynatech). Vybrané fúzne jamky sú dvakrát klonované rozriedením do 96 jamkových platní a po piatich dňoch vizuálne vyhodnotené na základe počtu kolónií na jamku. Pri monoklonálnych protilátkach produkovaných hybridómami sú určené izotypy pomocou Isostrip systému (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN).

Druhý možný postup využívajúci imunizáciu jednorázovou injekciou do sleziny môže byť uskutočnený podľa Spitze (Methods Enzymol., 121:33-41 (1986)). Slezina zvieraťa je obnažená a do nej je injektovaná rekombinantná ľudská chitináza (napr. 10-20 μg v PBS v koncentrácii približne 0,02 - 0,04 % s adjuvantom s obsahom oxidu hlinitého alebo bez nej) získaná spôsobom opísaným v príkladoch 3 až 6. Potom je slezina vrátená do peritoneálnej dutiny a zviera uzavrené zošitím. Po troch dňoch sa myš usmrtí, slezina sa vyberie a pripraví sa suspenzia slezinných buniek. Suspenzia je dvakrát premytá RPMI 1640 s prídavkom 3 % fetálneho teľacieho séra (FCS) a resuspendovaná v 25 ml rovnakého média. Myelomové bunky (NS-O) sú odoberané v čase logaritmickej rastovej fázy, raz premyté a pridané k suspenzii slezinných buniek v 50 ml skúmavke v pomere 3:1 alebo 2:1 (slezinné bunky : myelomové bunky). Zmes je peletovaná približne pri 450 g (1500 rpm), supernatant odsatý a peleta uvoľnená poklepávaním skúmavky. Fúzia je uskutočňovaná 1 minútu pri izbovej teplote za stáleho miešania pridaním 1 ml polyetylénglykolu (PEG) 1500. Zmes je inkubovaná ďalšiu minútu, potom je počas jednej minúty pridaný 1 ml RPMI s teplotou 30

- 37’C, ďalších 5 ml RPMI počas troch minút a ďalších 10 ml RPMI počas ďalších troch minút. Suspenzia buniek je centrifugugovaná a resuspendovaná približne v 200 ml selekčného média HAT obsahujúceho RPMI 1640 s 100 U/ml penicilínu, 100 μg/ml streptomycínu, 20 % FCS, 100 mM hypoxantínu, 0,4 mM aminopterínu a 16 mM tymidínu. Bunková suspenzia je rozdelená na 1 ml objemy do kultivačných platní a inkubovaná pri 37*C v vlhkej atmosfére; 5 % CO₂ - 95 % vzduchu, počas 8-10 dní. Supernatanty sú odsávané a do jamiek k bunkám doplňovaný 1 ml média HAT každé 2 až 3 dni podlá rastu buniek. Supernatanty zo súbežných jamiek sú testované na špecifické protilátky a pozitívne jamky ďalej klonované.

Príklad 8

Katalytická aktivita rekombinantnej chitinázy

Chitotriozidázová (chitinázová) aktivita bola meraná pomocou fluorescenčného substrátu 4-metylumbelliferyl-p-DΝ,Ν', JY-triacetylchitotrióza (4 MU - chitotrioside, Sigma Chemical, St. Luis, MO) v tlmivom roztoku podlá Mcllvaina (Hollak et al., pozri hore). 10 μΐ vzorky rekombinantného produktu boli zmiešané s 10 μΐ hovädzieho sérumalbumínu (10 mg/ml), 15 μΐ fluorescenčn0ho substrátu (2,71 mM) a 65 μΐ tlmivého roztoku (0,1 M kyselina citrónová, 0,2 M fosforečnan sodný, pH 5,2) v celkovom objeme 100 μΐ. Reakcia prebiehala 15 minút pri 37’C a bola potom zastavená pridaním 2 ml 0,3 M glycín/NaOH tlmivého roztoku (pH 10,6). Fluorescenčný štepný produkt 4-metylumbelliferon bol monitorovaný fluorimetrom (SLM-AMINCO Instruments, Inc., Rochester, NY) pri 450 nm. Na získanie štandardnej krivky bolo potrebné zmiešať niekoľko koncentrácií substrátu s prebytkom bakteriálnej chitinázy tak, aby bolo zaistené úplné rozštiepenie substrátu. Známe množstvo 4-MU potom bolo korelačné vztiahnuté k fluorescenčnému signálu nameranému fluorimetrom a pomocou lineárnej regresie bola zo32 stavená štandardná krivka. Signál produkovaný zriedenou rekombinantnou chitinázou bol potom použitý na interpoláciu nm množstva substrátu rozštiepeného enzýmom počas reakcie. Táto hodnota potom bola vydelená koncentráciou proteínov, aby sa získal pomer nm/min na mg proteínov (stanovený pomocou A₂₈₀ a vyrátaného molárneho extinkčného koeficientu).

Rekombinantná ľudská chitináza, produkovaná COS bunkami (tak ako je to opísané v príklade 5A) vykazovala chitotriozidázovú aktivitu 90 nm/min na mg proteínov.

Príklad 9

Anitifungálna aktivita rekombinantnej chitinázy in vitro

Inhibičné pôsobenie rekombinantnej ľudskej chitinázy na rast plesní a hub in vitro bol testovaný v predbežnom pokuse. Dve huby: Candida albicans a Aspergillus fumigatis sú závažnými patogénmi pacientov s poruchami imunity. Candida a Aspergillus boli pestované v RPMI rastovom médie pri 37°C do vzniku približne 10 000 - 50 000 jednotiek kolónií (CFU - colony forming units) na ml.

Rekombinantná ľudská chitináza (produkovaná COS bunkami, ako je opísané v príklade 5A) bola pridaná ku kultúram v koncentráciách 0; 2,8; 11,25; alebo 45 μς/ιηΐ. Rast hub bol hodnotený za 24 hodín podľa zakalenia kultúr. Pri tomto postupe a za týchto nefyziologických podmienok rástli všetky kultúry porovnateľnou rýchlosťou nezávisle na koncentrácii chitinázy. Koncentrácia testovaných hub však bola oveľa vyššia, ako záťaž počas hubovej infekcie in vivo. V odlišných podmienkach môžu byť získané odlišné výsledky, napr. pri nižšom obsahu huby alebo pri testovaní ľudskej chitinázy v kombinácii s inými antifungálnymi prostriedkami. Je možné očakávať, že chitináza je za fyziologických podmienok in vivo účinnejšia.

V ďalších pokusoch bola antifungálna aktivita rekombinantnej ľudskej chitinázy (získanej v COS bunkách, ako je opísané v príklade 5A) hodnotená pomocou difúzneho testu v agare, v tekutom živnom médie podľa Národnej komisie pre klinické laboratórne štandardy (National Commitee on Clinical Laboratory Standards) a testom inhibície bunkových stien podľa Selitrennikoffa, Antimicrob. Agents Chemother., 23: 757-765 (1983).

V difúznom agarovom teste bolo približne lxlO⁶ buniek/ml Candida albicans (ATCC No. 90028) inokulovaných do 1,5 % agaru (RPMI 1640 médium tlmené 2-(N-morfolino)propánsulfónovou kyselinou (MOPS), pH 7,0). Disk obsahujúci 50 μg vzorky (A: rekombinantná ľudská chitináza, B: kontrola - tlmivý roztok,

C: kontrola - protein, D: bakteriálny lyzát s chitinázovou aktivitou alebo známa antifungálna látka) bol položený na agar a bola meraná zóna inhibície rastu. Výsledky sú vyjadrené v nasledujúcej v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Vzorkaa (50 μς/άίε^	Candida albicans rast^	Aspergilus fumigatus rast
A: rH-chitináza	+	+
B: kontrola - tlmivý roztok	+	+
C: kontrola - protein	+	+
D: Bakteriálny lyzát s chitinázovou aktivitou	+	+c
amphotericin B	-	-

(400 ng/disk) ^aVzorka: A - rH chitináza pripravená z COS buniek podľa príkladu 5A v 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20mM Tris, pH 7,5; B tlmivý roztok (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris, pH 7,5);

C - inaktívny proteín PAF - AH (zriedený z rezervného roztoku 2 mg/ml); D - lyzát zo Serratia marcescens (SIGMA #C-7809) s chitinázovou aktivitou.

^Hodnotenie rastu: (+) - normálny rast, žiadna inhibícia rastu nebola pozorovaná; (-) - inhibícia rastu huby, inhibičná zóna pozorovaná.

^cVzorka D stimulovala rast Aspergillus fumigatus.

Pri skúške v tekutom médie bola 50 μg/ml vzorka (A: rekombinantná ľudská chitináza. B: kontrola - tlmivý roztok, C: kontrola - proteín, D: bakteriálny lyzát s chitinázovou aktivitou alebo známa antifungálna látka) pridaná s testovanou hubou s určitou koncentráciou do RPMI 1640 média tlmeného MOPS, pH 7,0. Vzorky boli inkubované pri 35^eC a trepaní pri 120 rpm počas 48 hodín, potom bol hodnotený rast podľa zakalenia suspenzie. Približné koncentrácie hub boli nasledujúce: 2,5x 10⁴ buniek/ml Candida albicans (ATCC no. 90028); 5 x 10⁹ buniek/ml Candida albicans - polyen rezistentný (ATCC no. 38247); 1 x 10⁴ buniek/ml Aspergillus fumigatus (ATCC no. 16424); 1 x 10⁴ buniek/ml Neurospora crassa (ATCC no. 18889); a 1 x 10⁹ buniek/ml Saccharomyces cerevisiae (ATCC no. 26108). Výsledky sú prezentované v nasledujúcej tabulke 2.

I «Λ m

ι

Tabuľka 2

Saccharomyces cerevisiae rast	cn	CN			1 pg/ml í	1 a ti-	1 a •c CN I—i A O	Ž
Neurospora crassa rast	n·	't		n-	I a. «n o	I a 00	1 a Tŕ VO Λ	ž
Aspergillus fumigatus rast	m	Tť	ΤΓ	t}·	I a CN	< Z	16 pg/ml	1 ot a in A O
C. albicans polyen rezistentný rast	CN	CN	m	tí-	I a vo l-H A	I M a vo M	0,06 pg/ml	CN
Ccmdida albicans xasŕ	CN	CN	’t		1 a «n e o	1 a «n e o	1 a CN	Ž
Nzxsťtä (50 μ/ml)	lA: rH - chitináza	| B: kontrola - tlmivý D roztok	| C: kontrola - proteín	| D: bakteriálny lyzát 0 s chitinázovou aktivitou	n á o '1 -§ u o σ >—<	J3 i I O m u 1—í	IIC50 5-fluorocytozínu	J3 i O o g ol m o

m s?

O «Λ

O '3 c?

Ό £

O

CX •O ?!

fS o¹ Ί s 2

Ň 2	o »8 44 -g
N
‘tí
V
•o v	o£ m
g	«Λ c CN —
Stí	.« O ä b
	•‘2, e 33^ λ

o
ω	P
Im	Im
-O	*o
44	44
CA	CA
3	3
ε	ε
-<D	sp
>	>
O	o
	1
2 4J	o
O	o
-3	»3
'í?	'«ď*
Ό	Ό
í)	P
►	>
O	O
cx	Q.
Ό	Ό
O	O
N	N

·* vO so θ'

O O «η

CZ3

Ό 44 g 5

O 2 •&S

O '>> N £

II >

•Ô *á Ä g v

•g g *1 ° 3 p <3 o c3 c 2 *S ¹ *P > **4

S S ·§ δ .p .s

Ov	•Λ
O	O
>3	»3
O	O
cx	o.
g	8
I	3
.H c
9 00	00
CZ	Im
o	O
	M
g	3
li	Im
1>	<D
31	'31
	rS Λ
ed •žá	.S i
-cd
ω	O
+Λ	4·^
*8	XZJ
‘5?	‘5?
u	Im
O	O
•c	•C
cx	cx
S	cd
	•
’3	Q
‘g	g
c	8
ω	0)
u	U
3	8
o	O
44	44
3	cd
>55	>5§
>N •a	.3
??	'éď*
3	8
J	ô m O
r	r

- 36 os-1 test používajúci celé bunky, pri ktorom sú identifikované inhibítory biosyntézy bunkovej steny huby, bol vykonaný podľa Selitrennikoffa (pozri hore) pri použití inokula z l,5xl0⁵ protoplastov/ml uchytených v agare (médium N podľa Vogela, 7,5 % sorbitol, 1,5 % sacharóza, 10 μg/ml nikotínamid a 1 % agar) inkubovaného 72 hodín pri 25’C. V kultúrach boli sledované zmeny rastu a morfológia po umiestnení diskov obsahujúcich 50 μς vzorky (A : rekombinantná ľudská chitináza, B: kontrola - tlmivý roztok, C: kontrola - proteín, D: bakteriálny lyzát s chitinázovou aktivitou alebo známa antifungální látka) na agarovom médie.

os-1 bunky sú zmutovaným kmeňom Neurospora crassa, ktorý pri inkubácii v určitých podmienkach pri 37’C raste vo forme protoplastov bez bunkovej steny, ale regeneruje ju vo vhodných podmienkach pri zmene teploty na 22’C. Vzorky inhibujúce rast huby sú považované za inhibítory rastu hub a vzorky, ktoré bránia regenerácii bunkovej steny, ale nezabíjajú bunky, sú považované za špecifické inhibítory bunkovej steny. Výsledky sú prezentované v nasledujúcej tabuľke 3.

Tabuľka 3

Vzorkaa	Rast buniek/	Regenerácia bunkovej
(50 μg/disk)	morfológia13	stenyc
A: rH - chitináza	+
	protoplasty	10	mm^
B: kontrola -	+	+
tlmivý roztok	protoplasty	5	mm^
C: kontrola -	+	+
proteín	hyfy
D: bakteriálny lyzát	+
s chitinázovou	protoplasty	7	mmd
aktivitou
nikomycin Z	+	—
(1 μ9/άίε^	protoplasty	30	mm^
amphotericin B	—	+
(400 ng/disk)	zvyšky buniek	10	mme

^aVzorky: A - rH-chitináza pripravená z COS buniek podľa príkladu 5A v 150 mM NaCl, lmM EDTA, 20 mM Tris, pH 7,5; B tlmivý roztok (150 mM NaCl, lmM EDTA, 20 mM Tris, pH 7,5);

C - inaktívny proteín PAF-AH (zriedený z rezervného roztoku 2 mg/ml); D - lyzát zo Serratia marcescens s chitinázovou aktivitou (SIGMA #C - 7809).

^bBodové hodnotenie rastu (rastové skóre); (+) - normálny rast, žiadna inhibícia rastu nebola pozorovaná; (-) - inhibícia rústu huby, inhibičná zóna pozorovaná.

^cBodové hodnotenie regenerácie bunkovej steny; (+) normálna regenerácia bunkovej steny; (-) - inhibícia regenerácie bunkovej steny.

^Radiálne meranie inhibovanej regenerácie bunkovej steny zo stredu disku.

^eRadiálne meranie inhibovaného rastu zo stredu disku.

Výsledky týchto testov preukázali, že chitinázové vzorky špecificky inhibovali rast bunkovej steny v os-1 testoch na celých bunkách a mali slabo antifungálny efekt pri testoch V tekutom médie.

Príklad 10

Fungicídna aktivita rekombinantnej chitinázy in vivo v myšiach

Farmakokinetiky rekombinantnej ľudskej chitinázy v myšiach boli stanovené nasledujúcim spôsobom. Samiciam myší Balb/c starým 6-8 týždňov bola injektovaná rekombinantná ľudská chitináza intravenózne do chvostovej žily v dávkach 0,5 mg/kg, 5,0 mg/kg a 50 mg/kg. Myši boli zbavené krvi 0,01,

0,25, 1, 8 a 24 hodín po injekcii pre každú dávku (pre každý termín odberu a dávku boli použité dve zvieratá). Vzorky séra t

potom boli analyzované na chitinázovú aktivitu a koncentráciu. Výsledky sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 4.

Tabuľka 4

Dávka	AUC	VSS	cL	MRT	Polčas	Cmax
(mg/kg)	^g/ml/h)	(ml/kg)	(ml/h/kg)	(h)	(h)	(úg)
0,5	31,24	12,03	16,01	0,75	0,74	22,30
5,0	278,50	13,61	17,95	0,76	1,38	162,84
50,0	2505,83	52,92	19,95	2,65	2,33	1179,19

AUC: plocha pod krivkou pre čas nekonečno (area under curve to tíme infinity)

Vss: distribučný objem v ustálenom stave (steady state volume of distribution) cL: odstraňovanie (clearance)

MRT: čas stredného pobytu molekuly v celom tele (total body mean residence time)

Cmax: maximálna koncentrácia v sére

Na testovanie účinnosti antifungálnych látok bolo zavedených niekoľko živočíšnych modelov (pozri Louie et al., Infect. Immun. 62:2761-2772, 1994; Kinsman et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 37: 1243-1246, 1993; Nakajima et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 39: 1517-1521, 1995; Tonetti et al., Eur. J. Immunol. 25: 1559-1565, 1995; Denning a Stevens, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 35: 1329-1333,

1991; pozri tiež Stevens, J. Mycol. Med. 6 (suppl. I): 7-10, 1996). Hostiteľské zvieratá sú infikované hubou a ich prežitie je merané pri aplikácii rôznych dávok chitinázy počas celého pokusu. V experimentoch je chitináza použitá bud ako jediný terapeutický prostriedok alebo sa použije v kombinácii s konvenčnou antifungálnou látkou ako je Amphotericin B a flukonazol, aby bolo možné zistiť, či chitináza nezvyšuje účinok tejto látky. Konkrétne u myší je akútna kandidóza vyvolaná intraperitoneálnou alebo intravenóznou aplikáciou 10xl0⁶ CFU Candida albicans. Terapeutická látka je podaná vopred alebo 1 až 5 hodín po inokulácii patogénom. Počet prežitých jedincov je stanovený po piatich dňoch. Navyše je možné po usmrtení myši stanoviť prítomnosť huby v určitých orgánoch ako je mozog, obličky, pľúca, pečeň a slezina. Inou možnosťou je aplikácia nízkych dávok huby, napr. Aspergillus (8-10xl0⁶ CFU) alebo Candida (lxlO⁶ CFU) a hodnotenie prežitia v dlhšom časovom úseku, napr. po 45 dňoch. Dlhodobú antifungálnu/fungistatickú aktivitu samotnej chitinázy alebo jej kombinácie s inými antifungálnymi liekmi je možné hodnotiť, keď sa pokračuje s terapiou počas jedného a viacerých týždňov (napr. 11 dní) a sledovaním zvierat počas niekoľkých týždňov, napr. 18 dní až 1 mesiac. Účinná antifungálna látka zvyšuje dlhodobé prežívanie zvierat a znižuje obsah huby v krvi a orgánoch.

Príklad 11

Aktivita chitinázy in vivo na modele invazívnej aspergilózy u králika

Účinnosť chitinázy samotnej alebo v kombinácii s inou konvenčnou antifungálnou látkou bola sledovaná na imunosupresívnom modele invazívnej aspergilózy u králika, ktorý je už cez desať rokov používaný na hodnotenie rôznych antifungálnych terapií. Pozri napr. Andriole et al., Clin. Infect. Dis. 14 (Suppl. 1): 5134-5138 (1992). Štúdia bola uskutočnená podľa Pattersona et al., Antimicrob. Agents Chemother. 37:2307-2310 (1993) alebo George et al., J. Infect. Dis. 168:692-698 (1993). Prvý deň je králikom intravenózne podaný cyklofosfamid (200 mg), za účelom vyvolania leukopénie, ďalej je po celý času experimentu denne aplikovaný subkutánne triamcinolon acetonid (10 mg). Druhý deň, tzn. 24 hodín po imunosupresii, je zvieratám intravenózne injektovaných približne 10⁶ (letálne napadnutie) alebo 10⁵ (subletálne napadnutie) konídií A. fumigatus. Antifungálna terapia (samotnou chitinázou alebo v kombinácii s inou konvenčnou antifungálnou látkou, napr. amphotericinom B, flukonazolom alebo 5-fluorocytozínom) je zahájená 24 hodín po injekcii patogéna alebo 48 hodín pred ňou (profylaxia) a pokračuje sa s ňou 5 až 6 dní alebo do smrti zvieraťa. Dávkovanie bežných antifungálnych látok je napr. 1,5 alebo 0,5 mg/ kg/deň intravenózne pre amphotericin B, 60 alebo 120 mg/kg/deň orálne pre flukonazol a 100 mg/kg/deň orálne pre 5-fluorocytozín Kontrolní králici nie sú ošetrení žiadnou antifungálnou látkou.

Pri pitve sú odoberané vzorky tkanív pre kultiváciu kultúry huby a histopatologické vyšetrenie pečene, sleziny, obličiek, pľúc a mozgu. Môžu byť tiež odoberané vzorky srdca, moča a krvi. V určitých intervaloch sú odoberané vzorky krvi, v kto41 rých je stanovovaný počet bielych krviniek a cirkulujúci sacharidový antigén Aspergillus metódou ELISA. Účinnosť ošetrenia testovanou látkou je hodnotená z troch hľadisok: zníženie miery mortality, zníženie počtu organizmov Aspergillus kultivovaných z cieľových orgánov (množstvo huby) a zníženie hladiny cirkulujúceho antigénu Aspergillus. Účinná antifungálna látka znižuje mortalitu a množstvo huby.

Na tomto modele je tiež možné hodnotiť pľúcnu aspergilózu podľa Chilvers et al., Mycopathologia 108: 163-171 (1989), ked sú imunosupresívni králici infikovaní intratracheálne konídiami Aspergillus fumigatus a v tekutine získanej pri následnom bronchoalveolárnom výplachu 1., 2., 4., 7. a 10. deň po infekcii je detekovaná huba, stanovený chitín, stanovený počet bielych krviniek a je vykonaný histopatologický rozbor na zistenie rozsahu infekcie pľúc. Účinné antifungálne látky znižujú rozsah infekcie alebo obmedzujú zápal pľúc.

Príklad 12

Aktivita chitinázy in vivo na modele králika s rozšírenou kandidózou

Účinok samotnej chitinázy alebo jej kombinácie s iným bežným antifungálnym prostriedkom je testovaný na modele králika s rozšírenou kandidózou podľa Rouse et al., Antimicrob. Agents Cheraother. 36: 56-58 (1992). Bieli novozélandskí králici sú systémovo infikovaní približne 3xl0⁶ blastospórami Candida albicans. Antifungálna terapia je započatá 48 hodín po napadnutí Candida (alebo profylaktický pred ním) a pokračuje sa s ňou napr. počas štyroch dní. Prežívajúce zvieratá sa usmrtia a množstvo huby je stanovené na srdcových chlopniach s pripojenými zväčšenosťami (aortic valve with attached vegetation) na pľúcach, obličkách a slezine. Stanovenie množstva huby a histopatologické vyšetrenia môžu byt vykonávané na týchto i ďalších orgánoch ako sú pečeň, mozog a srdce. Môžu byť tiež uskutočnené odbery krvi a moča. Hodnotený je účinok antifungálnej terapie na mortalitu, obsah cirkulujúcej huby a jej prítomnosť v tkanivách (tissue fungal burden).

Králičí sú inokulovaní (Bayer et al., Antimicrob. Agents Chemother. 19: 179-184 (1981)) intraperitoneálne približne 5x10® CFU Candida albicans. Štyri dni po intraperitoneálnej inokulácii je z každého zvieraťa získaný peritoneálny aspirát a je kultivovaný. Zvieratá pozitívne na prítomnosť huby v aspiráte sú náhodne usporiadané do kontrolných a pokusných skupín. Antifungálne ošetrenie je zahájené sedem dní po inokulácii patogénom. Oči všetkých králikov sú hodnotené pomocou nepriamej oftalmoskopie, pretože rozšírená kandidóza môže spôsobovať Candida endophtalmitis. Zvieratá sú usmrtené 7.,

11. a 14. deň po zahájení terapie a ich brušná dutina je vyšetrená na prítomnosť peritonitídy a intraabdominálneho abscesu. V očiach sú hodnotené makroskopické lézie. Vzorky tkaniva z peritoneálneho abscesu, všetkých ďalších viditelných abscesov, obličiek, pečene, sleziny a očných štruktúr sú zvážené, homogenizované v mozgosrdcovej tekutine (brain heart infusion broth), mnohonásobne zriedené a kultivované na stanovenie CFU na gram tkaniva. Obličkové a peritoneálne abscesy sú tiež fixované 10% neutrálnym formaldehydom a histopatologicky vyšetrené. Pre stanovenie obsahu huby a hodnotenie jej morfológie sú rezy farbené pomocou periodovej kyseliny-Schiffovho činidla. Hodnotí sa účinok testovaných liečiv na zvýšenie prežívania a zníženie obsahu huby.

Príklad 13

Aktivita chitinázy in vivo na modele králika a hubovej endopf tamitidy

Účinnosť samotnej chitinázy alebo jej kombinácie s inými antifungálnymi prostriedkami je hodnotená na modele králičej endoftalmitxdy (Candida endophtalmitis) podía Park et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39: 958-963 (1995). Novozélandskí bieli králici (albíni) s hmotnosťou 2 až 2,5 kg sú infikovaní intravitrálnou inokuláciou asi 1000 CFU Candida albicans. Po piatich dňoch je endoftalmitída potvrdená nepriamou oftalmoskopiou a opísaná ako mierne až silné zahmlenie sklovca s čiastočným alebo celkovým zatienením väčším ako 50 % retinálnej a choroidálnej vaskulatúry. Stupeň zakalenia sklovca je klasifikovaný pomocou stupnice a tiež vzhíad fundusu môže byt klasifikovaný a fotograficky dokumentovaný. Králici sú potom náhodne rozdelení do skupín s odlišným spôsobom liečby: samotná chitináza počas 2 až 4 týždňov, chitináza v kombinácii s ďalším bežným antifungálnym prostriedkom (napr. amphotericinom B, flukonazolom alebo 5-fluorocytozínom) počas 2 až 4 týždňov, alebo žiadne ošetrenie (kontrola). Dávkovanie antifungálnych prostriedkov je flukonazol - orálne - 80 mg/kg/deň a 5-fluorocytozín - orálne - 100 mg/kg každých 12 hodín.

Účinok liečby je hodnotený 2 až 4 týždne po terapii nepriamou oftalmoskopiou, kvantitatívnym stanovením obsahu huby a histopatologicky. Pre kvantitatívne stanovení obsahu huby sú oči vyberané, zvážené a odvážená čast z každej vzorky je homogenizovaná a kultivovaná na agarových platniach (brucella agar - 5 % konská krv) 48 hodín pri 35‘C v 5 až 10 % CO₂· Homogenizované vzorky môžu byt tiež pred nanesením na platne zriedené 10 až 100 krát sterilným fyziologickým roztokom. Kolónie sú spočítané a celkové CFU v oku sa vypočítajú na základe výsledku vztiahnutého k zmeraným častiam vzorky. Účinok liečby sa hodnotí podía celkového intraokulárneho obsahu huby. Pre histopatológiu sú typické oči vyberané, fixované formalínom v plastovej nádobe a narezané na 5 um časti. Rezy sú ofarbené hematoxylín-eozínom alebo Gomoriho meténamínovým farbením striebrom (Gomori methenamine silver stain) a pomocou sve44 telného mikroskopu sú sledované zápaly, vláknité štruktúry a časti huby. Účinok antifungálnych látok je hodnotený na základe zníženia mortality, obsahu huby alebo zápalov súvisiacich s hubovou infekciou.

Inou možnosťou je tiež využitie modelu králičej endoftalmitídy (Aspergillus endophtalmitis) podľa Jain et al., Doc. Ophthalmol. 69:227-235 (1988). Novozélandskí bieli králici sú inokulovaní do jedného oka asi 40 spórami Aspergillus fumigatus. Ich kontralaterálne (kontrolné) oko je inokulované sterilným inokulom. Po ošetrení testovanou látkou (chitinázou samotnou alebo v kombinácii s iným antifungálnym prostriedkom) môže byť na očiach králikov sledovaný klinický obraz, môžu byť sledované elektroretinogramy, môže byť použitá nepriama oftalmoskopia, stanovené kvantitatívne množstvo huby a vykonaná histopatológia. Klinicky patrná endoftalmitída sa zvyčajne vyvinie 3 až 7 dní po inokulácii.

Príklad 14

Aktivita chitinázy in vivo na modele králičej houbovej endokarditídy

Účinok chitinázy samotnej alebo v kombinácii s inými bežnými antifungálnymi prostriedkami je stanovený na modele králičej endokarditídy (Candida endokarditis) podľa Witt a Bayer, Antimicrob. Agents Chemother. 35: 2481-2485 (1991). Pozri tiež Lomgman et al., Rev. Infect. Dis. 12 (Suppl. 3): 5294-298 (1990) Sterilná trombotická endokarditída je u novozélandských bielych králikov vyvolaná zavedením cez chlopne sterilného polyetylénového katétru (s vnútorným priemerom 0,86 mm), ktorý sa ponechá na mieste počas štúdie. Infekčná endokarditída je vyvolaná 48 hodín po katetrlzácii intravenóznou injekciou asi 2xl0⁷ blastospór C. albicans. Možné je tiež použitie C. parapsilosis. Antifungálna terapia (samotnou chitinázou alebo v kombinácii s inou bežnou antifungálnou látkou) je zahájená 24 hodín pred alebo 60 hodín po napadnutí hubou. Terapia sa vykonáva počas 9 až 12 dní. Dávkovanie bežných antifungálnych prostriedkov je 1 mg/kg/deň intravenózne u amphotericinu B, 50 mg/kg/deň alebo 100 mg/kg/deň intravenózne alebo intraperitoneálne pre flukanazol. Kontrolným králikom nie je podávaný žiadny antifungálny prostriedok. Po usmrtení sú srdce králikov vyberané a pozícia zavedeného katétra prekontrolovaná. Srdcové zväčšenia sú z každého zvieraťa vyberané, spojené, zvážené a homogenizované v 1 ml sterilného fyziologického roztoku. Homogenát je mnohonásobne rozriedený a kvantitatívne kultivovaný na kvasničnom draselnodextrózovom agare pri 35°C 48 hodín. Za zväčšenia bez nálezu kultúr sú považované tie, ktoré obsahujú menej ako 2 log^Q CFU/g na základe priemernej hmotnosti zväčšenia.

Je zrejmé, že odborníci odhalia ďalšie obmeny a modifikácie hore opísaného vynálezu. Preto sú kladené na vynález len tie obmedzenia, ktoré sú opísané v priložených patentových nárokoch.

-46ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) ZÁKLADNÉ INFORMÁCIE:

(i) ŽIADATEĽ: ICOS CORPORATION (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: Chitináza - materiál a metódy (iii) POČET SEKVENCH: 17 (iv) POŠTOVÁ ADRESA:

(A) ADRESÁT: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murra & Borun (B) ULICA: 6300 Sears Tower, 233 South Wacker Drive (C) MESTO: Chicago (D) ŠTÁT: Illinois (E) KRAJINA: Spojené štáty americké (F) ZIP (PSČ): 60606-6402 (v) FORMA VHODNÁ PRE POČÍTAČOVÉ SPRACOVANIE:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilný (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Version #1.25 . (vi) SÚČASNÉ ÚDAJE O ŽIADOSTI:

(A) ČÍSLO ŽIADOSTI:

(B) DÁTUM REGISTRÁCIE:

(C) KLASIFIKÁCIA:

(vii) PREDCHÁDZAJÚCE ÚDAJE O ŽIADOSTI:

(A) ČÍSLO ŽIADOSTI: US 08/663,618 (B) DÁTUM REGISTRÁCIE: 14. júna 1996 (viii) INFORMÁCIE O PRÁVNOM ZÁSTUPCOVI/AGENTOVI:

(A) MENO: Rin-Laures, Li-Hsien (B) ČÍSLO REGISTRÁCIE: 33,547 (C) REFERENCIA/POČET SÚDNYCH PRÍPADOV: 27866/33994 (ix) TELEKOMUNIKAČNÉ INFORMÁCIE:

(A) TELEFÓN: 312/474-6300 (B) TELEFAX: 312/474-0448 (C) TELEX: 25-3856 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1636 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 2..1399 (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: mat peptid (B) UMIESTNENIE: 65..1399 (xi) OPIS SEKVENCIE:SEQ ID NO:1:

C ATG

GTG

CGG

TCT

GTG

GCC

TGG GCA GGT

TTC

ATG

GTC

CTG

CTG

ATG

46

Met

Val

Arg

Ser

Val

Ala

Trp Ala Gly

Phe

Met

Val

Leu

Leu

Met

-21

-20

-15

-10

ATC CCA TGG GGC TCT GCT GCA AAA CTG GTC TGC TAC TTC ACC PAC TGG

94

íle

Pro -5

Trp

Gly

Ser

Ala Ala Lys Leu Val Cys

Tyr

Phe Thr

Asn

Trp 10

1

5

GCC

CAG

TAC

AGA

CAG

GGG

GAG

GCT

CGC

TTC

CTG

CCC

AAG

GAC

TTG

GAC

142

Ala

Gin

Tyr

Arg

Gin

Gly

Glu

Ala

Arg

Phe

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

15

20

25

CCC

AGC

CTT

TGC

ACC

CAC

CTC

ATC

TAC

GCC

TTC

GCT

GGC

ATG

ACC

AAC

190

Pro

Ser

Leu

Cys

Thr

His

Leu

íle

Tyr

Ala

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

30

35

40

CAC

CAG

CTG

AGC

ACC

ACT

GAG

TGG

AAT

GAC

GAG

ACT

CTC

TAC

CAG

GAG

238

His

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

45

50

55

TTC

AAT

GGC

CTG

AAG

AAG

ATG

AAT

CCC

AAG

CTG

AAG

ACC

CTG

TTA

GCC

286

Phe

Asn

Gly

Leu

Lys

Lys

Met

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

Leu

Ala

60

65

70

ATC

GGA

GGC

TGG

AAT

TTC

GGC

ACT

CAG

AAG

TTC

ACA

GAT

ATG

GTA

GCC

334

íle

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

75

80

85

90

ACG

GCC

AAC

AAC

CGT

CAG

ACC

TTT

GTC

AAC

TCG

GCC

ATC

AGG

TTT

CTG

382

Thr

Ala

Asn

Asn

Arg

Gin

Thr

Phe

Val

Asn

Ser

Ala

íle

Arg

Phe

Leu

95

100

105

CGC

AAA

TAC

AGC

TTT

GAC

GGC

CTT

GAC

CTT

GAC

TGG

GAG

TAC

CCA

GGA

430

Arg

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

110

115

120

AGC

CAG

GGG

AGC

CCT

GCC

GTA

GAC

AAG

GAG

CGC

TTC

ACA

ACC

CTG

GTA

478

Ser

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Thr

Leu

Val

125

130

135

CAG

GAC

TTG

GCC

AAT

GCC

TTC

CAG

CAG

GAA

GCC

CAG

ACC

TCA

GGG

AAG

526

Gin Asp

Leu Ala

Asn Ala

Phe Gin Gin Glu Ala Gin

Thr Ser

Gly

Lys

140

145

150

GAA

CGC

CTT

CTT

CTG

AGT

GCA

GCG

GTT

CCA

GCT

GGG

CAG

ACC

TAT

GTG

574

Glu

Arg

Leu

Leu

Leu

Ser

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

155

160

165

170

GAT

GCT

GGA

TAC

GAG

GTG

GAC

AAA

ATC

GCC

CAG

AAC

CTG

GAT

TTT

GTC

622

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

Asp

Lys

íle

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

175

180

185

AAC

CTT

ATG

GCC

TAC

GAC

TTC

CAT

GGC

TCT

TGG

GAG

AAG

GTC

ACG

GGA

670

Asn

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

Phe

His

Gly

Ser

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

190

195

200

CAT

AAC

AGC

CCC

CTC

TAC

AAG

AGG

CAA

GAA

GAG

AGT

GGT

GCA

GCA

GCC

718

His

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Glu

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Ala

205

210

215

AGC

CTC

AAC

GTG

GAT

GCT

GCT

GTG

CAA

CAG

TGG

CTG

CAG

AAG

GGG

ACC

766

Ser

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

Ala

Val

Gin

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

220

225

230

CCT

GCC

AGC

AAG

CTG

ATC

CTT

GGC

ATG

CCT

ACC

TAC

GGA

CGC

TCC

TTC

814

Pro

Ala

Ser

Lys

Leu

Íle

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly Arg

Ser

Phe

235

240

245

250

ACA

CTG

GCC

TCC

TCA

TCA

GAC

ACC

AGA

GTG

GGG

GCC

CCA

GCC

ACA

GGG

862

Thr

Leu

Ala

Ser

Ser

Ser

Asp

Thr

Arg

Val

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

255

260

265

TCT

GGC

ACT

CCA

GGC

CCC

TTC

ACC

AAG

GAA

GGA

GGG

ATG

CTG

GCC

TAC

910

Ser

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

270

275

280

TAT

GAA

GTC

TGC

TCC

TGG

AAG

GGG

GCC

ACC

AAA

CAG

AGA

ATC

CAG

GAT

958

Tyr

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

íle

Gin

Asp

285

290

295

CAG

AAG

GTG

CCC

TAC

ATC

TTC

CGG

GAC

AAC

CAG

TGG

GTG

GGC

TTT

GAT

1006

Gin

Lys

Val

Pro

Tyr

íle

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

300

305

310

GAT

GTG

GAG

AGC

TTC

AAA

ACC

AAG

GTC

AGC

TAT

CTG

AAG

CAG

AAG

GGA

1054

Asp

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

315

320

325

330

CTG

GGC

GGG

GCC

ATG

GTC

TGG

GCA

CTG

GAC

TTA

GAT

GAC

TTT

GCC

GGČ

1102

Leu

Gly

Gly

Ala

Met

Val

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Asp

Phe

Ala

Gly

335

340

345

TTC

TCC

TGC

AAC

CAG

GGC

CGA

TAC

CCC

CTC

ATC

CAG

ACG

CTA

CGG

CAG

1150

Phe

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

Arg

Tyr

Pro

Leu

íle

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

350

355

360

GAA

CTG

AGT

CTT

CCA

TAC

TTG

CCT

TCA

GGC

ACC

CCA

GAG

CTT

GAA

GTT

1198

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu

Leu

Glu

Val

365 370 375

CCA AAA CCA

GGT CAG CCC TCT GAA CCT GAG CAT GGC CCC AGC CCT GGA

1246

Pro

Lys 380

Pro

Gly

Gin

Pro Ser 385

Glu

Pro Glu

His Gly 390

Pro

Ser Pro

Gly

CAA

GAC

ACG

TTC

TGC

CAG GGC

AAA

GCT GAT

GGG CTC

TAT

CCC AAT

CCT

1294

Gin

Asp

Thr

Phe

Cys

Gin Gly

Lys

Ala Asp

Gly Leu

Tyr

Pro Asn

Pro

395

400

405

410

CGG

GAA

CGG

TCC

AGC

TTC TAC

AGC

TGT GCA

GCG GGG

CGG

CTG TTC

CAG

1342

Arg

Glu

Arg

Ser

Ser

Phe Tyr

Ser

Cys Ala

Ala Gly

Arg

Leu Phe

Gin

415

420

425

CAA

AGC

TGC

CCG

ACA

GGC CTG

GTG

TTC AGC

AAC TCC

TGC

AAA TGC

TGC

1390

Gin

Ser

Cys

Pro

Thr

Gly Leu

Val

Phe Ser

Asn Ser

Cys

Lys Cys

Cys

430

435

440

ACC

TGG

AAT

TGAGTCGCTA AAGCCCCTCC AGTCCCAGCT TTGAGGCTGG

1439

Thr

Trp

Asn

445

GCCCAGGATC ACTCTACAGC CTGCCTCCTG GGTTTTCCCT GGGGGCCGCA ATCTGGCTCC

1499

TGCAGGCCTT TCTGTGGTCT TCCTTTATCC AGGCTTTCTG CTCTCAGCCT TGCCTTCCTT

1559

TTTTCTGGGT CTCCTGGGCT GCCCCTTTCA CTTGCAAAAT AAATCTTTGG TTTGTGCCCC

1619

TCTTCCCAAA AAAAAAA 1636 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 466 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:2:

Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met íle

-21

-20

-15

-10

Pro

Trp

Gly

Ser

Ala

Ala

Lys

Leu

Val

Cys

Tyr

Phe

Thr

Asn

Trp

Ala

-5

1

5

10

Gin

Tyr

Arg

Gin

Gly

Glu

Ala

Arg

Phe

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

Pro

15

20

25

Ser

Leu

Cys

Thr

His

Leu

íle

Tyr

Ala

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

30

35

40

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

45

50

55

Asn

Gly

Leu

Lys

Lys

Met

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

Leu

Ala

íle

60

65

70

75

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe

Gly

Thr

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

Thr

85 90

Ala Asn Asn Arg

Gin

Thr

Phe Val Asn Ser Ala íle Arg Phe Leu Arg

95

100

105

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

110

115

120

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Thr

Leu

Va'l

Gin

125

130

135

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

Phe

Gin

Gin

Glu

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

140

145

150

155

Arg

Leu

Leu

Leu

Ser

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

160

165

170

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

Asp

Lys

íle

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

175

180

185

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

Phe

His

Gly

Ser

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

His

190

195

200

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Glu

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Ala

Ser

205

210

215

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

Ala

Val

Gin

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

220

225

230

235

Ala

Ser

Lys

Leu

íle

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

Thr

240

245

250

Leu

Ala

Ser

Ser

Ser

Asp

Thr

Arg

Val

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Ser

255

260

265

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Tyr

270

275

280

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

íle

Gin

Asp

Gin

285

290

295

Lys

Val

Pro

Tyr

íle

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Asp

300

305

310

315

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

Leu

320

325

330

Gly

Gly

Ala

Met

Val

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

335

340

345

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

Arg

Tyr

Pro

Leu

íle

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

Glu

350

355

360

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu

Leu

Glu

Val

Pro

365

370

375

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Ser

Glu

Pro

Glu

Hls

Gly

Pro

Ser

Pro

Gly

Gin

380

385

390

395

Asp Thr Phe Cys Gin Gly Lys Ala Asp Gly Leu Tyr Pro Asn Pro Arg 400 405 410

Glu Arg Ser Ser Phe Tyr Ser Cys Ala Ala Gly Arg Leu Phe Gin Gin 415 420 425

Ser Cys Pro Thr Gly Leu Val Phe Ser Asn Ser Cys Lys Cys Cys Thr 430 435 440

Trp Asn 445 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 1656 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: CDS (B) UMIESTNENIE: 27..1424 (ix) VLASTNOSTI:

(A) MENO/KĽÚČ: mat peptid (B) UMIESTNENIE: 90..1424 (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:3:

GCTGCAGCCT GCCGCTGAGC TGCATC ATG GTG CGG TCT GTG GCC TGG GCA GGT 53

Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly -21 -20 -15

TTC ATG Phe Met

GTC Val -10

CTG Leu

CTG ATG ATC CCA TGG GGC TCT GCT GCA AAA CTG GTC

101

Leu

Met

íle Pro -5

Trp

Gly

Ser

Ala

Ala 1

Lys

Leu

Val

TGC

TAC

TTC

ACC

AAC

TGG

GCC

CAG

TAC

AGA

CAG

GGG

GAG

GCT

CGC

TTC

149

Cys

Tyr

Phe

Thr

Asn

Trp

Ala

Gin

Tyr

Arg

Gin

Gly

Glu

Ala

Arg

Phe

5

10

15

20

CTG

CCC

AAG

GAC

TTG

GAC

CCC

AGC

CTT

TGC

ACC

CAC

CTC

ATC

TAC

GCC

197

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

Pro

Ser

Leu

Cys

Thr

His

Leu

íle

Tyr

Ala

25

30

35

TTC

GCT

GGC

ATG

ACC

AAC

CAC

CAG

CTG

AGC

ACC

ACT

GAG

TGG

AAT

GAC

245

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

Glu

Trp

Asn

Asp

40

45

50

GAG

ACT

CTC

TAC

CAG

GAG

TTC

AAT

GGC

CTG

AAG

AAG

ATG

AAT

CCC

AAG

293

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asn

Gly

Leu

Lys

Lys

Met

Asn

Pro

Lys

55

60

65

CTG

AAG

ACC

CTG

TTA

GCC

ATC

GGA

GGC

TGG

AAT

TTC

AGC

ACT

CAG

AAG

341

Leu

Lys

Thr

Leu

Leu

Ala

íle

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

70

75

80

TTC

ACA

GAT

ATG

GTA

GCC

ACG

GCC

AAC

AAC

CGT

CAG

ACC

TTT

GTC

AAC

Phe 85

Thr

Asp

Met

Val

Ala 90

Thr

Ala

Asn

Asn

Arg 95

Gin

Thr

Phe

Val

Asn 100

TCG

GCC

ATC

AGG

TTT

CTG

CGC

AAA

TAC

AGC

TTT

GAC

GGC

CTT

GAC

CTT

Ser

Ala

íle

Arg

Phe 105

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ser 110

Phe

Asp

Gly

Leu

Asp 115

Leu

GAC

TGG

GAG

TAC

CCA

GGA

AGC

CAG

GGG

AGC

CCT

GCC

GTA

GAC

AAG

GAG

Asp

Trp

Glu

Tyr 120

Pro

Gly

Ser

Gin

Gly 125

Ser

Pro

Ala

Val

Asp 130

Lys

Glu

CGC

TTC

ACA

ACC

CTG

GTA

CAG

GAC

TTG

GCC

AAT

GCC

TTC

CAG

CAG

GAA

Arg

Phe

Thr 135

Thr

Leu

Val

Gin

Asp 140

Leu

Ala

Asn

Ala

Phe 145

Gin

Gin

Glu

GCC

CAG

ACC

TCA

GGG

AAG

GAA

CGC

CTT

CTT

CTG

AGT

GCA

GCG

GTT

CCA

Ala

Gin 150

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu 155

Arg

Leu

Leu

Leu

Ser 160

Ala

Ala

Val

Pro

GCT

GGG

CAG

ACC

TAT

GTG

GAT

GCT

GGA

TAC

GAG

GTG

GAC

AAA

ATC

GCC

Ala 165

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val 170

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu 175

Val

Asp

Lys

íle

Ala 180

CAG

AAC

CTG

GAT

TTT

GTC

AAC

CTT

ATG

GCC

TAC

GAC

TTC

CAT

GGC

TCT

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe 185

Val

Asn

Leu

Met

Ala 190

Tyr

Asp

Phe

His

Gly 195

Ser

TGG

GAG

AAG

GTC

ACG

GGA

CAT

AAC

AGC

CCC

CTC

TAC

AAG

AGG

CAA

GAA

Trp

Glu

Lys

Val 200

Thr

Gly

His

Asn

Ser 205

Pro

Leu

Tyr

Lys

Arg 210

Gin

Glu

GAG

AGT

GGT

GCA

GCA

GCC

AGC

CTC

AAC

GTG

GAT

GCT

GCT

GTG

CAA

CAG

Glu

Ser

Gly 215

Ala

Ala

Ala

Ser

Leu 220

Asn

Val

Asp

Ala

Ala 225

Val

Gin

Gin

TGG

CTG

CAG

AAG

GGG

ACC

CCT

GCC

AGC

AAG

CTG

ATC

CTT

GGC

ATG

CCT

Trp

Leu 230

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro 235

Ala

Ser

Lys

Leu

íle 240

Leu

Gly

Met

Pro

ACC

TAC

GGA

CGC

TCC

TTC

ACA

CTG

GCC

TCC

TCA

TCA

GAC

ACC

AGA

GTG

Thr 245

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe 250

Thr

Leu

Ala

Ser

Ser 255

Ser

Asp

Thr

Arg

Val 260

GGG

GCC

CCA

GCC

ACA

GGG

TCT

GGC

ACT

CCA

GGC

CCC

TTC

ACC

AAG

GAA

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr 265

Gly

Ser

Gly

Thr

Pro 270

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys 275

Glu

GGA

GGG

ATG

CTG

GCC

TAC

TAT

GAA

GTC

TGC

TCC

TGG

AAG

GGG

GCC

ACC

Gly

Gly

Met

Leu 280

Ala

Tyr

Tyr

Glu

Val 285

Cys

Ser

Trp

Lys

Gly 290

Ala

Thr

AAA

CAG

AGA

ATC

CAG

GAT

CAG

AAG

GTG

CCC

TAC

ATC

TTC

CGG

GAC

AAC

Lys

Gin

Arg 295

íle

Gin

Asp

Gin

Lys 300

Val

Pro

Tyr

íle

Phe 305

Arg

Asp

Asn

CAG

TGG

GTG

GGC

TTT

GAT

GAT

GTG

GAG

AGC

TTC

AAA

ACC

AAG

GTC

AGC

Gin

Trp 310

Val

Gly

Phe

Asp

Asp 315

Val

Glu

Ser

Phe

Lys 320

Thr

Lys

Val

Ser

389

437

485

533

581

629

677

725

773

821

869

917

965

1013

1061

TAT CTG

AAG CAG AAG

GGA Gly 330

CTG GGC GGG GCC ATG GTC TGG GCA CTG GAC

1109

Tyr 325

Leu

Lys

Gin

Lys

Leu Gly

Gly

Ala

Met 335

Val

Trp

Ala

Leu

Asp 340

TTA

GAT

GAC

TTT

GCC

GGC

TTC

TCC

TGC

AAC

CAG

GGC

CGA

TAC

CCC

CTC

1157

Leu

Asp

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly Arg

Tyr

Pro

Leu

345

350

355

ATC

CAG

ACG

CTA

CGG

CAG

GAA

CTG

AGT

CTT

CCA

TAC

TTG

CCT

TCA

GGC

1205

íle

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Gly

360

365

370

ACC

CCA

GAG

CTT

GAA

GTT

CCA

AAA

CCA

GGT

CAG

CCC

TCT

GAA

CCT

GAG

1253

Thr

Pro

Glu

Leu

Glu

Val

Pro

Lys

Pro

Gly

Gin

Pro

Ser

Glu

Pro

Glu

375

380

385

CAT

GGC

CCC

AGC

CCT

GGA

CAA

GAC

ACG

TTC

TGC

CAG

GGC

AAA

GCT

GAT

1301

His

Gly

Pro

Ser

Pro

Gly

Gin

Asp

Thr

Phe

Cys

Gin

Gly

Lys

Ala

Asp

390

395

400

GGG

CTC

TAT

CCC

AAT

CCT

CGG

GAA

CGG

TCC

AGC

TTC

TAC

AGC

TGT

GCA

1349

Gly

Leu

Tyr

Pro

Asn

Pro

Arg

Glu

Arg

Ser

Ser

Phe

Tyr

Ser

Cys

Ala

405

410

415

420

GCG

GGG

CGG

CTG

TTC

CAG

CAA

AGC

TGC

CCG

ACA

GGC

CTG

GTG

TTC

AGC

1397

Ala

Gly

Arg

Leu

Phe

Gin

Gin

Ser

Cys

Pro

Thr

Gly

Leu

Val

Phe

Ser

425

430

435

AAC

TCC

TGC

AAA

TGC

TGC

ACC

TGG

AAT

TGAGTCGCTA AAGCCCCTCC

1444

Asn

Ser

Cys

Lys

Cys

Cys

Thr

Trp

Asn

440 445

AGTCCCAGCT TTGAGGCTGG GCCCAGGATC ACTCTACAGC CTGCCTCCTG	GGTTTTCCCT	1504
GGGGGCCGCA ATCTGGCTCC TGCAGGCCTT TCTGTGGTCT TCCTTTATCC	AGGCTTTCTG	1564
CTCTCAGCCT TGCCTTCCTT TTTTCTGGGT CTCCTGGGCT GCCCCTTTCA	CTTGCAAAAT	1624
AAATCTTTGG TTTGTGCCCC TCAAAAAAAA AA		1656

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 466 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: proteín (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:4:

Met Val Arg Ser Val Ala Trp Ala Gly Phe Met Val Leu Leu Met íle -21 -20 -15 -10

Pro Trp Gly Ser Ala Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala -5 15 10

Gin Tyr Arg Gin Gly Glu Ala Arg Phe Leu Pro Lys Asp Leu Asp Pro 15 20 25

Ser Leu Cys

Thr His

Leu íle Tyr Ala Phe Ala Gly Met

Thr

Asn

His

30

35

40

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

45

50

55

Asn

Gly

Leu

Lys

Lys

Met

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

Leu

Ala

íle

60

65

70

75

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe

Ser

Thr

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

Thr

80

85

90

Ala

Asn

Asn

Arg

Gin

Thr

Phe

Val

Asn

Ser

Ala

íle

Arg

Phe

Leu

Arg

95

100

105

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

110

115

120

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Thr

Leu

Val

Gin

125

130

135

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

Phe

Gin

Gin

Glu

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

140

145

150

155

Arg

Leu

Leu

Leu

Ser

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

160

165

170

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

Asp

Lys

íle

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

175

180

185

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

Phe

His

Gly

Ser

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

His

190

195

200

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Glu

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Ala

Ser

205

210

215

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

Ala

Val

Gin

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

220

225

230

235

Ala

Ser

Lys

Leu

íle

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

Thr

240

245

250

Leu

Ala

Ser

Ser

Ser

Asp

Thr

Arg

Val

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Ser

255

260

265

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Tyr

270

275

280

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

íle

Gin

Asp

Gin

285

290

295

Lys

Val

Pro

Tyr

íle

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Asp

300

305

310

315

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

Leu

320

325

330

Gly

Gly

Ala

Met

Val

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

335

340

345

Ser

Cys

Asn 350

Gin

Gly

Arg

Tyr

Pro 355

Leu

íle

Gin

Thr

Leu 360

Arg

Gin

Glu

Leu

Ser 365

Leu

Pro

Tyr

Leu

Pro 370

Ser

Gly

Thr

Pro

Glu 375

Leu

Glu

Val

Pro

Lys 380

Pro

Gly

Gin

Pro

Ser 385

Glu

Pro

Glu

His

Gly 390

Pro

Ser

Pro

Gly

Gin 395

Asp

Thr

Phe

Cys

Gin 400

Gly

Lys

Ala

Asp

Gly 405

Leu

Tyr

Pro

Asn

Pro 410

Arg

Glu

Arg

Ser

Ser 415

Phe

Tyr

Ser

Cys

Ala 420

Ala

Gly

Arg

Leu

Phe 425

Gin

Gin

Ser

Cys

Pro 430

Thr

Gly

Leu

Val

Phe 435

Ser

Asn

Ser

Cys

Lys 440

Cys

Cys

Thr

Trp Asn 445 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 18 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:5:

GACACTATAG AATAGGGC 18 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 51 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:6:

TGGGATCATC AGCAGGACCA TGAAACCTGC CCAGGCCAC A GACCGC ACCA T 51 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 40 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden

-56(D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:7:

TACATCTAGA ATTATGGCAA AACTGGTCTG CTACTTCACC 40 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 34 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden P) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:8:

AGATCTAACC TTAGGTGCCT GAAGACAAGT ATGG 34 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 29 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POQET REŤAZCOV: jeden P) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:9:

TACAGAATTC TTATTCACAT CCGGCCCTG 29 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

» (A) DĹŽKA: 34 párov báz

P) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden * P) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 10:

TACATCTAGA CTCCATCCAG AAAAACAGGT ATGG 34 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

-57(A) DĹŽKA: 30 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:11:

TCTAGAGTCG ACCTGCAGGC ATGCAAGCTT 30 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 50 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 12:

CGCAAGCTTG AGAGCTCCGT TCCGCCACAT GGTGCGGTCT GTGGCCTGGG 50 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO:13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 32 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: cDNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:13:

GACTCTAGAC TAGGTGCCTG AAGGCAAGTA TG 32 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 373 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:14:

Ala Lys Leu Val Cys Tyr Phe Thr Asn Trp Ala Gin Tyr Arg Gin Glv 1 5 10 15

Glu Ala Arg Phe

Leu

Pro Lys Asp Leu Asp Pro Ser Leu Cys Thr His

20

25

30

Leu

íle

Tyr

Ala

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

35

40

45

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asn

Gly

Leu

Lys

Lys

50

55

60

Met

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

Leu

Ala

íle

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe

65

70

75

80

Gly

Thr

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

Thr

Ala

Asn

Asn

Arg

Gin

85

90

95

Thr

Phe

Val

Asn

Ser

Ala

íle

Arg

Phe

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

100

105

110

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

115

120

125

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Thr

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

130

135

140

Phe

Gin

Gin

Glu

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

Arg

Leu

Leu

Leu

Ser

145

150

155

160

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

165

170

175

Asp

Lys

íle

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

180

185

190

Phe

His

Gly

Ser

Trp

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

His

Asn

Ser

Pro

Leu

Tyr

195

200

205

Lys

Arg

Gin

Glu

Glu

Ser

Gly

Ala

Ala

Ala

Ser

Leu

Asn

Val

Asp

Ala

210

215

220

Ala

Val

Gin

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Ala

Ser

Lys

Leu

íle

225

230

235

240

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly

Arg

Ser

Phe

Thr

Leu

Ala

Ser

Ser

Ser

245

250

255

Asp

Thr

Arg

Val

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Ser

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

260

265

270

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Tyr

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

275

280

285

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

íle

Gin

Asp

Gin

Lys

Val

Pro

Tyr

íle

290

295

300

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Asp

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

305

310

315

320

Thr Lys Val Ser Tyr Leu Lys Gin Lys Gly Leu Gly Gly Ala Met Val 325 330 335

Trp Ala Leu Asp Leu Asp Asp Phe Ala Gly Phe Ser Cys Asn Gin Gly
340	345	350
Arg Tyr Pro Leu íle Gin Thr 355 Leu Pro Ser Gly Thr 370	Leu Arg 360	Gin Glu Leu Ser Leu Pro Tyr 365

(2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 373 aminokyselín (B) TYP: aminokyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: peptid (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 15:

Ala Lys Leu Val Cys

Tyr

Phe

Thr Asn Trp Ala Gin Tyr Arg Gin Gly

1

5

10

15

Glu

Ala

Arg

Phe

Leu

Pro

Lys

Asp

Leu

Asp

Pro

Ser

Leu

Cys

Thr

His

20

25

30

Leu

íle

Tyr

Ala

Phe

Ala

Gly

Met

Thr

Asn

His

Gin

Leu

Ser

Thr

Thr

35

40

45

Glu

Trp

Asn

Asp

Glu

Thr

Leu

Tyr

Gin

Glu

Phe

Asn

Gly

Leu

Lys

Lys

50

55

60

Met

Asn

Pro

Lys

Leu

Lys

Thr

Leu

Leu

Ala

íle

Gly

Gly

Trp

Asn

Phe

65

70

75

80

Gly

Thr

Gin

Lys

Phe

Thr

Asp

Met

Val

Ala

Thr

Ala

Asn

Asn

Arg

Gin

85

90

95

Thr

Phe

Val

Asn

Ser

Ala

íle

Arg

Phe

Leu

Arg

Lys

Tyr

Ser

Phe

Asp

100

105

110

Gly

Leu

Asp

Leu

Asp

Trp

Glu

Tyr

Pro

Gly

Ser

Gin

Gly

Ser

Pro

Ala

115

120

125

Val

Asp

Lys

Glu

Arg

Phe

Thr

Thr

Leu

Val

Gin

Asp

Leu

Ala

Asn

Ala

130

135

140

Phe

Gin

Gin

Glu

Ala

Gin

Thr

Ser

Gly

Lys

Glu

Arg

Leu

Leu

Leu

Ser

145

150

155

160

Ala

Ala

Val

Pro

Ala

Gly

Gin

Thr

Tyr

Val

Asp

Ala

Gly

Tyr

Glu

Val

165

170

175

Asp

Lys

íle

Ala

Gin

Asn

Leu

Asp

Phe

Val

Asn

Leu

Met

Ala

Tyr

Asp

180

185

190

Phe His Gly Ser Trp Glu Lys Val Thr Gly His Asn Ser Pro Leu Tyr 195 200 205

Lys

Arg 210

Gin Glu Glu

Ser Gly 215

Ala Ala Ala Ser

Leu Asn 220

Val

Asp Ala

Ala

Val

Gin

Gin

Trp

Leu

Gin

Lys

Gly

Thr

Pro

Ala

Ser

Lys

Leu

íle

225

230

235

240

Leu

Gly

Met

Pro

Thr

Tyr

Gly Arg

Ser

Phe

Thr

Leu

Ala

Ser

Ser

Ser

245

250

255

Asp

Thr

Arg

Val

Gly

Ala

Pro

Ala

Thr

Gly

Ser

Gly

Thr

Pro

Gly

Pro

260

265

270

Phe

Thr

Lys

Glu

Gly

Gly

Met

Leu

Ala

Tyr

Tyr

Glu

Val

Cys

Ser

Trp

275

280

285

Lys

Gly

Ala

Thr

Lys

Gin

Arg

íle

Gin

Asp

Gin

Lys

Val

Pro

Tyr

íle

290

295

300

Phe

Arg

Asp

Asn

Gin

Trp

Val

Gly

Phe

Asp

Asp

Val

Glu

Ser

Phe

Lys

305

310

315

320

Thr

Lys

Val

Ser

Tyr

Leu

Lys

Gin

Lys

Gly

Leu

Gly

Gly

Ala

Met

Val

325

330

335

Trp

Ala

Leu

Asp

Leu

Asp

Asp

Phe

Ala

Gly

Phe

Ser

Cys

Asn

Gin

Gly

340

345

350

Arg

Tyr

Pro

Leu

íle

Gin

Thr

Leu

Arg

Gin

Glu

Leu

Ser

Leu

Pro

Tyr

355

360

365

Leu Ser Ser Gly Thr 370 (2) INFORMÁCIE O SEQ ID N0:16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 28 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina _a (C) POČET REŤAZCOV: jeden • (D) TOPOLÓGIA: lineárna * (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina * (A) OPIS: oligonukleotidový prajmer (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO:16:

TGATACGGTA CCGCCCCATG GCTGACTA (2) INFORMÁCIE O SEQ ID NO: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) POČET REŤAZCOV: jeden (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: iná nukleová kyselina (A) OPIS: prajmer (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO: 17:

GCAAGTTTGG CGCGAAATCG

Claims (35)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:2 ľudskej chitinázy.
2. 2. Polynukleotid - DNA - podľa nároku 1.
3. 3. DNA podľa nároku 2 obsahujúca proteín kódujúci nukleotidy SEQ ID NO:l.
4. 4. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódujúci aminokyseliny 1 až 445 SEQ ID NO:2.
5. 5. Polynukleotid - DNA - podľa nároku 4.
6. 6. DNA podľa nároku 5 obsahujúca nukleotidy 65 až 1402 SEQ ID NO:l.
7. 7. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:4 ľudskej chitinázy.
8. 8. Polynukleotid - DNA - podľa nároku 7.
9. 9. DNA podľa nároku 8 obsahujúca proteín kódujúci nukleotidy SEQ ID NO:3.
10. 10. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódujúci aminokyseliny 1 až 445 SEQ ID NO:4.
11. 11. Polynukleotid - DNA - podľa nároku 10.
12. 12. DNA podľa nároku 11 obsahujúca nukleotidy 90 až 1427 SEQ ID NO:3.
13. 13. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódujúci íudskú chitinázu, vybraný zo skupiny zahŕňajúcej:

    a) dvojprameňovú DNA obsahujúcu čast sekvencie ukázanej v SEQ ID NO:3 kódujúcu proteín,

    b) DNA, ktorá hybridizuje za stringentných podmienok s nekódujúcim vláknom DNA uvedenej v bode a),

    c) DNA, ktorá by, vďaka redundancii genetického kódu hybridizovala za stringentných podmienok s nekódujúcim vláknom sekvencie DNA uvedených v bodoch a) alebo b).
14. 14. Polynukleotid - DNA - podía nároku 13.
15. 15. Vektor obsahujúci DNA podía nárokov 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12 alebo 14.
16. 16. Vektor podía nároku 15, ktorý je expresným vektorom a v ktorom je DNA operatívne spojená s kontrolou expresie sekvencie DNA.
17. 17. Hostiteíská bunka stabilne transformovaná alebo transfektovaná DNA podía nárokov 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 12 alebo 14 spôsobom dovoíujúcim expresiu íudskej chitinázy v uvedených hostiteíských bunkách.
18. 18. Metóda produkcie íudskej chitinázy obsahujúca pestovanie hostiteískej bunky podía nároku 17 na živnom médie a izoláciu íudskej chitinázy z uvedených hostiteíských buniek alebo uvedeného živného média.
19. 19. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid produkovaný metódami podía nároku 18.
20. 20. Purifikovaný, izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:2 ľudskej chitinázy.
21. 21. Purifikovaný, izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:4 ľudskej chitinázy.
22. 22. Purifikovaný, izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu 1 až 445 SEQ ID NO:2 ľudskej chitinázy.
23. 23. Purifikovaný, izolovaný polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu 1 až 445 SEQ ID NO:4 ľudskej chitinázy.
24. 24. Polypeptidový fragment ľudskej chitinázy postrádajúci 1 až asi 72 C-koncových aminokyselinových zvyškov finálnej ľudské chitinázy.
25. 25. Polypeptidový fragment ľudskej chitinázy SEQ ID NO:14
26. 26. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid obsahujúci poly nukleotidovú sekvenciu kódujúcu aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:14.
27. 27. Polynukleotid - DNA - podľa nároku 26.
28. 28. Polypeptidový analóg SEQ ID NO:15 kódujúci ľudskú chitinázu.
29. 29. Purifikovaný, izolovaný polynukleotid kódujúci aminokyselinovú sekvenciu SEQ ID NO:15.
30. 30. Hybridné bunkové línie produkujúce monoklonálne proti látky, ktoré špecificky reagujú s polypeptidmi podľa nárokov 19, 20, 21, 22, 23 alebo 28.
31. 31. Monoklonálne protilátky produkované hybridnými bunkovými líniami podľa nároku 30.
32. 32. Farmaceutické zmesi obsahujúce polypeptidy podľa akých koľvek nárokov 19 až 25 alebo podľa nároku 28.
33. 33. Metóda liečby fungálnej infekcie zahŕňajúca aplikáciu terapeuticky efektívneho množstva ľudskej chitinázy subjektovi
34. 34. Metóda podľa nároku 33 zahŕňajúca ďalšiu aplikáciu terapeuticky efektívneho množstva nechitinázovej antifungálnej látky uvedenému subjektovi.
35. 35. Metóda zníženia množstiev nechitinázových antifungálnych látok potrebných na uplatnenie antifungálnej aktivity u daného subjektu. Metóda zahŕňa aplikáciu takého množstva ľudskej chitinázy, ktoré by bolo efektívne pre zvýšenie antifungálnej aktivity uvedených nechitinázových a antifungálnych látok uvedenému subjektovi.