CZ372099A3 - Použití alfa-methyl-p-tyrosinu k inhibici produkce melaninu v pigmentových buňkách duhovky - Google Patents

Abstract

Je popsáno použití činidel blokujících syntézu tyrosinasy pro prevenci trvalé pigmentace duhovky způsobené deposity melaninu, kteráje indukována fakmakologickynebo metabolickými poruchami.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití činidle blokujících syntézu tyrosinasy pro prevenci trvalé pigmentace duhovky způsobené deposity melaninu indukovanými farmakologicky nebo metabolickou nerovnováhou.

Dosavadní stav techniky

Bylo prokázáno, že latanoprost (13,14-dihydro-17-fenyl18,19,20-tri-nor-PGF_2agf_a isopropyl ester), syntetický analog prostaglandinu (EP-A-0364317), stejně jako přirozené prostaglandiny, jako je ^pG^F2alfa ^a PGE₂, indukují zvýšenou pigmentaci duhovky opic během chronické léčby (Selén G.,

Stjernschantz J., Resul B., Prostaglandin-induced iridial pigmentation in primates, Surv. Opthalmol. 1997, 41, Suppl. 2: S125 až S128). Přesný mechanismus této reakce na léčbu prostaglandiny není znám, ale zvýšená syntéza melaninu (melanogenese) musí proběhnout, aby se barva oka stala tmavší. Také u pacientů léčených latanoprostem (Wistrand, P.J.,

Stjernschantz J. , Olsson K., The incidence and time-course of latanoprost-induced iridial pigmentation as function of eye color. Surv. Opthalmol. 1997, 41 Suppl. 2: S129 až S138) nebo isopropylunoprostonem (13,14-dihydro-15-keto-20-ethyl-PGF_2a^^_a isopropylesterem) (Yamamoto T., Kitazawa, Y, Iris-color change devoloped after topical isopropyl unoprostone treatment, J. Glaucoma 1997, 6: 430 až 432) se někdy vyskytlo ztmavnutí duhovky při chronické terapii. Zdá se, že k tomuto nežádoucímu účinku jsou predisponováni zejména pacienti s heterochromatickou duhovkou, t.j. modro-zelenou, Šedo-zelenou, hnědo-zelenou nebo ·· 4 4 4 4 4 4 4 ·· «4 · 4 4*4» 4···

4 4 4 4 4 4··· • · 4 4 4 4 4 4-4 4 4 4 • 444 4 * 4 4 4 4 4

4 · · 4 4 4 4 4 » · 44

- 2 světle hnědou barvou očí. Protože nežádoucí účinky mohou mít negativní kosmetické důsledky, zejména u pacientů s jednostranným glaukomem, kteří jsou léčeni pouze na jedno oko, a protože tyto nežádoucí účinky jsou ireversibilní a relativně časté, bylo by vhodné tyto nežádoucí účinky překonat, i když nejsou zdravotním rizikem pro pacienty, u kterých se vyvinou.

Melanin, velký přirozený polymer, je tvořen z aminokyseliny tyrosinu. V počátku tvorby melaninu je tyrosin hydroxylován na L-Dopa, která je dále oxidována na dopachinon. Enzym katalýzující obě tyto reakce se nazývá tyrosinasa. Dopachinon je labilní sloučenina, která je přeměněna na dopachrom, černě zbarvenou sloučeninu, která je nutná pro tvorbu DHICA (kyselina dihydroxyindolkarboxylová) oligomerů, které jsou nutné pro konečnou polymerizaci, při které vzniká eumelanin (černý nebo hnědý melanin). Dopachinon může alternativně reagovat s cysteinem a při této reakci vznikají oligomery obsahující síru a nakonec feomelanin (žlutavý nebo červený melanin). Významné je, že krok omezující rychlost v produkci melaninu je reakce katalyzovaná tyrosinasou. Chybění funkční tyrosinasy, například z důvodu mutace genu pro tyrosinasu, vede vždy k albinismu, protože v těle nemůže být tvořen žádný pigment.Je zajímavé, že stejný enzym (tyrosinasa) je také nutný v sympatických neuronech a nadledvinkách pro produkci noradrenalinu, neurotransmiteru, a adrenalinu, hormonu, protože tyto sloučeniny jsou biosyntetizovány z tyrosinu. Proto budou mít sloučeniny blokující tyrosinasu vliv jak na melanogenesy, tak na funkci sympatického nervového systému.

Podstata vynálezu

Nyní bylo zjištěno, že inhibitory tyrosinasy, konkrétně ce-methyl-p-tyrosin, inhibují produkci melaninu indukovanou • · • · · · • * ·

• · · ♦ • · · · • · · * podáváním derivátů PGF_2aif_a a PGE₂, jako je latanoprost a unoproston.

Proto léčba takovými inhibitory tyrosinasy před, v průběhu a po podávání derivátů prostaglandinů u pacientů s glaukomem inhibuje tvorbu melaninu melanocyty duhovky a brání změnám barvy očí u těchto pacientů.

Klasickým činidlem pro blokování syntézy tyrosinasy je α-methyl-para-tyrosin, lék známý po názvem metyrosin (J. Am. Chem. Soc. 77: 700, 1958), který je falešným substrátem pro enzym. Proto není tvořena L-Dopa a v důsledku toho nemůže být tvořen ani melanin, ani adrenalin/noradrenalin. Lék byl použit pro paliativní léčbu feochromocytomu, nádoru nadledvinek, který vede k vysokým koncentracím katecholaminů v krvi a proto k vysokému krevnímu tlaku. Při použití dostatečně vysokých koncentrací může a-methyl-para-tyrosin významně blokovat biosyntézu adrenalinu/noradrenalinu, stejně jako melaninu. Při použití při klinických koncentracích pro léčbu feochromocytomu je koncentrace katecholaminů v těle značně snížena (Weiner N., Drugs, that inhibit adrenergic nerveš and block adrenergic receptors, V Goodman Gilman A., Goodman LS, Rall TW, Murad F., eds.: Goodman and Gilman's the Pharmacological basis of Therapeutics, Macmillan, New York, 1985, str. 181 až 214) a v in vitro pokusech podle předkládaného vynálezu byla produkce melaninu významně snížena. V podstatě jakékoliv činidlo, které interferuje s tyrosinasou bude mít stejné příznivé účinky vedoucí k blokádě produkce melaninu.

Takovými činidly jsou například hydroxychinony a substance, které reagují s ionty mědi, protože měď je nezbytným kofaktorem pro tyrosinasu, a různé typy falešných substancí pro enzym. V

• · · · důsledku toho, pokud jsou tato činidla podána bud' separátně, nebo ve směsi s latanoprostem, isopropylunoprostonem nebo jakýmkoliv jiným prostaglandinem, který indukuje melanogenesi, tak může být zabráněno tvorbě pigmentu v duhovce nebo může být tato tvorby alespoň významně snížena.

Příklady provedení vynálezu

Tato aktivita oí - methyl-p-tyrosinu byla demonstrována v následujících příkladech:

Materiál a techniky

Buněčná kultura

Uveální melanocyty byly izolovány a kultivovány z očí dospělých dárců. Duhovka byla vyříznuta a byla umístěna do misky zadním povrchem nahoru. Pigmentový epitel duhovky byl oddělen od stromatu po ponoření do 0,25% roztoku trypsinu (Gibco, USA) při 37 na dobu 2 hodin. Zbylé stroma duhovky bylo umístěno do 0,25% roztoku trypsinu při 4 °C na dobu 18 hodin a potom následovala inkubace při 37 po dobu 1 hodiny. Izolované buňky byly shromážděny. Roztok trypsinu byl nahrazen roztokem kolagenasy (400 U/ml, v F-12 mediu, Sigma, USA) a provedla se inkubace při 37 °C. Roztok kolagenasy byl nahrazen a buňky byly odebrány, centrifugovány, resuspendovány a plotnovány každou hodinu po dobu 3 hodin.

Izolované uveální melanocyty byly kultivovány na Falcon kultivačních discích (Becton Dickinson, USA) s FIC mediem, které se skládalo z F-12 media doplněného 10% fetálním hovězím sérem, mM glutaminu (vše od Gibco), 10 ng/ml cholera toxinu, 0,1 M isobutylmethylxantinu, 50 gg/ml gentamicinu (vše od Sigma) a 20

ng/ml basického fibroblastového růstového faktoru (Promega,

USA). Kultivační disky byly inkubovány ve zvlhčené atomosféře 5% CC>2. Medium bylo měněno třikrát týdně. Geneticin (Sigma, USA), cytotoxické činidlo, byl přidán (100 gg/ml) na dobu 3 až 7 dnů, pokud to bylo nutné.

Od dárců s různou barvou duhovky (modrou a hnědo-modrou) bylo v tomto pokusu izolováno 8 buněčných kmenů uveálních melanocytů.

Měření melaninu

Kultivované uveální melanocyty byly odděleny roztokem trypsinu-EDTA a byly počítány v hemocytometru, buněčné suspenze byly centrifugovány a peleta byla rozpuštěna v 1 N NaOH. Koncentrace melaninu byla stanovena měřením optické density při 475 nm a srovnáním se standardní křivkou získanou za použití syntetického melaninu (Sigma). Obsah melaninu byl vyjádřen v ng/buňku.

Výpočet produkce melaninu

Produkce melaninu byla vypočtena z obsahu melaninu a počtu buněk na začátku a na konci každé generace za použití následujícího vzorce:

Cp = C_tP - C₀/l.3D (P-l) kde Cq a C_t představují obsah melaninu na buňku v čase 0 a v čase t, v příslušném pořadí; P je zvětšení populace za čas t, D je zdvojovači čas uveálních melanocytů; a Cp je produkce melaninu na buňku za den během času t.

· · · · · • · · · 0 0 0 * 0 » 0 0 · · ♦ • 0 000000 0 · 0 0 0 0 0

0· 000 00 0 0

Aktivita tyrosinasy

Aktivita tyrosinasy byla hodnocena v devíti buněčných kmenech za použití adaptované Pomerantzovi techniky, která je založena na měření uvolněné enzymatickou hydroxylací tyrosinu.

Výsledky

Obsah melaninu v melanocytech duhovky kultivovaných z 5 kmenů buněk hnědých duhovek a 3 kmenů buněk z hnědo-modrých duhovek se zvyšoval po přidání latanoprostu v nejvyšších molárních koncentracích. Stejné výsledky byly zjištěny pro produkci melaninu a aktivitu tyrosinasy (tabulka 1 a 2).

Po přidání a-methyl-p-tyrosinu (10“^ M) bylo pozorováno významné snížení obsahu a produkce melaninu a tyrosinasové aktivity při latanoprostu 10 az 10 M jak v melanocytech kultivovaných z hnědých duhovek, tak z hnědo-modrých duhovek (tabulka 1 a 2).

Tyto výsledky ukazují, že produkce melaninu v melanocytech duhovky je ínhibována a-methyl-p-tyrosinem.

Předkládaný vynález se také týká farmaceutických prostředků obsahujících deriváty ^PGF2alfa ^ne^° ^PGE2 ^{s ant}i-glaukomovou aktivitou a inhibitor tyrosinasy, které jsou kombinovanými prostředky pro simultání, separátní nebo sekvenční použití v terapii glaukomu. Konkrétně se vynález týká farmaceutických prostředků obsahujících latanoprost jako anti-glaukomové činidlo a a-methyl-p-tyrosin, které jsou kombinovanými prostředky pro simultání, separátní nebo sekvenční použití v terapii glaukomu.

V předpokládaném terapeutickém použití bude a-methyl-ρ-tyrosin výhodně podán lokálně nebo orálně v denní dávce přibližně 100-500 mg.

Ačkoliv se předkládaný vynález týká zejména inhibice produkce melaninu indukované latanoprostem, může být α-methyl-p-tyrosin úspěšně použit pro inhibici stejných nežádoucích účinků pigmentace indukované jinými terapeutickými činidly nebo metabolickými poruchami jiného původu.

Tabulka 1: 5 buněčných kmenů (hnědých) - růstové stadium -

	Obsah melaninu (ng/buňku)
bez	a-methyl-p-tyrosinu	a-methyl-p-tyrosin IO”5
bez latanoprostu
(kontrola)		0,0138	0,0133
O latanoprost 10	M	0,0141	0,0135
Ύ latanoprost 10	M	0,0151	0,0136
latanoprost 10	M	0,0161*	0,0137
latanoprost 10”5	M	0,0149*	0,0131

p <0,01 vs. kontrola » · · I

I »9 1 k · · « to *

Tabulka 1 - pokračování

Produkce melaninu (ng/buňku/den) bez α-methyl-p-tyrosinu a-methyl-p-tyrosin bez latanoprostu

(kontrola)		0,0031	0,0033
latanoprost 10®	M	0,0038	0,0035
latanoprost 10-7	M	0,0046*	0,0039
latanoprost 10”^	M	0,0036	0,0029
latanoprost 10”^	M	0,0047*	0,0031
p <0,01 vs. kontrola

	Aktivita tyrosinasy (jednotky)
bez a-methyl-p-tyrosinu	a-methyl-p-tyrosin 10“ 5
bez latanoprostu
(kontrola)	36,7	33,6
latanoprost 10_®	M 36,7	35,5
latanoprost 10-7	M 38,3	38,7
latanoprost 10“θ	M 42,5	34,6
latanoprost 10“5	M 63,1*	31,5

p <0,01 vs. kontrola • » · · · 9 *9 · *99 » 9 « 9

9 9 9 » » 9 9 9 ♦ · · « »9 :: :.:::

9 · 9·9

9 9 9 9 9 «

Tabulka 2: 3 buněčných	kmenů (hnědo-modré)	- růstové stadium -
	Obsah melaninu	(ng/buňku)
bez ot	-methyl-p-tyrosinu	α-methyl-p-tyrosin 10“5
bez latanoprostu
(kontrola)	0,0121	0,0122
latanoprost 10“® M	0,0127	0,0119
latanoprost 10“7 M	0,0142*	0,0123
latanoprost 10”® M	0,0149*	0,0125
latanoprost 10“5 M	0,0151*	0,0128

p <0,01 vs. kontrola

Produkce melaninu	(ng/buňku/den) -methyl-p-tyrosin IO“5
	bez	α-methyl-p-tyrosinu a
bez latanoprostu
(kontrola)		0,0021	0,0023
latanoprost 10“®	M	0,0038	0,0025
latanoprost 10	M	0,0046*	0,0029
latanoprost 10“®	M	0,0056*	0,0029
latanoprost 10“^	M	0,0067*	0,0031

p <0,01 vs. kontrola

- 10 Tabulka 2 - pokračování

Aktivita tyrosinasy (jednotky) bez α-methyl-p-tyrosinu a-methyl-p-tyrosin

bez latanoprostu (kontrola)	32,5	32,4
latanoprost 10“θ M	33,7	34,6
latanoprost 10-7 M	48,1*	31,7
latanoprost 10M	52,5*	34,6
latanoprost 10M	62,7*	39,5

p <0,01 vs. kontrola • · *··· * · 9 · * ·« • · · # ♦ · » «»·» 4 4 4 »44 ··«· • « ♦ « · W *»**·* « · 4 ♦ 4 · · «»·· • · · · 4 » ♦ · » ·4 4 4

Claims (8)

1. Patentové nároky

   1. Použití inhibitorů tyrosinasy pro přípravu léku, který brání produkci melaninu melanocyty duhovky, která je indukována farmakologicky nebo metabolickou poruchou.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde produkce melaninu je indukována deriváty ^EGE2alfa ^ne^° ^PGE2'
3. 3. Použití podle nároku 2, kde deriváty ^PGE2alfa ^ne^° ^PGE2 3 ^sou latanoprost nebo unoproston.
4. 4. Použití podle jakéhokoliv z předcházejících nároků, kde inhibitorem tyrosinasy je ce-methyl-p-tyrosin.
5. 5. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje derivát ^PGE2alfa 3^ak° anti-glaukomové činidlo a inhibitor tyrosinasy, který je kombinovaným prostředkem pro simultání, separátní nebo sekvenční použití v terapii glaukomu.
6. 6. Farmaceutický prostředek podle nároku 5vyznačuj ící se t í m, že obsahuje latanoprost jako anti-glaukomové činidlo a α-methyl-p-tyrosin, který je kombinovaným prostředkem pro simultání, separátní nebo sekvenční použití v terapii glaukomu.
7. 7. Způsob pro prevenci produkce melaninu melanocyty duhovky vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství inhibitoru tyrosinasy.
8. 8. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že inhibitorem tyrosinasy je α-methyl-p-tyrosin.