CZ33336U1 - Diagnostická sada pro neinvazivní diagnostiku mozkových nádorů - Google Patents

Diagnostická sada pro neinvazivní diagnostiku mozkových nádorů Download PDF

Info

Publication number
CZ33336U1
CZ33336U1 CZ2019-35822U CZ201935822U CZ33336U1 CZ 33336 U1 CZ33336 U1 CZ 33336U1 CZ 201935822 U CZ201935822 U CZ 201935822U CZ 33336 U1 CZ33336 U1 CZ 33336U1
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mir
primer
stem
primers
levels
Prior art date
Application number
CZ2019-35822U
Other languages
English (en)
Inventor
Jiří Šána
Ondřej Slabý
Alena Kopková
Pavel Fadrus
Original Assignee
Masarykova Univerzita
FakultnĂ­ nemocnice Brno
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Masarykova Univerzita, FakultnĂ­ nemocnice Brno filed Critical Masarykova Univerzita
Priority to CZ2019-35822U priority Critical patent/CZ33336U1/cs
Publication of CZ33336U1 publication Critical patent/CZ33336U1/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Diagnostická sada pro neinvazivní diagnostiku mozkových nádorů
Oblast techniky
Předkládané technické řešení se týká diagnostické sady pro neinvazivní diagnostiku mozkových nádorů. Sada je určena pro stanovení mikroRNA v mozkomíšním moku umožňující detekci různých typů mozkových nádorů.
Dosavadní stav techniky
Primární nádory mozku a mozkové metastázy postihnou ročně v celosvětovém měřítku téměř 40 pacientů na 100 tisíc obyvatel a jejich incidence neustále stoupá. Přibližně 33 % primárních nádorů mozku pak tvoří maligní formy s pětiletým přežíváním v průměru u 34,4 % pacientů, přičemž prognóza úzce souvisí s konkrétním typem nádoru. Nejlepší prognózu mají nízkostupňové gliomy společně s meningeomy, naopak nejkratší přežívání je asociováno s multiformním glioblastomem (GBM). Velmi špatná prognóza bývá rovněž spojována s mozkovými metastázami, které se vyskytují u 20 % až 40 % dospělých pacientů s nádorovým onemocněním. Určení správné diagnózy hraje rozhodující roli i při výběru nejvhodnější terapie. Navzdory významným pokrokům v diagnostice nádorů mozku jako jsou různé modifikace zobrazovacích metod a následné histopatologické vyšetření tkáně, je diagnostika stále omezena lokalizací nádoru a často jeho značnou heterogenitou. Zavedení dostatečně senzitivních a specifických metod pro detekci a stanovení diagnózy u pacientů s mozkovými nádory je proto velice žádoucí. Vhodným diagnostickým nástrojem u mozkových nádorů je analýza mikroRNA, krátkých nekódujících RNA, v mozkomíšním moku (cerebrospinal fluid; CSF), který omývá centrální nervovou soustavu a je tak v přímém kontaktu s případnou patologickou tkání.
Podstata technického řešení
V rámci předkládaného technického řešení byly identifikovány mikroRNA v mozkomíšním moku asociované s přítomností vybraných mozkových nádorů. Předkládané technické řešení tedy poskytuje diagnostickou sadu pro detekci multiformního glioblastomu (GBM), meningeomu a/nebo mozkových metastáz na základě kvantifikace let-7i-5p, miR-151a-3p, miR-423-3p, a alespoň jedné miRNA vybrané z let-7b-5p, miR-140-5p, miR-21-3p, ve vzorku CSF metodou kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR).
Nukleotidové sekvence předmětných mikroRNA jsou následující:
let-7b-5p: miR-140-5p: miR-21-3p: let-7i-5p:
5’ UGAGGUAGUAGGUUGUGUGGUU 3’
5’ CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG 3’
5’ CAACACCAGUCGAUGGGCUGU 3’
5’ UGAGGUAGUAGUUUGUGCUGUU 3’ miR-151a-3p: 5’ CUAGACUGAAGCUCCUUGAGG 3’ miR-423-3p: 5’ AGCUCGGUCUGAGGCCCCUCAGU 3’
Uvedené sady diagnostického setu mají následující složení:
- stanovení hladiny exprese let-7b-5p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu pro qPCR sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC AACCAC - 3’ univerzální reverse primer: 5’ - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’
- 1 CZ 33336 Ul forward primer: 5’ - GGGTGAGGTAGTAGGTTGT - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACAACCACACAACC - 3’
- stanovení hladiny exprese miR-140-5p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu pro qPCR sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC CTACCA - 3’ univerzální reverse primer: 5’ - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - GGGCAGTGGTTTTACCCTA - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACCTACCATAGGGT - 3’
- stanovení hladiny exprese miR-21-3p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu pro qPCR sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC ACAGCC - 3’ univerzální reverse primer: 5’ - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - GTTGCAACACCAGTCGATG - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACACAGCCCATCGA - 3’
- stanovení hladiny exprese let-7i-5p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu pro qPCR sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC AACAGC - 3’ univerzální reverse primer: 5' - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - GTTTGGTGAGGTAGTAGTTTGT - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACAACAGCACAAAC - 3’
- stanovení hladiny exprese miR-151a-3p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu pro qPCR sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC CCTCAA - 3’ univerzální reverse primer: 5' - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - GTTGCTAGACTGAAGCTCC - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACCCTCAAGGAGCT - 3’
- stanovení hladiny exprese miR-423-3p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu pro qPCR sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC ACTGAG - 3’ univerzální reverse primer: 5' - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - TTGAGCTCGGTCTGAGGC - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACACTGAGGGGCCT - 3’
Sada může také s výhodou obsahovat deionizovanou vodu sloužící jako negativní kontrola a qRT-PCR standard odpovídající expresi let-7b-5p ve vzorku pacienta s GBM, expresi miR-1405p ve vzorku pacienta s meningeomem, expresi miR-21-3p ve vzorku pacienta s mozkovými metastázami a expresi let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p ve vzorcích pacientů s glioblastomem, meningeomem a mozkovými metastázami a jedinců bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění.
-2CZ 33336 Ul
Diagnostika multiformmho glioblastoma
Kvantitativní analýza hladiny let-7b-5p normalizované na průměr hladin let-7i-5p, miR-151a-3p amiR-423-3p, jejichž nukleotidové sekvence jsou specifikovány výše, pomocí qRT-PCR umožňuje s dostatečnou specificitou a senzitivitou odlišit pacienty s multiformním glioblastomem (GBM) od jedinců bez jakéhokoliv histopatologicky prokázaného nádorového onemocnění. Hladiny let-7b-5p, let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p se s pomocí předmětné sady stanovují v RNA izolované ze supematantu CSF.
Bylo zjištěno, že normalizovaná hladina let-7b-5p v supematantu CSF je významně změněna (zvýšena) u pacientů s GBM ve srovnání s dárci bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění.
Diagnostika meningeomu
Kvantitativní analýza hladiny miR-140-5p normalizované na průměr hladin let-7i-5p, miR-151a-3p amiR-423-3p, jejichž nukleotidové sekvence jsou specifikovány výše, pomocí qRT-PCR umožňuje s dostatečnou specificitou a senzitivitou odlišit pacienty s meningeomem od jedinců bez jakéhokoliv histopatologicky prokázaného nádorového onemocnění. Hladiny miR-140-5p, let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p se s pomocí předmětné sady stanovují v RNA vyizolované ze supematantu CSF.
Bylo zjištěno, že normalizovaná hladina miR-140-5p v supematantu CSF je významně změněna (zvýšena) u pacientů s meningeomem ve srovnání s dárci bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění.
Diagnostika mozkových metastáz
Kvantitativní analýza hladiny miR-21-3p normalizované na průměr hladin let-7i-5p, miR-151a-3p amiR-423-3p, jejichž nukleotidové sekvence jsou specifikovány výše, pomocí qRT-PCR umožňuje s dostatečnou specificitou a senzitivitou odlišit pacienty s mozkovými metastázami od jedinců bez jakéhokoliv histopatologicky prokázaného nádorového onemocnění. Hladiny miR-21-3p, let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p se s pomocí předmětné sady stanovují v RNA vyizolované ze supematantu CSF.
Bylo zjištěno, že normalizovaná hladina miR-21-3p v supematantu CSF je významně změněna (zvýšena) u pacientů s mozkovými metastázami ve srovnání s dárci bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění.
Objasnění výkresů
Obrázek 1 zobrazuje rozdíl v normalizovaných hladinách let-7b-5p v mozkomíšním moku mezi pacienty s multiformním glioblastomem (GBM) a jedinci bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění pro (p < 0,0001). Rozdíl exprese byl analyzován pomocí Mann-Whitneyho testu.
Obrázek 2 zobrazuje ROC křivku, která udává, s jakou senzitivitou a specificitou je mozkomíšní let-7b-5p schopna rozlišit pacienty s GBM a jedince bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění (AUC 0,9091; specificita 81 %; senzitivita 83 %).
Obrázek 3 zobrazuje rozdíl v normalizovaných hladinách miR-140-5p v mozkomíšním moku mezi pacienty s meningeomem a jedinci bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění pro (p < 0,001). Rozdíl exprese byl analyzován pomocí Mann-Whitneyho testu.
-3CZ 33336 UI
Obrázek 4 zobrazuje ROC křivku, která udává, s jakou senzitivitou a specificitou je mozkomíšní cirkulující miR-140-5p schopna rozlišit pacienty s meningeomem a jedince bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění (AUC 0,8073; specificita 83 %; senzitivita 75 %).
Obrázek 5 zobrazuje rozdíl v normalizovaných hladinách miR-21-3p v mozkomíšním moku mezi pacienty s mozkovými metastázami a jedinci bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění pro (p < 0,01). Rozdíl exprese byl analyzován pomocí Mann-Whitneyho testu.
Obrázek 6 zobrazuje ROC křivku, která udává, s jakou senzitivitou a specificitou je mozkomíšní ίο cirkulující miR-21-3p schopna rozlišit pacienty s mozkovými metastázami a jedince bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění (AUC 0,7969; specificita 75 %; senzitivita 100 %).
Příklad uskutečnění technického řešení
Pro testování diagnostické schopnosti miRNA podle předkládaného technického řešení byly připraveny qRT-PCR sety o následujícím složení:
Komponenta Množství Účel
Mix RT - reverzní transkripce 1 1x4,67 μΙ (1 rxn) Přepis miRNA do cDNA
Mix PCR2 1 x 17, 4 μΙ (1 rxn) Amplifikace miRNA
Detekční sada pro miR-1405p (RT primer; qPCR primery; TaqMan sonda) 2 μΙ; 1 μΙ (1 rxn) Reverzní transkripce a amplifikace miR-140-5p
Detekční sada pro miR-21-3p (RT primer; qPCR primery; TaqMan sonda) 2 μΙ; 1 μΙ (1 rxn) Reverzní transkripce a amplifikace miR-21-3p
Detekční sada pro let-7i-5p (RT primer; qPCR primery; TaqMan sonda) 2 μΙ; 1 μΙ (1 rxn) Reverzní transkripce a amplifikace let-7i-5p
Detekční sada pro miR-151a3p (RT primer; qPCR primery; TaqMan sonda) 2 μΙ; 1 μΙ (1 rxn) Reverzní transkripce a amplifikace miR-151a-3p
Detekční sada pro miR-4233p (RT primer; qPCR primery; TaqMan sonda) 2 μΙ; 1 μΙ (1 rxn) Reverzní transkripce a amplifikace miR-423-3p
Deionizovaná voda RT, qPCR 3,33 μΙ; 1,6 μΙ (1 rxn) Negativní kontrola
Pozitivní kontrola RT, qPCR 3,33 μΙ; 1,6 μΙ (1 rxn) Pozitivní kontrola pro let-7b5p, miR-140-5p, miR-21-3p, let-7i-5p, miR-151a-3p a miR423-3p
Pozn. TMix RT obsahuje 10X RT pufr, dNTP mix w/dTTp (100M total), inhibitor RNáz (20U/pL), and MultiScribe™ RT enzym (50U/pL). 2Mix PCR obsahuje AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, dNTPs s dUTP/dTTP směsí, ROX Passive Reference a optimalizovaný pufr. Uvedené objemy komponent platí pro jednu miRNA v rámci RT reakce v objemu 10 μΐ a qPCR 25 reakce v objemu 20 μΐ. Pozitivní kontrola obsahuje qRT-PCR standard odpovídající hladinám let-7b-5p ve vzorku pacienta s multiformním glioblastomem, hladinám miR-140-5p ve vzorku pacienta s meningeomem, hladinám miR-21-3p ve vzorku pacienta s mozkovými metastázami a hladinám let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p ve vzorcích pacientů s glioblastomem,
-4CZ 33336 UI meningeomem a mozkovými metastázami a jedinců bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění.
Set podle předkládaného technického řešení může obsahovat všech šest sad pro stanovení hladin všech šest miRNA, může však také obsahovat detekční sady pro let-7i-5p, miR-151a-3p a miR423-3p, a dále jednu nebo dvě sady vybrané z detekčních sad pro let-7b-5p, miR-140-5p, miR21-3p.
Stem-loop primer (RT primer), qPCR primery (forward, reverse), a TaqMan sonda měly sekvence uvedené v nároku 1.
K izolaci RNA byl použit CSF pacientů odebraný pomocí lumbální punkce v objemu 3 až 5 ml do sterilní zkumavky. Poté byl CSF centrifugován 10 minut při RCF 500 g a 4 °C s následným oddělením a uschováním supematantu. Celková RNA obohacená o frakci krátkých RNA byla izolována z 1 ml CSF supematantu za použití kitu Urine microRNA Purification Kit od Norgen Biotek.
K detekci hladin let-7b-5p, miR-140-5p, miR-21-3p, let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p byly použity výše uvedené sady obsahující jak specifické stem-loop primery pro reverzní transkripci (RT), pomocí níž je RNA přepsána do cDNA, tak primery a fluorescenčně značené sondy pro qPCR. Finální amplifikace a kvantifikace konkrétních miRNA byla provedena za použití přístroje QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System (Thermo Fisher Scientific). Kvantita stanovovaných miRNA je vyjádřena tzv. Cq (quantitation cycle), tedy číslem cyklu, při kterém fluorescenční signál dosáhl nastavené prahové hodnoty. Detekované hladiny let-7b-5p, miR-1405p amiR-21-3p byly normalizovány na průměr hladin referenčních let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p.
Relativní exprese let-7b-5p, miR-140-5p a miR-21-3p byly stanoveny metodou 2 dCq, kde hodnota dCq představuje rozdíl mezi Cq jednotlivých stanovovaných miRNA a průměrem hladin tri referenčních miRNA.
Všichni pacienti, jejichž RNA byla použita k analýze, byli předem diagnostikovaní pomocí histologického vyšetření odebrané tkáně. Do studie byli zařazeni pouze pacienti, u nichž byl histopatologicky potvrzen GBM, meningiom nebo mozkové metastázy. Kontrolní skupinu tvořili jedinci bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění.
U pacientů s GBM byla v CSF detekována významně zvýšená hladina let-7b-5p ve srovnání s jedinci bez jakéhokoliv histopatologicky prokázaného nádorového onemocnění (p < 0,0001) (Obrázek 1). Rozdíl hladin mezi sledovanými skupinami byl testován pomocí Mann-Whitneyho testu.
Pomocí ROC (receiver operating characteristic) analýzy byla získána hodnotící, prahová hodnota normalizované exprese let-7b-5p v CSF (cut-off = 0,6418), podle které lze rozlišit pacienty s GBM od jedinců bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění se specificitou 81 % a senzítívítou 83 % (AUC [area under curve] = 0,9091) (Obrázek 2).
Vzorky s vyšší normalizovanou hladinou let-7b-5p, než je prahová hodnota, jsou považovány za vzorky pacientů s GBM, naopak vzorky s nižší normalizovanou hladinou let-7b-5p, než je prahová hodnota, jsou považovány za vzorky jedinců bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění.
U pacientů s meningeomem byla v CSF detekována významně zvýšená hladina miR-140-5p ve srovnání s jedinci bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění (p < 0,001) (Obrázek 3). Rozdíl hladin mezi sledovanými skupinami byl testován pomocí Mann-Whitneyho testu.
-5CZ 33336 Ul
Pomocí ROC (receiver operating characteristic) analýzy byla získána hodnotící, prahová hodnota normalizované exprese miR-140-5p v CSF (cut-off = 0,2248), podle které lze rozlišit pacienty s meningeomem od jedinců bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění se specificitou 83 % a senzitivitou 75 % (AUG [area under curve] = 0,8073) (Obrázek 4).
Vzorky s vyšší normalizovanou hladinou miR-140-5p, než je prahová hodnota, jsou považovány za vzorky pacientů s meningeomem, naopak vzorky s nižší normalizovanou hladinou miR-1405p, než je prahová hodnota, jsou považovány za vzorky jedinců bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění.
U pacientů s mozkovými metastázami byla v CSF detekována významně zvýšená hladina miR21-3p ve srovnání s jedinci bez jakéhokoliv histopatologicky prokázaného nádorového onemocnění (p < 0,01). Rozdíl hladin mezi sledovanými skupinami byl testován pomocí MannWhitneyho testu.
Pomocí ROC (receiver operating characteristic) analýzy byla získána hodnotící, prahová hodnota normalizované exprese miR-21-3p v CSF (cut-off = 0,0661), podle které lze rozlišit pacienty s mozkovými metastázami od jedinců bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění se specificitou 75 % a senzitivitou 100 % (AUC [area under curve] = 0,7969) (Obrázek 6).
Vzorky s vyšší normalizovanou hladinou miR-21-3p, než je prahová hodnota, jsou považovány za vzorky pacientů s mozkovými metastázami, naopak vzorky s nižší normalizovanou hladinou miR-21-3p, než je prahová hodnota, jsou považovány za vzorky jedinců bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění.

Claims (7)

NÁROKY NA OCHRANU
1. Diagnostický set pro detekci multiformního glioblastomu, meningeomu a/nebo mozkových metastáz ze vzorku mozkomíšního moku metodou kvantitativní PCR v reálném čase, vyznačený tím, že obsahuje sady pro stanovení hladin následujících mikroRNA: let-7i-5p, miR-151a-3p, miR-423-3p a alespoň jedné mikroRNA vybrané z let-7b-5p, miR-140-5p a miR-21-3p, přičemž uvedené sady jsou:
- sada pro stanovení hladiny let-7b-5p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu typu TaqMan sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
2. Diagnostický set pro detekci multiformního glioblastomu podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje sady stem-loop primerů pro reverzní transkripci, primerů a fluorescenčně značených sond pro stanovení hladin mikroRNA let-7b-5p, let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p.
3. Diagnostický set pro detekci meningeomu podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje sady stem-loop primerů pro reverzní transkripci, primerů a fluorescenčně značených sond pro stanovení hladin mikroRNA miR-140-5p, let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p.
4. Diagnostický set pro detekci mozkových metastáz podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje sady stem-loop primerů pro reverzní transkripci, primerů a fluorescenčně značených sond pro stanovení hladin mikroRNA miR-21-3p, let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p.
5. Diagnostický set podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že dále obsahuje deionizovanou vodu jako negativní kontrolu.
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC ACTGAG - 3’ univerzální reverse primer: 5' - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - TTGAGCTCGGTCTGAGGC - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACACTGAGGGGCCT - 3’
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACCCTCAA - 3’ univerzální reverse primer: 5' - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - GTTGCTAGACTGAAGCTCC - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACCCTCAAGGAGCT - 3’
- sada pro stanovení hladiny miR-423-3p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu typu TaqMan sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC AACAGC - 3’ univerzální reverse primer: 5' - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - GTTTGGTGAGGTAGTAGTTTGT - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACAACAGCACAAAC - 3’
- sada pro stanovení hladiny miR-151a-3p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu typu TaqMan sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACACAGCC - 3’ univerzální reverse primer: 5’ - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - GTTGCAACACCAGTCGATG - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACACAGCCCATCGA - 3’
- sada pro stanovení hladiny let-7i-5p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu typu TaqMan sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACCTACCA - 3’ univerzální reverse primer: 5’ - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - GGGCAGTGGTTTTACCCTA - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACCTACCATAGGGT - 3’
-6CZ 33336 UI
- sada pro stanovení hladiny miR-21-3p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu typu TaqMan sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC AACCAC - 3’ univerzální reverse primer: 5’ - GTGCAGGGTCCGAGGT - 3’ forward primer: 5’ - GGGTGAGGTAGTAGGTTGT - 3’
TaqMan sonda: 5’ - AGCCAACAACCACACAACC - 3’
- sada pro stanovení hladiny miR-140-5p, obsahující stem-loop primer pro reverzní transkripci a primery a fluorescenčně značenou sondu typu TaqMan sestávající ze sekvencí:
stem-loop primer:
6. Diagnostický set podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že dále obsahuje směsný qRT-PCR standard odpovídající hladinám let-7b-5p ve vzorku pacienta s multiformním glioblastomem, hladinám miR-140-5p ve vzorku pacienta s meningeomem, a/nebo hladinám miR-21-3p ve vzorku pacienta s mozkovými metastázami; a směsný qRT-PCR
-7 CZ 33336 Ul standard odpovídající hladinám let-7i-5p, miR-151a-3p a miR-423-3p ve vzorcích pacientů s glioblastomem, meningeomem a/nebo mozkovými metastázami; a směsný qRT-PCR standard odpovídající hladinám uvedených miRNA u jedinců bez jakéhokoliv prokázaného nádorového onemocnění.
CZ2019-35822U 2019-01-12 2019-01-12 Diagnostická sada pro neinvazivní diagnostiku mozkových nádorů CZ33336U1 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-35822U CZ33336U1 (cs) 2019-01-12 2019-01-12 Diagnostická sada pro neinvazivní diagnostiku mozkových nádorů

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-35822U CZ33336U1 (cs) 2019-01-12 2019-01-12 Diagnostická sada pro neinvazivní diagnostiku mozkových nádorů

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ33336U1 true CZ33336U1 (cs) 2019-10-31

Family

ID=68465438

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-35822U CZ33336U1 (cs) 2019-01-12 2019-01-12 Diagnostická sada pro neinvazivní diagnostiku mozkových nádorů

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ33336U1 (cs)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3083986B1 (en) Mirnas as non-invasive biomarkers for parkinson&#39;s disease
US20120322680A1 (en) Use of mirnas as biomarkers in glioma diagnosis
KR20180118670A (ko) 외상성 뇌 손상의 바이오마커
JP6667813B2 (ja) アルツハイマー病又は軽度認知症の検出を補助する方法
EP2406402A2 (en) Method to assess human allograft status from microrna expression levels
US20180155787A1 (en) Non-alcoholic fatty liver disease biomarkers
JP2017184642A (ja) 認知症マーカー、それを用いた認知症の評価方法、評価試薬および評価キット
JP2015512249A (ja) 循環から採取される身体試料中のウイルス、特に、ｈｉｖの親和性及び受容体使用の決定方法
KR102178922B1 (ko) 당뇨병성 신증 진단을 위한 마이크로RNA let-7 또는 마이크로RNA-150 바이오마커 및 이의 용도
JP2021045131A (ja) 健康のサイン
KR102178919B1 (ko) 당뇨병성 신증 진단을 위한 마이크로rna 바이오마커 및 이의 용도
JP2021112167A (ja) うつ病の診断補助方法及び診断用キット
US10913979B2 (en) Determination of miR-423-5p in heart failure
CZ33336U1 (cs) Diagnostická sada pro neinvazivní diagnostiku mozkových nádorů
EP3083987B1 (en) Determination of platelet-mirnas in alzheimer&#39;s disease
WO2015091963A2 (en) Determination of platelet-mirnas in acute myocardial infarction
CN111051531B (zh) 短核酸的多重检测
WO2015091897A1 (en) Determination of platelet-mirnas
EP4239082A1 (en) Micrornas as predictive biomarkers of immune reconstitution inflammatory syndrome
CZ31584U1 (cs) Diagnostický set pro stanovení rizika relapsu po nefrektomii u pacientů s nemetastatickým renálním karcinomem
US20160194712A1 (en) Mirna based treatment monitoring in autoimmune diseases
KR101930818B1 (ko) 방광암의 비침습적 진단 방법
Sanjaya et al. Identification of Microrna in Pediatric Latent Tuberculosis: A Preliminary Study in Indonesia
KR20220052474A (ko) 주사증 진단을 위한 마이크로RNA-21-3p 및 이의 용도
CZ36892U1 (cs) Sada pro odlišení indolentního a agresivního karcinomu prostaty

Legal Events

Date Code Title Description
FG1K Utility model registered

Effective date: 20191031

MK1K Utility model expired

Effective date: 20230112