CZ309744B6 - Způsob detekce a kvantifikace RNA užitím termorezistentní ligázy z termofilní bakterie Thermococcus gorgonarius - Google Patents

Způsob detekce a kvantifikace RNA užitím termorezistentní ligázy z termofilní bakterie Thermococcus gorgonarius Download PDF

Info

Publication number
CZ309744B6
CZ309744B6 CZ2022-352A CZ2022352A CZ309744B6 CZ 309744 B6 CZ309744 B6 CZ 309744B6 CZ 2022352 A CZ2022352 A CZ 2022352A CZ 309744 B6 CZ309744 B6 CZ 309744B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
rna
tgri
ligase
ligation
dna
Prior art date
Application number
CZ2022-352A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2022352A3 (cs
Inventor
Pavol Utekal
Utekal Pavol RNDr., Ph.D.
Petr Dráber
DrSc. Dráber Petr RNDr.
Original Assignee
Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i. filed Critical Ústav molekulární genetiky AV ČR, v.v.i.
Priority to CZ2022-352A priority Critical patent/CZ2022352A3/cs
Publication of CZ309744B6 publication Critical patent/CZ309744B6/cs
Publication of CZ2022352A3 publication Critical patent/CZ2022352A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Řešení se týká použití TgRI ligázy při detekci RNA, zejména mRNA, způsobem, který zahrnuje kroky hybridizace detekované RNA a dvou jednovláknových DNA sond komplementárních s detekovanou RNA, nasedajících na detekovanou RNA bezprostředně vedle sebe, vytvoření hybridní molekuly RNA-DNA a ligace zakotvených jednovláknových DNA za vzniku templátové jednovláknové DNA a nakonec polymerázové řetězové reakce detekující templátovou ssDNA vzniklou ligací sond. TgRI ligáza byla připravena využitím rekombinantní technologie z baktérie Thermococcus gorgonarius. TgRI vykazuje vlastnosti výhodné pro použití při detekci RNA, zejména teplotní optimum ligační aktivity, které je přibližně 65 °C. Užitím TgRI ligázy bylo dosaženo výrazného zvýšení citlivosti a specificity detekce RNA.

Description

Způsob detekce a kvantifikace RNA užitím termorezistentní ligázy z termofilní bakterie Thermococcus gorgonarius
Oblast techniky
Vynález se týká použití TgRI ligázy při detekci a kvantifikaci RNA, která zahrnuje kroky hybridizace detekované RNA a dvou jednovláknových DNA sond komplementárních s detekovanou RNA, nasedajících na detekovanou RNA bezprostředně vedle sebe, vytvoření hybridní molekuly RNA-DNA a ligace zakotvených jednovláknových DNA za vzniku templátové jednovláknové DNA, a nakonec kvantitativní polymerázové řetězové reakce detekující templátovou jednovláknovou DNA vzniklou ligací sond. TgRI ligáza byla připravena využitím rekombinantní technologie z baktérie Thermococcus gorgonarius. Užitím TgRI ligázy bylo dosaženo výrazného zvýšení citlivosti a specificity detekce RNA.
Dosavadní stav techniky
Genová exprese je proces, ve kterém je informace v DNA (genech) transformována během tzv. transkripce do RNA. RNA může být konečným produktem genové exprese (tRNA, mikroRNA) a uplatní se např. při řízení exprese jiných genů. Ve většině případů je však RNA mezistupněm tvorby proteinů na základě informace uložené v genech. Tyto RNA, označované messenger RNA (mRNA) vznikají transkripcí DNA v procesu genové exprese a jsou následnou šablonou pro vznik nových bílkovin na základě genetické informace dané pořadím nukleotidů v DNA. Metody genové exprese jsou široce využívány pro výzkum funkční genomiky, která se zabývá strukturou, funkcí a regulací globálně všech genů a dynamickými aspekty, jakými jsou genová transkripce, translace a meziproteinové interakce v těchto procesech. Změny v expresi specifických genů bývají příčinou změn buněk za normálních a patologických stavů.
Nejčastěji používaná metoda analýzy genové exprese je založena na kvantifikaci mRNA. Pro toto stanovení byla vyvinuta řada metod, jakými jsou Northern hybridizace, microarray, sériová analýza genové exprese (SAGE), RNA-sekvenování a metody na bázi amplifikace nukleových kyselin pomocí polymerázové řetězcové reakce (PCR). Nejčastěji používanou metodou kvantifikace mRNA je kvantitativní PCR v reálném čase (RT-qPCR). Tato metoda je kombinací třech kroků: a) reverzní transkripce (RT), ve které dochází k přepisu genetické informace z mRNA na cDNA pomocí enzymu reverzní transkriptázy, b) amplifikace cDNA pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) a c) detekce a kvantifikace produktu amplifikace v reálném čase (1). Ačkoliv RT-PCR bývá první volbou při kvantifikaci mRNA (2, 3) je zatížena řadou problémů, které znesnadňují přesnou analýzu genové exprese.
Pro detekci a kvantifikaci RNA (mRNA) je nyní často užívána metoda RASL (RNA-mediated oligonucleotide Annealing, Selection and Ligation), založená na ligaci jednořetězcových sond DNA specificky hybridizovaných k RNA. Detekce RNA založená na tvorbě RNA/DNA duplexů (bez přepisu RNA do cDNA reversní transkripcí) vyžaduje enzym schopný efektivně ligovat jednovláknové molekuly DNA (ssDNA) hybridizované na komplementární molekulu mRNA. Většina komerčně dostupných ligáz má však relativně nízkou schopnost ligace DNA zakotvených na RNA. Například DNA ligáza z T4 bakteriofága je schopná iniciovat ligační reakci molekul ssDNA hybridizovaných na RNA přidáním AMP. Relativně nízká reakční kinetika a slabá vazebná afinita T4 DNA ligázy k RNA/DNA hybridní molekule má za následek disociaci ligázy a RNA/DNA duplexu dříve, než dojde k vzniku kovalentní vazby mezi DNA sondami (4, 5).
T4 RNA ligáza (T4Rnl2) je běžně používaná k ligaci RNA i ssDNA nezávisle na templátu. Je ale také schopná opravit přerušení (nick) jednoho vlákna v hybridním duplexu, když je nick tvořen 3'-OH RNA a 5'-fosforylovanou DNA. V minulosti byla použitá na přípravu knihoven pro tzv. next generation sequencing (4).
- 1 CZ 309744 B6
Další ligázou schopnou ligovat DNA hybridizovanou na RNA je NAD+-závislá ligáza z entomopoxviru napadajícího Melanoplus sanguinipes. Aktivní je, avšak jen v přítomnosti Mn2+ a aktivitu má porovnatelnou s T4 DNA ligázou (6).
DNA ligáza z Chlorella viru, který napadá Paramecium bursaria (PBCV-1 DNA ligáza/SplintR) je malá DNA ligáza o velikosti 298 aminokyselin, která byla charakterizovaná jako minimální ligační systém. Bylo zjištěno, že tato ligáza dovede efektivně katalyzovat ligaci přerušení jednoho vlákna ve dvojvláknové DNA (dsDNA) stejně jako ligovat donorovou jednovláknovou RNA (ssRNA) s akceptorovou jednovláknovou ssDNA. V kontrastu s předchozími zjištěními bylo zjištěno, že PBCV-1 DNA ligáza je schopná katalyzovat ligaci ssDNA molekul hybridizovaných k RNA s překvapivou efektivitou, mnohem vyšší v porovnání s T4 DNA ligázou. Následně byla schopnost PBCV-1 ligovat DNA zakotvenou na RNA potvrzena (7).
RNA ligáza z termofilního mikroorganismu Thermococcus kodakarensis (KOD1Rnl) byla popsána jako jeden z RNA/DNA modifikujících enzymů se zvýšeným teplotním optimem (8).
RNA ligáza z Thermococcus gorgonarius nebyla dosud izolována ani připravena rekombinantní technologií, její předpokládána sekvence byla počítačově predikována v rámci genomové sekvence Thermococcus gorgonarius (NCBI, ref. číslo NZ_CP014855.1).
Podstata vynálezu
Vynález je zaměřený na způsob detekce a kvantifikace různých druhů RNA, zejména mRNA, se zvýšenou citlivostí a specificitou v porovnání s již existujícími způsoby založenými na stejném principu. Výrazného zvýšení citlivosti a specificity bylo dosaženo použitím nové rekombinantní, termorezistentní ligázy z termofilních bakterií Thermococcus gorgonarius (TgRI). Ligáza pro použití podle vynálezu byla připravena rekombinantní technologií, je tvořená 380 aminokyselinami (v důsledku způsobu přípravy obsahuje úsek 6 histidinů na purifikaci a 2 aminokyseliny vnesené klonováním) s predikovanou molekulovou hmotností 44,2 kDa.
Principem detekční metody RNA je hybridizace dvou jednovláknových DNA oligonukleotidů, které jsou komplementární ke kvantifikované RNA a nasedají na ni tak, že 5' konec jedné sondy a 3' konec druhé sondy hybridizují s RNA v bezprostřední blízkosti, což umožňuje, v kombinaci s použitím vhodného enzymu, ligázy, vytvoření kovalentní vazby mezi nimi. Takto vzniklá jednovláknová molekula DNA je následně použita jako templát v polymerázové řetězové reakci (PCR), výhodně kvantitativní PCR (qPCR), výhodněji kvantitativní PCR v reálném čase (RTqPCR), a na základě získaných hodnot, zejména hodnot Ct (Cycle of treshold, cyklus prahu) je možné detekovat přítomnost RNA ve vzorcích a popřípadě i stanovit její relativní koncentraci.
Použití ligázy TgRI umožňuje provádět denaturaci sekundární struktury analyzované mRNA při teplotě 95 °C a ta je pak lépe dostupná pro hybridizaci DNA sond, což zvyšuje citlivost metody. Následnou hybridizaci je taktéž možné provádět při vyšší teplotě (až 70 °C), což zvyšuje specificitu metody, protože vyšší teplota brání nespecifické hybridizaci sond, tzn. že sondy nasedají jen na RNA, se kterou jsou 100% komplementární. Spolu s optimální reakční teplotou TgRI ligázy, která činí přibližně 65 °C a umožňuje udržovat RNA v denaturovaném stavu po celou dobu ligace, bylo dosaženo výjimečného zvýšení citlivosti i specificity metody. Další významná výhoda použití TgRI ligázy spočívá v tom, že termorezistence TgRI ligázy umožňuje uskutečnit všechny tři kroky, tj. denaturaci, hybridizaci a následnou ligaci v jedné zkumavce. U běžně používaných ligáz, které mají mnohem nižší optimální reakční teplotu (SplintR 37 °C, T4 RNA 37 °C), je nutné nejdřív provést denaturaci a hybridizaci a až pak přidat ligázu, aby se předešlo denaturaci samotných ligáz. V průběhu ligace při 37 °C může docházet k renaturaci mRNA a tím ke kompetici s hybridizačními sondami.
- 2 CZ 309744 B6
Aditiva trehalóza a 1,2-propandiol (TP) pomohla dosáhnout lepší konzistenci výsledků.
Vynález se tedy konkrétně týká použití TgRI ligázy při způsobu detekce a kvantifikace RNA, který zahrnuje kroky a) hybridizace detekované RNA a dvou jednovláknových DNA sond komplementárních s detekovanou RNA, nasedajících na detekovanou RNA bezprostředně vedle sebe, za vytvoření hybridní molekuly RNA-DNA a ligace zakotvených jednovláknových DNA za vzniku templátové jednovláknové DNA při teplotě až 70 °C, a výhodně za přítomnosti trehalózy a 1,2-propandiolu, což zvyšuje citlivost i specificitu metody, b) kvantitativní polymerázové řetězové reakce, výhodně kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase, detekující templátovou ssDNA vzniklou ligací DNA sond.
Objasnění výkresů
Obrázek 1. Nukleotidová (A) sekvence (sekvence id. č. 1) a aminokyselinová (B) sekvence (sekvence id. č. 4) ligázy TgRI.
Obrázek 2. Sekvence primerů TgRI-For (sekvence id. č. 2) a TgRI-Rev (sekvence id. č. 3) použitých pro amplifikaci DNA kódující RNA ligázu TgRI.
Obrázek 3. Ukázka průběhu amplifikace (záznam výstupních dat z termocykleru RealPlex EP Mastercycler, Eppendorf) a relativní kvantifikace produktů ligace sRNA o různých koncentracích se třemi různými ligázami. Průměrné Ct hodnoty ke znázorněným grafům jsou zahrnuty v tabulce 1.
Obrázek 4. Ukázka průběhu amplifikace (záznam výstupních dat z termocykleru RealPlex EP Mastercycler, Eppendorf) a relativní kvantifikace produktů ligace sond pro mRNA genu TNF-α v neaktivovaných a aktivovaných buňkách Lyn +/+. Průměrné Ct hodnoty ke znázorněným grafům jsou zahrnuty v tabulce 2.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Příprava TgRI
Nukleotidová sekvence TgRI odpovídající nukleotidům 119088 až 120230 (celková délka 1143 nukleotidů) v genomové sekvenci termofilní baktérie Thermococcus gorgonarius (NCBI: NZ_CP014855.1), je v sekvenčním protokolu uvedena jako SEKVENCE IDENTIFIKAČNÍHO ČÍSLA (ID. Č.) 1.
Na základě znalosti výše uvedené počítačově predikované sekvence RNA ligázy byla nejdříve amplifikována z genomové DNA Thermococcus gorgonarius (kmen ze sbírky DSMZ, ref. č. 10395, viz https://www.dsmz.de/collection/catalogue/details/culture/DSM-10395) DNA kódující RNA ligázu označenou zde jako TgRI. Amplifikace byla provedena použitím primerů „TgRI-For“ a „TgRI-Rev“.
TgRI-For: SEKVENCE ID. Č. 2
TgRI-Rev: SEKVENCE ID. Č. 3.
Primer TgRI-For obsahuje rozeznávací sekvenci pro endonukleázu NcoI a primer TgRI-Rev obsahuje rozeznávací sekvenci pro endonukleázu XhoI. Takto získaný gen byl po štěpení příslušnými endonukleázami naklonován do plazmidu pET28b+ za vzniku plazmidu pET28-TgRI.
- 3 CZ 309744 B6
Tím byl následně transformován expresní kmen E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL, bakterie se nechaly rozrůst přes noc za přítomnosti kanamycinu s koncentrací 1 ng/ml. Noční kulturou bylo druhý den naočkováno 200 ml LB média obsahující kanamycin s koncentrací 1 ng/ml v poměru 1:100 a inkubovalo se při 37 °C na rotačním inkubátoru (180 RPM) do dosažení OD = 0,5. Potom byla snížena inkubační teplotu na 22 °C a po ochlazení média byla exprese TgRI indukována přidáním IPTG o výsledné koncentraci 0,5 mM a inkubovalo se další 4 hodiny. Pak byly bakterie usazeny centrifůgací, rozsuspendovány v 12 ml roztoku A (50mM fosfátový pufr pH = 8,0, 1M NaCl, 5mM imidazol) a sonikovány. Následně byla centrifůgací oddělena nerozpustná frakce od rozpustné, která obsahovala TgRI a ta byla nanesena na Iml kolonu s pryskyřicí HisPurTM Cobalt. Pak byla kolona promyta 12 ml roztoku B (50mM fosfátový pufr pH = 8,0, 1M NaCl, lOmM imidazol) a následně byla TgRI eluována 3 ml roztoku C (50mM fosfátový pufr pH = 8,0, 500mM NaCl, 250mM imidazol). Purifikovaná TgRI byla dialyzována ve skladovacím pufru (50mM TrisHC1 pH = 8,0, ImM DTT, ImM EDTA, 0,1% Tween 20, 50% glycerol) a naředěna na koncentraci 0,5 mg/ml.
Aminokyselinová sekvence rekombinantní TgRI (388 aminokyselin), získané výše uvedeným postupem, je uvedena v sekvenčním protokolu jako SEKVENCE ID. C. 4. Posledních 8 aminokyselin s šesti histidiny bylo do sekvence introdukováno z důvodu izolace. Predikovaná aminokyselinová sekvence TgRI (380 aminokyselin) je dostupná v databázi NCBI pod ref. číslem WP_088884437.1.
Rekombinantní ligázu TgRI lze připravit i jiným obdobným postupem přípravy rekombinantních proteinů, např. pomocí jiného plazmidu, jiného expresního hostitele atd., jakje odborníkovi známo.
Reakční teplota TgRI ligázy pro ligaci DNA leží výhodně v rozmezí 55 °C až 75 °C, výhodněji 60 °C až 70 °C, optimální teplota je 65 °C.
Příklad 2
Stanovení koncentrace syntetické RNA (sRNA) se třemi různými ligázami
Stručný přehled kroků stanovení sRNA s využitím TgRI:
1. Hybridizace DNA sond ke komplementární sRNA a ligace DNA sond
2. Detekce jedno vláknové DNA vzniklé ligaci DNA sond pomocí qPCR
Detailní protokol:
1. Hybridizace a ligace. Použita byla syntetická RNA mající sekvenci uvedenou v sekvenčním protokolu jako SEKVENCE ID. C. 5 o různých koncentracích 100, 10 nebo 1 amol/μΐ v zásobním roztoku. Reakce probíhaly v 0,2ml zkumavkách v PCR cyklem. Denaturace RNA probíhala při teplotě 95 °C po dobu 1 minuty, hybridizace 30 sekund při 45 °C a ligace při 55 °C 1 hodinu. Složení hybridizační a ligační směsi bylo následující:
+TP -ΤΡ
RNA 3 μΐ 3 μΐ
Sondy (5nM) 3 μΐ 3 μΐ
Ligáza 0,5 μΐ 0,5 μΐ
ATP (20mM) 1 μΐ 1 μΐ
Pufr (lOx) 2 μΐ 2 μΐ
TP 2,5 μΐ -
h2o 8 μΐ 10,5 μΐ
Celkem 20 μΐ 20μ1
-4CZ 309744 B6
Složení pufru: 500mM Tris-HCl, 100mM MgCh, 100mM DTT, 10mM ATP, pH 7,5 (25 °C).
TP: 0,8M Trehalóza, 4M 1,2-propandiol.
Koncentrace ligázy: 0,5 mg/ml.
2. Pro detekci ligovaných sond bylo 10 pl ligační směsi smícháno se 40 pl reakční směsi pro qPCR obsahující barvivo SYBR Green I a s výsledným složením 75mM Tris-HCl pH 8,8 (25 °C), 20mM (NH4)2SO4, 0,2M trehalóza, 1M 1,2-propandiol, 0,01% Tween 20, 2,5mM MgCl2, 200pM dNTPs, Taq DNA polymeráza (25 U/ml).
Stručný přehled kroků stanovení sRNA s využitím ligáz SplintR a T4 RNA:
1. Hybridizace DNA sond ke komplementární sRNA.
2. Ligace DNA sond.
3. Detekce jednovláknové DNA vzniklé ligací DNA sond pomocí qPCR.
Detailní protokol:
1. Hybridizace. Byla použita syntetická RNA o různých koncentracích 100, 10 nebo 1 amol/pl v zásobním roztoku. Reakce probíhaly v 0,2ml zkumavkách v PCR cykleru. Denaturace RNA probíhala při teplotě 95 °C po dobu 1 minuty, hybridizace při 45 °C po 1 minutu. Složení hybridizační a ligační směsi bylo následující:
RNA 3 pl
Sondy (5nM) 3 pl
Pufr (10x) 1 pl
h2o 3 pl
Celkem 10 pl
Pufr: pro každou ligázu jiný, dodaný výrobcem/prodejcem spolu s ligázou.
2. Ligace. Ligace probíhala 1 hodinu při 37 °C. Do každé zkumavky s 10 pl vzorku (hybridizace) bylo přidáno 10 pl ligační směsi s následujícím složením:
+TP -TP
Ligáza 0,2 pl 0,2 pl
Pufr (10x) 1 pl 1 pl
TP 2,5 pl -
h2o 6,3 pl 8,8 pl
Celkem 10 pl 10 pl
3. Pro detekci ligovaných sond bylo 10 pl ligační směsi smícháno se 40 pl reakční směsi pro qPCR obsahující barvivo SYBR Green I a s výsledným složením 75mM Tris-HCl pH 8,8 (25 °C), 20mM (NH4)2SO4, 0,2M trehalóza, 1M 1,2-propandiol, 0,01% Tween 20, 2,5mM MgCl2, 200pM dNTPs, Taq DNA polymeráza (25 U/ml).
Pro PCR byl využit přístroj RealPlex EP Mastercycler (Eppendorf). Program byl zahájen denaturací po dobu 3 min při 95 °C. Následovalo 40 cyklů, z nichž každý zahrnoval fázi denaturace při 95 °C po dobu 10 s, fázi nasedání primerů při 60 °C po 10 s a fázi syntézy při 72 °C po dobu 8 s.
- 5 CZ 309744 B6
Sekvence DNA sond:
Sonda 1: SEKVENCE ID. Č. 6
Sonda 2: SEKVENCE ID. Č. 7
Sekvence primem použitých v qPCR: qPCR-For: SEKVENCE ID. Č. 8 qPCR-Rev: SEKVENCE ID. Č. 9
Výsledky stanovení:
V konečném kroku qPCR jsou výsledky zaznamenány jako hodnoty Ct, neboli počet cyklů, které proběhnou, než hodnota fluorescence, která je měřena v reálném čase, překročí určenou hranici (threshold). Čím je množství templátu v reakci nižší, tím vyšší je hodnota Ct. Použití termorezistentní TgRI vedlo ke snížení hodnoty Ct v porovnání s dalšími použitými ligázami a zvětšil se rozdíl Ct hodnot mezi jednotlivými koncentracemi sRNA. V tomto konkrétním případě není snížení hodnot Ct příliš výrazné, což je způsobeno nízkou teplotou tání (Tm) použitých DNA sond, která je nižší než optimální teplota, při které TgRI katalyzuje ligaci. V následujícím příkladu, kde u TgRI byly použity sondy s vyšší Tm, je tento rozdíl mnohem větší. Přídavek TP aditiv způsobil vyrovnání rozdílu mezi vzorky s různými koncentracemi mRNA. Výsledky shrnuje tabulka 1 (viz také obr. 3).
Tabulka 1
Koncentrace (amol/μΐ) 0 1 10 100 ACt 0-1 ACt 1-10 ACt 10-100
Ligáza TP
TgRI (Ct) 26,64 21,24 18,2 14,46 5,4 3,04 3,74
+ 26,92 22,52 18,7 15,11 4,4 3,82 3,59
SplintR (Ct) 30,4 26,32 24 18,84 4,08 2,32 5,16
+ 26,94 23,58 19,85 16,49 3,36 3,73 3,36
T4 RNA (Ct) - 24,1 23,95 22,81 19,68 0,15 1,14 3,13
+ 23,56 23,28 21,68 18,1 0,28 1,6 3,58
Příklad 3
Stanovení hladiny exprese genu TNF-α v neaktivovaných a aktivovaných myších žírných buňkách na úrovni mRNA různými ligázami s použitím sond navrhnutých pro TgRI ligázu s Tm přibližně 70 °C.
Vyšší teplota v průběhu hybridizace sond zaručuje, že mRNA nemůže tvořit sekundární strukturu a tím zvyšuje specificita hybridizace.
Zdroj RNA: Aktivace myších žírných buněk a izolace mRNA
Myší žírné buňky Lyn +/+ (stabilní buněčná linie izolovaná ze stehenních a holenních kostí myší linie C57 BL/6, daroval M. Hibbs, Ludwig Institute for Cancer Research, Melbourne, Australia) byly přes noc inkubované (senzitizované) v hustotě 3 miliony/ml v aktivačním médiu (kultivační médium bez cytokinů) obsahujícím myší IgE s koncentrací 1 pg/ml. Následně buňky byly 2 krát promyty aktivačním roztokem BSS (20mM HEPES pH = 7,4, 135mM NaCl, 5mM KC1, l,8mM
-6CZ 309744 B6
CaCl2, 1mM MgCh, 5,6mM glukóza a 0,1% BSA) a pak rozsuspendovány ve stejném roztoku s koncentrací 10 milionu buněk/ml. Aktivované byly přidáním antigenu TNP o výsledné koncentraci 500 ng/ml a kultivovací při 37 °C 1 hodinu. Pak byly buňky usazeny centrifugací a mRNA byla izolovaná použitím komerčního kitu RNA Blue (Top-Bio).
Stručný přehled kroků stanovení TNF-α mRNA s využitím ligázy TgRI:
1. Hybridizace DNA sond ke komplementární mRNA a ligace DNA sond.
2. Detekce jednovláknové DNA vzniklé ligací DNA sond pomocí qPCR.
Detailní protokol:
1. Hybridizace a ligace. Byla použita mRNA izolovaná z buněk Lyn+/+ buď aktivovaných antigenem anebo neaktivovaných (viz výše), v obou případech s koncentraci 200 ng/μl. Reakce probíhaly v 0,2ml zkumavkách v PCR cykleru. Denaturace RNA probíhala při teplotě 95 °C po dobu 1 minuty, hybridizace 30 sekund při 70 °C a ligace při 65 °C 1 hodinu. Složení hybridizační a ligační směsi bylo:
+TP -TP
RNA 3 μl 3 μl
Sondy (5nM) 3 μl 3 μl
Ligáza 0,5 μl 0,5 μl
ATP (20mM) 1 μl 1 μl
Pufr (10x) 2 μl 2 μl
TP 2,5 μl -
H2O 8 μl 10,5 μl
Celkem 20 μl 20μl
Složení pufru: 500mM Tris-HCl, 100mM MgCl2, 100mM DTT, 10mM ATP, pH 7,5 (25 °C).
TP: 0,8M Trehalóza, 4M 1,2-propandiol.
Koncentrace ligázy: 0,5 mg/ml.
2. Pro detekci ligovaných sond bylo 10 μl ligační směsi smícháno se 40 μ! reakční směsi pro qPCR obsahující barvivo SYBR Green I a s výsledným složením 75mM Tris-HCl pH 8,8 (25 °C), 20mM (NH4)2SO4, 0,2M trehalóza, 1M 1,2-propandiol, 0,01% Tween 20, 2,5 mM MgCl2, 200μΜ dNTPs, Taq DNA polymeráza (25 U/ml).
Stručný přehled kroků stanovení TNF-α mRNA s využitím ligázy SplintR:
1. Hybridizace DNA sond ke komplementární m RNA.
2. Ligace DNA sond.
3. Detekce jednovláknové DNA vzniklé ligací DNA sond pomocí qPCR.
Detailní protokol:
1. Hybridizace. Byla použita mRNA izolovaná z buněk Lyn+/+ aktivovaných antigenem nebo neaktivovaných. Reakce probíhaly v 0,2ml zkumavkách v PCR cykleru. Byly použity sondy navrhnuté pro SplintR ligázu s Tm přibližně 45 °C. Denaturace RNA probíhala při teplotě 95 °C
- 7 CZ 309744 B6 po dobu 1 minuty, hybridizace při 45 °C 30 sekund. Složení hybridizační a ligační směsi bylo následující: ________________________________
RNA 3 μΐ
Sondy (5nM) 3 μΐ
Pufr (lOx) 1 μΐ
h2o 3 μΐ
Celkem 10 μΐ
Pufr: pro každou ligázu jiný, dodaný výrobcem/prodejcem spolu s ligázou.
TP: 0,8M Trehalóza, 4M 1,2-propandioL
2. Ligace. Ligace probíhala 1 hodinu při 37 °C, v přítomnosti TP nebo bez TP. Do každé zkumavky s 10 μΐ vzorku (hybridizace) bylo přidáno 10 μΐ ligační směsi se složením:
+TP -ΤΡ
Ligáza 0,2 μΐ 0,2 μΐ
Pufr (10χ) 1 μΐ 1 μΐ
TP 2,5 μΐ -
h2o 6,3 μΐ 8,8 μΐ
Celkem 10 μΐ 10 μΐ
3. Pro detekci ligovaných sond bylo 10 μΐ ligační směsi smícháno se 40 μΐ reakční směsi pro qPCR obsahující barvivo SYBR Green las výsledným složením 75mM Tris-HCl pH 8,8 (25 °C), 20mM (NH4)2SO4, 0,2M trehalóza, IM 1,2-propandiol, 0,01% Tween 20, 2,5mM MgCl2, 200μΜ dNTPs, Taq DNA polymeráza (25 U/ml).
Pro PCR byl využit přístroj RealPlex EP Mastercycler (Eppendorf). Program byl zahájen denaturací po dobu 3 min při 95 °C. Následovalo 40 cyklů, z nichž každý zahrnoval fázi denaturace při 95 °C po dobu 10 s, fázi nasedání primem při 60 °C po 10 s a fázi syntézy při 72 °C po dobu 8 s.
Sekvence DNA sond:
Sonda 1 pro TgRI: SEKVENCE ID. Č. 10
Sonda 2 pro TgRI: SEKVENCE ID. Č. 11
Sonda 1 pro SplintR: SEKVENCE ID. Č. 12
Sonda 2 pro SplintR: SEKVENCE ID. Č. 13
Sekvence primem použitých v qPCR:
For-TgRI: SEKVENCE ID. Č. 14
Rev-TgRI: SEKVENCE ID. Č. 15
For-SplintR: SEKVENCE ID. Č. 16
Rev-SplintR: SEKVENCE ID. Č. 17
Výsledky stanovení
-8CZ 309744 B6
Protože konečným krokem stanovení je qPCR, jsou výsledky zaznamenány jako hodnoty Ct, neboli počet cyklů, které proběhnou, než hodnota fluorescence, která je měřena v reálném čase, překročí určenou hranici (threshold). Čím je množství templátu v reakci nižší, tím vyšší je hodnota Ct. Použití termorezistentní TgRI v tomto případě nejen snížilo hodnoty Ct v porovnání se SplintR ligázou, ale důležitější je vysoce signifikantní nárůst rozdílů Ct hodnot mezi aktivovanými a neaktivovanými vzorky v případě TgRI, což umožňuje přesnější stanovení rozdílu v koncentraci mRNA. TP aditiva tento rozdíl ještě zvětšila. Výsledky shrnuje tabulka 2 (viz také obr. 4).
Tabulka 2
Ligáza TP - Antigen + Antigen ACt
TgRI (Ct) - 29,14 23,26 5,88
+ 28,61 21,66 6,95
SplintR (Ct) - 32,92 29,72 3,22
+ 32,94 29,6 3,34
Citovaná literatura
1. Gibson U.E., Heid C.A. and Williams P.M. (1996) A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001.
2. Bustin S.A. (2000) Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J. Mol. Endocrinol. 25, 169-193.
3. Bustin S.A. et al. (2009) The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments. Clin. Chern. 55, 611-622.
4. Bullard D.R. and Bowater R.P. (2006) Direct comparison of nickjoining activity of the nucleic acid ligases from bacteriophage T4. Biochem. J. 398, 135-144.
5. Nilsson M., Antson D.O., Barbany G., Landegren U. (2001). RNA-templated DNA ligation for transcript analysis. Nucleic Acids Res. 29: 578-581.
6. Lu J., Tong J., Feng H., Huang J., Afonso C.L., Rock D.L., Barany F., Cao W. (2004) Unique ligation properties of eukaryotic NAD+-dependent DNA ligase from Melanoplus sanguinipes entomopoxvirus. Biochim. Bicphys. Acta. 1701, 37-48.
7. Schneider N. and Meier M. (2017) Efficient in situ detection of mRNAs using the Chlorella virus DNA ligase for padlock probe ligation. RNA. 23:250-256.
8. Zhang, L. and Tripathi, A. (2017) Arcaeal RN Aligase from thermoccocus kodakarensis for template dependent ligation. RNA Biology. 14 (1): 36-44.

Claims (10)

1. Způsob detekce a kvantifikace RNA, který obsahuje kroky, kdy se:
- denaturuje detekovaná RNA;
- hybridizuje detekovaná RNA a dvě jednovláknové DNA sondy komplementární s detekovanou RNA, nasedající na detekovanou RNA bezprostředně vedle sebe, za vytvoření hybridní molekuly RNA-DNA;
- ligují zakotvené jednovláknové DNA sondy za vzniku templátové jednovláknové DNA;
- templátová jednovláknová DNA se detekuje polymerázovou řetězovou reakcí, vyznačující se tím, že jednovláknové DNA sondy se ligují užitím termostabilní RNA ligázy TgRI připravitelné z termofilní baktérie Thermococcus gorgonarius.
2. Způsob detekce RNA podle nároku 1, vyznačující se tím, že se termostabilní RNA ligáza TgRI připraví expresí genu pro TgRI z Thermococcus gorgonarius majícího nukleotidovou sekvenci id. č. 1.
3. Způsob detekce RNA podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se gen termostabilní RNA ligázy TgRI připraví z genomové DNA Thermococcus gorgonarius, DSMZ 10395, amplifikací v polymerázové řetězové reakci pomocí dvou DNA primerů se sekvencí id. č. 2 a sekvencí id. č. 3.
4. Způsob detekce RNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že termostabilní RNA ligáza TgRI má aminokyselinovou sekvenci id. č. 4.
5. Způsob detekce RNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že ligace termostabilní RNA ligázou TgRI se provádí při teplotě v rozmezí 55 °C až 75 °C.
6. Způsob detekce RNA podle nároku 5, vyznačující se tím, že ligace termostabilní RNA ligázou TgRI se provádí při teplotě 65 °C.
7. Způsob detekce RNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že kroky denaturace, hybridizace a ligace probíhají v jedné zkumavce v jednom pufru.
8. Způsob detekce RNA podle nároku 7, vyznačující se tím, že denaturace RNA se provádí při teplotě 95 °C, hybridizace při teplotě 45 °C až 70 °C a ligace při teplotě 65 °C.
9. Způsob detekce RNA podle nároků 7 nebo 8, vyznačující se tím, že pufr obsahuje trehalózu a 1,2-propandiol.
10. Způsob detekce RNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že templátová jednovláknová DNA se detekuje kvantitativní polymerázovou řetězovou reakcí v reálném čase.
CZ2022-352A 2022-08-24 2022-08-24 Způsob detekce a kvantifikace RNA užitím termorezistentní ligázy z termofilní bakterie Thermococcus gorgonarius CZ2022352A3 (cs)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2022-352A CZ2022352A3 (cs) 2022-08-24 2022-08-24 Způsob detekce a kvantifikace RNA užitím termorezistentní ligázy z termofilní bakterie Thermococcus gorgonarius

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2022-352A CZ2022352A3 (cs) 2022-08-24 2022-08-24 Způsob detekce a kvantifikace RNA užitím termorezistentní ligázy z termofilní bakterie Thermococcus gorgonarius

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ309744B6 true CZ309744B6 (cs) 2023-09-06
CZ2022352A3 CZ2022352A3 (cs) 2023-09-06

Family

ID=87846564

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2022-352A CZ2022352A3 (cs) 2022-08-24 2022-08-24 Způsob detekce a kvantifikace RNA užitím termorezistentní ligázy z termofilní bakterie Thermococcus gorgonarius

Country Status (1)

Country Link
CZ (1) CZ2022352A3 (cs)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060019366A1 (en) * 2004-06-09 2006-01-26 Wanli Bi Reversibly modified thermostable enzyme compositions and methods of making and using the same
WO2008040355A2 (en) * 2006-10-06 2008-04-10 Exiqon A/S Novel methods for quantification of micrornas and small interfering rnas
US20160215328A1 (en) * 2013-03-01 2016-07-28 Somagenics, Inc. Methods, compositions and systems for the analysis of nucleic acid molecules

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060019366A1 (en) * 2004-06-09 2006-01-26 Wanli Bi Reversibly modified thermostable enzyme compositions and methods of making and using the same
WO2008040355A2 (en) * 2006-10-06 2008-04-10 Exiqon A/S Novel methods for quantification of micrornas and small interfering rnas
US20160215328A1 (en) * 2013-03-01 2016-07-28 Somagenics, Inc. Methods, compositions and systems for the analysis of nucleic acid molecules

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAO, WEIGUO: "Recent developments in ligase-mediated amplification and detection", TRENDS IN BIOTECHNOLOGY, vol. 22, no. 1, pages 38 - 44, XP002461108, ISSN: 0167-7799, DOI: 10.1016/j.tibtech.2003.11.001 *

Also Published As

Publication number Publication date
CZ2022352A3 (cs) 2023-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11118175B2 (en) Transposon end compositions and methods for modifying nucleic acids
JP6966681B2 (ja) 限られたヌクレオチド組成を有するプライマーを用いた増幅
US8039214B2 (en) Synthesis of tagged nucleic acids
JP5409360B2 (ja) 酵素反応における試料中のｃＤＮＡの合成方法
KR100189229B1 (ko) 핵산 증폭을 강화하는 방법
JP5654749B2 (ja) 改良された増幅のための核酸の修復
US20060078894A1 (en) Methods and compositions for analyzing nucleic acids
US10144972B2 (en) Composition for hot-start reverse transcription reaction or hot-start reverse transcription polymerase chain reaction
US20120156679A1 (en) Methods for making transcription products
JP2009516525A (ja) 複合的核酸検出法
US20200332352A9 (en) Thermolabile exonucleases
JPWO2002062993A1 (ja) 増幅核酸及びその固定化物
JP2012165755A (ja) サブトラクション・ポリヌクレオチドの取得方法
EP3055430B1 (en) Method for the detection of target nucleic acid sequences
WO2009140497A1 (en) Enzyme reagents for amplification of polynucleotides in the presence of inhibitors
US20070099184A1 (en) Nucleic acid amplication utilizing intermediate duplexes
AU2002310366A1 (en) Nucleic acid amplification utilizing intermediate duplexes
CZ309744B6 (cs) Způsob detekce a kvantifikace RNA užitím termorezistentní ligázy z termofilní bakterie Thermococcus gorgonarius
CN102459632B (zh) 复杂核酸的扩增
US20100105109A1 (en) Multiply-primed amplification of circular nucleic acid sequences
US9587267B2 (en) Quantification of nucleic acids
CZ2020213A3 (cs) Způsob detekce RNA se zvýšenou účinností a citlivostí vhodný pro kvantitativní stanovení mRNA a reakční pufr pro použití při tomto způsobu
US20140162276A1 (en) Method of amplifying target nucleic acid, method of analyzing target nucleic acid, kit for amplifying target nucleic acid, and composition for amplifying target nucleic acid
JP2011087534A (ja) 夾雑物の影響を排除する方法