CZ2020213A3 - Způsob detekce RNA se zvýšenou účinností a citlivostí vhodný pro kvantitativní stanovení mRNA a reakční pufr pro použití při tomto způsobu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu detekce RNA, výhodně využitelné pro kvantifikaci exprese genů, při kterém se užívá kombinace aditiv, trehalózy a propandiolu. Reakční prostředí s aditivy poskytuje zvýšení účinnosti ligace jednovláknových DNA sond zakotvených na komplementární sekvenci RNA a zároveň i zvýšení citlivosti následné amplifikace ligovaných fragmentů DNA pomocí kvantitativní polymerázové reakce. Řešení se týká zjednodušení celého postupu, kdy se ligační reakce a kvantitativní polymerázová reakce provádějí společně v téže zkumavce. Tento zjednodušený způsob zrychluje detekci, zmenšuje riziko kontaminace a snižuje výskyt nespecifických produktů. Řešení se také týká reakčního pufru vhodného pro uvedené reakce při způsobu detekce RNA.

Description

Způsob detekce RNA se zvýšenou účinností a citlivostí vhodný pro kvantitativní stanovení mRNA a reakční pufr pro použití při tomto způsobu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu detekce RNA, výhodně využitelné pro kvantifikaci exprese genů, při kterém se užívá kombinace aditiv, která umožňuje zvýšení účinnosti ligace jednovláknových DNA sond zakotvených na komplementární sekvenci RNA a zároveň i zvýšení citlivosti následné amplifikace ligovaných fragmentů DNA pomocí kvantitativní polymerázové reakce. Vynález se zejména týká zjednodušení celého postupu, kdy se ligační reakce a kvantitativní polymerázová reakce provádějí společně v téže zkumavce. Vynález se týká i reakčního pufru vhodného pro uvedené reakce.

Dosavadní stav techniky mRNA (messenger RNA) je označení pro molekuly RNA, které vznikají transkripcí DNA a jsou následnou šablonou pro vznik nových bílkovin na základě genetické informace dané pořadím nukleotidů. Změny v expresi specifických genů patří ke klíčovým ukazatelům patofyziologických změn buněk. Tyto změny můžeme sledovat na úrovni mRNA. Charakteristika genové exprese se velmi často uplatňuje v diagnostice i prognóze různých onemocnění.

Pro detekci a kvantifikaci mRNA existuje široké spektrum metod. Dnes již ne příliš používaná metoda tzv. Northern blot spočívá v elektroforetické separaci molekul RNA dle jejich velikosti, transferu RNA na membránu a detekci pomocí různě značených (radioaktivně nebo fluorescenčně) DNA či RNA sond, jejichž sekvence je komplementární ke zkoumané sekvenci. Vzhledem k časové náročnosti, pracnosti, nízké citlivosti této metody a požadavku na relativně velké množství vstupního materiálu se metoda dnes již v širším měřítku nepoužívá.

Metoda in situ hybridizace opět využívá spojování dvou řetězců nukleových kyselin dle pravidla párování baží, z nichž jeden je zkoumaná sekvence a druhý je značená sonda. K hybridizaci v tomto případě dochází přímo ve zkoumaném vzorku, např. na ultratenkých řezech tkání v parafinu. Výhodou je, že není třeba izolovat RNA. Nejčastěji se metoda používá ve spojení s fluorescenčně značenými sondami jako tzv. FISH metoda. Ne příliš vysokou citlivost metody lze zvýšit připojením kvalitní kamery k mikroskopu a zpracováním fluorescenčního signálu počítačovým programem. To ale zvyšuje již tak celkem vysokou cenu provedení této metody.

Třetí metodou založenou na hybridizaci nukleových kyselin je tzv. RPA (Ribonuclease Protection Assay), kdy dochází k hybridizaci zkoumané mRNA s radioaktivně značenou sondou ve vzorku obsahujícím celkovou RNA. Následně je vzorek vystaven vlivu specifických ribonukleáz štěpících jednovláknové RNA. Zkoumaná molekula mRNA hybridizovaná se sondou je jako dvouvláknová molekula ochráněna před degradací. V konečné fázi je zkoumaná molekula detekována elektroforézou v polyakrylamidovém gelu. Metoda je citlivější než samotná in situ hybridizace a Northern blot díky vyšší účinnosti hybridizace v roztoku a vynecháním kroku přenosu na membránu, při kterém dochází ke ztrátám RNA. Další výhodou je možnost simultánně studovat více mRNA v jednom vzorku, ale celkově je to metoda časově náročná a komplexní.

Další skupina metod využívá hybridizaci velkého množství DNA sond mobilizovaných na pevném nosiči, který' se nazývá DNA nebo RNA mikročip. Lze tak současně měřit úroveň exprese velkého množství genů. Jediný mikročip může poskytnout celou řadu dat, jejichž analýza je však zdlouhavá a náročná. Touto metodou lze detekovat pouze známé sekvence, pro které je nutné předem vytvořit sondy uspořádané do čipů. Specifita metody je omezená, neboť měřený signál fluorescenčních sond není vždy přímo úměrný množství komplementární molekuly ze vzorku. Problematická je také detekce mRNA s více možnostmi sestřihu (splicing) či při vysoké variabilitě genomu.

-1 CZ 2020 - 213 A3

Výsledky těchto metod jsou proto obvykle ověřovány ještě další metodou, jakou je např. kvantitativní polymerázová řetězová reakce (qPCR).

qPCR v kombinaci s reverzní transkripcí je v současné době jednou z nej používanějších metod pro detekci a kvantifikaci mRNA. Výsledky stanovení většího množství vzorků mohou být získány relativně rychle při vysoké citlivosti metody. Principem metody je převod RNA na cDNA reverzní transkripcí (RT) a následná PCR s měřením fluorescence substrátu v reálném čase, která je úměrná množství cDNA v reakci.

Přes všeobecné rozšíření této metody jsou i zde úskalí, která je třeba brát v úvahu. Ukazuje se, že velká variabilita výsledků RT-qPCR metod je zapříčiněna různou účinností reverzní transkripce, která závisí na mnoha faktorech jako je např. konkrétní použitý enzym, koncentrace vzorku RNA, přítomnost inhibitorů a podmínky reakce (Stahlberg et al., 2004; Bustin et al., 2015). Dalším problémem může být tvorba sekundárních a terciárních struktur mRNA, která ztěžuje přepis mRNA do cDNA. Variabilitu může vnášet i použití oligo-dT či náhodných hexamerů, které nemusí zaručit úplné proběhnutí reverzní transkripce.

Pro kvantifikaci mRNA transkriptů pomocí PCR je možné využít i jiných možnosti než převodů mRNA na cDNA. Jednou z nich je využití spojení jednořetězcových DNA sond (ssDNA) specificky vázaných na RNA. Jedná se o tzv. RASL (z angl. RNA-mediated oligonucleotide Annealing, Selection and Ligation) metodu, která byla použita pro detekci specifických mRNA transkriptů (Park et al., 1996; Hsuih et al., 1996; Miyauchi et al., 1998), mikroRNA (Jonstrup et al., 2006; Arefían et al., 2011), mapování exonů v transkriptech (Yeakley et al., 2002), detekci „single base polymorfismu (Nilsson et al., 2000), neobvyklých modifikací nukleových kyselin (Saikia et al., 2006) a profilování a simultánní kvantifikaci různých RNA ve studovaných vzorcích (Miyauchi et al., 1998; Yeakley et al., 2002). Detekce ligovaných ssDNA na RNA matrici byla provedena pomocí PCR nebo qPCR, amplifikací cirkulámích DNA prób (Jonstrup et al., 2006; Nilsson et al., 1994), využitím fluorescenčně značených molekulárních beaconů (Tang et al., 2008), popřípadě „next-generation sekvenováním (Larman et al., 2014).

Stále rostoucí znalosti o vlivu exprese konkrétních genů na zdraví člověka a zároveň stále nevyřešený problém spolehlivé kvantifikace reverzní transkripce je hnacím motorem dalšího zdokonalování metod detekce RNA, zejména mRNA využívající kombinace ligace a PCR jako metody průkazu a kvantifikaci exprese genů. Značný přínos do těchto snah měl objev PBCV-1 ligázy a její schopnosti ligace ssDNA vázaných na komplementární RNA sekvenci, která je nejméně lOx efektivnější než ligace dříve využívanou ligázou pro RASL metody - T4 DNA ligázou (Patentová přihláška US 2014/0179539 Al). Efektivnost ligace dvou fragmentů nukleových kyselin zvyšuje přídavek enhancerů - malých molekul o velikosti méně než 1000 Daltonů. Tyto enhancery jsou ze skupiny polyolů obsahujících 2 až 20 atomů uhlíku, například 1,2-ethylenglykol, 1,2-propandiol, glycerol, sorbitol a další (Patent US 8697408 B2). Podobně účinnost qPCR potencuje přítomnost 1,2-propandiolu a současně trehalosy (PT enhancer) a umožňuje tak amplifikací i u vzorků, u kterých by za běžných podmínek amplifikace neprobíhala nebo jen neúčinně (Horáková et al., 2011).

Podstata vynálezu

Vynález se týká způsobu detekce RNA se zvýšenou výtěžností a citlivostí dílčích reakcí. Způsob je založen na hybridizaci dvou syntetických jednovláknových DNA sond komplementárních s testovanou sekvencí RNA. DNA sondy jsou navrženy tak, že nasedají na RNA sekvenci bezprostředně vedle sebe a jsou v dalším kroku ligovány vhodnou ligázou do jediného DNA řetězce, který následně slouží jako templát pro kvantitativní polymerázovou reakci (qPCR). Zvýšení efektivity ligace jednovláknových DNA (ssDNA) sond zakotvených na komplementární RNA sekvenci je dosaženo využitím reakčního prostředí obsahujícího kromě odborníkovi známých standardních složek kombinaci trehalózy a propandiolu. Při použití této kombinace aditiv lze využít

- 2 CZ 2020 - 213 A3 pro spojování úseků DNA i jiné ligázy, které by za podmínek doporučovaných výrobci vykazovaly jen nízkou enzymatickou účinnost (viz příklad provedení 1). qPCR prováděná v reakčním prostředí obsahujícím kromě odborníkovi známých standardních složek kombinaci trehalózy a propandiolu vykazuje vyšší citlivost. V provedení způsobu detekce RNA podle vynálezu je krok ligace a krok qPCR sloučen v jedné zkumavce (postup „single tube), přičemž reakční prostředí obsahuje kromě odborníkovi známých standardních složek kombinaci trehalózy a propandiolu (viz příklad provedení 2). Sloučení dvou kroků do jednoho provedení způsobu urychluje, navíc výrazně snižuje riziko kontaminace zkoumaného vzorku, protože není potřeba otevírat zkumavku mezi krokem ligace a qPCR. Kromě toho se prokázalo se, že při Single Tube postupu vzniká menší množství nespecifických PCR produktů.

Praktické využití vynálezu je uvedeno v příkladu provedení 3, který se týká stanovení exprese referenčního (housekeeping) genu GAPDH v buňkách ROSA, a v příkladu provedení 4, který se týká detekce nárůstu mRNA pro TNF-α v žímých buňkách po jejich aktivaci.

Vynález se tedy konkrétně týká způsobu detekce RNA, který zahrnuje kroky a) hybridizace detekované RNA a dvou jednovláknových DNA sond komplementárních s detekovanou RNA, nasedajících na detekovanou RNA bezprostředně vedle sebe, za vytvoření hybridní molekuly RNA-DNA, b) ligace zakotvených jednovláknových DNA za vzniku templátové jednovláknové DNA, a c) kvantitativní polymerázové řetězové reakce detekující templátovou DNA, kdy je způsob detekce RNA zjednodušen tím, že krok ligace a kvantitativní polymerázové reakce se provádějí společně v jedné zkumavce, přičemž reakce probíhají v reakčním pufru obsahujícím trehalózu a 1,2-propandiol.

V reakčním pufru pro ligaci je koncentrace trehalózy 0,1 M až 0,3 M a koncentrace 1,2-propandiolu 0,5 M až 1,3 M a v reakčním pufru pro kvantitativní polymerázovou reakci je koncentrace trehalózy 0,15 M až 0,3 M a koncentrace 1,2-propandiolu 0,75 M až 1,3 M.

Ve výhodném provedení způsobu podle vynálezu je v reakčním pufru pro společnou ligaci a polymerázovou reakci v jedné zkumavce koncentrace trehalózy 0,15 M až 0,25 M a koncentrace 1,2-propandiolu 0,75 M až 1,25 M.

Způsob detekce RNA podle vynálezu se výhodně užije pro detekci nebo kvantifikaci mRNA.

Vynález se dále také týká reakčního pufru, tj. reakčního roztoku pro provádění reakcí uvedeného způsobu. Reakční pufir pro použití při zjednodušeném postupu v jedné zkumavce („Single Tube) obsahuje trehalózu a 1,2-propandiol.

V popisu a nárocích uváděný termín „obsahuje nebo „obsahující je užit v širokém významu, tj. ve smyslu otevřené definice. Pokud tedy např. pufr obsahuje trehalózu a propandiol, může obsahovat neomezené množství dalších složek, typicky obsahuje složky vhodné pro danou reakci, které jsou odborníkovi známy. Koncentrace je vyjadřována jako koncentrace molámí (molarita), označovaná symbolem M, o rozměru mol/dm³, tj. mol/1 (mol na litr), vč. příslušných odvozenin, jako je např. mM nebo μΜ.

Jednotlivá výhodná provedení se mohou libovolně kombinovat. Podrobnější objasnění vynálezu je dále poskytnuto formou příkladů výhodných provedení.

Objasnění výkresů

Obrázek 1. Porovnání analýzy teplot tání qPCR produktů při detekci RNA PNPLA3 Ile-148 a Met148 postupem standardním a Single Tube postupem, kdy ligace a qPCR proběhly společně v jedné zkumavce (Single Tube postup). Na obrázku jsou zobrazené křivky teplot tání qPCR produktů. Z porovnání vzorků obsahujících detekovanou RNA a vzorků kontrolních (bez této

-3CZ 2020 - 213 A3

RNA) je vidět, že Single Tube postup přispěl k menšímu množství nespecifických PCRproduktů.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Detekce mRNA PNPLA3 třemi různými ligázami - porovnání výsledků v přítomnosti a nepřítomnosti TP aditiv

Stručný přehled kroků stanovení mRNA:

1) Hybridizace DNA sond s komplementární RNA,

2) Ligace DNA sond +/- TP aditiva (trehalóza + 1,2-propandiol),

3) Detekce ligovaných DNA sond pomocí qPCR s TP aditivy.

Princip stanovení je založen na hybridizaci dvou syntetických ssDNA sond s testovanou komplementární sekvencí RNA. DNA sondy jsou navrženy tak, že nasedají na RNA sekvenci bezprostředně vedle sebe a jsou v dalším kroku ligovány vhodnou ligázou do jediného DNA řetězce, který slouží jako templát pro qPCR. Přídavek TP aditiv, tj. trehalózy a 1,2-propandiolu, v kroku ligace a qPCR výrazně vylepšuje možnosti použití jednotlivých ligáz.

Detailní protokol

1) Hybridizace. Jako vzorek RNA byla použita syntetická RNA (PNPLA3) v definovaném množství 100, 10 a 1 amol na jednu reakci. Hybridizace dvou syntetických DNA sond se vzorkem RNA probíhala v 96-jamkové destičce za definovaných teplotních podmínek v PCR cykleru. První teplotní krok byl nastaven na 90 °C po dobu 5 min a poté byl vzorek postupně ochlazován v průběhu 40 min až na 50 °C. Hybridizace vzorku probíhala v triplikátech. Každá jamka destičky s reakční směsí o objemu 10 pl obsahovala:

pl RNA;

pl hybridizačního pufru (HB);

pl směsi DNA sond (10 finol každé sondy).

Jako hybridizační pufr byl použit roztok: 125 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCl₂. Pro vzorky, které byly následně ligovány T4 RNA ligázou 2, byl použit hybridizační pufr o nižší koncentraci MgCl₂: 125 mM Tris-HCl, pH 7,5 a 5 mM MgCl₂.

DNA sondy jsou dvě syntetické ssDNA, jejichž sekvence jsou komplementární ke stanovované mRNA a navazují bezprostředně vedle sebe (dle obecného protokolu RASL metody).

2) Ligace probíhala 45 min při 37 °C. Do každé jamky s 10 pl vzorku po hybridizaci bylo přidáno: 1 pl ligázy;

0,15 nebo 0,06 pl ATP (100 mM);

pl Tris/MgCl₂ pufru (150 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20,5 mM MgCl₂) nebo 4 pl 2x koncentrovaného TP pufru.

Jednotlivé ligázy byly naředěny tak, aby 1 pl obsahoval obvyklé množství ligázy potřebné pro jednu reakci:

SplintR ligáza (25 U/pl): ředěna 20x, výsledná koncentrace 1,25 U/pl;

T4 DNA ligáza (400 U/pl): ředěna lOx, výsledná koncentrace 40 U/pl;

T4 RNA ligáza 2(10 U/pl): ředěna lOx, výsledná koncentrace 1 U/pl.

Množství ATP bylo různé podle doporučení výrobce ligáz:

SplintR ligáza a T4 DNA ligáza obsahovaly 0,15 pl, tzn. výsledná koncentrace ATP byla ~1 mM; T4 RNA ligáza 2 obsahovala 0,06 pl, tzn. výsledná koncentrace ATP je ~0,4 mM.

-4CZ 2020 - 213 A3

3) Pro detekci ligovaných sond pomocí qPCR bylo přeneseno z každé jamky 5 μΐ vzorku a smícháno s 15 μΐ PCR směsi obsahující barvivo SYBR Green I a další komponenty o výsledné koncentraci: 0,15 Mtrehalózy, 0,75 M 1,2-propandiolu, 0,1 UTaqDNApolymerázy, 150nMmixu primerů, 200 μΜ dNTPs mixu ve finálním objemu reakce 20 μΐ.

Pro PCR byl využit přístroj RealPlex EP Mastercycler (Eppendorf). Program byl zahájen denaturací po dobu 3 min při 94 °C. Následovalo 45 cyklů, z nichž každý zahrnoval fázi denaturace při 94 °C po dobu 10 s, fázi nasedání primerů při 60 °C po 10 s a fázi syntézy při 72 °C po dobu 8 s.

Použité reagencie:

2x koncentrovaný TP pufr: 150 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20,5 mM MgCE, 40 mM (NH^SO?, 0,4 M trehalóza, 2 M 1,2-propandiol (Top-Bio)

Tris/MgCh pufr: Tris-HCl, MgCE (jednotlivé chemikálie Sigma)

PCR komponenty, včetně Taq Unis polymerázy a TP pufiru, byly z firmy Top-Bio, SplintR ligáza, T4 DNA ligáza a RNA ligáza 2 (New England Biolabs), ATP (Sigma)

Sekvence DNA sond:

- GTT GCT CGA CCT CTC TAT GCC ACT GTA GAA GGG G - 3

5pATG AAG CAG GAA CAT GGA GAC ACG CAG GGC TTA A - 3'

Primery pro qPCR:

5GTT GCT CGA CCT CTC TAT G - 3'

- TTA AGC CCT GCG TGT CTC C - 3

Protože konečným krokem stanovení je qPCR, jsou výsledky zaznamenány jako hodnoty Ct, neboli počet cyklů, které proběhnou, než hodnota fluorescence, která je měřena v reálném čase, překročí určenou hranici (threshold). Čím je množství templátu v reakci nižší, tím vyšší je hodnota Ct.

Přídavek TP aditiv již během ligace DNA sond výrazně ovlivňuje účinnost ligace u všech třech testovaných ligáz. To lze vyčíst nejen z nižších hodnot Ct, ale i z hodnot rozdílu Ct (ACt) sériově ředěných vzorků (ACt lOx a lOOx nebo lx a lOx, viz tabulka 1). Ideální hodnotou ACt pro desetinásobek rozdílu v koncentraci studované DNA při 100% účinnosti qPCR jsou 3,3 cykly. V nepřítomnosti aditiv hodnoty ACt vykazovaly velkou heterogenitu při srovnání různě ředěných vzorků se všemi testovanými ligázami a v řadě případů dosahovaly ACt velmi nízkých hodnot, zvláště při nízkých koncentracích RNA. Přítomnost TP aditiv během ligace vzorků přiblížila hodnoty ACt ideální hodnotě 3,3. Přítomnost TP aditiv dále zvyšovala rozdíl hodnot Ct mezi nej vyšším testovaným množstvím RNA (100 amol) a kontrolním vzorkem bez přídavku RNA (ACt 0 až 100, viz tabulka 1) pro všechny tři testované ligázy.

Tabulka 1

Vliv přítomnosti TP aditiv během ligace na kvantifikaci RNA (PNPLA3) - 100, 10 a 1 amol syntetické RNA bylo detekováno qPCR po ligaci dvou DNA sond hybridizovaných se stanovovanou RNA. TP aditiva byla přítomna během qPCR obou skupin vzorků, ale pouze jedna skupina vzorků obsahovala TP aditiva i v ligačním kroku. Tato skupina vzorků vykazovala nižší hodnoty Ct a vyšší rozdíly hodnot Ct mezi 100 amol RNA a kontrolním vzorkem bez RNA (A Ct 0 až 100). Rozdíly hodnot Ct mezi sousedícími ředěními vzorku byly za přítomnosti TP aditiv podobné.

-5CZ 2020 - 213 A3

Ct {průměr)* ±SD	TP během ligace	RNA splint PNP LAB Ue (amsl)	act
100	10	1	0	0-	10-100	1-10
SpfífttR ϊ,25 ΰ	-	aval's	303 4 0,8	32,1 1	33,0 + 0,7	7/3	4'6.....
T4 DNA40U	28,3 1 0..5	30,4 ± 0,3	31,3 ž	32,4 ± 0,8	3,5	1,5	0,9
T4 RNA Ííg2 W	29,311,9 ί	31,8 i 03	32,01	33,0 10,9	3,7	2,5	ρ kí
SprintR 1,25 ϋ	♦	17,610,2 ί	20,9 ± 0,2	24,3 ±	28,9 ± 0,6	11,3	3,3	3,4
T4 ĎNÁ40U	23,410.4	26,6 i 0,4	29,01	29,6 1 0,9	6,2	3,1	2,5
T4 RNA hg2 W	24,7 10.3 i	28,4 1 0,6	31,5 1	32,3 1 0,8	7,6	3,7	3,1

*Tabulka udává průměrné hodnoty Ct (n=3) a jejich standardní odchylku.

Příklad 2

Detekce syntetické RNA (PNPLA3) v provedení tříkrokovém či zjednodušeném, tzv. Single tube

Variace genu PNPLA3 Ilel48Met je asociována s vyšším rizikem vzniku onemocněním jater NAFLD (z angl. Non-Alcoholic Fatty Liver Disease; Romeo et al., 2008). Pro tyto dvě variace téhož genu byly navrženy dvě dvojice DNA sond označené lie a Met.

Polovina vzorků byla stanovena tříkrokovým postupem (hybridizace, ligace, qPCR), kdy ke vzorku po hybridizaci byla přidána ligáza a ATP a po inkubaci při 37 °C byla část vzorku přenesena do Master Mixu obsahujícího veškeré potřebné reagencie pro qPCR. Druhá polovina vzorků byla stanovena zjednodušeným způsobem, tzv. Single Tube, kdy ligace a qPCR proběhly společně v jedné zkumavce, tzn. že ke vzorku po hybridizaci je přidána nejen ligáza a ATP, ale i Master mix se všemi komponentami potřebnými k proběhnutí qPCR. Vzorek stačí umístit do cykléru a nastavit inkubaci při 37 °C s následným qPCR programem. Není tedy vůbec nutné zkumavku/jamku otevírat mezi těmito dvěma kroky.

Princip stanovení viz příklad provedení 1.

Stručný přehled stanovení:

1) Hybridizace DNA sond s komplementární RNA.

2) Ligace DNA sond +/- TP aditiva.

3) Detekce ligovaných DNA sond pomocí qPCR s TP aditivy.

Detailní protokol:

1) Jako vzorek RNA byly použity 2 syntetické RNA (PNPLA3, varianta obsahující na pozici 148 lie a Met) v definovaném množství 10, 1 a 0,1 amol najednu reakci. Hybridizace dvou syntetických DNA sond se vzorkem RNA probíhala v 96-jamkové destičce za definovaných teplotních podmínek v PCR cykléru. První teplotní krok byl nastaven na 90 °C po dobu 5 minut a poté byl vzorek postupně ochlazován v průběhu 40 min až na 50 °C.

Hybridizace vzorku probíhala v duplikátech. Jedna jamka destičky odpovídající jedné reakční směsi o objemu 10 μΐ obsahovala:

μΐ RNA o různé koncentraci;

μΐ hybridizačního pufru;

μΐ směsi DNA sond ve vodě (10 finol každé DNA sondy).

Hybridizační pufr byl roztok: 125 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCL.

-6CZ 2020 - 213 A3

DNA sondy jsou dvě syntetické DNA, jejichž sekvence jsou komplementární ke stanovované mRNA a navazují bezprostředně vedle sebe (dle obecného protokolu RASL metod).

2) Ligace probíhala 2 hodiny při 37 °C. Standardní protokol:

Do každé reakční směsi (10 pl) po hybridizaci bylo přidáno:

0,05 pl (1,25U) SplintR ligázy;

0,15 pl ATP 100 mM;

pl Tris/MgCL pufru (12,5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2,5 mM MgCL).

Výsledná koncentrace ATP byla dle doporučení výrobce ~1 mM.

Single tube postup:

Do každé reakční směsi (10 pl) po hybridizaci bylo přidáno:

0,05 pl (1,25U) SplintR ligázy + 0,15 pl ATP (100 mM) + 19,8 pl 2x koncentrovaného TP pufru + 10 pl 4x koncentrované PCR směsi obsahující (uvedeny jsou výsledné koncentrace): 0,4 pM interkalační barvivo SYBR Green I, 0,15 M trehalózy, 0,75 M 1,2-propandiolu, 0,1 U polymerázy, 150 nM mixu PCRprimerů, 200 pM každého z nukleotidů (dNTPs mix) ve finálním objemu reakce 40 pl.

Destička byla vložena do cykléru RealPlex EP Mastercycler, kde nejprve proběhla ligace při teplotě 37 °C a poté následovala PCR s 3 min denaturací při 94 °C a následně 45 teplotních cyklů: 94 °C po 10 s, 60 °C po 10 s a 72 °C po 8 s.

3) Pro detekci ligovaných sond ve standardním postupu pomocí qPCR bylo do každé jamky s ligovaným vzorkem přidáno 30 pl PCR směsi obsahující barvivo SYBR Green I a další PCR komponenty tak, aby výsledná koncentrace všech komponent byla stejná jako v postupu Single Tube. Objem jedné qPCR reakce byl 40 pl, PCR program i použitý cyklér byly totožné se standardním postupem.

Použité reagencie:

2x koncentrovaný TP pufr: 150 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20,5 mM MgCL, 40 mM (NH^SO^ 0,4 M trehalóza, 2 M 1,2-propandiol (Top - Bio)

Tris/MgCL pufr: Tris-HCl, MgCL (jednotlivé chemikálie Sigma)

PCR komponenty včetně Taq Unis polymerázy a TP pufru z firmy Top-Bio

SplintR ligáza (New England Biolabs)

ATP (Sigma)

Sekvence DNA sond:

PNPLA3 Ile

- GTT GCT CGA CCT CTC TAT GCC ACT GTA GAA GGG G - 3

5pATG AAG CAG GAA CAT GGA GAC ACG CAG GGC TTA A - 3'

PNPLA3 Met

- GTT GCT CGA CCT CTC TAT GCC ACT GTA GAA GGG C-3

-7 CZ 2020 - 213 A3

5pATG AAG CAG GA A CAT GGA GAC ACG CAG GGC TTA A - 3'

Primery pro qPCR

5GTT GCT CGA CCT CTC TAT G - 3'

- TTA AGC CCT GCG TGT CTC C - 3

Výsledky experimentu zobrazuje tabulka 2. Výsledky jsou udávány v hodnotách Ct, které udávají pořadí cyklu, ve kterém fluorescence vzorku překročí stanovenou hodnotu (treshold). Je-li tedy templátu pro PCR ve vzorku více, stane se tak časněji a hodnota Ct je nižší než u vzorků s menším množstvím templátu.

Z tabulky je zřejmé, že Single tube metoda, tedy jednodušší varianta způsobu, při které dojde ke spojení kroku ligace a qPCR, je funkční. V Single Tube variantě protokoluje využito příznivých účinků TP aditiv na ligaci a zároveň qPCR a jednotlivé komponenty ajejich koncentrace nejsou překážkou pro úspěšné provedení obou kroků najednou. Výsledkem spojení obou kroků jsou nižší Ct hodnoty oproti standardní variantě protokolu, jak zobrazuje tabulka 2. Z analýzy teplot tání qPCRproduktů dále vyplývá, že TP aditiva přispívají i ke snížení vzniku nespecifických produktů, jak je vidět na obrázku 1.

Tabulka 2

Porovnání standardního postupu detekce RNA a zjednodušeného postupu Single Tube Testovaným vzorkem byla syntetická RNA (PNPLA3 He -148 a PNPLA3 Met-148) v množství 10, 1 a 0,1 amol na reakci. Hybridizace v obou postupech probíhala shodně a následoval krok ligace a qPCR. Tyto dva kroky byly v Single Tube postupu spojeny do jednoho kroku. Nižší hodnoty Ct dosažené Single Tube postupem ukazují pozitivní vliv TP aditiv na účinnost ligace a celého stanovení. Tabulka udává průměrnou hodnotu Ct (n = 2) a standardní odchylku.

	RW 1	Ct (pnům&r ± SO)
10 amol	1 amol	dl amol	0 amol
SUndat dní postup	lie	25.8*0,0	29.5 ± 0,0	32,0 i Oj	313*0,4
Met	2M*0,3	28,8 * 04	32,2*14 i	334 * OJ
“Single Tubew postup	lie	22410,2	26,2*0,0	294 i OJ i	30,8 * 1,0
Met	234 i OJ	27,0*0,2	313 * 04 |	33,5 * 14

Příklad 3

Stanovení exprese housekeeping genu GAPDH v buňkách ROSA KIT WT - vliv TP aditiv na hybridizaci a ligaci

Stručný přehled stanovení:

1) Izolace celkové RNA z ROSA buněk;

2) Hybridizace DNA sond s komplementární RNA ze vzorku;

3) Ligace DNA sond +/- TP aditiva;

4) Detekce ligovaných DNA sond pomocí qPCR s TP aditivy.

-8CZ 2020 - 213 A3

Detailní protokol:

1) RNA byla izolována z ROSA WT KIT (RRID:CVCL_5G49) buněk pomocí kitu MicroElute Total RNA Kit (Omega Bio-tek) dle instrukcí výrobce. Z 1,5 x 10⁶ buněk bylo získáno 35 pl RNA o koncentraci 144 ng/μΐ.

2) Hybridizace 2 syntetických DNA sond se vzorkem RNA probíhala v 96-jamkové destičce za definovaných teplotních podmínek v PCR cykléru. První teplotní krok byl nastaven na 90 °C po dobu 5 minut a poté byl vzorek postupně ochlazován v průběhu 40 min až na 50 °C.

Hybridizace vzorku probíhala v triplikátech. Jedna jamka destičky odpovídající jedné reakci o objemu 10 μΐ obsahovala:

μΐ RNA (ředěné 16,7x; jedná se o ředění, při kterém inhibitory v izolátu RNA neblokovaly proces stanovení specifické RNA);

+ 7 μΐ hybridizační pufr (HB);

+ 2 μΐ směsi DNA sond (10 finol každé DNA sondy);

+ hybridizační pufr (HB): 125 mM Tris-HCl, pH 7,5, 25 mM MgCL.

Jako DNA sondy byly použity dvě syntetické DNA, jejichž sekvence jsou komplementární ke stanovované mRNA a navazují bezprostředně vedle sebe (dle obecného protokolu RASL metod).

K porovnání byl do jedné skupiny vzorků přidán optimalizovaný pufr s TP aditivy (v tabulce výsledků označeno jako TP). V tomto případě hybridizace obsahovala:

μΐ RNA (ředěné 16,7x);

μΐ 2x koncentrovaný TP pufr;

μΐ voda bez RNáz;

μΐ směsi DNA sond (10 finol každé DNA sondy).

3) Ligace probíhala 2 hodiny při 37 °C. Do každé hybridizační směsi (10 μΐ) bylo přidáno:

0,05 μΐ (1,25U) SplintR ligázy;

0,14 μΐ ATP 100 mM;

μΐ pufru.

Výsledná koncentrace ATP byla ~1 mM dle doporučení výrobce.

Do reakce bylo přidáno 4 μΐ pufru: 12,5 mM Tris-HCl pH 7,5; 2,5 mM MgCL (v tabulce výsledků ligace: HB), nebo 2x koncentrovaného TP pufru (HB+TP) nebo Ix koncentrovaného TP pufru (TP)

4) Pro detekci ligovaných sond pomocí qPCR bylo přeneseno z každé jamky 5 μΐ vzorku a smícháno s μΐ PCR směsi obsahující (výsledné koncentrace): SYBR green I (0,4 μΜ), 0,15 M trehalózy, 0,75 M 1,2-propandiolu, 0,1 U polymerázy, 150 nM mixu primerů, 200 μΜ dNTPs mixu ve finálním objemu reakce 20 μΐ.

PCR reakce probíhala v cykléru RealPlex EP Mastercycler s nastaveným teplotním programem:

min 94 °C, 45x (10 s 94 °C, 10 s 60 °C, 8 s 72 °C).

Použité reagencie:

2x koncentrovaný TP pufr: 150 mM Tris-HCl, pH 8,8, 20,5 mM MgCL, 40 mM (NH^SCL, 0,4 M trehalóza, 2 M 1,2-propandiol (Top - Bio)

Tris/MgCL pufr: Tris-HCl, MgCL (jednotlivé chemikálie Sigma)

PCR komponenty včetně Taq Unis polymerázy a TP pufru z firmy Top-Bio

-9CZ 2020 - 213 A3

SplintR ligáza (New England Biolabs)

ATP (Sigma)

Sekvence DNA sond:

- CCC GTA ATC TTC ATA ATC CGA G TGG TGC AGG AGG CAT - 3

5p TGC TGA TGA TCT TGA CTG AAT GGC ATC GAG TAC - 3'

Primery pro qPCR:

5CCC GTA ATC TTC ATA ATC CGA G - 3'

5GTA CTC GA TGC CAT TCA G - 3'

Výsledky stanovení:

Protože konečným krokem stanovení je qPCR, jsou výsledky zaznamenány jako hodnoty Ct, neboli počet cyklů, které proběhnou, než hodnota fluorescence, která je měřena v reálném čase, překročí určenou hranici (threshold). Čím je množství templátu v reakci nižší, tím vyšší je hodnota Ct. Přídavek pufru s TP aditivy do ligace snížil výrazně hodnoty Ct těchto vzorků (Hybridizace/Ligace HB/HB+TP Ct 24,31) oproti vzorkům, kde TP aditiva přidána nebyla (HB/HB Ct 28,10). Přídavek TP aditiv již během hybridizace posunul výsledky stanovení do velmi vysokých hodnot Ct (TP/TP Ct 32,80). Výsledky shrnuje tabulka 3.

Tabulka 3

Výsledky stanovení exprese GAPDH mRNA v ROSA buňkách za přítomnosti TP aditiv během celého stanovení (Hybridizace TP, Ligace TP), nebo pouze během ligace a qPCR (Hybridizace HB, Ligace HB+TP) anebo s přídavkem TP aditiv pouze během qPCR (Hybridizace HB, Ligace HB). Tabulka udává průměrné hodnoty Ct (n=3) jako výsledek stanovení qPCR detekce ligovaných DNA sond. Množství zligovaných DNA sond je úměrné množství mRNA ve vzorku.

	Vzorek RNA	Kontrolní vzorek bez RNA
Hybridizace	HB	H8	TP	HB	HB	TP
Ligace	HB	HB+TP	rp	HB	HB+TP	TP
Ct (průměr) ± SD	28,1 ±0,1	24,3 ± 0,1	32,8 + 0,8	40,2*	34,1 ± 0,5	45,9*

* Pouze jeden z triplikátu překročil stanovený threshold a lze stanovit hodnotu Ct. Nelze tedy stanovit st. odchylku.

Příklad 4

Detekce nárůstu mRNA pro TNF-α v žímých buňkách po aktivaci.

Zímé buňky odvozené z kostní dřeně myší (BMMC) byly aktivovány přidáním Streptolysinu O (625 ng/ml). Buňky byly inkubovány se Streptolysinem O po dobu jedné hodiny a následně byly porovnány hladiny mRNA pro TNF-α u buněk neošetřených a ošetřených Streptolysinem O.

Stměný přehled stanovení:

-10CZ 2020 - 213 A3

1) Izolace celkové RNA z buněk neaktivovaných a aktivovaných Streptolysinem O.

2) Hybridizace DNA sond s komplementární RNA ze vzorku.

3) Ligace DNA sond s TP aditivy.

4) Detekce ligovaných DNA sond pomocí qPCR s TP aditivy.

Detailní protokol ) RNA byla izolována z buněk BMMC WT pomocí kitu MicroElute Total RNA Kit (Omega Biotek) dle instrukcí výrobce. Ze 2 x 10⁶ buněk bylo získáno 30 μΐ RNA o koncentraci ~99 ng/μΐ. Koncentrace RNA ve vzorcích byla upravena ředěním na stejnou hodnotu.

) Hybridizace dvou syntetických DNA sond se vzorkem RNA probíhala v 96-jamkové destičce za definovaných teplotních podmínek v PCR cykléru. První teplotní krok byl nastaven na 90 °C po dobu 5 min a poté byl vzorek postupně ochlazován v průběhu 40 min až na 50 °C.

Hybridizace vzorku probíhala v triplikátech. Jedna jamka destičky odpovídala jedné reakci o objemu 10 μΐ a obsahovala:

μΐ vzorku RNA (ředěné lOx; jedná se o ředění, při kterém inhibitory v izolátu RNA neblokovaly proces stanovení specifické RNA);

μΐ hybridizační pufr (HB);

μΐ směsi DNA sond (10 finol každé DNA sondy).

Hybridizační pufr (HB): 500 mM Tris-HCl pH 7,5; 100 mM MgCL.

DNA sondy jsou dvě syntetické DNA, jejichž sekvence jsou komplementární ke stanovované mRNA a navazují bezprostředně vedle sebe (dle obecného protokolu RASL metod).

3) Ligace probíhala 2 hodiny při 37 °C.

Do každé reakční směsi (10 μΐ) po hybridizaci bylo přidáno: 0,05 μΐ (1,25U) SplintR ligázy 0,14 μΐ ATP 100 mM.

μΐ 2x koncentrovaného TP pufru.

Výsledná koncentrace ATP je ~1 mM dle doporučení výrobce.

4) Pro detekci ligovaných sond pomocí qPCR bylo přeneseno z každé jamky 5 μΐ vzorku a smícháno s 15 μΐ PCR směsi obsahující (výsledné koncentrace): SYBR green I (0,4 μΜ, 0,15 Μ trehalózy, 0,75 M 1,2-propandiolu, 0,1 U polymerázu, 150 nM mixu primerů, 200 μΜ dNTPs mixu ve finálním objemu reakce 20 μΐ.

PCR reakce probíhala v cykléru RealPlex EP Mastercycler s nastaveným teplotním programem: 3 min 94 °C, 45x (10 s 94 °C, 10 s 60 °C, 8 s 72 °C).

Použité reagencie:

2x koncentrovaný TP pufr: 150 mM Tris-HCl, pH 8,8; 40 mM (NH^SCL; 0,4 M trehalóza; 2 M 1,2-propandiol

Tris/MgCL pufr: Tris-HCl, MgCL (jednotlivé chemikálie Sigma)PCR komponenty včetně Taq Unis polymerázy a TP pufru z firmy Top-Bio

SplintR ligáza (New England Biolabs),

ATP, Streptolysin O (Sigma)

-11 CZ 2020 - 213 A3

Sekvence DNA sond:

5CTC GAC CTC TCT ATG GGC AAT TTT GAG AAG ATG A - 3'

- pTCT GAG TGT GAG GGT CGG AGA CAC GCA GGG CTT AA - 3

Primery pro qPCR:

- GCT CGA CCT CTC TAT GGG C - 3

- TTA AGC CCT GCG TGT CTC C - 3

Množství ligovaných DNA sond, které slouží jako templát pro qPCR je úměrné množství komplementární mRNA. Rozdíl v množství templátové DNA pro qPCR mezi vzorkem neaktivovaným a vzorkem po aktivaci lze vyjádřit jako rozdíl Ct hodnot (ACt). Hodnota 2^Mt udává, kolikrát se množství templátu změnilo. Z výsledků v tabulce vyplývá, že se exprese genu pro TNFα (sledovaná na úrovni mRNA) po aktivaci 4 různých typů žímých buněk (BMMC) zvýšila, a to 29,7x - 48,7x (viz tabulka 4).

Tabulka 4

Kvantifikace mRNA pro TNF-α v žímých buňkách po 1 h aktivaci Streptolysinem O. Obsah mRNA TNF-α v žímých buňkách (BMMC WT) byl stanoven u buněk neaktivovaných a v buňkách po aktivaci. Z rozdílu byl vypočten nárůst množství mRNA TNF-α. Hodnota 2^Mt udává, kolikrát se množství mRNA pro TNF-α zvýšilo po aktivaci. Tabulka zobrazuje průměrné hodnoty Ct (n = 3) a jejich standardní odchylku.

Ct( průměr) +	Neaktivované	Aktivované	ACt	2ÁCí	Kontrola bez
BMMC Wil	30,9 ± 0,3	25,5 ± 0,0	5/1	43,6	34,S
8MMC WT2	30,7 + 0,1	25,0 ± 0,2	5,6	48,7
BMMC W13	30,8 ± 0,2	25,9 ± 03	4,9	29,7	-
BMMC WT4	31,4 + 0,2	26,2 + 0.3		38,6	-

Seznam citované literatury

Arefian, E., Kiani, J., Soleimani, M., Shariati, S.A., Aghaee-Bakhtiari, S.H., Atashi, A., Gheisari, Y., Ahmadbeigi, N., Banaei-Moghaddam, A.M., Naderi, M., Namvarasl, N., Good, L., Faridani, O.R., 2011. Analysis of microRNA signatures using size-coded ligation-mediated PCR. Nucleic Acids Res. 39, e80.

Bustin, S., Dhillon, H.S., Kirvell, S., Greenwood, C., Parker, M., Shipley, G.L., Nolan, T., 2015. Variability of the reverse transcription step: practical implications. Clin. Chem. 61, 202-212.

Horáková, H., Polakovicová, I., Shaik, G.M., Eitler, J., Bugajev, V., Dráberová, L., Dráber, P., 2011. 1,2-propanediol-trehalose mixture as a potent quantitative real-time PCR enhancer. BMC. Biotechnol. 11,41.

Hsuih, T.C., Park, Y.N., Zaretsky, C., Wu, F., Tyagi, S., Kramer, F.R., Sperling, R., Zhang, D.Y., 1996. Novel, ligation-dependent PCR assay for detection of hepatitis C in serum. J. Clin.

-12 CZ 2020 - 213 A3

Microbiol. 34, 501-507.

Jonstrup, S.P., Koch, J., Kjems, J., 2006. A microRNA detection system based on padlock probes and rolling circle amplification. RNA. 12, 1747-1752.

Larman, H.B., Scott, E.R., Wogan, M., Oliveira, G., Torkamani, A., Schultz, P.G., 2014. Sensitive, multiplex and direct quantification of RNA sequences using a modified RASL assay. Nucleic Acids Res. 42, 9146-9157.

Miyauchi, I., Moriyama, M., Zhang, D.Y., Abe, K., 1998. Further study of hepatitis C virus RNA detection in formalin-fixed, paraffin-embedded liver tissues by ligation-dependent polymerase chain reaction. Pathol. Int. 48, 428-432.

Nilsson, M., Malmgren, H., Samiotaki, M., Kwiatkowski, M., Chowdhary, B.P., Landegren, U., 1994.

Padlock probes: circularizing oligonucleotides for localized DNA detection. Science. 265, 20852088.

Nilsson, M., Barbany, G., Antson, D.O., Gertow, K., Landegren, U., 2000. Enhanced detection and distinction of RNA by enzymatic probe ligation. Nat. Biotechnol. 18, 791-793.

Park, Y.N., Abe, K., Li, H., Hsuih, T., Thung, S.N., Zhang, D.Y., 1996. Detection of hepatitis C virus RNA using ligation-dependent polymerase chain reaction in formalin-fixed, paraffinembedded liver tissues. Am. J. Pathol. 149, 1485-1491.

Romeo, S., Kozlitina, J., Xing, C., Pertsemlidis, A., Cox, D., Pennacchio, LA., Boerwinkle, E., Cohen, J.C., Hobbs, H.H. 2008. Genetic variation in PNPLA3 confers susceptibility to nonalcoholic fatty liver disease. Nat Genet. 40(12), 1461-5.

Saikia, M., Dai, Q., Decatur, W.A., Fournier, M.J., Piccirilli, J.A., Pan, T., 2006. A systematic, ligation-based approach to study RNA modifications. RNA. 12, 2025-2033.

Stahlberg, A., Kubista, M., Pfaffl. M., 2014. Comparison of reverse transcriptases in gene expression analysis. Clin. Chem. 50, 1678-80.

Tang, H., Yang, X., Wang, K., Tan, W., Li, H., He, L., Liu, B., 2008. RNA-templated single-base mutation detection based on T4 DNA ligase and reverse molecular beacon. Taianta. 75,1388-1393.

Patent US 20140179539 AL Novel ligase activity.

Patent US 8697408 B2. Ligation enhancement.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob detekce RNA, který obsahuje kroky hybridizace detekované RNA a dvou jednovláknových DNA sond komplementárních s detekovanou RNA, nasedajících na detekovanou RNA bezprostředně vedle sebe, za vytvoření hybridní molekuly RNA-DNA;

   ligace zakotvených jednovláknových DNA za vzniku templátové jednovláknové DNA;

   kvantitativní polymerázové řetězové reakce detekující templátovou DNA, vyznačující se tím, že krok ligace a krok kvantitativní polymerázové řetězové reakce se provádějí společně v jedné zkumavce, přičemž se užije reakční pufr obsahující trehalózu a 1,2-propandiol.
2. 2. Způsob detekce RNA podle nároku 1, vyznačující se tím, že v reakčním pufru pro společnou ligaci a polymerázovou reakci v jedné zkumavce je koncentrace trehalózy 0,15 M až 0,25 M a koncentrace 1,2-propandiolu 0,75 M až 1,25 M.
3. 3. Způsob detekce RNA podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačující se tím, že RNA je mRNA.
4. 4. Reakční pufr k provádění způsobu podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje 0,15 až 0,25 M trehalózy a 0,75 M až 1,25 M 1,2-propandiolu.