CZ309617B6 - 3α5ß-Neuroaktivní steroidy pro léčbu epilepsie a záchvatových onemocnění - Google Patents

3α5ß-Neuroaktivní steroidy pro léčbu epilepsie a záchvatových onemocnění Download PDF

Info

Publication number
CZ309617B6
CZ309617B6 CZ2019-216A CZ2019216A CZ309617B6 CZ 309617 B6 CZ309617 B6 CZ 309617B6 CZ 2019216 A CZ2019216 A CZ 2019216A CZ 309617 B6 CZ309617 B6 CZ 309617B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
carboxylate
dimethylhexadecahydro
phenanthren
seizures
general formula
Prior art date
Application number
CZ2019-216A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ2019216A3 (cs
Inventor
Eva Kudová
Kudová Eva RNDr., Ph.D
Hana Chodounská
CSc Chodounská Hana RNDr.
Pavel Mareš
DrSc Mareš Pavel prof. MUDr.
Karel VALEŠ
Valeš Karel RNDr., Ph.D
Original Assignee
Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i
Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i, Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i filed Critical Ústav organické chemie a biochemie AV ČR, v. v. i
Priority to CZ2019-216A priority Critical patent/CZ309617B6/cs
Priority to PL20718527.3T priority patent/PL3947410T3/pl
Priority to JP2021558713A priority patent/JP7248819B2/ja
Priority to CA3128921A priority patent/CA3128921C/en
Priority to US17/439,688 priority patent/US20220162257A1/en
Priority to EP20718527.3A priority patent/EP3947410B1/en
Priority to PCT/CZ2020/050017 priority patent/WO2020200335A1/en
Publication of CZ2019216A3 publication Critical patent/CZ2019216A3/cs
Publication of CZ309617B6 publication Critical patent/CZ309617B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J43/00—Normal steroids having a nitrogen-containing hetero ring spiro-condensed or not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton
    • C07J43/003—Normal steroids having a nitrogen-containing hetero ring spiro-condensed or not condensed with the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton not condensed
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0038—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 with an androstane skeleton, including 18- or 19-substituted derivatives, 18-nor derivatives and also derivatives where position 17-beta is substituted by a carbon atom not directly bonded to a further carbon atom and not being part of an amide group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/0044—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 with an estrane or gonane skeleton, including 18-substituted derivatives and derivatives where position 17-beta is substituted by a carbon atom not directly bonded to another carbon atom and not being part of an amide group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J41/00—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring
    • C07J41/0033—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005
    • C07J41/005—Normal steroids containing one or more nitrogen atoms not belonging to a hetero ring not covered by C07J41/0005 the 17-beta position being substituted by an uninterrupted chain of only two carbon atoms, e.g. pregnane derivatives

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

3α5β-steroidní sloučeniny vzorce (I), které vykazují významný antikonvulzivní účinek. Při dávkách 1,5 a 10 mg/kg, bylo v modelu epilepsie u potkanů popsáno významné potlačení konvulzivní aktivity v mozku i záchvatů indukovaných elektrickou stimulací 6 Hz. V modelu pentylenetetrazolem indukovaných záchvatů u potkanů došlo v dávce 10 mg/kg k úplné blokaci záchvatů u mláďat a významnému snížení incidence a latence generalizovaných tonicko-klonických záchvatů u dospělých jedinců. V 6Hz-modelu epilepsie dávka 10 mg/kg téměř úplně blokovala výskyt záchvatů po stimulaci 60 mA. Nárokované řešení umožňuje vytvoření nového, bezpečného a vysoce účinného léčivého přípravku pro léčbu epilepsie.

Description

α 5β-Neuroaktivní steroidy pro léčbu epilepsie a záchvatových onemocnění
Oblast techniky
Předkládaný vynález je z oboru farmacie a farmakologie. Předmětem je soubor sloučenin s prokázaným antikonvulzivním účinkem v animálních modelech epileptických záchvatů, chránících tak tkáň centrálního nervového systému (CNS).
Dosavadní stav techniky
Neurosteroidy patří do rodiny látek syntetizovaných z cholesterolu de novo v mozku. Jejich základní charakteristikou je schopnost přímo ovlivňovat řadu transmembránových neurotransmiterových receptorů. Ze strukturního hlediska patří mezi důležité faktory vztahu mezi chemickou strukturou a biologickou aktivitou geometrie mezi kruhem A a B (stereochemie v poloze C-5), typ substituentu v poloze C-3 uspořádání postranního řetězce na C-17. Dalším důležitým strukturním faktorem je lipofilicita molekuly (J. Med. Chem. 2015, 58, 5950), kterou je možno synteticky modifikovat. Mezi nejvíce prozkoumané neurosteroidy patří allopregnanolon (20-oxo-5α-pregnan-3α-ol, ALLO), dehydroepiadrosteron (17-oxo-androst-5-en-3β-ol, DHEA), pregnenolon (20-oxo-pregn-5-en-3 β-ol, PREG) a progesteron (pregn-4-ene-3,20-dione, PROG). Syntetické analogy endogenních neurosteroidů jsou tzv. neuroaktivní steroidy. Neuroaktivní steroidy představují molekuly s terapeuticky zajímavými vlastnostmi. Jsou to povětšinou allosterické modulátory receptorů γ-aminobutyrové kyseliny (GABAa) a N-methyl- D-asparagové kyseliny (NMDA), tedy receptory zodpovědné za excitačně-inhibiční rovnováhu CNS. Neurosteroidy i jejich syntetické analogy (neuroaktivní steroidy) mají řadu funkcí v centrální nervové soustavě i periferii od vývoje až po řízení komplexního chování. Současné studie ukazují, že jejich účinek může postrádat psychotomimetické i kognitivní vedlejší účinky (J. Neurosci. 2016, 36, 2161). Neuroaktivní steroidy mají nesporný terapeutický potenciál prokázaný při experimentech in vitro i in vivo. Neuroprotektivní účinek neurosteroidů či neuroaktivních steroidů je pravděpodobně zprostředkován na negenomové úrovni, ale zahrnuje i regulaci exprese proapoptotických a antiapoptotických faktorů, zapojení signalizačních kaskád v buňce, neurotransmisi, či oxidativní a zánětlivé procesy (Front. Endocrinol. 2011, 2, 50).
Bylo také prokázáno, že neuroaktivní steroidy mají antikonvulzivní vlastnosti v animálních modelech. Aplikace ALLO a PROG měla signifikantní účinek v animálních modelech epileptických záchvatů, vyvolaných aplikací pentylentetrazolu (Brain Res. 2000, 881, 98), pilokarpinu (Neuropharmacology 1996, 35, 1049), NMDA (J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997, 282, 543) a kyseliny kainové (Psychoneuro-endocrinology 2000, 25, 407). Jelikož ALLO působí potenciačně na GABAA receptory, jeho podání v animálních modelech epilepsie vede ke snížení četnosti záchvatů, mortality a buněčné smrti (Pol. J. Pharmacol. 1997, 49, 411). Ganaxolon, syntetický derivát ALLO, dokonce zabránil vzniku záchvatů u hlodavců (Epilepsia 2010, 51, 84.). Některé syntetické steroidy, jako je ganaxolon, alfaxalon, alfadolon, hydroxydion a minaxolon, vstoupily do klinických studií jako potenciální sedativa a anestetika. Zatím nejvíce úspěšným syntetickým steroidem je ganaxolon, C-3 methylovaný derivát ALLO, vyvinutý firmou Marinus Pharmaceutical. Jedná se o CNS selektivní pozitivní allosterický modulátor GABAA receptorů s prokázaným antiepileptickým účinkem v mnoha animálních modelech. V klinických studiích byl dobře tolerován dospělými i dětmi.
Epilepsie je charakterizována více než 25 syndromy a četnými typy záchvatů, které se mohou lišit jak v závažnosti, tak odpovědi na léčbu (Mental Health Clinician 2017, 7, 235). Vzhledem k různorodosti symptomatiky epilepsie, osoby s touto diagnózou mohou být zatíženy i psychiatrickými symptomy, například kognitivními a behaviorálními změnami chování, které často komplikují vlastní léčbu epilepsie (Expert Opin. Drug Saf. 2011, 10, 913). Mezi běžné psychické komorbidity spojené s epilepsií patří deprese, úzkost, poruchy pozornosti a psychózy v
- 1 CZ 309617 B6 prevalenci od 20 % do 30 % (Expert Opin. Drug Saf. 2011, 10, 913). Deprese představují jednu z nejčastějších psychiatrických komorbidit u pacientů s epilepsií s prevalencí od 20 % do 55 %, avšak u některých populací může prevalence dosahovat až 80 % (Expert Opin. Drug Saf. 2011, 10, 913). Podle řady autorů jsou úzkostné poruchy hned po depresivní poruše druhou nejčastější psychiatrickou komorbiditou u pacientů s epilepsií, jiní uvádějí dokonce častější výskyt poruch úzkostných. Jelikož bylo opakovaně prokázáno, že existuje signifikantní vztah mezi výskytem úzkostných poruch a kvalitou života pacientů s epilepsií, vhodná terapie úzkostí a úzkostných poruch v epileptologické praxi, by tedy měla být jednou z priorit péče o tyto jedince. Tento přístup byl již experimentálně ověřen i pro neurosteroidy. Existuje několik animálních a lidských studií, které naznačují, že PROG, DHEA i PREG se podílejí na mechanismu účinku antidepresiv (Neuroscience 2011, 191 ,55)
Neuroprotektivní účinek steroidních derivátů se substituentem schopným tvořit ion v poloze C-3 nárokují patenty US 8575376, EP 2435463 a US 15/506318. Tyto dokumenty nárokují pregnanové deriváty (polární acetylový substituent v poloze C-20), respektive androstanové deriváty (nepolární substituent v poloze C-17) substituované v poloze C-3 ionizovatelným substituentem. Neuroprotektivní účinek těchto nabitých derivátů je přímo spjat se specifickou kombinací strukturních rysů v poloze C-3 (3 α-nabitý substituent) a C-5β, a se schopností těchto látek inhibovat ionotropní glutamátové NMDA receptory. V dosud uveřejněných článcích a patentové literatuře bylo zároveň vždy uváděno, že inhibice NMDA receptorů, potažmo neuroprotektivní účinek, jsou podmíněny nabitým C-3 substituentem a nenabitá analoga postrádají biologický efekt na modulaci NMDA receptorů (J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000, 293, 747; Mol. Pharmacol. 1997, 52, 1113). Deriváty nárokované ve zde předkládané přihlášce vynálezu mají cyklický či acyklický C-3 substituent, který náboj nenese.
Současná odborná a patentová literatura (US 9527881; J. Med. Chem. 2009, 52, 6012) uvádí neuroprotektivní účinek C-3 substituovaných steroidních analogů PROG nesoucí prolinový či acyklický substituent s NH2 skupinou. Tyto látky jsou zdánlivě strukturně podobné látkám nárokovaným ve zde přikládané přihlášce. Konkrétně např. 3 β-L-proline-progesterone-HCI (PI33) výše uvedeného patentu. Tyto látky jsou popsány jakožto steroidní analogy pro léčbu a prevenci neurodegenerace u pacientů po poranění centrální nervové soustavy. Látka PI-33 byla resyntetizována a testována i v modelu pentylentetrazolu-indukovaných křečí. Po podání 25denním zvířatům v dávce 1 a 10 mg/kg však nezměnila výskyt generalizovaných tonickoklonických záchvatů. Naopak, všechna zvířata ve skupině pro 1 i 10 mg/kg tento typ záchvatu vykázala. Z výše uvedeného vyplývá, že antikonvulzivní účinek látek nesoucí cyklický či acyklický substituent s NH či NH2 skupinou nelze obecně predikovat a že substituce či modifikace na C-3, případně D-kruhu v kombinaci s velikostí a složením substituentu v poloze C-3 je vždy zcela unikátní a není možné ji předem předvídat a strukturu navrhnout aditivním přístupem.
Neuroprotektivní účinek steroidních derivátů nárokuje také přihláška US 20170246188 A1 (Method of treating organophosphate intoxication) s předpokládaným antikonvulzivním účinkem. Nároky této přihlášky lze považovat za spekulativní, neboť nárokované neurosteroidní látky jsou definovány jako pregnany, androstany, 19-norandrostany a norpregnany substituované skupinami obecného vzorce, který nedefinuje žádný typ ani pozici substituentu na steroidním skeletu. Takto definovaný obecný vzorec pokrývá obecně stovky až tisíce endogenních či syntetických látek. Jako příklad můžeme jmenovat žlučové kyseliny, které jsou složkou žluči a hrají významnou roli při trávení lipidů, v metabolismu cholesterolu a jeho odstraňování z organismu nebo endogenní glukokortikoidní hormon tetrahydrokortikosteron. Výše uvedené náhodně jmenované látky sice splňují definici obecného vzorce, nicméně odborník v oboru je jednoznačně schopen předem odhadnout, že tyto látky jsou v léčbě intoxikace organofosfátové intoxikace s následky definovanými jakožto tzv. symptomy cholinergní krize neúčinné. V rámci syntézy námi nárokovaných látek byl připraven i (S)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylátový analog allopregnanolonu (3α5α), jako látka strukturně podobná nárokovaným látkám z přihlášky US 20170246188 A1, potažmo uváděnému ganaxalonu, splňující i strukturní kritéria nárokované
- 2 CZ 309617 B6 v této přihlášce. Její účinek byl testován v modelu pentylentetrazolu-indukovaných křečí u laboratorních potkanů. Bylo zjištěno, že allopregnanolon (S)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát vykazuje velmi slabou antikonvulsivní účinnost v obou věkových skupinách u 12ti i 25denních potkanů proti generalizovaným tonicko-klonickým křečím, vyvolaným podkožní aplikací pentylentetrazolu (PTZ) v enormní dávce 100 mg/kg. Tyto výsledky opět jednoznačně ukazují, že nelze obecně predikovat terapeutický účinek neurosteroidů a že substituce či modifikace na C-3, případně D-kruhu v kombinaci s velikostí a složením substituentu v poloze C-3 je vždy zcela unikátní, není možně ji předem předvídat a strukturu navrhnout aditivním přístupem.
U sloučenin podle předkládaného vynálezu byla překvapivě zjištěna výrazně zvýšená účinnost u jedinců v P12, tedy v období, které odpovídá novorozeneckému a časně kojeneckému období u dětí. Předkládané sloučeniny lze tedy hodnotit jako mající specifickou účinnost pro epilepsie a epileptické syndromy s věkovou vazbou. Epilepsie a epileptické syndromy během vývoje vykazují výrazně odlišné biologické parametry v porovnání se situací u dospělých. Zvýšenou záchvatovou pohotovost a tím i snadnější vznik epileptických záchvatů způsobuje fakt, že od narození až nejméně do prepubertálního období probíhá rozsáhlý postnatální vývoj mozku. U raných vývojových stádií nejsou plně vyvinuty a stabilizovány přirozené inhibiční mechanismy a probíhá intenzívní vývoj neuronálních sítí se změnami neuromodulátorů a neurotransmiterů. Epilepsie se v raných vývojových stadiích na rozdíl od epilepsie u dospělců rozvíjí na neurobiologickém substrátu měnícího se, vyvíjejícího mozku. V pediatrické epileptologii se vyskytují specifické epileptické syndromy s věkovou vazbou, které se objevují pouze v dětství a adolescenci. V dětství i mládí se ovšem lze rovněž setkat i se stejnými typy epilepsií jako v dospělosti (syndromy bez věkové vazby). Výsledkem je daleko širší spektrum možných epilepsií v dětství než v dospělosti.
Správná diagnostika má v epilepsii klíčový význam pro vhodně zvolenou farmakoterapii. Řada věkově vázaných epilepsií není senzitivní vůči klinicky používaným léčivům, čímž je zdůrazněna medicínská potřeba vývoje věkově specifických antiepileptik, které představují specifickou farmakologickou kategorii. Typ epilepsie je často rovněž determinující pro prognózu onemocnění i celkový vývoj dítěte. Existují syndromy vysloveně benigní, které jen málo ovlivňují behaviorální projevy a neuropsychologické parametry. Na druhé straně se v časném dětství vyskytují závažné syndromy spojené obvykle s encefalopatií, které jsou právem označovány za katastrofické, protože devastují vývoj jedince, vedou ke kognitivnímu deficitu až zvratu v psychomotorickém vývoji a je u nich velmi malá šance na úplnou kompenzaci. Právě věkově specifická účinnost zde předkládaných látek umožňuje jejich využití v těchto specifických diagnózách, včetně vzácných chorob. Využití předkládaných látek bude zvláště důležité v případech současného výskytu psychiatrických a neurovývojových syndromů a komorbidit během vývoje i dospělosti. Zde předkládané sloučeniny vykazují slibné výsledky už v animálních modelech psychiatrických diagnóz, neboť obdobné stavy vykazují i mláďata laboratorního potkana.
U známých neuroaktivních steroidů se strukturou relativně blízkou zde předkládaným sloučeninám nebyla věkově specifická účinnost dosud pozorována. Z toho je možné vyvodit, že nárokované sloučeniny jsou svým farmakologickým profilem specifické a unikátní. Jejich biologické účinky nelze dovodit na základě veřejně publikovaných znalostí. Zde uvedené údaje jsou výsledkem originální vědecké a vynálezecké činnosti.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce I.
- 3 CZ 309617 B6
(I), kde
R1 je methyl a potom R2jsou buď dva vodíkové atomy, nebo jeden vodíkový atom spolu s Ci- C4 alkylem s přímým nebo rozvětveným uhlíkovým řetězcem, nebo
R1 a R2 dohromady tvoří skupinu -(CH2)n-, kde n = 2 nebo 3, která s původními uhlíkovými atomy 1 a 3 v obecném vzorci I vytváří pěti nebo šesti členný cyklus,
R3 je skupina -O-(CH2)n -Om-, kde n = 0až2am = 0 nebo 1, navázaná v poloze 3 substituentu R4,
R4 je 3a5^-androstan 3,11,17,17-tetrayl,
R5 je vodíkový atom nebo hydroxylová skupina,
R6 je atom vodíku a potom R7 je zvolen ze skupiny, zahrnující atom vodíku, acetylovou skupinu, kyano skupinu, C1-C2 kyanoalkylovou skupinu, 1,1-difluorethylovou skupinu a přímý nebo větvený C1-C4 alkyl, nebo R6 a R7 společně představují strukturu, zvolenou ze skupiny, zahrnující C1-C2 alkyliden, kyanomethylenovou skupinu, atom kyslíku, dva atomy fluoru.
Definice skupin jsou použity tak, jak jsou obecně chápány odborníky v oboru.
Alkyl je radikál lineárního nebo rozvětveného Ci až C4, s výhodou Ci až C3 nejvýhodněji Ci až C2 nasyceného alifatického uhlovodíkového řetězce, vytvořený odštěpením jednoho vodíkového atomu. Alkylen je rovný, rozvětvený nebo cyklický, s výhodou rovný nebo rozvětvený, dvojvazný alifatický uhlovodíkový řetězec.
Acetylovou skupinou se rozumí skupina -CO-CH3.
Kyanovou skupinou se rozumí skupina -ON.
Kyanoalkylovou skupinou se rozumí skupina, sestávající z alkylové skupiny podle výše uvedené definice, na niž je za odštěpení jednoho vodíkového atomu navázána skupina -ON.
Kyanomethylenovou skupinou se rozumí skupina =CH-ON.
1,1- Difluorethylovou skupinou se rozumí skupina -CF2-CH3.
C1-C2 Alkyliden je dvojvazný alifatický uhlovodíkový řetězec, obsahující dvojnou vazbu (=CH2 nebo =CH-CH3).
Výraz „hydroxyl“ označuje skupinu -OH.
-4 CZ 309617 B6
Ve výhodném provedení jsou předmětem vynálezu následující sloučeniny obecného vzorce I:
(3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-Acetyl- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (S)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (1), (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-Acetyl- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-6-oxopiperidin-2-karboxylát (2), (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-Kyano- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (3), (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-Acetyl-11 -hydroxy- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcykklopenta[ a ]fenantren-3-yl (S)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (4), (3R,5R,8R,9S,10S,13S,14S)- 10,13-Dimethylhexadekahydro-1H-cyklopenta[a]fenantren-3-yl (S)5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (5), (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S) - 10,13-Dimethyl- 17-oxohexadekahydro-1H-cyklopenta[ a ]fenantren3-yl (R)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (6), (3R,5R,8R,9S,10S,13S,14S)- 10,13-Dimethylhexadekahydro-1H-cyklopenta[a]fenantren-3-yl (R)6-oxopiperidin-2-karboxylát (7), (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-Kyano- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-6-oxopiperidin-2-karboxylát (8), (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl acetylglycinát (9), (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-acetyl- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl acetylleucinát (10), (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 10,13,17-Trimethylhexadekahydro-1H-cyklopenta[a]fenantren3-yl (S)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (11).
(3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, Z) - 17-Ethyliden- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (12),
2-(((3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S) - 10,13-Dimethylhexadekahydro-1H-cyclopenta[ a ]fenantren-3yl)oxy)ethyl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (13).
2-(((3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S) - 10,13-Dimethylhexadekahydro-1H-cyklopenta[ a ]fenantren-3yl)oxy)ethyl (S)-6-oxopiperidin-2-karboxylát (14),
2-((3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S,17 S) - 17-Acetyl- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl)ethyl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (16),
2-((3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S,17 S) - 17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl)ethyl (R )-6-oxopiperidin-2-karboxylát (17).
Dalším předmětem vynálezu jsou sloučeniny obecného vzorce I a jemu odpovídající výše uvedené konkrétní sloučeniny, pro použití jako léčiva.
Význakem vynálezu je použití sloučenin obecného vzorce I a jemu odpovídajících výše uvedených konkrétních sloučenin pro léčení epilepsie či jiných onemocnění spojených s křečemi,
- 5 CZ 309617 B6 jako jsou například záchvaty spojené s hypoxií; záchvaty spojené s traumatickým poškozením mozku; záchvaty spojené s intoxikací; patologické změny způsobené hyperexcitací.
Význakem vynálezu je použití sloučenin obecného vzorce I a jemu odpovídajících výše uvedených konkrétních sloučenin pro léčení stavů, které mohou doprovázet epilepsii, jako jsou afektivní poruchy, deprese, post-traumatické stresové poruchy (PTSD) a nemoci související se stresem, anxieta, schizofrenie a psychotické poruchy, související ischemické poškození CNS, neurodegenerativní změny a poruchy, roztroušená skleróza.
Předmětem vynálezu je rovněž použití sloučenin obecného vzorce I a jemu odpovídajících výše uvedených konkrétních sloučenin pro výrobu veterinárního nebo humánního farmaceutického přípravku pro léčení epilepsie a komorbidit s ní spojených či jiných onemocnění spojených s křečemi, jako jsou například záchvaty spojené s hypoxií; záchvaty spojené s traumatickým poškozením mozku; záchvaty spojené s intoxikací; patologické změny způsobené hyperexcitací.
Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutický prostředek pro humánní i veterinární použití, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku sloučeninu obecného vzorce I a/nebo odpovídající výše uvedeným konkrétním sloučeninám.
Předmětem vynálezu je dále výše zmíněný farmaceutický prostředek pro použití k léčení epilepsie a komorbidit s ní spojených či jiných onemocnění spojených s křečemi, jako jsou například záchvaty spojené s hypoxií; záchvaty spojené s traumatickým poškozením mozku; záchvaty spojené s intoxikací; patologické změny způsobené hyperexcitací.
Předmětem vynálezu je dále výše zmíněný farmaceutický prostředek pro použití k léčení stavů, které mohou doprovázet epilepsii, jako jsou afektivní poruchy, deprese, post-traumatické stresové poruchy (PTSD) a nemoci související se stresem, anxieta, schizofrenie a psychotické poruchy, související ischemické poškození CNS, neurodegenerativní změny a poruchy, roztroušená skleróza.
Předmětem vynálezu je také použití sloučenin podle obecného vzorce I pro výrobu analytických standardů používaných v experimentálním výzkumu a analytické chemii či jako sloučenin obsažených v potravinových doplňcích či kosmetických přípravcích určených pro zlepšování reakcí jednotlivých částí organismu vůči onemocněním spojených s křečemi.
Objasnění výkresů
Obr. 1. Antikonvulzivní účinek látek z příkladu 1, z příkladu 2 a z příkladu 3 v modelu PTZvyvolaných křečí u rybky dánio pruhované (Danio rerio). Antikonvulzivní efekt látek byl studován v dávkách 1, 3 a 5 mg/kg pro látky (A) látka z příkladu 1, (B) látka z příkladu 2 a (C) látka z příkladu 3. Jednotlivé grafy ukazují účinek látek na spontánní lokomoční aktivitu (levý graf), rychlost plavání (prostřední graf), počet otoček při otáčení (specifické nepředvídatelné pohyby, pravý graf).
Obr. 2. Antikonvulzivní účinek látek z příkladu 1, z příkladu 2 a z příkladu 3 v modelu PTZvyvolaných křečí u rybky dánio pruhované (Danio rerio). Antikonvulzivní efekt látek byl studován v dávkách 1, 3 a 5 mg/kg pro látky (A) látka z příkladu 1, (B) látka z příkladu 2 a (C) látka z příkladu 3. Jednotlivé grafy ukazují efekt látek na přirozené chování zebřičky pruhované ve tmě a při osvětlení (tzv. dark/light test).
Obr. 3. Antikonvulzivní účinek látky z příkladu I v modelu PTZ-vyvolaných křečí u 15 a 25denních jedinců laboratorního potkana. Byly použity dávky 1,5 a 10 mg/kg i.p. Grafy znázorňují (A) výskyt (osa y; v %) generalizovaných záchvatů kompletních s tonickou fází (GTCS) a nekompletních bez tonické fáze (GCS); (B) latenci (osa y; s) do začátku
- 6 CZ 309617 B6 generalizovaných záchvatů; (C) tíži záchvatů. Na ose x jsou uvedeny dávky. Tíže záchvatů byla stanovena tak, že každému zvířeti bylo přiřazeno skóre (1 až 5) podle nejzávažnějšího epileptického projevu. Skóre: 0 - bez projevu; 1 - myoklonické záškuby; 2 - epileptické automatismy; 3 - minimální, klonický záchvat; 4 - nekompletní generalizovaný záchvat (GCS); 5 - kompletní generalizovaný tonicko-klonický záchvat (GTCS). Zkratky: P12 - 12denní zvířata; P25 - 25denní zvířata; * - signifikantní rozdíl vůči kontrole; 0 nebo 1 - podání látky kompletně zablokovalo vznik záchvatu u všech zvířat, nebo vyjma 1 zvířete.
Obr. 4. Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 2 v modelu PTZ-vyvolaných křečí u 15 a 25denních zvířat jedinců laboratorního potkana. Byly použity dávky 1,5 a 10 mg/kg i.p. Grafy znázorňují (A) výskyt (osa y; v %) generalizovaných záchvatů kompletních s tonickou fází (GTCS) a nekompletních bez tonické fáze (GCS); (B) latenci (osa y; s) do začátku generalizovaných záchvatů; (C) tíži záchvatů. Na ose x jsou uvedeny dávky. Tíže záchvatů byla stanovena tak, že každému zvířeti bylo přiřazeno skóre (1 až 5) podle nejzávažnějšího epileptického projevu. Skóre: 0 - bez projevu; 1 - myoklonické záškuby; 2 - epileptické automatismy; 3 - minimální, klonický záchvat; 4 - nekompletní generalizovaný záchvat (GCS); 5 - kompletní generalizovaný tonicko-klonický záchvat (GTCS). Zkratky: P12 - 12denní zvířata; P25 - 25denní zvířata; * - signifikantní rozdíl vůči kontrole; 0 nebo 1 - podání látky kompletně zablokovalo vznik záchvatu u všech zvířat, nebo vyjma 1 zvířete; nt - netestováno.
Obr. 5. Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 3 v modelu PTZ-vyvolaných křečí u 15 a 25denních zvířat jedinců laboratorního potkana. Byly použity dávky 1, 5 a 10 mg/kg i.p. Grafy znázorňují (A) výskyt (osa y; v %) generalizovaných záchvatů kompletních s tonickou fází (GTCS) a nekompletních bez tonické fáze (GCS); (B) latenci (osa y; s) do začátku generalizovaných záchvatů; (C) tíži záchvatů. Na ose x jsou uvedeny dávky. Tíže záchvatů byla stanovena tak, že každému zvířeti bylo přiřazeno skóre (1 až 5) podle nejzávažnějšího epileptického projevu. Skóre: 0 - bez projevu: 1 - myoklonické záškuby; 2 - epileptické automatismy; 3 - minimální, klonický záchvat; 4 - nekompletní generalizovaný záchvat (CCS); 5 - kompletní generalizovaný tonicko-klonický záchvat (GTCS). Zkratky: P12 - 12denní zvířata; P25 - 25denní zvířata; * - signifikantní rozdíl vůči kontrole; 0 nebo 1 - podání látky kompletně zablokovalo vznik záchvatu u všech zvířat, nebo vyjma 1 zvířete; nt - netestováno.
Obr. 6. Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 1 v modelu záchvatů vyvolaných elektrickou stimulací 6 Hz u dospělých zvířat (60denní) laboratorního potkana. Steroidní derivát byl aplikován 20 minut před aplikací PTZ (100 mg/kg, s.c.) a byly použity dávky 1,5 a 10 mg/kg i.p. Grafy znázorňují (A) výskyt (osa y; v %) generalizovaných záchvatů kompletních s tonickou fází (GTCS) a nekompletních bez tonické fáze (GCS); (B) výskyt (osa y; v %) minimálních klonických záchvatů (C) latenci (osa y; s) do začátku generalizovaných záchvatů; (D) latenci (osa y; s) do začátku minimálních klonických záchvatů; (E) tíži záchvatů. Na ose x jsou uvedeny dávky. Tíže záchvatů byla stanovena tak, že každému zvířeti bylo přiřazeno skóre (1 až 5) podle nejzávažnějšího epileptického projevu. Skóre: 0 - bez projevu; 1 - myoklonické záškuby; 2 epileptické automatismy; 3 - minimální, klonický záchvat; 4 - nekompletní generalizovaný záchvat (GCS); 5 - kompletní generalizovaný tonicko-klonický záchvat (GTCS). Zkratky: P12 12denní zvířata; P25 - 25denní zvířata; * - signifikantní rozdíl vůči kontrole; 1 nebo 2 - podání látky kompletně zablokovalo vznik záchvatu u všech zvířat vyjma 1 nebo 2; nt - netestováno.
Obr. 7. Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 1 v modelu záchvatů vyvolaných elektrickou stimulací 6 Hz u 15 a 25denních zvířat (samci laboratorního potkana). Na ose x jsou uvedeny intenzity stimulace potřebné pro vyvolání záchvatu (60 a 80 mA u 15denních a 40 a 60 mA u 25denních zvířat). Osy y zobrazují (A) výskyt záchvatů v %, (B) trvání záchvatů v sekundách; (C) tíži záchvatů. Tíže záchvatů byla stanovena tak, že každému zvířeti bylo přiřazeno skóre (1 až 5) podle nejzávažnějšího epileptického projevu. Skóre: 0 - bez projevu; 1 - myoklonické záškuby; 2 - epileptické automatismy; 3 - minimální, klonický záchvat; 4 - nekompletní generalizovaný záchvat (GCS); 5 - kompletní generalizovaný tonicko-klonický záchvat (GTCS). Zkratky: P15 15denní zvířata; P25 - 25denní zvířata; * - signifikantní rozdíl vůči kontrole.
- 7 CZ 309617 B6
Obr. 8. Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 1 v modelu záchvatů vyvolaných elektrickou stimulací 6 Hz u dospělých jedinců (P60) (samci laboratorního potkana), který je zobrazen formou box plots (medián s 25 až 75 %) a odchylkami, reprezentujícími maximální a minimální hodnoty (osa y). Osa x zobrazuje dávky v mg/kg. Symboly v jednotlivých boxech ukazují individuální hodnoty pro jednotlivá zvířata.
Obr. 9. Histologické poškození, resp. neuroprotektivní vliv látky z příkladu 1 v dávce 1 mg/kg po provedení NMDA leze infúzí excitotoxického NMDA (25 mmol.l-1) do dorzálního hippocampu u samců laboratorního potkana. Snímky v panelu (A) zobrazují řezy kontrolních zdravých zvířat, v panelu (B) skupinu zvířat, kterým byly provedeny NMDA léze hipokampu a aplikován (2hydroxypropyl)-(e-cyklodextrin (CDX) a v panelu (C) řezy mozku zvířat, kterým byly provedeny NMDA léze hipokampu a 5 minut po provedení NMDA léze aplikována látka z příkladu 1 v dávce 1 mg/kg.
Příklady uskutečnění vynálezu
Seznam zkratek:
CHCl3 CDX DCM DMAP DMF DMSO EDCI ESI HPLC chloroform (2-hydroxypropyl)-β-cyklodextrin dichlormethan 4-dimethylaminopyridin (IUPAC: N,N-Dimethylpyridin-4-amin) dimethylformamid (IUPAC: N,N-Dimethylformamid) dimethylsulfoxid hydrochlorid 1 -ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDCI) ionizace elektrosprejem vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii (angl. high-performance liquid chromatography)
HRMS IČ MS NMDA NMR PBS hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením infračervená spektroskopie hmotnostní spektroskopie N-methyl- D-asparagová kyselina nukleární magnetická rezonance fyziologický roztok pufrovaný fosfátem (angl. (phosphate buffered saline).
Syntetické postupy
Reakce, pro které bylo nutné vyloučení vodného prostředí, byly vždy prováděny ve vyžíhané aparatuře a pod argonovou atmosférou. Vzorky pro analýzu byly sušeny několik hodin nad oxidem fosforečným při 50 °C a tlaku 100 Pa. Rozpouštědla byla odpařována na vakuové odparce při tlaku 0,25 kPa a teplotě 50 °C. K tenkovrstvé chromatografii (TLC) byly použity desky potažené vrstvou silikagelu (ICN Biochemicals). Pro preparativní sloupcovou chromatografii byl použit silikagel Fluka (60 μm). Body tání byly měřeny na bodotávku Hund Wetzlar H 600 (Helmut Hund, Německo) a nejsou korigovány. Optická rotace byla měřena polarimetrem Autopol IV (Rudolf Research Analytical, Flanders, USA) při 589,3 nm a teplotě 22 °C. Hodnoty [α]π jsou uvedeny v [10-1 · deg · cm2 · g-1], koncentrace c jako [g · 100 ml-1]. Infračervená spektra byla měřena na spektrometru Nicolet 6700 (Thermo Scientific, USA), kdy vzorek byl rozpuštěn v chloroformu. NMR spektra byla měřena při 24 °C na spektrometrech Bruker AVANCE III™ 400 MHz. NMR spektra jsou korigována na tetramethylsilan jako vnitřní standard a jsou vypsána v stupnici ppm (části z milionu), interakční konstanty J jsou udány v Hz. Multiplicity signálů jsou označeny následovně: s - singlet, d - dublet, t - triplet, q - kvartet, dt dublet tripletu, qd - kvartet dubletu, m - multiplet. Hmotnostní spektra byla měřena na
- 8 CZ 309617 B6 spektrometru LTQ Advantage Thermo s ESI nebo El ionizací (10 eV) a to v pozitivním nebo negativním módu.
Obecné postupy
Obecný postup A
Suchý dimethylformamid (DME, 10 ml) byl přidán pod inertní atmosférou ke směsi 3hydroxysteroidu (1,0 mmol), 4-dimethylaminopyridinu (DM AR, 0,25 mmol), hydrochloridu V(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylkarbodiimidu (EDCI, 2,7 mmol) a hydroxybenzotriazolu (HOBt, 2,2 mmol), která byla sušena za sníženého tlaku (0,1 hPA) 1 hodinu při teplotě místnosti. Poté byl přikapán roztok příslušné karboxylové kyseliny (1,5 mmol) v suchém DME (5 ml). Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti přes noc. Po odpaření rozpouštědla byl odparek čištěn chromatografii na sloupci silikagelu.
Obecný postup B
Suchý dichlormethan (DCM, 2 ml) byl přidán pod inertní atmosférou ke směsi 3-hydroxysteroidu (1,0 mmol), 4-dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,25 mmol) a příslušné karboxylové kyseliny (1,5 mmol). Tato směs byla sušena za sníženého tlaku (0,1 hPA) 1 hodinu při teplotě místnosti. Poté byl pomalu přikapán roztok hydrochloridu 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimidu (EDCI, 2,7 mmol) v suchém DCM (5 ml).
Reakční směs byla míchána při teplotě místnosti přes noc, následně nalita do vody, promyta 5% (obj./obj.) vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové, vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného a solankou. Po usušení nad bezvodým Na2SO4 a odpaření rozpouštědel byl odparek čištěn chromatografii na sloupci silikagelu.
Příklad 1: (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (S)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (1)
V nadpisu uvedená sloučenina 1 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 20-oxo-5 β pregnan-3 α-olu (318 mg, 1,0 mmol) za použití L-pyroglutamové kyseliny (194 mg, 1,5 mmol). Chromatografii na silikagelu (5% obj./obj. aceton v CHCE) byla získána výsledná sloučenina 1 (370 mg, 89% výtěžek): bt 167 až 168 °C (chloroform, diethylether), [α]d20 +105,6 (c 0,3, CHCl3): 1H NMR (400 MHz, CDla): δ 0,60 (3H, s, H-18); 0,94 (3H, s, H-19); 2,11 (3H, s, H-21); 4,16-4,24 (1H, m, H-C2'); 4,80 (1H tt, J = 11,4; 4,8 Hz; H-3); 5,86 (1H, s, N-H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 209,7; 177,6; 171,5; 75,9; 64,0; 56,8; 55,6; 44,5; 41,9; 40,6; 39,3; 35,9; 35,1; 34,7; 32,2; 31,7; 29,3; 26,9; 26,7; 26,4; 25,1; 24,6; 23,4; 23,1; 21,0; 13,6. IČ spektrum (CHCE): 1734, I702 (C = 0), 1230 (C-O). MS: ESI m/z 452,3 (100 %, M+Na). HR-MS (ESI) m/z: pro C26H39NO4Na [M+Na] vypočteno, 452,27713; nalezeno, 452,26742. Pro C26H39NO4 (429,6) vypočteno: 72,69 %, C; 9,15 %, H; 3,26 %, N. Nalezeno: 72,29 %, C; 9,15 %, H; 3,11 %, N.
Příklad 2: (3R,5R,8R,9S,10S,13S,14S,17S)-17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[a]fenantren-3-yl (R)-6-oxopiperidin-2-karboxylát (2)
V nadpisu uvedená sloučenina 2 byla připravena dle obecného postupu B (I)CM) z 20-oxo-5 β pregnan-3 α-olu (318 mg, 1,0 mmol) za použití 6-oxo-2-piperidinkarboxylové kyseliny (213 mg, 1,5 mmol). Chromatografií na silikagelu (3% aceton/chloroform, obj./obj.) byla získána výsledná sloučenina 2 (142 mg, 32% výtěžek): bt 139 až 141 °C (aceton/ n-heptan), [u]d20 +103,2 (c 0,3, CHCE). 1H NMR (400 MHz, CDCb): δ 0,60 (3H, s, H-18); 0,94 (3H, s, H-19); 4,05 (1H, m, HC2'); 4,81 (1H, m, H-3); 6,14 (1H, s, N-H). 13C NMR (101 MHz, CDCb): δ 209,7; 171,4; 170,5; 76,1; 64,0; 56,8; 55,1; 44,5; 42,0; 41,0; 39,3; 35,9; 35,0; 34,7; 32,2; 31,7; 31,2; 27,0; 26,7; 26,4; 25,6; 24,6; 23,4; 23,1; 21,0; 19,7; 13,6. IČ spektrum (CHCE): 3402 (NH); 1734, 1698, 1663 (C =
- 9 CZ 309617 B6
O). MS: ESI m/z 466,3 (100 %, M+Na). HR-MS (ESI) m/z: pro C27H41NO4Na [M+Na] vypočteno, 466,29278; nalezeno, 466,29283.
Příklad 3: (3 R ,5 S,8 R ,9 S, 10 S,13 S,14 S, 17 S) -17-Kyano- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (3)
V nadpisu uvedená sloučenina 3 byla připravena dle obecného postupu B (DCM) z 3 α-hydroxy5β-androstan-17β-karbonitrilu (250 mg, 0,83 mmol), za použití L-pyroglutamové kyseliny (139 mg, 1,07 mmol). Chromatografii na silikagelu (20% obj./obj. aceton v CHCE) byla získána výsledná sloučenina 3 (180 mg, 53% výtěžek): bt 188 až 189 °C (chloroform/diethyleter), [ α ]d20 +75,5 (c 0,2, CHCE). 1H NMR (400 MHz, CDCb): δ 0,91 (3H, s. H-18); 0,96 (3H, s, H-19); 4,25 (1H, ddd, J= 8,8; 5,1; 0,7 Hz; H-C2'); 4,80 (1H tt, J = 11,3; 4,8 Hz; H-3); 5,92 (1H, s, N-H). 13C NMR (101 MHz, CDCb): δ 177,7; 171,5; 121,4; 75,8; 55,6; 54,5; 44,7; 41,8; 40,5; 40,5; 37,4; 36,3; 35,1; 34,8; 32,2; 29,3; 26,8; 26,8; 26,6; 26,4; 25,0; 24,7; 23,3; 20,6; 14,8. IČ spektrum (CHCE): 2237 (CN). 1735, 1705 (C = O), 1229 (C-O). MS: ESI m/z 435,3 (100 %. M+Na). HRMS (ESI) ni/z: pro C25H36N2O3Na [M+Na] vypočteno, 435,26181; nalezeno, 435,26135. Pro C25H36N2O3 (412,6) vypočteno: 72,78 %, C; 8,80 %, H; 6,79 %, N. Nalezeno: 72,39 %, C; 8,64 %, H; 6,33 %, N.
Příklad 4: (3 R ,5 R ,8 S,9 S,10 S,11R ,13 S,14 S,17 S)-17-Acetyl-11-hydroxy-10,13dimethylhexadekahydro-1H-cycklopenta[a]fenantren-3-yl (S)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (4)
V nadpisu uvedená sloučenina 4 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 20-oxo-5β pregnan-3α,11 α-diolu (334 mg, 1,0 mmol), za použití L-pyroglutamové kyseliny (193 mg, 1,5 mmol). Chromatografii na silikagelu (30% obj./obj. aceton v CHCl3) byla získána výsledná sloučenina 4 (213 mg, 48% výtěžek): bt 183 až 185 °C (chloroform/diethylether), [ α ]d20 +86,4 (c 0,2, CHCE). 1H NMR (400 MHz, CDCb): δ 0,62 (311, s, H-18); 1,06 (3H, s, H-19); 2,13 (1H, s, H-21); 3,91 (1H, s, H-11); 4,20 (1H, ddd, J = 8,7; 5,2; 0,7 Hz; H-C2'); 4,85 (1 H, tt, J = 10,9; 5,1 Hz; 11-3); 5,83 (1H, s, N-H). 13C NMR (101 MHz, CDCb): δ 209,1; 177,7; 171,5; 76,3; 69,1; 63,5; 55,7; 55,6; 50,8; 47,3; 44,3; 43,5; 38,0; 35,9; 34,8; 32,7; 31,6; 29,3; 27,6; 27,4; 26,3; 25,0; 24,5; 23,7; 23,1; 14,6. IČ spektrum (CHCE): 1734, 1702 (C = O). MS: ESI m/z 468,3 (100 %, M+Na). HR-MS (ESI) m/z: pro C26H39NO5Na [M+Na] vypočteno, 468,27219; nalezeno, 468,27204. Pro C26H39NO5 (445,6) vypočteno: 70,08 %. C; 8,82 %, H; 3,14 %, N. Nalezeno: 69,91 %, C; 8,68 %. H; 2,87 %, N.
Příklad 5: (3 R ,5 R ,8 S,9 S,10 S,13 S,14 S) -10,13 -Dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (S)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (5)
V nadpisu uvedená sloučenina 5 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 3 α-hydroxy5β-androstranu (300 mg, 0,94 mmol) za použití L-pyroglutamové kyseliny (190 mg, 1,9 mmol). Chromatografii na silikagelu (5% obj./obj. aceton v CHCE) byla získána výsledná sloučenina 5 (210 mg, 58% výtěžek): bt 136 až 137 °C (chloroform/diethyleter), [ α ]d20 +29,5 (c 0,2, CHCE). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,69 (3H, s, H-18); 0,94 (311, s, H-19); 4,16-4,24 (1H, m, HC2'); 4,79 (1 H tt, J = 11,3; 4,8 Hz; H-3); 5,89 (1H, s, N-H). 13C NMR (101 MHz, CDCb): δ 177,5; 171,4; 76,0; 55,5; 54,5; 41,9; 40,9; 40,7; 40,5; 39,0; 36,2; 35,0; 34,7; 32,1; 29,2; 27,0; 26,7; 26,5; 25,5; 24,9; 23,3; 20,8; 20,6; 17,5. IČ spektrum (CHCE): 1734, 1704 (C = O). MS: ESI m/z 386,3 (100 %, M-H). HR-MS (ESI) m/z: pro C24H36NO3 [M-H] vypočteno, 386,27007; nalezeno, 386,26962. Pro C24H37NO3 (387,3) vypočteno: 74,38%, C; 9,62%, H; 3,61%N. Nalezeno: 74,20%, C; 9,61%, H; 3,26%, N.
Příklad 6: (3R,5R,8R,9S,10S,13S,14S)-10,13-Dimethyl-17-oxohexadekahydro-1Hcyklopenta[a]fenantren-3-yl (R)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (6)
V nadpisu uvedená sloučenina 6 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 17-oxo-5β androstan-3 α-olu (290 mg, 1,0 mmol), za použití L-pyroglutamové kyseliny (194 mg, 1,5 mmol).
- 10 CZ 309617 B6
Chromatografií na silikagelu (5% obj./obj. aceton/chloroform) byla získána výsledná sloučenina 6 (197 mg, 49% výtěžek): bt 114 až 116 °C (aceton/n-heptan), [α]d20 +98,5 (c 0,2, CHCE). 1H NMR (400 MHz, CDCk): δ 0,86 (311, s, H-18); 0,97 (3H, s, H-19); 4,20 (1H, m, H-C2'); 4,80 (1H, m, H-3); 5,91 (1H, s, N-H). 13C NMR(101 MHz, CHCE): δ 221,3; 177,7; 171,5; 75,8; 55,6; 51,6; 47,9; 41,9; 40,9; 36,1; 35,5; 35,0; 34,9; 32,2; 31,8; 29,3; 26,8; 26,6; 25,4; 25,0; 23,3; 21,9; 20,3; 13,9. IČ spektrum (CHCE): 3439 (NH); 1703, 1706(C = O); 1060 (C-O). MS: ESI m/z 424,2 (100 %, M+Na). HR-MS (ESI) m/z: pro C24H35NO4Na [M+Na] vypočteno, 424,24583; nalezeno, 424,24548. Pro C24H35NO4 (401,2) vypočteno: 71,79 %, C; 8,79 %, H; 3,49 %, N. Nalezeno: 71,40 %, C; 8,93 %, H, 3,32 %, N.
Příklad 7: (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S) - 10,13-Dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-6-oxopipendin-2-karboxylát (7)
V nadpisu uvedená sloučenina 7 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 5β-androstan3 α-olu (276 mg, 1,0 mmol), za použití 6-oxo-piperidinkarboxylové kyseliny (213 mg, 1,5 mmol). Chromatografii na silikagelu (5% obj./obj. aceton/chloroform) byla získána výsledná sloučenina 7 (189 mg, 47% výtěžek): bt 109 až 111 °C (diethylether), [ α ]d20 +18,3 (c 0,3, CHCia). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,68 (311, s, 11-18); 0,94 (3H, s, H-19); 4,04 (1H, m, H-C2'); 4,81 (1H, m, H-3); 6,13 (1H, s, NH). 13C NMR (101 MHz, CHCE): δ 171,4; 170,6; 76,3; 55,1; 54,7; 42,0; 41,1; 40,9; 40,6; 39,1; 36,3; 35,2; 34,9; 32,3; 31,2; 27,1; 26,8; 26,7; 25,7; 25,6; 25,6; 23,4; 21,0; 20,7; 19,7; 17,6. IČ spektrum (CHCE): 3402 (NH); 1734, 1665 (C = O); 1062 (C-O). MS: ESI m/z 424,3 (100%, M+Na). HR-MS (ESI) m/z: pro C25H39NO3Na [M+Na] vypočteno, 424,28222; nalezeno, 424,28258. Pro C25H39NO3 (401,3) vypočteno: 74,77 %, C; 9,79 %, H; 3,49 %, N. Nalezeno: 74,97 %, C; 9,92 %, H; 3,43 %, N.
Příklad 8: (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) -17-Kyano- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-6-oxopiperidin-2-karboxylát (8)
V nadpisu uvedená sloučenina 8 byla připravena dle obecného postupu A (DMf) z 3 α-hydroxy5β-androstan-17β-karbonitrilu (112 mg, 0,37 mmol), za použití 6-oxo-piperidinkarboxylové kyseliny (80 mg, 0,56 mmol). Chromatografii na silikagelu (3% obj./obj. aceton/chloroform) byla získána výsledná sloučenina 8 (76 mg, 48% výtěžek): bt 69 až 71 °C (ethyl acetát/n-heptan), [ α ]d20 +65,4 (c 0,3, CHCE). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,91 (311, s, H-19); 0,95 (3H, s, H18); 2,29 (1H, t, J = 8,8 Hz; H-I7); 4,04 (1H, m, H-C2'); 4,81 (1H, m, H-3); 6,12 (1H, s, N-H). 13C NMR (101 MHz, CHCE): δ 171,4; 170,5; 121,4; 75,9; 55,1; 54,5; 44,7; 41,8; 40,5; 40,5; 37,4; 36,3; 35,0; 34,8; 32,2; 31,2; 26,8; 26,8; 26,7; 26,4; 25,6; 24,7; 23,3; 20,7; 19,7; 14,5. IČ spektrum (CHCÍ3): 3403 (NH); 2237 (CN); 1734, 1664, 1418 (C = O); 1062 (C-O). MS: ESI m/z 449,3 (100 %, M+Na). HR-MS (ESI) m/z: pro C26H38N2O3Na [M+Na] vypočteno, 449,27746; nalezeno, 449,27789. Pro C26H38N2O3 (426,6) vypočteno: 73,20 %, C; 8,98 %, H; 6,57 %, N. Nalezeno: 73,22 %, C; 9,29 %, H; 6,25 %, N.
Příklad 9: (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl acetylglycinát (9)
V nadpisu uvedená sloučenina 9 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 20-oxo-5β pregnan-3α-olu (318 mg, 1,0 mmol) za použití N-acetylglycinu (176 mg, 1,5 mmol). Chromatografii na silikagelu (3% aceton/chloroform, obj./obj.) byla získána výsledná sloučenina 9 (338 mg, 81% výtěžek): bt 111 až 113 °C (ethylacetát/n-heptan), [ α ]d20 +92,0 (c 0,3, CHQ3). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,60 (3H, s, H-18); 0,93 (3H, s, H-19); 2,04 (3H, s. H-C5'); 2,11 (3H, s, 11-21); 2,53 (1H, t, J = 8,8 Hz; H-17); 4,00 (2H, d, J = 5,0 Hz; H-C5'); 4,80 (1H, m, H3); 6,00 (1H, m, N-H). 13C NMR (101 MHz, CHCE): δ 209,7; 170,2; 169,7; 75,9; 63,9; 56,8; 44,4; 41,9; 41,8; 40,6; 39,3; 35,9; 35,1; 34,8; 32,3; 31,7; 27,0; 26,7; 26,4; 24,6; 23,4; 23,2; 23,0; 21,0; 13,6. IČ spektrum (CHCE): 3463, 1516 (NH); 1734, 1697, 1676 (C = O); 1192, 1063 (CO). MS: ESI m/z 440,3 (100 %, M+Na). HR-MS (ESI) m/z: pro C25H39NO4Na [M+Na] vypočteno, 440,27713; nalezeno, 440,27753. Pro C25H39NO4 (417,6) vypočteno: 71,91 %, C;
- 11 CZ 309617 B6
9,41 %, H; 3,35 %, N. Nalezeno: 72,03 %, C; 9,36 %. H; 3,39 %, N.
Příklad 10: (3 R ,5 R ,8 R ,9 S, 10 S,13 S,14 S,17 S) - 17-acetyl- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl acetylleucinát (10)
V nadpisu uvedená sloučenina 10 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 20-oxo-5β pregnan-3α-olu (318 mg, 1,0 mmol) za použití N-acetyl-L-leucinu (260 mg, 1,5 mmol). Chromatografií na silikagelu (15% EtOAc v petroletheru, obj./obj.) byla získána směs diasteromerů. Následnou UPEC chromatografii (20% aceton/hexan, obj./obj.) byla získán C3'R/S diastereomer jako výsledná sloučenina 10 (155 mg, 33% výtěžek) olejové konzistence: [α]d20 +93,3 (c 0,3, CHCia). 1H NMR (400 MHz, CDQ3): δ 0,60 (3H, s, H-18); 0,93 (3H, s, 11-19); 0,95 (6H, dd. J= 6,3; 4,5 Hz; H-C5' a C6'); 2,02 (3H, s, N-acetyl-L-leucinát); 2,11 (3H, s, H-21); 2,55 (1H, t, J = 8,8 Hz; H-17); 4,58 (1H, m, H-C2'); 4,76 (1H, m, H-3); 5,83 (1H, 1H, NH). 13C NMR (101 MHz, CHCE): δ 209,8; 173,0; 169,9; 75,6; 64,0; 56,8; 51,1; 44.5; 42,0; 40,6; 39,3; 35.9; 35,1; 34,8; 32,2; 31,7; 27,0; 26,7; 26,5; 25,0; 24,6; 23,4; 23,4; 23,0; 23,0; 22,3; 21,0. IČ spektrum (CHCÍ3): 3436 (NH); 2959, 2872 (CH3); 1727, 1697 (C = O); 1193, 1021 (C-O). MS: ESI m/z 496,3 (100 %. M+Na). HR-MS (ESI) m/z: proC29H48NO4 [M+H] vypočteno, 474,35779; nalezeno, 474,35753. Pro C29H47NO4 (473,7) vypočteno: 73,53 %. C; 10,00 %, H; 2,96 %, N. Nalezeno: 73,37 %, C; 10,35 %, H; 2,69 %, N.
Příklad 11: (3 R ,5 R ,8 S,9 S,10 S,13 R ,14 S,17 S)-10,13,17-Trimethylhexadekahydro-1 Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (S)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (11)
V nadpisu uvedená sloučenina 11 byla připravena podle obecného postupu A z 17β-methyl-5β androstan-3α-olu (102 mg, 0,35 mmol) za použití L-pyroglutamové kyseliny (112 mg, 0,525 mmol). Chromatografii na silikagelu (aceton/chloroform, 1:50 až 1:6) bylo získána výsledná sloučenina 11 (124 mg, 60% výtěžek) jako bílá amorfní látka: bt 157 až 158 °C (aceton/n-heptan). [α]d20+31,0 (c 0,3, CHCÍ3). Ή NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,52 (3H, s, H-18); 0,82 (3H, d, J = 6,8 Hz; 17-Me); 0,94 (3H, s, 11-19); 4,19 (dd, J = 8,6; 5,2 Hz; H-C2'); 4,78 (1H, tt, J = 11,4; 4,8 Hz; H-3); 6,19 (1H, s, N-H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 177,9; 171,6; 76,1; 55,9; 55,7; 45,3; 42,3; 42,2; 40,9; 37,8; 36,2; 35,2; 34,8; 32,3; 30,4; 29,4; 27,2; 26,7; 26,6; 25,0; 24,8; 23,5; 20,7; 13,9; 12,2. IČ spektrum (CHCÍ3): 3206, 3118 (NH), 2951, 2867 (CH2), 1736 (C = O), 1716 (C = O), 1448 (CH2), 1203, 1022 (C-O). MS; ESI m/z 424,3 (100 %, M+Na), 402,3 (24 %, M+H). HR-MS (ESI) m/z: pro C25H39NO3Na [M+Na] vypočteno, 424,2823, nalezeno, 424,2822; pro C25H40NO3 [M+H] vypočteno, 402,3003, nalezeno, 402,3003. Pro C25H39NO3 (401,6) vypočteno: 74,77 %, C; 9,79 %, H; 3,49 %, N. Nalezeno: 74,77 %, C; 9,94 % H; 2,94 %, N.
Příklad 12: (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, Z) -17-Ethyliden- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (12)
V nadpisu uvedená sloučenina 12 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 5β-pregnan17-ethyliden-3α-olu (302 mg, 1,0 mmol), za použití L-pyroglutamové kyseliny (194 mg, 1,5 mmol). Produkt byl předčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (8% aceton/chloroform, obj./obj.). V nadpisu uvedená sloučenina 12 (190 mg, 46% výtěžek) byla získána HPLC chromatografii v následujícím uspořádání: vysokotlaká pumpa (model 361, Gilson), Inject Valve Rheodyne, preparativní ELSD detektor (Gilson) spojený s PC (software Trilution EC, Gilson). Průtok 17 ml/min, aceton/hexan 20/80, eluční čas 48 min. Kolona Luna 5 μm Si(2); Axia Packed 250x21,2 mm. Nástřik: 1 ml dichlormethanu: bt 155 až 157 °C (aceton/hexan), [ α ]d20 +57,1 (c 0,3, CHCl3): 1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0,86 (311, s, H-18); 0,95 (311, s, 11-19); 4,20 (1H, ddd, J = 8,7; 5,4; 0,7 Hz; H-C2'); 4,79 (1H, tt, J = 11,4; 4,8 Hz; H-3); 5,11 (1H, qt, J = 7,1; 2.0 Hz; 11-20); 5,86 (1H, s, N-H). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 177,6; 171,6; 150,4; 113,4; 76,1; 56,4; 55,6; 44,6; 42,0; 40,7; 37,5; 35,5; 35,0; 34,8; 32,3; 31,6; 29,3; 27,1; 26,7; 26,3; 25,0; 24,5; 23,4; 21,2; 17,0; 13,3. IČ spektrum (CHCÍ3): 3438, 1706 (oxopyrrolidin); 1734 (C = O); 1244, 1022 (C-O); 1678, 828 (C=C). MS: ESI m/z 827,6 (100 %, 2M). 414,3 (65 %, M+H). HR-MS
- 12 CZ 309617 B6 (ESI) m/z: pro C26H40NO3 [M+HJ vypočteno, 414,30027; nalezeno, 414,29987. Pro C26H39NO3 (413,6) vypočteno: 75,50 %; C; 9,50 %; H; 3,39 %; N. Nalezeno: 75,24 %, C; 9,51 %, H; 3,02 %, N.
Příklad 13: 2-(((3 R ,5 R ,8 S,9 S,10 S,13 S, 14 S) - 10,13-Dimethylhexadecahydro-1Hcyclopenta[ a ]fenantren-3-yl)oxy)ethyl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (13)
V nadpisu uvedená sloučenina 13 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 3-(5βandrostan-3α-yl)oxy)ethan-1-olu (320 mg, 1,0 mmol), za použití L-pyroglutamové kyseliny (194 mg, 1,5 mmol). Produkt byl předčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (8% aceton/chloroform, obj./obj.). V nadpisu uvedená sloučenina 13 (180 mg, 42% výtěžek) byla získána UPEC chromatografii v následujícím uspořádání: vysokotlaká pumpa (model 361, Gilson), Inject Valve Rheodyne, preparativní EESD detektor (Gilson) spojený s PC (software Trilution EC, Gilson). Průtok 17 ml/min, aceton/hexan 20/80, eluční čas 45 min. Kolona Euna 5 μm Si(2): Axia Packed 250x21,2 mm. Nástřik: 1 ml dichlormethanu: bt 110 až 111 °C (aceton/hexan), [α]d20 +11,4 (c 0,3, CHCh). 1H NMR (400 MHz, CDCb): δ 0,67 (3H, s, 11-18); 0,92 (3H, s, 11-19); 3,28 (1H, tt, J = 11,1; 4,6 Hz, H-3); 3,48 (1H, J = 7,0 Hz; H-C2'); 3,64-3,74 (2H, m, OCH2CH2O-ster); 4,18-4,42 (2H, m, OCHžC^O-ster); 5,92 (1H, s, N-H). I3C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 177,6; 172,1; 79,9; 65,7; 65,3; 55,4; 54,7; 42,3; 41,1; 40,8; 40,6; 39,2; 36,4; 35,6; 35.2; 33,3; 29,2; 27,4; 27,3; 26.9; 25,7; 25,0; 23,6; 21,0; 20,7; 17,6. IČ spektrum (CHCl3): 3437, 1705 (oxopyrrolidin); 1744 (C = O); 1240, 1033 (C-O). MS: ESI m/z 454,3 (87 %, M+Na), 432,3 (58 %, M+H). HR-MS (ESI) m/z: pro C26H42NO4 [M+H] vypočteno, 432,31084; nalezeno, 432,3 1049. Pro C20H41NO4 (431,6) vypočteno: 72,35 %, C; 9,58 %, H; 3,25 %, N. Nalezeno: 71,99 %, C; 9,93 %, H; 3,13 %, N.
Příklad 14: 2-(((3 R ,5 R ,8 S,9 S,10 S,13 S, 14 S) - 10,13-Dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl)oxy)ethyl (S)-6-oxopiperidin-2-karboxylát (14)
V nadpisu uvedená sloučenina 14 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 3-(5βandrostan-3 α-yl)oxy)ethan-l-olu (320 mg, 1,0 mmol), za použití 6-oxo-2-piperidinkarboxylové kyseliny (214 mg, 1,5 mmol). Produkt byl předčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (5% aceton/chloroform, obj./obj.). V nadpisu uvedená sloučenina 14 (170 mg, 38% výtěžek) byla získána HPLC chromatografií v následujícím uspořádání: vysokotlaká pumpa (model 361, Gilson), Inject Valve Rheodyne, preparativní ELSD detektor (Gilson) spojený s PC (software Trilution EC, Gilson). Průtok 17 ml/min, aceton/hexan 20/80, eluční čas 42 min. Kolona Luna 5 μm Si(2); Axia Packed 250x21,2 mm. Nástřik: 1 ml dichlormethanu: bt 117 až 119 °C (aceton/hexan), [ α ]d20 +8,1 (c 0,3, CHCla). 1H NMR (400 MHz, CDCb): δ 0,68 (3H, s, H-18); 0,92 (3H, s, 11-19); 3,27 (1H, tt, J = 11,1; 4,6 Hz; 11-3); 3,69 (211, ddd, J = 5,5; 4,2; 1,3 Hz; OCHaCHaO-ster); 4,12 (1H, ddd, J = 8,3; 5,1; 1,6 Hz; H-C2'); 4,25-4,36 (2H, m. OCH2CH2Oster); 6,11 (1H, s, N-H). I3C NMR (101 MHz, CDCb): δ 171,0; 170,9; 79,6; 65,3; 65,1; 54,6; 54,4; 42,0; 40,8; 40,5; 40,3; 38,9; 36,0; 35,2; 34,8; 33,0; 30,9; 27,1; 26,9; 26,6; 25,4; 25,3; 23,2; 20,7; 20,4; 19,4; 17,3. IČ spektrum (CHCl3): 3400, 1666 (oxopiperidin); 1743 (C = O); 1294, 1244 (C-O). MS: ESI m/z 468,3 (100 %, M+Na). 446,3 (88 %, M+H). HR-MS (ESI) m/z: pro C27H44NO4 [M+H] vypočteno, 446,32649; nalezeno, 446,32614. Pro C27H43NO4 (445,6) vypočteno: 72,77 %, C; 9,73 %, H; 3,14 %, N. Nalezeno: 72,63 %, C; 9,65 %, H; 3,03 %, N.
Příklad 15: 1 -((3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S, 14 S,17 S)-3-(2-Hydroxyethyl)-10,13dimethylhexadekahydro-1H-cyklopenta[ a ]fenantren- 17-yl)ethan-1 -on (15)
Roztok 20-oxo-5β-pregnan-3 α-octové kyseliny (5,9 g, 16,0 mmol) v THF (20 ml) byl po kapkách přidán k refluxujícímu roztoku LiAlH4 (1,4 g, 36,8 mmol) v THE (580 ml). Po 2 hodinách refluxu byla reakční směs ochlazena na 0 °C a byl přidán nasycený vodný roztok Na2SO4. Oddělený filtrát byl zakoncentrován a následně naředěn ethyl acetátem. Organická složka byla promyta vodným roztokem kyseliny chlorovodíkové (10% obj./obj.; 3 x 40 ml), vodou (3 x 40 ml) a nasyceným roztokem NaHCO3 (3 x 40 ml). Rozpouštědla sušena nad bezvodým Na2SO4
- 13 CZ 309617 B6 a následně odpařena. Sloupcovou chromatografii na silikagelu (4% EtOAc v petroleum etheru, obj./obj.) byla získána látka 1- ((3R,5R,8R,9S,10S,13S,14S,17S)-3-(2-hydroxyethyl)-10,13dimethylhexadekahydro-1 H- cyklopenta[ a ]fenantren-17-yl)ethan-1-ol (3,1 g, 54% výtěžek) jako směs 20R a 20S-izomerů, která byla použita v dalším reakčním kroku. Vodný roztok NaOCI (5,5%, 30 ml) byl přidán k roztoku výše uvedené látky (3 g, 8,6 mmol) v kyselině octové (75 ml). Po hodině míchání při teplotě místnosti byl přidán isopropanol (45 ml) a reakční směs byla míchána dalších 30 minut. Reakční směs byla zředěna vodou a extrahována chloroformem (3 x 30 ml). Spojené organické fáze byly promyty solankou, sušeny na bezvodým Na2SO4 a rozpouštědla odpařena. Odparek byl předčištěn pomocí sloupcové chromatografie (3 až 5% aceton/hexan). V nadpisu uvedená sloučenina 15 (850 mg, 25% výtěžek) byla získána HPLC chromatografii v následujícím uspořádání: vysokotlaká pumpa (model 361, Gilson), Inject Valve Rheodyne, preparativní ELSD detektor (Gilson) spojený s PC (software Trilution LC, Gilson). Průtok 10 ml/min, aceton/hexan 20/80, eluční čas 36 min. Kolona Luna 5 μm Si(2); Axia Packed 250x21,2 mm. Nástřik: 3 ml dichlormethanu. V nadpisu uvedená sloučenina byla použita do dalšího reakčního kroku. 1H NMR (400 MHz, CDCk): δ 0,59 (3H, s, H-18); 0,92 (3H, s, H-19); 2,11 (311, s. H-21); 2,53 (1H, t, J = 9,0 Hz; H-17); 3,66 (2H, t, J = 6,9 Hz; OCH2CH-ster). 13C NMR (101 MHz, CDCk) δ 209,6; 63,8; 61,7; 56,7; 44,2; 39,9; 39,2; 37,3; 35,6; 35,3; 34,6; 31,4; 31,1; 30,4; 29,5; 27,0; 26,2; 24,6; 24,3; 24,0; 22,7; 20,8; 13,3.
Příklad 16: 2-((3R,5R,8R,9S,10S,13S,14S,17S)-17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl)ethyl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (16)
V nadpisu uvedená sloučenina 16 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 20-oxo-5β pregnan-3α-ethanolu (347 mg, 1 mmol), za použití L-pyroglutamové kyseliny (194 mg, 1,5 mmol). Produkt byl předčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (8% aceton/chloroform, obj./obj.). V nadpisu uvedená sloučenina 16 (200 mg, 44% výtěžek) byla získána HPLC chromatografii v následujícím uspořádání: vysokotlaká pumpa (model 361, Gilson), Inject Valve Rheodyne, preparativní ELSD detektor (Gilson) spojený s PC (software Trilution EC, Gilson). Průtok 10 ml/min, aceton/hexan 40/80, eluční čas 42 min. Kolona Luna 5 μm Si(2); Axia Packed 250x21,2 mm. Nástřik: 3 ml dichlormethanu: nízkotající látka, [ α ]d20 +66,3 (c 0,3, CHCl3). 1H NMR (400 MHz, CDCk): δ 0,59 (3H, s, H-18); 0,93 (3H, s, H-19); 2,11 (3H, s, H-21); 4,18 (2H, t, J = 6,9 Hz; OCH2CH-ster); 4,26-4,21 (1H, m, H-C2'); 5,90 (1 H, s, NH). 13CNMR(101 MHz, CDCk): δ 209,8; 177,6; 172,1; 65,1; 64,1; 57,0; 55,5; 44,5; 40,2; 39,5; 37,6; 35,9; 35,6; 31,7; 31,3; 30,5; 30,2; 29,3; 27,2; 26,5; 25,0; 25,0; 24,7; 24,6; 24,3; 23,0; 21,1; 13,6. IČ spektrum (CHCl3): 3438, 1739, 1702 (oxopyrrolidin); 2924, 2864 (CH2). MS: ESI m/z 480,3 (100 %, M+Na), 458,3 (12 %, M+H). HR-MS (ESI) m/z: pro C28H44NO4 [M+H] vypočteno, 458,32649; nalezeno, 458,32611. Pro C28H43NO4 (457,7) vypočteno: 73,49 %, C; 9,47 %, H; 3,06 %, N. Nalezeno: 73,08 %, C; 9.43 %, H; 2,79 %, N.
Příklad 17: 2-((3R,5R,8R,9S,10S,13S,14S,17S)-17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[a]fenantren-3-yl)ethyl (R)-6-oxopiperidin-2-karboxylát (17)
V nadpisu uvedená sloučenina 17 byla připravena dle obecného postupu A (DMF) z 20-oxo-5β pregnan-3α-ethanolu (347 mg, 1 mmol), za použití 6-oxo-2-piperidinkarboxylové kyseliny (214 mg, 1,5 mmol). Produkt byl předčištěn sloupcovou chromatografii na silikagelu (5% aceton/chloroform, obj./obj.). V nadpisu uvedená sloučenina 17 (175 mg, 37% výtěžek) byla získána HPLC chromatografii v následujícím uspořádání: vysokotlaká pumpa (model 361, Gilson), Inject Valve Rheodyne, preparativní ELSD detektor (Gilson) spojený s PC (software Trilution LC, Gilson). Průtok 12 ml/min, aceton/hexan 40/60, eluční čas 37 min. Kolona Luna 5 μm Si(2); Axia Packed 250x21,2 mm. Nástřik: 1 ml dichlormethanu: bt olej, [ α ]d20 +61,5 (c 0,2, CHCl3). 1H NMR (400 MHz, CDCk): δ 0,59 (311, s, H-18), 0,93 (3H, s, H-19), 2,11 (3H, s, H-21), 4,10-4,03 (2H, m, OCH2CH-ster), 4,30-4,11 (1H, m, H-C2'), 6,11 (1H, s, N-H). 13CNMR (101 MHz, CDCl3) δ 209,8; 171,3; 171,2; 164,4; 65,2; 64,1; 57,0; 55,0; 44,5; 40,2; 39,5; 37,5; 35,9; 35,6; 31,7; 31,3; 31,2; 30,5; 30,2; 27,9; 27,2; 26,5; 25,6; 24,6; 24,3; 23,0; 21,1; 19,7; 13,6. IČ spektrum (CHCla): 3102 (oxopiperidin); 1739, 1697 (C = O); 1265, 1011 (C-O). MS: ESI m/z
- 14 CZ 309617 B6
494,3 (100 %, M+Na). HR-MS (ESI) m/z: pro C29H45NO4Na [M+Na] vypočteno, 494,32408; nalezeno, 494,32371.
Experimenty in vivo
Dospělí jedinci (kmen AB) rybky danio pruhované (Danio rerio) byly chovány při 28 až 29 °C ve světelném cyklu 14 hodin světla/10 hodin tmy (zapnutí světla v 7 hod., vypnutí světla v 21 hodin) v zařízení ZeClinics (Barcelona, Španělsko). Veškeré manipulace se zvířaty a péče o ně byly prováděny v souladu s legislativou CEA-OH/9421/2 vládního nařízení Katalánska. Embrya získaná pářením byla chována v médiu E3 za kontrolované teploty 28,5 °C až do dne 7 po oplodnění - (dpf), kdy byly provedeny experimenty.
Antikonvulzivní účinek látek byl hodnocen ve dvou modelech epileptických záchvatů u laboratorních hlodavců (PTZ model a 6Hz model) s použitím tří věkových skupin samců laboratorních potkanů kmene Wistar. Byla použita dvanáctidenní (P12 - pro PTZ model) nebo patnáctidenní (P15 - pro Hz model) a dvaceti pětidenní (P25) mláďata a rovněž dospělá zvířata (P60). Den porodu byl stanoven jako P0. Experimenty hodnotící prokognitivní účinek byly provedeny s dospělými samci laboratorního potkana kmene Wistar a Long-Evans (3 měsíce, 300až 400 g). Všechna zvířata pocházela z chovného zařízení Fyziologického ústavu AV ČR (oprávnění 1396/2014-MZE-17214). Zvířata byla chována ve standartních podmínkách (21 + 1 °C, vlhkost 50 až 60 %, světelný cyklus 12/12) se stálým přístupem k vodě a potravě. Veškeré manipulace se zvířaty byly provedeny v souladu postupy https://www.nc3rs.org.uk/arrive- guidelines a v souladu se zákonem č. 246/1992 Sb. a mezinárodními zákony a předpisy (EU Directive 2010/63/EU for animal experiments).
Vzhledem k zákonem danému etickému požadavku na redukci počtu laboratorních zvířat použitých v pokusech byla jako modelová molekula ke studiu antikonvulzivních a neuroprotektivních vlastností v animálních modelech hlodavců vybrána z příkladu 1.
Antikonvulsivní účinky steroidních derivátů v modelu akvarijní rybky dánio pruhované (Danio rerio)
Primárně byl studován antikonvulzivní účinek nárokovaných látek na nervový systém v embryonálním testu s organismem akvarijní rybky dánio pruhované (Danio rerio). Tento test je moderní alternativou k testům na dospělých zvířatech, mající srovnatelnou vypovídací hodnotu. Danio rerio je velmi všestranný organismus, který vykazuje řadu fyziologických podobností se savci včetně člověka (Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 2009, 5, 393). Antikonvulzivní účinek steroidních derivátů byl studován na jedincích o stáří 7 dpf („days post fertilization“ - dny po oplození). Steroidní deriváty byly testovány ve 3 koncentracích (1, 3 a 5 pmol.l-1). Jako negativní kontrola byl použit 1% (obj./obj.) roztok DMSO. Epileptiformní aktivita byla vyvolána aplikací pentylentetrazolu (PTZ) v dávce 5 mmol.l-1. Topiramát, klinicky používané léčivo pro tuto indikaci, byl použit jako komparátor. Výsledky byly analyzovány softwarem GraphPad Prism a statistická významnost byla stanovena testem One-way ANOVA s následným srovnáním s použitím Turkeyho testu. Spontánní pohyby dánia pruhovaného a jeho reakce na impulsy světla a tmy byly nahrávány na zařízení DanioVision a analyzovány pomocí softwaru EthoVision XT 12 (Noldus Information Technologies, Wageningen, Holandsko). Tento systém obsahuje kameru umístěnou nad nádržkou s cirkulující vodou a s teplotním senzorem nastaveným na 28 °C. Jednotlivé rybky jsou umístěny v 48-jamkové destičce, což umožňuje softwarem specificky kontrolovat a modifikovat podmínky experimentu (např. stimulaci světlem a tmou). Před každým experimentem byla zvířata ponechána 10 minut ve tmě pro aklimatizaci a teprve poté byla vystavena sérii impulzů světla a tmy. Protokol experimentu se skládá z několika fází: (a) 15 minut s osvětlením destičky; (b) série 5 krátkých záblesků světla, které indukují epileptické záchvaty; (c) 25 minut střídání světla a tmy po 5 minutách (tzv. dark/light test). Z každé fáze experimentu se dají získat odlišná experimentální data. V první fázi experimentu se získají informace o spontánním lokomočním pohybu zvířete. Druhá část experimentu umožňuje
- 15 CZ 309617 B6 analyzovat změny chování na světelný stimul vyvolávající epileptiformní aktivitu a vyhodnotit její základní charakteristiky: rychlost plavání a rychlost otáčení (specifické nepředvídatelné pohyby). Poslední část experimentu umožňuje vyhodnotit anomálie či odchylky od přirozeného chování dánia pruhovaného (pohyb ve tmě vs přirozený klidový stav při osvětlení). Tyto údaje charakterizují případný sedativní účinek testovaných látek.
Antikonvulzivní efekt látek byl studován v dávkách 1, 3 a 5 mg/kg pro látky uvedené v Příkladu 1, Příkladu 2 a v Příkladu 3. Výsledky (viz Obr. 1 a Obr. 2) ukazují, že všechny látky signifikantně snížily epileptiformní lokomoční aktivitu způsobenou aplikací PTZ ve všech třech hodnocených parametrech - spontánní lokomoční aktivitě, rychlosti plavání a rychlosti otáčení. Všechny látky také snížily epileptiformní lokomoční aktivitu ve fázi dark/ligh testu, aniž by způsobily sedaci.
Antikonvulsivní účinky steroidních derivátů u laboratorních potkanů
Antikonvulzivní účinek byl studován na dvou věkových skupinách mláďat laboratorního potkana kmene Wistar, 12 či 15denních a 25denních, a na dospělých jedincích (P60). Důvodem dvou věkových skupin mláďat potkanů byla jednak existence novorozeneckých záchvatů (dětských epileptických encefalopatií), které jsou ve většině případů rezistentní k současné farmakoterapii k tomuto účelu jsme testovali mladší skupinu, kde vývoj mozku odpovídá vývoji mozku u lidských kojenců. Zvířata 25denní pak odpovídají dětem školního věku. Byly použity dva modely: konvulsivní generalizované tonicko-klonické záchvaty vyvolané podkožní aplikací pentylentetrazolu (PTZ) v dávce 100 mg/kg a záchvaty vyvolané transkorneální elektrickou stimulací o frekvenci 6 Hz trvající 3 s. Pulsy jsou bifazické a mají trvání 1 ms, stimulátor firmy Ugo Basile generuje pulzy s konstantní intenzitou proudu. Křeče vyvolané PTZ představují model lidských generalizovaných tonicko-klonických záchvatů (GTCS), záchvaty vyvolané 6Hz stimulací jsou obecně považovány za model temporálních (psychomotorických, komplexních parciálních) záchvatů. Výsledky jsou prezentovány jako průměr±SEM. Rozdíly v latencích a tíži záchvatů byly stanoveny testem ANOVA s následným srovnáním s použitím Holm-Sidak testu. Incidence byly porovnány s použitím Fischerova testu. Hodnota p byla stanovena <0,5.
Účinnost steroidních derivátů v modelu záchvatů vyvolaných PTZ u laboratorních potkanů
Antikonvulzivní efekt látek byl studován na dvou věkových skupinách mláďat laboratorního potkana kmene Wistar - 12denních a 25denních. Steroidní deriváty byly aplikovány v dávkách 1, 5, a 10 mg/kg i.p., 20 minut před aplikací PTZ (100 mg/kg, s.c.).
Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 1 je zobrazen na Obr. 3. U 12denních mláďat byla dávkou 1 mg/kg potlačena tonická fáze záchvatu, dávka 5 mg/kg signifikantně snížila výskyt záchvatů a dávka 10 mg/kg je zcela potlačila. Latence generalizovaných záchvatů byly signifikantně prodlouženy dávkami 1 a 5 mg/kg, index závažnosti záchvatů (tj. tíže záchvatů) klesal v závislosti na dávce. U 25denních mláďat dávky 5 a 10 mg/kg signifikantně snížily výskyt generalizovaných tonicko-klonických v dávce 10 mg/kg záchvatů bez specifického ovlivnění jednotlivých fází. Latence záchvatů po dávce 1 mg/kg se významně nezměnily, po obou vyšších dávkách se však záchvaty vyskytly jen u jednoho zvířete. Index závažnosti záchvatů kopíroval výskyt záchvatů. Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 2 je zobrazen na Obr. 4. Látka v příkladu 2 v dávkách 5 a 10 mg/kg signifikantně potlačila výskyt generalizovaných záchvatů i tíži epileptických projevů u obou věkových skupin. Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 3 je zobrazen na Obr. 5. Látka z příkladu 3 v dávkách 5 a 10 mg/kg potlačila výskyt generalizovaných záchvatů u 25denních mláďat. U 12denních zvířat byla účinná dávka 5 mg/kg.
Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 1 u dospělých zvířat je zobrazen na Obr. 6. U dospělých zvířat látka z příkladu 1 v dávce 10 mg/kg signifikantně snižovala výskyt kompletních generalizovaných záchvatů s tonickou fází (GTCS) bez ovlivnění výskytu minimálních, převážně klonických záchvatů. Latence generalizovaných záchvatů byla významně snížena dávkou 5
- 16 CZ 309617 B6 mg/kg, po které měla záchvat pouze dvě z osmi zvířat a v případě dávky 10 mg/kg dokonce jen jedno zvíře. Tíže záchvatů byla signifikantně snížena po obou dávkách, 5 i 10 mg/kg.
Účinnost steroidních derivátů v modelu záchvatů vyvolaných elektrickou stimulací 6 Hz u laboratorních potkanů
Pro tento test byla použita mláďata 15denní, protože ta již mají rozlepená víčka a není nutné je chirurgicky rozevírat. Jako druhá skupina byla použita zvířata 25denní. Citlivost dvou uvedených věkových skupin na tuto stimulaci je různá, proto jsme použili u 15denních mláďat intenzity proudu 40, 60 a 80 mA, zatímco u 25denních mláďat to byly intenzity 20, 40 a 60 mA. Mezi jednotlivými stimulacemi jsme dodržovali 20minutový odstup, 10 minut před každou stimulací byly obě oči znecitlivěny kapkou mesocainu. Steroidní deriváty byly podány v dávce 10 mg/kg, i.p. 20 min před první stimulací. Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 1 u 15 a 25denních zvířat je zobrazen na obr. 7. U 15denních zvířat látka v testované dávce signifikantně potlačovala záchvaty vyvolané stimulací o intenzitě 60 ale ne 80 Hz. Podání PPG však významně zkrátilo trvání záchvatů u obou intenzit. Intenzita záchvatů nebyla ovlivněna. Starší věková skupina ukázala tendenci k nižšímu výskytu záchvatů, které po obou účinných intenzitách stimulace trvaly signifikantně kratší dobu a měly nižší intenzitu.
Antikonvulzivní účinek látky z příkladu 1 u dospělých zvířat je zobrazen na obr. 8. U dospělých potkanů látka ovlivnila práh pro vyvolání křečí v 6Hz modelu epileptických záchvatů pouze nesignifikantně. Tendence ke zvýšení prahu se objevila po podání nejvyšší testované dávky 10 mg/kg i.p. Nicméně, tyto výsledky spolu s výsledky získanými ve stejném modelu na mláďatech jednoznačně prokazují vyšší účinnost a širší spektrum antikonvulzivní účinnosti v pediatrických modelech.
Účinnost látky z příkladu 1 v modelech afektivních poruch (komorbidit epilepsie)
Behaviorální modely afektivních poruch jsou založeny na vystavení stresové situaci. Provedeny byly dva behaviorální testy: test ve vyvýšeném křížovém bludišti (PPM, Nat. Protoc. 2007, 2, 322) a v modelu „novelty suppressed feeding“ (NSF, Interdiscip. Toxicol. 2017, 10, 40).
V testu LPM byla testovaná sloučenina aplikována v dávkách 1,3 a 10 mg/kg, i.p. 30 minut před samotným testováním v bludišti. Během 10 minut pobytu v bludišti byly sledovanými parametry čas strávený v otevřených ramenech, v uzavřených ramenech a v centrální platformě. Aplikace látky z příkladu 1 v dávce 10 mg/kg vedla ke snížení všech sledovaných parametrů anxiety. Test EPM průkazně doložil anxiolytické vlastnosti látky z příkladu 1.
V testu NSF byla sloučenina z příkladu 1 byla aplikována i.p. 30 min před samotným měřením v dávkách 0,1; 0,3; 1; 3 a 10 mg/kg. Výsledky ukázaly signifikantní pokles latence do zahájení příjmu krmiva u dávky 0,3 mg/kg, tedy anxiolytické vlastnosti. U dávek 1 a 3 mg/kg byl zaznamenán trend ke snížení doby latence příjmu krmiva.
Účinnost látky z příkladu 1 v modelech schizofrenii podobného chování a prokognitivního účinku
Schizofrenii podobné chování bylo vyvoláno i.p. aplikací dizocilpinu (MK-801) v dávce 0,1 mg/kg. Vliv látky z příkladu 1 byl testován v behaviorálním testu „pasivní vyhýbání“ (passive avoidance) (Psychopharmacology (Berl). 2016, 233, 2077). Jedná se úlohu, která slouží ke studiu paměti a schopnosti učení.
Látka z příkladu 1 byla aplikována 30 min i.p. před úlohou v dávkách 0,1; 1 a 3 mg/kg. Výsledky ukazují, že aplikace látky z příkladu 1 intaktním zvířatům nenarušuje paměť hodinu po aplikaci averzivního podnětu. Vliv na snížení latence vstupu byl zaznamenán u latence měřené 24 h po asociaci již u dávky 0,1 mg/kg. Aplikace dizocilpinu vedla k poškození paměti, měřenému jako
- 17 CZ 309617 B6 latence vstupu po 1 i 24 h po aplikaci averzivního stimulu. Aplikace látky z příkladu 1 v dávce 0,1 mg/kg zabránila poškození paměti měřeno 1 h po averzivním stimulu. V ostatních dávkách a delším časovém odstupu byl pozorován obdobný trend. Aplikace látky z příkladu 1 tedy vykazuje prokognitivní vliv, a to spíše u krátkodobé paměti.
Neuroprotektivní účinnost látky z příkladu 1 v modelu excitotoxického poškození CNS
Neuroprotektivní vliv látky z příkladu 1 byl testován v modelu bilaterální excitotoxické léze dorzálního hipokampu. Postup byl prováděn podle literatury (Neuropharmacology 2011, 61, 61). Tento model simuluje nadměrnou stimulaci NMDA receptorů, která se objevuje u řady patofyziologických stavů, což vede k toku vápníku do nitra neuronu a následně k apoptóze až nekróze. Klinicky se tento stav projevuje neurodegenerací a poškozením CNS.
Potkani byli náhodně rozděleni do tří skupin. Kontrolní zvířata zahrnovala operovaná zvířata, kterým byl do hipokampu aplikován fosfátový pufr o pH 7,4. Druhou skupinu, nazvanou NMDA, tvořila zvířata, kterým byly provedeny NMDA léze hipokampu. Zvířatům ve třetí skupině byl 5 minut po provedení NMDA léze aplikován PPG v dávce 1 mg/kg i.p. NMDA léze byla indukována infúzí excitotoxického NMDA (25 mmol.l-1, objem 1 pl) do dorzálního hippocampu. kontrolní zvířata dostala sterilní PBS (10 mmol.l-1). Látka z příkladu 1 (1 mg/kg) nebo vehikulum bylo podáno 5 minut po ukončení infuze NMDA. Za 24 h po indukci excitotoxického poškození hipokampu byla provedena transcardiální perfúze. Mozková tkáň byla následně postfixována přes noc ve 4% PFA a následně v 10%, 20%, 30% (obj./obj.) sacharóze (ke kryoprotekci) pro histologickou evaluaci. Histologické poškození, resp. neuroprotektivní vliv látky z příkladu 1 byl hodnocen pomocí obarvení degenerujících neuronů látkou Fluoro Jade B (Merck Millipore, katalogové číslo AG310-30MG), vyhodnocené oblasti zahrnuly: hipokampus - DG, hilus, CA3, CA1. Výsledky na Obr. 9 ukazují signifikantní snížení poškození dorsálního hipokampu po aplikaci látky z příkladu 1. Tyto výsledky jasně dokládají neuroprotektivní účinek látky z příkladu 1.
Průmyslová využitelnost
Sloučeniny podle předloženého vynálezu budou využitelné pro léčení onemocnění centrálního nervového systému, zejména epilepsie a záchvatových stavů u dětí. Kromě toho mohou být použity i k ovlivnění přidružených komorbidit. Jedná se například o deprese, úzkost, schizofrenii podobné chování, neurovývojové poruchy, afektivní poruchy a stresové poruchy. Nárokované látky lze v terapii použít samostatně, ale i jako adjuvantní léčbu k léčivům, která jsou v současné době schválena k terapii.

Claims (11)

1. Sloučeniny obecného vzorce I,
kde
R1 je methyl a potom R2 jsou dva vodíkové atomy, nebo vodíkový atom a Cl až C4 alkyl s přímým nebo rozvětveným uhlíkovým řetězcem, nebo
R1 a R2 dohromady tvoří skupinu -(CH2)n-, kde n = 2 nebo 3, který s původními uhlíkovými atomy 1 a 3 v obecném vzorci I vytváří pěti nebo šesti členný cyklus,
R3 je skupina -O-(CH2)n-Om-„ kde n = 0až2am = 0 nebo 1, navázaná v poloze 3 substituentu R4,
R4 je 3«5^-androstan 3,11,17,17-tetrayl,
R5 je vodíkový atom nebo hydroxylová skupina,
R6 je atom vodíku a potom R7je zvolen ze skupiny, zahrnující atom vodíku, acetylovou skupinu, kyanoskupinu, C1-C2 kyanoalkylovou skupinu, 1,1-difluorethylovou skupinu a přímý nebo větvený C1-C4 alkyl, nebo R6 a R7 společně představují strukturu, zvolenou ze skupiny zahrnující C1-C2 alkyliden, kyanomethylenovou skupinu, atom kyslíku, dva atomy fluoru.
2. Sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1, zvolené ze skupiny, zahrnující:
(3R, 5R, SR, 9S, 1 OS, 13S, 145,1 IS)-17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro- 1Hcyklopenta[a]fenantren-3-yl (5)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát, (3R, 5R, SR, 9S, 1 OS, 13S, 145,175)-17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro- 1Hcyklopenta[a]fenantren-3-yl (7?)-6-oxopiperidin-2-karboxylát, (3R,5S,SR,9S, 105,135,145,175)-17-Kyano-10,13-dimethylhexadekahydro- 1Hcyklopenta[a]fenantren-3-yl (7?)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát, (3R, 5R,85,95,105,1 IR, 135,145,175)-17-Acetyl-11 -hydroxy-10,13-dimethylhexadekahydro- 1Hcycklopenta[a]fenantren-3-yl (5)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát, (3R,5R,85,95,105,135,145)-10,13-Dimethylhexadekahydro-1 //-cyklopcnta[«]fcnantrcn-3-yl (5)-5oxopyrrolidin-2-karboxylát, (3R, 5R, SR, 9S, 105,135,145)-10,13-Dimethyl-17-oxohexadekahydro-I //-cyklopcnta[«]fcnantrcn-3yl (7?)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát,
- 19CZ 309617 B6 (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S) - 10,13-Dimethylhexadekahydro-1H-cyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-6oxopiperidin-2-karboxylát, (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-Kyano- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-6-oxopiperidin-2-karboxylát, (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-Acetyl- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl acetylglycinát, (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, 17 S) - 17-acetyl- 10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl acetylleucinát, (3 R ,5 R ,8 S,9 S,10 S, 13 R ,14 S,17 S) -10,13,17-Trimethylhexadekahydro-1H-cyklopenta[ a ]fenantren-3yl (S)-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát, (3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S, Z) - 17-Ethyliden- 10,13-dimethylhexadekahydro-1H- cyklopenta[ a ]fenantren-3-yl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát,
2-(((3 R ,5 R ,8 S,9 S, 10 S,13 S,14 S) - 10,13-Dimethylhexadekahydro-1H-cyclopenta[ a ]fenantren-3yl)oxy)ethyl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát,
2-(((3 R ,5 R ,8 S,9 S, 10 S,13 S,14 S) - 10,13-Dimethylhexadekahydro-1H-cyklopenta[ a ]fenantren-3yl)oxy)ethyl (S)-6-oxopiperidin-2-karboxylát,
2-((3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S,17 S) - 17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl)ethyl (R )-5-oxopyrrolidin-2-karboxylát,
2-((3 R ,5 R ,8 R ,9 S,10 S,13 S,14 S,17 S) - 17-Acetyl-10,13-dimethylhexadekahydro-1Hcyklopenta[ a ]fenantren-3-yl)ethyl (R )-6-oxopiperidin-2-karboxylát.
3. Sloučeniny obecného vzorce l podle nároku 1 pro použití jako léčiva.
4. Sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití k léčení epilepsie či onemocnění spojených s křečemi, kterými jsou záchvaty spojené s hypoxií; záchvaty spojené s traumatickým poškozením mozku; záchvaty spojené s intoxikací; patologické změny způsobené hyperexcitací.
5. Sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití k léčení stavů, které mohou doprovázet epilepsii, kterými jsou afektivní poruchy, deprese, post-traumatické stresové poruchy - PTSD, a nemoci související se stresem, anxieta, schizofrenie a psychotické poruchy, související ischemické poškození CNS, neurodegenerativní změny a poruchy, roztroušená skleróza.
6. Farmaceutický prostředek pro humánní i veterinární použití, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku sloučeninu obecného vzorce I podle nároku 1.
7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 pro použití k léčení epilepsie či onemocnění spojených s křečemi, kterými jsou záchvaty spojené s hypoxií; záchvaty spojené s traumatickým poškozením mozku; záchvaty spojené s intoxikací; patologické změny způsobené hyperexcitací.
8. Farmaceutický prostředek podle nároku 6 pro použití k léčení stavů, které mohou doprovázet epilepsii, kterými jsou afektivní poruchy, deprese, post-traumatické stresové poruchy - PTSD, a nemoci související se stresem, anxieta, schizofrenie a psychotické poruchy, související ischemické poškození CNS, neurodegenerativní změny a poruchy, roztroušená skleróza.
9. Potravinový doplněk určený pro zlepšování reakcí jednotlivých částí organismu vůči onemocněním spojených s křečemi, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku sloučeninu obecného vzorce I podle nároku 1.
- 20 CZ 309617 B6
10. Analytický standard používaný v analytické chemii, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku sloučeninu obecného vzorce I podle nároku 1.
11. Kosmetický přípravek pro zlepšování reakcí jednotlivých částí organismu vůči onemocněním spojených s křečemi, vyznačující se tím, že obsahuje jako aktivní složku sloučeninu obecného 5 vzorce I podle nároku 1.
CZ2019-216A 2019-04-05 2019-04-05 3α5ß-Neuroaktivní steroidy pro léčbu epilepsie a záchvatových onemocnění CZ309617B6 (cs)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-216A CZ309617B6 (cs) 2019-04-05 2019-04-05 3α5ß-Neuroaktivní steroidy pro léčbu epilepsie a záchvatových onemocnění
PL20718527.3T PL3947410T3 (pl) 2019-04-05 2020-04-02 3alfa, 5beta–neuroaktywne sterydy do leczenia padaczki i chorób napadowych
JP2021558713A JP7248819B2 (ja) 2019-04-05 2020-04-02 てんかんおよび発作疾患の治療のための３α５β－神経活性ステロイド
CA3128921A CA3128921C (en) 2019-04-05 2020-04-02 3alpha, 5beta-neuroactive steroids for the treatment of epilepsy and seizure diseases
US17/439,688 US20220162257A1 (en) 2019-04-05 2020-04-02 3alpha, 5beta-neuroactive steroids for the treatment of epilepsy and seizure diseases
EP20718527.3A EP3947410B1 (en) 2019-04-05 2020-04-02 3alpha, 5beta-neuroactive steroids for the treatment of epilepsy and seizure diseases
PCT/CZ2020/050017 WO2020200335A1 (en) 2019-04-05 2020-04-02 3alpha, 5beta-neuroactive steroids for the treatment of epilepsy and seizure diseases

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2019-216A CZ309617B6 (cs) 2019-04-05 2019-04-05 3α5ß-Neuroaktivní steroidy pro léčbu epilepsie a záchvatových onemocnění

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2019216A3 CZ2019216A3 (cs) 2020-10-14
CZ309617B6 true CZ309617B6 (cs) 2023-05-24

Family

ID=70285346

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2019-216A CZ309617B6 (cs) 2019-04-05 2019-04-05 3α5ß-Neuroaktivní steroidy pro léčbu epilepsie a záchvatových onemocnění

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20220162257A1 (cs)
EP (1) EP3947410B1 (cs)
JP (1) JP7248819B2 (cs)
CA (1) CA3128921C (cs)
CZ (1) CZ309617B6 (cs)
PL (1) PL3947410T3 (cs)
WO (1) WO2020200335A1 (cs)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114907436A (zh) * 2021-02-08 2022-08-16 南京诺瑞特医药科技有限公司 3-羟基-5-孕烷-20-酮衍生物的晶型及其制备方法和用途

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018103626A1 (zh) * 2016-12-05 2018-06-14 江苏恩华络康药物研发有限公司 一类水溶性别孕烯醇酮衍生物及其用途
CN108517001A (zh) * 2018-05-17 2018-09-11 江苏恩华络康药物研发有限公司 水溶性别孕烯醇酮衍生物及其用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2600653B1 (fr) * 1986-06-24 1988-12-16 Pasteur Strasbourg Universite Composes de synthese associative d'acides amines soufres ou non soufres avec des derives du d-4 pregnene 3,20-dione ou avec des derives du d-1,4 pregnadiene 3,20-dione aux proprietes glucocorticoides et anti-inflammatoires, procedes d'obtention, compositions pharmaceutiques les contenant. proprietes pharmacologiques et applications
FR2607504B1 (fr) * 1986-12-02 1989-01-27 Rhone Poulenc Sante Nouveaux derives de l'isoindolinone, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
JP4380508B2 (ja) * 2003-11-28 2009-12-09 田辺三菱製薬株式会社 医薬組成物
US7329763B1 (en) * 2006-09-11 2008-02-12 New Cell Formulations Ltd Creatine pyroglutamic acid salts and methods for their production and use in individuals
EP2076288A2 (en) * 2006-09-22 2009-07-08 Braincells, Inc. Combination comprising an hmg-coa reductase inhibitor and a second neurogenic agent for treating a nervous system disorder and increasing neurogenesis
EP2260052A4 (en) * 2008-02-26 2013-01-16 Univ Emory STEROIDANALOGA FOR NEUROPROTEKTION
CZ303037B6 (cs) 2009-05-28 2012-03-07 Ústav organické chemie a biochemie, Akademie ved CR, v. v. i. Deriváty pregnanolonu substituované v poloze 3alfa, zpusob jejich výroby a jejich použití
MA40498A (fr) 2014-09-02 2021-05-19 Texas A & M Univ Sys Méthode de traitement de l'intoxication par organophosphates

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018103626A1 (zh) * 2016-12-05 2018-06-14 江苏恩华络康药物研发有限公司 一类水溶性别孕烯醇酮衍生物及其用途
CN108517001A (zh) * 2018-05-17 2018-09-11 江苏恩华络康药物研发有限公司 水溶性别孕烯醇酮衍生物及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
V.NOHRIA, E.GILLER; Ganaxolone. Neurotherapeutics 4, 102-105, 2007, ISSN: 1933-7213 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3947410C0 (en) 2025-02-12
EP3947410B1 (en) 2025-02-12
US20220162257A1 (en) 2022-05-26
EP3947410A1 (en) 2022-02-09
CZ2019216A3 (cs) 2020-10-14
WO2020200335A1 (en) 2020-10-08
CA3128921C (en) 2023-08-01
PL3947410T3 (pl) 2025-06-23
JP7248819B2 (ja) 2023-03-29
JP2022527327A (ja) 2022-06-01
CA3128921A1 (en) 2020-10-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7617057B2 (ja) ３，３－二置換１９－ノルプレグナン化合物およびその使用
US8354395B2 (en) Method for providing neuroprotection from spinal muscular atrophy
CA2725791C (fr) Derives de l&#39;oxime de cholest-4-en-3-one, compositions pharmaceutiques les renfermant, et procede de preparation
AU2017204452A1 (en) Neuroactive Seroids, Compositions, and Uses Thereof
EP3171855B1 (en) 11.beta.-hydroxysteroid-4-aza-compounds, compositions and uses thereof
CZ309617B6 (cs) 3α5ß-Neuroaktivní steroidy pro léčbu epilepsie a záchvatových onemocnění
JP5731397B2 (ja) ３，５−セコ−４−ノル−コレスタンの新規オキシム誘導体、それを含む医薬組成物、及びその調製方法
CN108218945B (zh) 去氧胆酸衍生物、其制备方法、药物组合物及用途
CN108218946B (zh) 一种去氧胆酸类化合物、其制备方法及应用
Buisson Bordet et a
RU2808165C2 (ru) Нейроактивные стероиды, композиции и их применения
HK40001824B (zh) 3,3-二取代的19-去甲孕甾烷化合物、组合物、及其用途
Tsutsui et al. frontiers in MINI REVIEW ARTICLE CELLULAR NEUROSCIENCE