CZ303037B6

CZ303037B6 - Deriváty pregnanolonu substituované v poloze 3alfa, zpusob jejich výroby a jejich použití

Info

Publication number: CZ303037B6
Application number: CZ20090348A
Authority: CZ
Inventors: Chodounská@Hana; Štastná@Eva; Kapras@Vojtech; Kohout@Ladislav; Borovská@Jirina; Vyklický@Ladislav; Valeš@Karel; Cais@Ondrej; Rambousek@Lukáš; Stuchlík@Aleš; Valešová@Vera
Original assignee: Ústav organické chemie a biochemie, Akademie ved CR, v. v. i.; Fyziologický ústav Akademie ved CR, v. v. i.; Psychiatrické centrum Praha
Priority date: 2009-05-28
Filing date: 2009-05-28
Publication date: 2012-03-07
Also published as: ES2631029T3; WO2010136000A4; EP2435463B1; WO2010136000A2; WO2010136000A3; EP3243829A1; US20120071453A1; EP2435463A2; CZ2009348A3; DK2435463T3; US8575376B2

Abstract

Deriváty pregnanolonu obecného vzorce I, v nemž R.sup.1 .n.má stejný význam jako je uveden v popisu, zpusob výroby derivátu pregnanolonu obecného vzorce I, v nemž R.sup.1 .n.znamená jak uvedeno v popisu, použití derivátu pregnanolonu obecného vzorce I pro lécení ruzných onemocnení CNS, pro lécení neuropsychiatrických poruch souvisejících s dysbalancemi glutamátergního neuroprenašecového systému, ischemického poškození CNS, neurodegenerativních zmen a poruch CNS, afektivní poruchy, deprese, posttraumatické stresové poruchy a nemocí související se stresem, anxietu, schizofrenie a psychotických poruch, bolesti, závislosti, roztroušené sklerózy, epilepsie, gliomu. Dále se toto rešení týká použití derivátu pregnanolonu obecného vzorce I pro výrobu veterinárního a humánního farmaceutického prípravku pro lécení uvedených onemocnení.

Description

Deriváty pregnanolonu substituované v poloze 3alfa, způsob jejich výroby a jejich použiti

Oblast techniky

Tento vynález se týká derivátů pregnanolonu substituovaných v poloze 3alfa, způsobu jejich výroby, jejich použití a farmaceutického přípravku je obsahující. Zvláště se tento vynález týká derivátů pregnanolonu substituovaných v poloze 3alfa, které mají v této poloze anionickou skupinu, Tyto deriváty jsou užitečné pro léčení některých onemocnění centrálního nervového systému io (CNS), zvláště pak pro léčení ischemického poškození CNS, neurodegenerativních změn a poruch, atéktivní poruchy, deprese, post-traumatické stresové poruchy (PTSD) a nemocí souvisejících se stresem, schizofrenie a psychotické poruchy, anxietu, bolesti, závislostí, roztroušené sklerózy, epilepsie a gliomů.

Dosavadní stav techniky

Glutamát je hlavním excitačním neuroprenašečem v centrálním nervovém systému savců. Během výlevu glutamátu z presynaptické terminály odpovědi postsynaptického neuronu vznikají pro20 střednictvím ionotropních a metabotropních glutamátových receptoru. Metabotropní receptory fungují prostřednictvím vazby na Gprotemy a mobilizují vápníkové ionty z intracelulámích kompartmentů. Aktivace ionotropních receptorů vede ke zvýšení propustnosti postsynaptické membrány pro sodné, draselné a vápenaté kationty otevřením iontových kanálů, které jsou součástí receptorů.

Mezi ionotoropní glutamát ové receptory patří N-methyl-D-aspartátové receptory (NMDAR), AMPA a kainátové receptory. Ačkoliv současné poznatky naznačují úlohu různých podtypů rodiny glutamátových receptorů v glutamátem indukované excitotoxicitě, ionotropní receptory jsou považovány za klíčového hráče v těchto procesech. Aktivace ionotropních glutamátových recep30 torů vede ke změnám v intracelulámích koncentracích iontů, především vápenatých a sodných. Současné výzkumy ukazují, že kromě vápníku, i zvýšení intracelulámích hladin Na’ může vést k zániku neuronů. U neuronů v hipokampální kultuře a v retině může vést aktivace glutamátových receptorů k poškození neuronů prostřednictvím Na+ kationtů, dokonce i bez přítomnosti extracelulámího vápníku. Nicméně, toxicita vyšších hladin glutamátu je zpravidla spojována se vzestupem intracelulámích hladin Ca²⁺. V současnosti je poměrně dobře prokázáno, že existuje přímý vztah mezi nadměrným průnikem vápníku do buněk a glutamátem navozeným poškozením neuronů. Glutamátem vyvolané patologické zvýšení intracelulámího vápníku je připisováno déletrvající aktivaci ionotropních glutamátových receptorů. Zvýšení intracelulámího vápníku může spustit sestupnou neurotoxickou kaskádu, která zahrnuje odpřažení mitochondriálního elektrono40 vého transportu od syntézy ATP, a nadměrnou aktivaci enzymů jako kapalin a dalších proteas, proteinkinas, syntézy NO, kalcineurinů a endonukleas. Změny v aktivitě těchto neuronů mohou vést k produkci toxických reaktivních molekul jako volných kyslíkových radikálů (oxid dusný, superoxid, peroxid vodíku), ke změnám v architektuře cytoskeletu a k aktivaci genetických signálů vedoucích k apoptóze a k poškození funkce mitochondrií (Villman a Becker, 2007).

Řada preklinických studií dokládá výraznou schopnost NMDA antagonistů zabránit excesivnímu působení glutamátu na nervové buňky a tím omezit narušení funkcí CNS. Nicméně jejich neuroprotektivní potenciál je z klinického pohledu malý. Vzhledem k faktu, že NMDA receptory jsou jedněmi z nej rozšířenějších typů receptorů v CNS, vede jejich podání (NMDA antagonistů) k řadě závažných nežádoucích účinků od narušení motoriky po indukci psychóz schizofrenního typu. Na druhou stranu velká rozmanitost NMDA receptorů, jejich rozdílná distribuce na synapsích i mimo ně a různé funkční stavy tohoto receptoru nabízejí možnost hledat sloučeniny selektivně ovlivňující pouze určitou skupinu NMDA receptorů a tím omezit výskyt neočekávaných a nežádoucích účinků pri zachování neuroprotektivního působení.

- 1 CZ 303037 B6

Předchozí výsledky ukázaly, že přirozeně se vyskytující 3α5β pregnanolon-sulfát use-dependentním způsobem ovlivňuje aktivitu NMDA receptorů. V důsledku tohoto mechanismu působení má výrazněji inhibiční působení na NMDA receptorech tonicky aktivovaných glutamátem než na fázicky aktivovaných NMDA receptorech během synaptického přenosu. Právě aktivace extrasynaptických tonicky aktivovaných NMDA receptorů je zásadní pro excitotoxické působení glutamátu (Petrovic et al., 2005).

Proto jsme zahájili vývoj a testování nových NMDA antagonistů odvozených od neurosteroidů. Tyto zcela nově syntetizované sloučeniny vykazují afinitu k extrasynaptickým NMDA receptorům. Co je však ještě důležitější, předchozí elektrofyziologické studie ukázaly, že tento typ látek se váže pouze na dlouhodobě otevřené NMDA receptory. Předpokládaný neuroprotektivní mechanismus účinku je tedy blokace excesivního vtoku vápníku do buňky prostřednictvím dlouho otevřených NMDA receptorů. K. ostatním typům NMDA receptorů nemají tyto sloučeniny afinitu, předpokládáme tedy, že nebudou ovlivňovat přenos signálu mezi neurony.

V posledním desetiletí se biomedicínský výzkum soustředil na studium role neurosteroidů v patofyziologii řady neuropsychiatrických chorob a zhodnocení jejich terapeutického potenciálu. Mechanismus účinku neurosteroidů je spojován s jejich aktivitou na NMDA a GABA_a receptorech. Řada experimentálních studií na animálních modelech poukazuje na jejich potenciál v léčbě řady nemocí centrálního nervového systému, především neurodegenerativních chorob, roztroušené sklerózy, afektivních poruch, alkoholismu, bolesti, insomnie či schizofrenie (Morow, 2007; Weaver, 2000).

Neurosteroidy hrají zásadní roli také v regulaci reaktivity na stres a s tím souvisejícími poruchami CNS. Hladina neurosteroidů krátkodobě po vystavení stresu stoupá, jedná se o adaptivní mechanismus. Naproti tomu experimentální modely chronického stresu a deprese u laboratorních hlodavců ukazují sníženou koncentraci neurosteroidů jak v mozku, tak v plazmě. Podobné nálezy nacházíme i u pacientů trpících depresí nebo premenstruačním syndromem. To poukazuje na narušení homeostatických mechanismů v CNS u neuropsychiatrických chorob souvisejících se stresem.

Steroidní sloučeniny ovlivňují aktivitu a plasticitu neuronů a gliových buněk během časného vývoje, a později ve vývoji hrají důležitou trofickou a neuroprotektivní roli v dospělém nervovém systému. Steroidy jsou produkovány pohlavními žlázami a nad ledvinkám i, stejně tak jako v CNS. Do mozku, prodloužené míchy a periferních nervů se steroidní sloučeniny dostávají krevním řečištěm. Nicméně, některé steroidy (neurosteroidy) jsou produkovány přímo v centrální nervové soustavě. Mezi nejlépe prozkoumané neurosteroidy patří pregnenolon, progesteron, dehydroepiandrosteron (DHEA) a jejich redukované metabolity a sulfátové estery. O regulaci syntézy neurosteroidů v CNS není známo příliš mnoho poznatků, avšak obecně se soudí, že jejím podkladem jsou interakce mezi více typy buněk. Například syntéza progesteronu Schwannovými buňkami u periferních nervuje regulována difuzními signály z neuronů.

Neurotrofické a neuroprotektivní účinky neurosteroidů byly ukázány jak v buněčných kulturách, tak in vivo. Progesteron hraje důležitou roli v neurologickém zotavení z traumatického poškození mozku a míchy prostřednictvím mechanismů zahrnujících ochranu před excitotoxickým poškozením buněk, před peroxidací lipidů a indukcí specifických enzymů. Například po přetětí spinální míchy potkanů, progesteron zvyšuje počet astrocytů exprimujících TVO-syntézu těsně nad a pod místem přetětí.

Tento steroid rovněž hraje roli v regulaci formování nových myelinových pochev. To bylo ukázáno u regeneruj ícího potkaního nervus sciaticus v kultuře sensorických neuronů a Schwannových buněk. Progesteron rovněž posiluje myelinizaci prostřednictvím aktivace genů kódujících proteiny účastnící se myelinizace.

- 2 CZ 303037 B6

Jak již bylo řečeno, neurosteroidy významně modulují funkci membránových receptorů pro neuropřenašeče, zejména GABA_a receptorů, NMDA receptorů a sigma 1-receptorů. Tyto mechanismy jsou zodpovědné za psychofarmako logické účinky steroidů a částečně vysvětlují jejich antikonvulzivní, anxiolytické, neuroprotektivní a sedativní účinky, stejně jako jejich vliv na procesy učení a paměti. Například u pregnanolon-sulfátu bylo prokázáno, že je schopen zvrátit kognitivní deficit u zvířat vyššího věku a že má protektívní účinek na paměť v několika modelech amnézie. Nové studie dokládají přímý vliv neurosteroidů i na nitrobuněčné receptory. Ačkoliv například nejsou doklady o přímé vazbě na glukokortikoidní receptor, modulují účinek kortikoidů nepřímo prostřednictvím interakcí s proteinkinasami A, C, MAPK nebo CAMK. Navíc byl proio kázán vliv pregnanolonu a pregnanolon-sulfátu na proteiny asociované s mikrotubuly a akcelerací polymerace mirkotubulů, čímž dochází k ovlivnění neuronální plasticity. Tyto nově popsané účinky neurosteroidů jsou dosud velmi málo prozkoumané, nicméně lze předpokládat jejich roli v neuroprotektivitě.

i5 Sulfátové estery neurosteroidů hrají fyziologickou roli v regulaci receptorů excitačních i inhibičních neuropřenašečů a participují na přirozených protektivních vlastnostech tkáně centrálního nervového systému. Sulfatované estery ajejich analogy jsou nadějnými molekulami v terapii chorob centrálního nervového systému. Nicméně v nervové tkáni je enzymaticky udržován poměr mezi neurosteroidy a jejich sulfatovanými estery. Umělé podání sulfatovaných esterů v důsledku enzymové aktivity nemusí vést k zlepšení sledovaných funkcí. Námi předkládané molekuly představují metabolicky stabilnější analogy sulfatovaných esterů. Navíc vzhledem ke své struktuře snadněji procházejí přes hematoencefalickou bariéru. Sulfatované a tedy polární steroidní sloučeniny obecně nepronikají hematoencefalickou bariérou, ale bylo zjištěno, že i.v. podaný pregnanolon-sulfát proniká přes hematoencefalickou bariéru. V transportu sulfatovaných analogů se pravděpodobně uplatňují aktivní mechanismy spojené s transportním proteinem organických iontů (OATP), který je exprimován v buňkách mozkové tkáně.

Výhodou zde popsaných sloučenin je to, že si uchovávají podobné farmakologtcké i fyziologické vlastnosti jako pregnanolon-sulfát, který má terapeutický potenciál, přičemž ale nejsou odbouráno vány sulfatasami.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká sloučenin obecného vzorce I

v němž

R¹ znamená skupinu obecného vzorce R³OOC-R²-C(R⁴)-R⁵-, kde R² znamená alkylovou nebo alkenylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku s přímým nebo větveným uhlíkovým řetězcem, které mohou být substituovány jedním nebo více atomy halogenu, aminovou skupinou, která může být buď volná, nebo chráněná chránící skupinou zvolenou z terc-buty loxy karbony lu a/nebo hetero45 cyklickou skupinou, kterou je {4—[1,1 lbis(methylensulfo)-3,3,9,9-tetramethyl-4,8 diaza-6oxa-3,6,8,9-tetrahydro-pentacen-13-yl]-benzen-l-karboxylová kyselina}~3-karbonyl, R³ znamená buď atom vodíku, nebo chránící skupinu karboxylové skupiny, zvolenou z benzylu, R⁴ znamená atom kyslíku, NH skupinu nebo atom síry vázaný dvojnou vazbou nebo R⁴ znamená dva atomy vodíku, a R⁵ znamená atom kyslíku, atom dusíku nebo atom uhlíku, kromě toho, kdy R

-3 CZ 303037 Β6 znamená skupinu (CH₂)_n, kde n = O až 3, a současně R³ znamená atom vodíku a R⁴ i R? znamenají atom kyslíku.

Vynález je založen na výsledcích našich pokusů, v nichž jsme zkoumali vliv pregnanolon-sulfátu na nativní a rekombinantní NMDA receptory. Ty ukázaly, že tento přirozeně se vyskytující neuro steroid inhibuje odpovědi vyvolané exogenní aplikací specifických agonistů NMDA receptorů. Ukázali jsme, že se pregnanolon-sulfát váže pouze na aktivované receptory (use-dependentní účinek), ale neváže se do iontového kanálu jako některé látky typu - Mg²⁺, ketamin, dizocilpin nebo memantin. Rychlost vazby a mechanismus účinku pregnanolon-sulfátu má za následek vyšší inhibiční působení na receptory tonicky aktivované glutamátem než na fázicky aktivované receptory během synaptického přenosu. Nově syntetizované analogy, kterých se týká vynález, mají stejný mechanismus působení na NMDA receptorech jako pregnanolon-sulfát.

Navíc aplikace pregnanolon-sulfátu v důsledku enzymové aktivity v CNS nevede k zlepšení sledovaných funkcí. Námi předkládané molekuly představují sulfatasami nehydrolyzovatelné analogy·

Dále se tento vynález týká způsobu výroby shora uvedených derivátů pregnanolonu substituovaných v poloze Šalfa obecného vzorce 1, kde R¹ znamená jak shora uvedeno. Pri výrobě sloučenin uvedeného vzorce I, v němž R^l znamená jak shora uvedeno a R⁵ znamená atom kyslíku, se vychází ze 3alfa-hydroxy-5beta-pregnan-20-onu vzorce 11

Tato sloučenina vzorce II se může převést na sloučeninu obecného vzorce I, kde R¹ znamená jak shora uvedeno a R⁴ znamená atom kyslíku, následujícím způsobem. Příslušná dikyselina, popřípadě chráněná na aminové skupině a popřípadě chráněná na jedné karboxylové skupině, se rozpustí ve vhodném rozpouštědle, kterým se ze směsi mohou oddestilováním odstranit zbytky vody, s výhodou v benzenu nebo toluenu, nejvýhodněji v benzenu. Po odstranění vody oddestilováním části rozpouštědla se reakční směs, ke které je zabráněn přístup vody, ochladí na laboratorní teplotu. Pod inertní atmosférou se pomalu přidá kondenzační činidlo, s výhodou dicyklohexylkarbodiimid (DCC) a roztok sloučeniny vzorce II ve vhodném rozpouštědle, s výhodou v aromatickém uhlovodíku, výhodněji v benzenu nebo toluenu, nej výhodněji v benzenu za přítomnosti katalytického činidla, s výhodou dimethylaminopyridinu (DMAP). Tato reakční směs se míchá 10 až 48 hodin, s výhodou přes noc, za teploty od 0 do 50 °C, s výhodou za teploty místnosti. Druhý den se směs nalije do nasyceného vodného roztoku hydrogenuhličitanu, s výhodou NaHCOi nebo KHCO₃, a produkt se extrahuje organickým rozpouštědlem, ve kterém je dobře rozpustný, například a s výhodou ethylacetátem, a spojené organické fáze se promývají vodou do odstranění přítomného hydrogenuhličitanu. Vysrážená Ν,Ν’-dicyktohexylmočovina se odfiltruje, filtrát se vysuší sušicím činidlem, s výhodou síranem hořečnatým nebo síranem sodným, nej výhodněji síranem sodným, a rozpouštědlo se odpaří, s výhodou oddestilováním ve vakuu. Získaný produkt se popřípadě přečistí, s výhodou chromatografií na sloupci silikagelu. Takto se získá sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená skupinu obecného vzorce R³OOC-R²-COO-, kde R² znamená alkylovou nebo alkenylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku s přímým nebo větveným uhlíkovým řetězcem, které mohou být substituovány jedním nebo více atomy halogenu, aminovou skupinou, která je chráněná chránící skupinou, a R³ znamená H nebo chránící skupinu karboxylové skupiny, s výhodou benzylovou skupinu.

-4CZ 303037 B6

Pokud ve sloučenině vzorce I symbol R³ znamená benzylovou chránící skupinu, je nutné odstranění této chránící skupiny, které se provádí tak, že se získaná sloučenina rozpustí ve vhodném rozpouštědle, s výhodou v alkoholu, nejvýhodněji v methanolu, a k tomuto roztoku se přidá hydrogenační katalyzátor, s výhodou Pd/CaCO3 a zavede se vodík. Po hydrogenací se katalyzátor odfiltruje a rozpouštědlo se odpaří. Získá se tak produkt obecného vzorce I, v němž R¹ znamená skupinu obecného vzorce ROOC-R COO-, kde R² znamená alkylovou nebo alkenylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku s přímým nebo větveným řetězcem, které mohou být substituovány jedním nebo více atomy halogenu, aminovou skupinou, kteráje chráněná chránící skupinou, a R³znamená atom vodíku.

Pokud získaná sloučenina obecného vzorce I, v němž R¹ znamená skupinu obecného vzorce R³OOC~R²-COO-, kde R² znamená alkylovou nebo alkenylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku s přímým nebo větveným uhlíkovým řetězcem, které mohou být substituovány jedním nebo více atomy halogenu, aminovou skupinou, která je chráněná chránící skupinou, a R³ znamená atom vodíku, obsahuje aminovou skupinu, kteráje chráněná chránící skupinou, provede se v následujícím stupni odblokování chránění aminové skupiny, a to tak, že se tato sloučenina rozpustí v organickém rozpouštědle, s výhodou v dichlormethanu, a přidá se trifluoroctová kyselina. Tato směs se nechá reagovat 0,1 až 48 hodin, s výhodou 16 hodin, při teplotě v rozmezí od 0 do 50 °C, s výhodou za teploty místnosti. Po ukončení reakce se odstraní rozpouštědla, odparek se opět rozpustí v organickém rozpouštědle, s výhodou v methanolu, přidá se pyridin a směs se odpaří dosueha. Získá se tak produkt obecného vzorce I, v němž R¹ znamená skupinu obecného vzorce ROOC-R²-COO-, kde R² znamená alkylovou nebo alkenylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku s přímým nebo větveným uhlíkovým řetězcem, které mohou být substituovány jedním nebo více atomy halogenu, aminovou skupinou, a R³ znamená atom vodíku.

Pokud R² obsahuje heterocvklickou skupinu, jako je tomu například ve sloučenině následujícího vzorce III

může být do molekuly obecného vzorce 1 zavedena například reakcí aktivované karboxylové skupiny s aminovým substituentem na alkylovém řetězci R². Karboxylová skupina může být funkcionalizována aktivační skupinou (např. hydroxybenzotriazolovou, substituovaným hydroxybenzotriazolem, O-(7-azabenzotriazol-1 -y 1)-/V. N_fNjV ’-tetramethy íuronium-hexafluorfosfátem, O-P-azabenzotriazol-l-ylj-W.XjV',#-tetramethyluronium-tetrafluoroboritanem a s výhodou ;V,.V..V’,A⁷’ tetramethyl O-(N-sukcinimidyl)uronium tetrafiuoroboritanem jako je sukcinimidyl ester). Tento ester reaguje se sloučeninou obecného vzorce I, v němž R² znamená alkylovou skupinu substituovanou aminovou skupinou. Opět se tak získá sloučenina obecného vzorce 1, v němž R² znamená alkylovou skupinu substituovanou aminovou skupinou s navázanou heterocyklickou skupinou (III).

-5 CZ 303037 B6

Analogickým způsobem může zručný odborník z oblasti techniky připravit obdobné sloučeniny obecného vzorce l, v němž R² znamená jak shora uvedeno.

Thiosloučeniray a amidy mohou být připraveny analogickými postupy z látek obecného vzorce L kde R znamená atom síry (například jak popisují Swan, Turnbull, Tetrahydron 22, 1966, str. 231), případně atom dusíku (například jak popisují Schmitt J., Panouse J.J., Hallot A., Pluchet H., Comoy P.: Bull Soc. Chim. France 1962, str. 1846).

Dalším předmětem tohoto vynálezu ie použití derivátů pregnanolonu substituovaných v poloze 3alfa obecného vzorce I, kde R¹ znamená jak shora uvedeno, pro výrobu léčiva pro léčení neuropsychiatrických poruch souvisejících s dysbalancemi glutamátergního neuropřenašečového systému, zvláště ischemického poškození CNS, neurodegenerativní změny a poruchy CNS, afektivní poruchy, deprese, PTSD a nemocí souvisejících se stresem, anxietu, schizofrenie a psychotické poruchy, bolesti, závislosti, roztroušené sklerózy, epilepsie, gliomů.

Různé strukturální modifikace námi připravených sloučenin obecného vzorce I ukázaly pouze minimální rozdíly v biologické účinnosti, tyto nálezy potvrzují předchozí elektroíyziologické výsledky (patch-clamp) sledující kinetiku vazby těchto látek na NMDA receptory. Proto jsme vybrali molekulu pregnanolon-glutamátu z příkladu 9 [dále: sloučenina z příkladu 9; sloučenina obecného vzorce 1, v němž R¹ znamená skupinu -OCO-CH(NH₂)-(CH2)2-COOH], Tu jsme podrobili podrobnému testování jednak v souvislosti s jejím neuroprotektivním působením na excitotoxickou hipokampální lézí (pomocí NMDA; sloučenina z příkladu 9), jednak testování potenciálního vlivu a chovám při aplikaci této sloučeniny samotné a jejího srovnání s látkou známou z odborné literatury, dizocílpinem, nekompetitivním agonistou NMDA receptorů, který sice vykazuje ve specifických uspořádáních neuroprotektivní účinky, ale rada důkazů z literatury, dokazuje jeho výrazné psychotomimetické vedlejší účinky ve zvířecích modelech.

Biologická aktivita na buněčných kulturách

Primárně disociované hipokampální kultury byly připraveny z 1 až 2 denních potkanů. Zvířata byla dekapitována a následně byl izolován hipokampus. Buněčná suspenze byla připravena rozvolněním pomocí trypsinu a mechanické disociace. Buňky byly nasazeny na 25mm nebo t2mm póly lys i nem potažená krycí sklíčka v hustotě 500 000 buněk/cm². Neuronální kultury byly udržovány v médiu Neurobasal™-A (Invitrogen, Carlsbad, USA) doplněného glutaminem (0,5 mM) a doplňkem B-27 Serum-Free Supplement (Invitrogen) při 37 °C a 5 % CO₂.

HEK293 buňky (American Type Culture Collection, ATTC No. CRL1573, Rockville, MD) byly kultivovány v médiu Opti-MEM® I (Invitrogen) s přídavkem 5% fetálního telecího séra při 37 °C a transfekovány NRl la/NR2B/GFP plazmidy, jak bylo popsáno drive (Cais et al., 2008). Stejná množství (0,3 gg) cDNA kódující NR1, NR2 a GFP (green fluorescent protein) (pQBI 25, Takara, Japonsko) byla smíchána s 0,9 gl Matra-A Reagent (1BA, Gottingen, Německo) a přidána ke konfluentním HEK293 buňkám kultivovaným v 24-jamkové destičce. Po trypsinizaci byly buňky resuspendovány v Opti-MEM® I obsahujícím 1% fetální telecí sérum. Do směsi bylo dále přidáno 20 mM MgCl·, 1 mM D,L-2-amino-5~fosfonopentanové kyseliny, 3 mM kynurenové kyseliny, ketamin a buňky byly nasazeny na póly lysině m potažená krycí sklíčka o průměru 25 mm. Pro transfekci byly použity následující geny kódující podjednotky NMDA receptorů: NR1-1 a (GenBank accession no. U08261) a NR2B (GenBank accession no, M91562).

Pro elektroíyziologické pokusy byly použity 5 až 10 dní staré hipokampální kultury nebo kultury HEK.293 buněk 16 až 40 hodin po transfekci. Proudy vzniklé při snímání z celé buňky byly měřeny pomocí patch-clamp zesilovače (Axopatch ID; Axon Instruments, lne. FosterCity, USA) po kompenzaci kapacity a sériového odporu (<10ΜΩ) na 80 až 90%). Agonistou indukované odpovědi byly filtrovány na 1 kHz (filtr 8-pole Bessel; Frequency Devices, Haverhill, USA), digitalizovány při 5 kHz a analyzovány softwarovým programem pClamp verze 9 (Axon Instruments). Borosilikátové mikropipety byly naplněny intracelulámím roztokem, který obsahoval

-6CZ 303037 B6

125 mM D-glukonové kyseliny, 15 mM chloridu česného, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 3 mM chloridu hořečnatého, 0,5 mM chloridu vápenatého a 2 mM horečnaté soli ATP (pH upraveno na 7,2 roztokem hydroxidu česného). Extracelulámí roztok (ECS) obsahoval 160 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu draselného, 10 mM HEPES, 10 mM glukózy, 0,2 mM EDTA a 0,7 mM chloridu vápenatého (pH upraveno na 7,3 roztokem hydroxidu sodného). Glycin byt přidán jak do testovacího, tak do kontrolního roztoku. K hipokampálním kulturám byl ještě navíc přidán bicuculin (10 μΜ) a tetrodotoxin (0,5 μΜ). Roztoky se steroidem byly připraveny z čerstvě připraveného zásobního roztoku (20 mM) steroidu rozpuštěného v dimethylsulfbxidu (DMSO). Ve všech extracelulámích roztocích byla použita stejná koncentrace DMSO. Kontrolní a testovalo cí roztoky byly aplikovány mikroprocesorem kontrolovaným systémem promývání, s rychlostí výměny roztoku v okolí buňky přibližně 10 ms.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: znázorňuje proudové odpovědi vyvolané aplikací 1 mM glutamátu a vlivu neurosteroidu z příkladu 9, aplikovaného v koncentraci 200 μΜ současně s glutamátem. Snímání bylo pořízeno technikou patch-clamp zkultivovaných HEK293 buněk transfekovaných NR1/NR2B receptory. Míra inhibice vyvolaná neurosteroidem byla vypočtena podle vzorce: (l a/b). 100 (%).

Obrázek 2: Horní panel. Celková ušlá dráha vynesená na ose y jako měřítko spontánní pohybové aktivity v testu otevřeného pole se nelišila mezi kontrolními zvířaty a těmi, jimž byla aplikována samotná sloučenina z příkladu 9.

2? Obrázek 2: Dolní panel, Prepulzní inhibice úlekové reakce (v procentech, na ose y) rovněž nebyla signifikantně ovlivněna aplikací samotné sloučeniny z příkladu 9,

Obr. 3 ukazuje celkovou ušlou dráhu (v metrech, na ose y) za každé sezení v úloze AAPA, a to po aplikaci dizocilpinu a sloučeniny z příkladu 9.

* značí signifikantní rozdíl oproti kontrolám (P < 0,05).

Obr. 4 ukazuje počet vstupů do zakázané oblasti (vynesený na ose y) jako měřítko kognitivních funkcí za každé sezení v úloze AAPA, a to aplikaci dizocilpinu a sloučeniny z příkladu 9.

* značí signifikantní rozdíl oproti kontrolám (P < 0,05), statistické rozdíly byly vyhodnocovány v posledním sezení, kdy je přítomná asymptotická úroveň u kontrol,

Obr. 5 ukazuje maximální dobu vyhýbání (v sekundách na ose y) jako měřítko kognitivních funk40 cí za každé sezení v úloze AAPA, a to aplikaci dizocilpinu a sloučeniny z příkladu 9.

* značí signifikantní rozdíl oproti kontrolám (P < 0,05), statistické rozdíly byly vyhodnocovány v posledním sezení, kdy je přítomna asymptotická úroveň,

Obr. 6 ukazuje vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,01 mg/kg na počet vstupů (vynesený na ose y) během následného testování v úloze AAPA.

* P<0,05 vzhledem k samotnému NMDA, * P<0,05 vzhledem ke kontrolám, ** P<0,01 vzhledem ke kontrolám.

Obr. 7 ukazuje vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,01 mg/kg na maximální čas vyhýbání (v sekundách na ose y) během následného testování v úloze AAPA.

* P<0,05 vzhledem k samotnému NMDA, * P<0,05 vzhledem ke kontrolám, ** P<0,01 vzhledem ke kontrolám,

-7CZ 303037 Β6

Obr. 8 znázorňuje vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,1 mg/kg na počet vstupů (vynesený na ose y) do zakázané oblasti během následného testování v úloze AAPA. * P < 0,05 vzhledem ke kontrolám.

Obr. 9 znázorňuje vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,1 mg/kg na maximální čas vyhýbání během následného testování v úloze AAPA.

Obr. 10 znázorňuje vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 10 mg/kg na celkový počet vstupů do zakázané oblasti během následného testování v úloze AAPA. # P < 0,05 vzhledem k samotnému NMDA, * P < 0,05 vzhledem ke kontrolám.

Obr. 11 znázorňuje vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 10 mg/kg na maximální čas vyhýbání ze sezení během následného testování v úloze AAPA. # P <0,05 vzhledem k samotnému NMDA, * P < 0,05 vzhledem ke kontrolám.

Příklady provedení vynálezu

Syntéza 20-oxo-5p-pregnan-3a-yl (2S)-4-{benzyloxy)-2-[(/e/*c-butoxykarbonyl)amino]—4oxo-butanoátu

Sloučenina vzorce II (320 mg, 1 mmol), a Boc-Asp(OBzl)-OH (345 mg, 1,1 mmol) v 50ml baňce byly rozpuštěny v čerstvě sušeném benzenu (35 ml) jehož část (6 ml) byla poté oddestilována. Po vychlazení na laboratorní teplotu byl pod argonem do směsi přidán 4-dimethylaminopyridin (4 mg) a dicyklohexylkarbodiimid (550 mg, 2,18 ekv.) v suchém benzenu (3 ml) a reakční směs byla míchána přes noc. Druhý den byla směs nalita do nasyceného vodného roztoku NaHCO₃(40 ml), produkt byl extrahován EtOAc (3 x 30 ml) a spojené organické fáze byly 2x promyty vodou (po 10 ml). Vysrážená Ν,Ν’-dicyklohexylmočovina byla odfiltrována, filtrát byl sušen Na₂SO₄ a rozpouštědla byla odpařena ve vakuu. Další podíl Ν,Ν’-dicyklohexylmočoviny byl odkrystalován a odsát, filtrát s produktem byl po odpaření rozpouštědla nanesen na sloupec silikagelu (20 g) a chromatografován v soustavě PeAe-Et₂O 9:1. Titulní sloučenina byla získána odpařením rozpouštědel jako nekry stal i zující bílá tuhá pěna (582 mg; 93 %), [a]_D +82,0 (c 0,36).

vs, br (aspartát), 1702 vs (-€OCH₃, -NHBoc); v(N-H); 3438 w, 1499 s (amid); v(C O): 1232 s (aspartát), 1166 vs (-NHBoc); 5_S (-CH₃): 1368 s (-/-Bu); v(ring): 1455 m (-Bzl). Pro C₃₇H₅₃NO₇ (623,8) vypočteno: 71,24 % C, 8,56 %, 2,25 % N; nalezeno: 71 ?40 % C, 8,70 % H, 2,18 % N.

Příklad 2

20-Oxo-5p-pregnan-3a-yl N-(/erc-butoxykarbonyl) L-aspartyl 1-ester

Sloučenina získaná podle předcházejícího příkladu 1 (565 mg, 0,906 mmol) byla rozpuštěna v absolutním MeOH (7 ml) a k roztoku bylo přidáno 5% Pd/CaCO₃ (56 mg). Po osmihodinové hydrogenaci za intenzivního míchání a mírného přetlaku vodíku (10 mbar) byla reakce ukončena.

Katalyzátor byl odfiltrován, produkt z filtrátu byl po odpaření rozpouštědla rozpuštěn v Et₂O a napěněn. Takto byla získána čistá bílá pěna titulní sloučeniny (484 mg, 100%), [ct]_D +87,0 (c0,49). 'HNMR 400 MHz, CD₃OD): δ 0,60 (s, 3H, H-l8); 0,92 (s, 3H, H-19); 1,45 (s, 9H, /Bu-O); 2,12 (s, 3H, H-21); 2,52 (t, IH, J, = 8,9, H-l7); 2,63-2,67 (m, 2H, H-3a’,3b’); 4,45 (t, 1H, H-2’); 4,65—4.73 (m, 1 Η, H-3). IR (CHCh): v(C=O): 1742 s,sh (aspartát, - COOH mono-8CZ 303037 B6 mer), 1715 vs (-COOH dimer), 1703 vs (-COCH₃, -NHBoc); v(N-H): 3439 m; v(C-N, amid) 1500 s; v(C-O): 1235 s, 1194 s (aspartát), 1161 s (NHBoc); ó_s (-CH0: 1369 s (í-Bu-O). Pro C₃₍)H₄₇NO₇ (533,7) vypočteno: 67,51 % C, 8,88 % H, 2,62 % N; nalezeno: 67,90 % C, 9,01 % H,

2,55 %N.

Příklad 3

20-Oxo-5[3-pregnan-3a-yl L-aspartyl l ester

Sloučenina získaná podle předcházejícího příkladu 2 (465 mg, 0,871 mmol) byla rozpuštěna v dichlormethanu (10 ml) a za míchání byla prikapána trifluoroctová kyselina (1 ml, 13,4 mmol,

15,5 ekv.). Směs byla 2 hodiny míchána při teplotě místnosti a poté byla ponechána přes noc při 5 °C. Druhý den byla reakční směs odpařena 3x s benzenem, rozpuštěna ve směsi pyridinu (1 ml) a MeOH (1 ml), znovu odpařena, rozpuštěna v chloroformu a vytřepána s vodou. Organická fáze byla sušena bezvodým Na₂SO₄, rozpouštědla byla odpařena na odparce. Olejovitý odparek byl rozpuštěn v Et₂O jehož odpařením byla získána bílá pěna titulní sloučeniny (370 mg, 98 %), [a]_D+ 132 (c 0,11, MeOH-CHCh 1:1). *H NMR (400 MHz, (CDC1₃): 0,60 (s, 3H, H-18); 0.94 (s,3H, H-19); 2,12 (s,3H, H-21); 2,56 (t, IH, J, - 8,8, H-17); 2,77 (dd, IH, J, = 17,0; J, = 8,1, H-3b’); 2,88 (bd, IH, Ji = 17,0, H-3a’); 4,00-4,07 (bm, IH, H-2’); 4,78-1,86 (bm, H, H-3). IR (KBr): v(C=O): 1746 a (aspartát), 1707 vs (-COCH₃); v(C-O): 1215 s (aspartát); v(NH₃ ⁺): 2121 vw, br; v(COO ): 1616 s, br. pro C₂₅H₃₉NO₅ (433,5) vypočteno: 69,25 % C, 9,07 % H, 3,23 % N; nalezeno: 69,01 % C, 9,23 % H, 3,05 % N.

Podle shora uvedených postupů byl ze sloučenin, které jsou uvedeny na počátku každého příkladu, připraveny příslušné titulní sloučeniny následujících příkladů 4 až 12.

Příklad 4

20-Oxo-5(3-pregnan~3ct-yl (3S)-4~(benzyloxy)~3-[(terc-butoxykarbonyl)amino]-4-oxobutanoát

Sloučenina vzorce II (1 mmol) a Boc-Asp(OBzl) (1,1 mmol) poskytla zpracováním podle příkladu 1 titulní sloučeninu, [a]_D +92,5 (c 0,24). ⁽H NMR (400 MHz, CDOD): 0,59 (s, 3H, CH₃-18); 0,92 (s, 3H, H-19); 1,44 (s 9H, /-Bu-O); 2,11 (s 3H, H-21); 2,53 (t, IH, J, = 8,8, H-17); 2,79 (dd, IH, J, = 16,8; J₂ = 4,6, H-3b’); 2,98 (bdd, IH, J, = 16,8, J₂ = 4,6, H-3a’); 4,60-4,65 (bm, IH, CH-2’); 4,64-4,73 (m, IH, H-3); 5,13-5,23 (m, 2H, CH₂-benzyl); 5,50 (bd, IH, J, = 8,8 HN); 7,30-7,36 (m, 5H, fenyl). IR (CHC1₃): v(C=O): 1717 vs, sh (aspartát), 1703 vs (-OOCH₃, -NHBoc); v(N-H): 3439 w, 1499 s (amid); v(C-O): 1163 vs (-NHBoc); δ₅ (-CH₃): 1380 s (/Bu); v(ring): 1455 m (-Bzl). Pro C₃₇H₅₃NO₇ (623,8) vypočteno: 71,24 % C, 8,56 % H, 2,25 % N; nalezeno: 70,91 % C, 8,74 % H, 2,52 % N.

Příklad 5

20-0x0- 5β- pregnan-ja-yl N-(/crc-butoxykarbonyl)-L-aspartyl T ester

Sloučenina z předcházejícího příkladu 4 poskytla obdobným zpracováním jako v příkladu 2 titulní sloučeninu: [a]_D +96,3 (c 0,20). 'HNMR (400 MHz, CD₃OD): δ 0,60 (s, 3H, 11-18): 0,93 (s, 3H, H-19); 1,46 (s, 9H, z-Bu-O); 2,11 (s, 3H, H-21); 2,52 (t, IH, J, = 8,9, H-17); 2,81 (dd, IH, J, = 17,0; J, =5.2 H-3b’); 3,00 (dd, IH, J, = 16,9; J, = 4,7 H-3a’): 4,56-4,64 (m, IH, H-2^-); 4,70-4,82 (m, IH, H-3), 5,55 (d, IH. J = 7,9, HN). IR (CHCI,): v(C=O): 1716 vs, 1703 vs (-COCH3, -NHBoc); 3439 w, 1501 s (amid); v(N-H): 1232 s, 1193 a (aspartát), 1160 s

-9CZ 303037 B6 (-NHBoc); 5_S (-CH_;): 1386 s (-/-Bu). Pro C₃₀H₄₇NO₇ (533,7) vypočteno: 67,51 % C, 8,88 % H, 2,52 % N; nalezeno: 67,25 % C, 9,15 % H, 2,90 % N.

Příklad 6

20-Oxo-5|3-pregnan-3a-yl L-aspartyl 4-ester

Sloučenina 7 předcházejícího příkladu 5 poskytla zpracováním podle příkladu 3 titulní sloučeninu, [a]_D +91.5 (c 0,24; ve směsi MeOH:CHCl₃ 1:1). 'HNMR (400 MHz, CDC1₃): 0,60 (s, 3H, H-l 8); 0,95 (s, 3H, H-l9); 2,12 (s, 3H, H-21); 2,54 (m, 3H, H-l 7); 2.86-3,08 (bm, 2H, H-3b\ H-3a’); 3,86-3,98 (bm, IH, H-2⁵); 4,72-4,80 (bm, H, H~3); 8,00 (s, IH, HN). IR (CHC13): v(C-O): 1721 s (aspartát), 1720 vs (-COCH3); v(C-O): 1215 s (aspartát); v(NH3⁺):1621 s, br. Pro C25H₃₉NO₅ (433,5) vypočteno: 69,25 % C, 9,07 % H, 3,23 % N; nalezeno: 69,25 % C, 9,15 %H, 3,54 % N.

Příklad 7

20-0x0-5P-pregnan-3a-yl (2S)-5-(benzyloxy>-2-[(Zerc-butoxykarbonyl)amino]-5-oxopentanoát

Sloučenina vzorce II (1 mmol) a Boc-GIu(OBzl)-OH (1,1 mmol) poskytly reakcí podle příkladu 1 titulní sloučeninu, [<x]_D +70,9 (c 0,35). ‘HNMR (CDC1₃) δ 0,60 (s, 3H, CH₃-18); 0,93 (s, 3H, H-19); 1,44 (s 9H, z-Bu-O); 2,12 (s 3H, H-21); 2,52 (t, IH, J, - 8,9, H-l7); 2,88 (dd, IH, J,- 16,8; J₂ = 4,5); 3,03 (bdd, IH, J, = 16,8; J₂ = 4,5); 4,50-4,55 (bm, IH, CH-2’); 4,71^,79 (m, IH, H-3); 5,10-5,17 (m, 2H, H-benzyl); 5,48 (bd, IH, J, = 8,6 HN); 7,31-7,40 (m, 5H, fenyl). IR (CHC1₃): v(C=O): 1732 vs, br (glutamát), 1702 vs (-C0GH₃, -NHBoc); v(N-H): 3438 w, 1499 s (amid); v(C-O); 1232 s(glutamát), 1166 vs (-NHBoc). Pro C₃₈H₅₅NO₇ (637,8) vypočteno: 71,55 % C, 8,69 % H, 2,20 % N; nalezeno: 71,87 % C, 8,42 % H, 2,06 % N.

Příklad 8

20-Oxo-5 p-pregnan-3a-yl N-(Zerc-butoxykarbonyl)-L-glutamyl 1-ester

Sloučenina z předcházejícího příkladu 7 poskytla obdobným zpracováním jako v příkladu 2 titulní sloučeninu. ‘HNMR (400 MHz, CD₃OD): δ 0,60 (s, 3H, H-18); 0,92 (s, 3H, H-19); 1,45 (s, 9H, z-Bu-O); 2,12 (s, 3H, H-21); 2,52 (t, IH, J, = 8,9, H-l7); 2,63-2,67 (m, 2H); 4,45 (t, IH); 4.65-4,73 (m, IH, H-3). IR (CHCl₃): v(C=O): 1742 s, sh (glutamát, -COOH monomer), 1715 vs (-COOH dimer), 1703 vs (~COCH₃, -NHBoc); v(N-H): 3439 m; v(C-N, amid) 1500 s; v(C-O); 1235 s, 1194 s (glutamát), 1161 s (-NHBoc); ó_s (-CH₃): 1369 s (-Z-Bu). Pro C₃iH₄₉NO₇ (547,7) vypočteno; 67,98 % C, 9,02 % H, 2,56 % N; nalezeno: 67,75 % C, 9,39 % H, 2,73 % N.

Příklad 9

20-0x0-5p-pregnan-3a-yl L-glutamyl 1-ester

Sloučenina z předcházejícího příkladu 8 poskytla obdobným zpracováním jako v příkladu 3 titulní sloučeninu. 'H NMR (400 MHz, CDC1₃): 0,60 (s, 3H, H-18); 0,94 (s, 3H, H-19); 2,12 (s, 3H, H-21); 2,56 (t, IH, J, = 8,8, H-l7); 2,77 (dd, IH, J, = 17,0; J₂ 8,1); 2,88 (bd, 1H, J, = 17,0); 4.00-4,07 (bm, IH, H-2’); 4,78-4,86 (bm, 2H, H-3). IR (KBr): v(C=O); 1746 s (glutamát), 1707 vs (-COClh); v(C-O): 1215 s (glutamát); v(NH₃ ⁺): 2121 vw, br; v(CO<): 1616 s, br. Pro

- 10CZ 303037 Bó

C26H41NO5 (447,6) vypočteno: 69,77 %, 9,23 % H, 3,11 % N; nalezeno: 69,46 % C, 9,49 % H, 3,51 %N.

Příklad 10

20-Oxo-5(3-pregnan-3a-yl (4S)-5-(benzyloxy)-4-[(/erc-butoxykarbonyl)amino]-5-oxopentanoát

Sloučenina vzorce II (1 mmol) a Boc43lu(OBzl) (1,1 mmol) poskytly reakcí podle příkladu 1 titulní sloučeninu, [a]o +64 (c 0,28). 'HNMR (CDCb): 6 0,60 (s, 3H, CH3-I8); 0,93 (s, 3H, CH,-19); 1,44 (s 9H, ř-But); 2,12 (s, 3H, CHi-21); 2,38-2,5 (m, 2H, 2,56 (t, IH, J, =

8,9, H-17); 4,25-4,35 (bm, IH, H-2’); 4,68-4,74 (m, 2H, H-l); 5,10-5,17 (d, IH, J - 7,9, NH); 5,18-5,22 (m, 2H, H-benzyl); 7,28-7,40 (bm, 5H, fenyl). IR (CHCI,): v(C-O): 1730 vs, (ester), 1702 vs (-COCH3, -NHBoc); 1164 vs (-NHBoc); ó_s (-CH₃): 1368 s (-Z-Bu); v(kruh): 1451 m (-Bzl). Pro C38H55NO7 (637,8) vypočteno: 71,55 % C, 8,69% H, 2,20% N; nalezeno: 71,27% C, 8,75 % H, 2,32 % N.

Příklad 11

20-Oxo-5[3-pregnan-3a-yl N- (/erc-butoxvkarbonyl)-L-gIutamyl 5-ester

Sloučenina z příkladu 10 poskytla reakcí podle příkladu 2 titulní sloučeninu, [a]_D +80,0 (c 0,31). 'H NMR (400 MHz, CDjOD): δ 0,63 (s, 3H, CH₃-18); 0,99 (s, 3H, CH,-19); 1,45 (s, 9H, í-But); 2,13 (s, 3H, CH₃—21); 2,52 (t, IH, J, - 8,9, H-17); 2,87 (dd, IH, J = 10,2, Γ = 3); 3,04 (dd, IH, J = 10,2, J’ = 3); 4,47 (t, IH, H-2’); 5,22-5,28 (m, IH, NH); IR (CHCIj); v(C=O): 1730 s, sh (ester), 1710 vs (-NHBoc), 1700 vs (-COCH₃); v(N-H) 3436 w; v(C-N, amid) 1501 s; v(C-O) 1163 s ((-NHBoc), 5_S (~CH₃). Pro C₃,H„NO₇ (547,7) vypočteno: 67,98 % C, 9,02 % H, 2,56 % N; nalezeno: 67,59 % C, 9,23 % H, 2,93 % N.

Příklad 12

20-Oxo-5p-pregnan-3a-yl l.glutamyl 5-ester

Sloučenina z předchozího příkladu 11 poskytla reakcí podle postupu uvedeného v příkladu 3 titulní sloučeninu, [a]_D +93,7 (c 0,26, MeOH~CH₃OH 1:1). 'H NMR (400 MHz, CDC1₃): 0,60 (s, 3H, H-18); 0,94 (s, 3H, H-19); 2,12 (s, 3H, H-21); 2,56 (t, IH, J, - 8,8, H-17); 2,50-2,60 (m, IH, H-3a’); 3,85-3,87 (m, IH, H-2’); 4,78-4,86 (bm, IH, H-3); 7,35-7,40 (m, IH, NH). IR: v(C=O): 1732 s (glutamát), 1703 vs (-COCH₃); v(C-O): 1215 s (glutamát); 2100 vw, br, v(COO~): 1616 s, br. Pro C₂₆H4iNO₅ (447,6) vypočteno: 69,77 % C, 9,23 % H, 3,13 % N; nalezeno: 69,39 % C, 9,53 % H, 3,40 % N.

Příklad 13

CPOxo-5 p-pregnan-3a-yl adipyl 1-ester

K roztoku kyseliny adipové (300 mg, 2 mmol) v 10 ml suchého THF byl přidán dicyklohexylkarbodiimid (410 mg, 2 mmol) v 10 ml suchého benzenu. Směs byla míchána 1 h pod argonem. Poté byl za míchání během 15 min přikapán roztok sloučeniny vzorce II (3a-hydroxy-5p-pregnan-20~onu) (320 mg, 1 mmol) a dimethylaminopyridinu (10 mg, 0,08 mmol) v 10 ml suchého benzenu. Reakční směs byla míchána za laboratorní teploty 16 h. Poté byla rozpouštědla odpaře-IICZ 303037 Β6 na. Chromatografii odparku na sloupci silikagelu ve směsi petrolether-ether 9:1 bylo získáno 350 mg, 78 % nekrystalizujícího hemiesteru [a]_D +89 (c 0,49). 'HNMR: δ 0,60 (s, 3H, (H-18); 0,92 (s, 3H, H-19); 2,11 (s, 3H, H-21); 2,30 (m, 2H, W-20, H-adipát); 2,37 (m, 2H, W~20, Hadipát); 2,53 (t, IH, J = 9, H-17); 4,73 (m, IH, W-35, H-3). IR: 1727, 1706 (C=O); 1358 (CH_?CO); 1233, 1193, 1183 (CO). Pro C27H42O5 (446,6) vypočteno: 72,61 % C, 9,48% H; nalezeno: 72,13 % C, 9,53 % H.

Stejným postupem jako v příkladu 13 byly připraveny sloučeniny uvedené v příkladech 14 až 16 s tím, že se místo kyseliny adípové použije v příkladu 14 kyselina pimelnvá (heptandiová), v příkladu 15 kyselina suberová (korková, oktandiová) a v příkladu 16 kyselina fumarová (2(E>— butendiová).

Příklad 14

200xo-5(3-pregnan-3ct-yl 6-karboxy hexanoát

Olej, [a]_D +72,3 (c 0,33). *H NMR: δ 0,60 (s, 3H, (H-l8); 0,93 (s, 3H, H-19); 2,11 (s, 3H H-21); 2,30 (m, 2H, W-20, H-pimelát); 2,37 (m, 2H, W-20, H-pimelát); 2,53 (t, IH, J = 8,8); 4,74 (m, 1H, W = 35, H-3). MS: (ESI): 460 (4 %, M), 442.

Příklad 15

Όχο-5β—pregnan-3a-yl 7-karboxyheptanoát

Olej, 'HNMR: δ 0,60 (s, 3H, (H-l8); 0,92 (s, 3H, H-19); 2,11 (s, 3H H-21); 2,30 (m, 2H, W20, H-suberát); 2,37 (m, 2H, W-20„ H-suberát); 2,54 (t, IH, J = 8,7); 4,73 (m, IH, W = 35, H3).

Příklad 16

200xo-5p-pregnan-3a-yl (E)-3-karboxyprop-2-enoát 'H NMR. δ 0,62 (s, 3H, H-18); 0,99 (s, 3H, H-19); 2,11 (s, 3H H-21); 2,53 (t, IH, J = 8, H-17); 4,77 (m, IH, W = 35, H-3); 6,69 (d, 2H, J= 14, H-fumarát). IR: 1723, 1702 (CO); 1358 (CH3CO); 1 181, 982 (CO); 1645 (CO). Pro C₂₅H_3ŮO₅ (416,6) vypočteno: 72,08 % C, 8,71 % H; nalezeno: 72,05 % C, 8,86 % H.

Příklad 17

20-Oxo-5 β-pregnan—3 α-y i (Z)-3-karboxyprop—2—enoát

Sloučenina vzorce II (100 mg, 0,31 mmol) byla rozpuštěna v pyridinu (0,5 ml), po ochlazení na 0 °C byl přidán 4—dimethylaminopyridin (1 mg) a anhydrid kyseliny maleinové (180 mg,

1,55 mmol). Reakční směs byla temperována na 40 °C a ponechána při ní 16 h. Poté byla nalita na led. Po jeho rozpuštění byl produkt extrahován do ethylacetátu (3 x 30 ml). Spojené organické fáze byly promyty vodným roztokem kyseliny citrónové (1%, 30 ml), vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného (5%, 20 ml) a vodou (30 ml). Poté byl roztok sušen bezvodým síranem sodným a odpařen na rotační odparce. Získaný odparek byl chromatografován na preparativní desce silikagelu (200x200x0,3 mm). Bylo získáno 116 mg (90%) titulního hemiesteru, 'H NMR: δ 0,62 (s, 3H, H-18); 0,99 (s, 3H, H-19); 2,11 (s, 3H, H-21); 2,67 (t, IH, J - 9, H-17);

- 12 CZ 303037 B6

4,77 (m, IH, w = 35, H-3); 6,77 (d, 2H, J = 6, H-maleinát). IR: 1275, 1705 (C=O); 1358 (CH₃C=O); 1172, 982 (C-O); 1645 (C=C). Pro C_2gH₃₆O₅ (416,6) vypočteno: 72,08 % C, 8,71 % H; nalezeno: 72,05 % C, 8,86 % H.

Stejným postupem byly připraveny i sloučeniny v příkladech 18a 19.

Příklad 18 io 2B-Oxo-5p-pregnan-3a-yl 3-karboxyperfluoropropanoát

Reakcí sloučeniny vzorce II (240 mg, 0,75 mmol) v pyridinu (5 ml) a perfluorosukcinanhydridu (645 mg, 3,75 mmol) byl získán olej. ^!HNMR: δ 0,60 (s, 3H, H-l8); 0,92 (s, 3H, H-19); 2,11 (s, 3H, H-21); 2,53 (t, IH, J = 8,7); 4,75 (m, IH, W = 35, H-3).

Příklad 19

20-Oxo-5p-pregnan-3a-yl 3-karboxy^-methyl-propanoát

Reakcí sloučeniny vzorce II (100 mg, 0,31 mmol), 4-dimethylaminopyridinu (3 mg, 0,03 mmol) a methyl-sukcinyl-anhydridu (170 mg, 1,5 mmol) byla získána titulní látka (jako směs isomerů), 'HNMR: δ 0,60 (s, 3H, H-l8); 0,93 (s, 3H, H-19); 2,11 (s, 3H, H-21); 2,30 (m, 2H, w~20, Hmethylpropanoát); 2,55 (t, IH, J = 8, H-l7); 4,75 (m, IH, w = 35, H-3). IR: 1712, 1702 (C=O);

1358 (CH,C-O); 1181, 987 (C-O). Pro C₃₆H4₀O₅ (432,6) vypočteno: 72,19% C; 9,32% H;

nalezeno: 71,88 % C, 9,70 % H.

Příklad 20

Konjugát vzorce III

Aktivní ester Alexa fluor 567 (sulfonovaný rhodaminový derivát ve formě sukcinimidylesteru, dodávaný firmou Molecular Probes) (57,3 mg, 64,1 μπιοί) a aspartát z příkladu 3 (33 mg, 1,2 ekv., 76,8 μπιοί) se rozpustí ve 3 ml dimethylsulfoxidu (DMSO) a 1 ml pyridinu. Směs byla ponechána při 40 °C 72 h. Po ukončení reakce podle kontroly pomocí HPLC byla rozpouštědla odpařena ve vakuu na olejové pumpě při 60 °C. Odparek byl dělen PLC ve směsi butanokmetha40 nokvoda (3:1:1) s 1 % (obj.) triethylaminu. Eluát byl spojen a vysušen za sníženého tlaku (1 mm). Bylo získáno 40,3 mg titulní sloučeniny, IR: 1648 s (CONH), 3360, 3300 (NH), 1246

- 13CZ 303037 B6 s(C-O, ester), 1731 (CO, kyselina), 1229 (SO,H), 1612, 1497, 1405 kruh. MS-ESI: 368,8 [63%, M-3H]'³; 553,7 [63%, M~2H]~²; 1130,1 [2%, M+Naf; 1146,1 [6%, M+K]⁺; (HR) pro [C58H67N3O15N2-2H] ² m/z vypočteno: 553,692856; nalezeno: 553,69231. 'HNMR (D2O, K₃CCh): 0,54 s, 3H (3 x H-l 8); 0,90 s, 3H (3 x H-19); 0,88-0,92 m (4CH,, rhodamin) 1,27 t, 9H, J - 7,0 (NCH2CH3); 2,12 s, 3H (3 x H -21); 3,60 t, 8H, J - 7,0 (NCJbCHs); 5,69 s, 2H, (H-l 1 +

21. rhodamin); 6,53 m, 4H, (4H-rhodamin); 7,33 d, 2H, J = 8,0 (H-6’ a H-2’, rhodamin); 8,19 d, 2H, J - 8,0 (H-3’ a H-5’, rhodamin).

Příklad 21

Vliv pregnano Ion sulfátu ajeho analogů na nativní a rekombinantní NMDA receptory

Primárně disociované hípokampální kultury byly připraveny z í až 2 denních potkanů. Zvířata byla dekapitována a následně byl izolován hipokampus. Buněčná suspenze byla připravena rozvolněním pomocí trypsinu a mechanické disociace. Buňky byly nasazeny na 25mm nebo 12mm polylysinem potažená krycí sklíčka v hustotě 500 000 buněk/cm². Neuronální kultury byly udržovány v médiu Neurobasal™-A (Invitrogen, Carlsbad, USA) doplněného glutaminem (0,5 mM) a B-27 Serum-Free Supplement (Invitrogen) při 37 °C a 5 % CO₂.

HEK293 buňky (American Type Culture Collection, ATTC No. CRL1573, Rockville, MD) byly kultivovány v médiu Opti-MEM® I (Invitrogen) s přídavkem 5% fetálního telecího séra při 37 °C a transfekovány NRl-la/NR2B/GFP plazmidy jak bylo popsáno dříve (Cais et al., 2008). Stejná množství (0,3 gg) cDNA kódující NR1, NR2 a GFP (green fluorescent protein) (pQBI 25, Takara, Japonsko) byla smíchána s 0,9 μΐ Matrar-A Reagent (1BA, Góttingen, Germany) a přidána ke konťluentním HEK293 buňkami kultivovaných v 24jamkové destičce. Po trypsinizaci byly buňky resuspendovány v Opti-MEM® 1 obsahujícím 1% fetální telecí sérum. Do směsi bylo dále přidáno 20 mM MgCU, 1 mM D,L-2-amino-5-fosfonopentanové kyseliny, 3 mM kynurenové kyseliny, ketamin a buňky byly nasazeny na polylysinem potažená krycí sklíčka o průměru 25 mm. Po transfekci byly použity následující geny kódující podjednotky NMDA receptorů: NRl-la(GenBank accession no. U08261) aNR2B (GenBank accession no. M91562).

Pro elektroťyziologické pokusy byly použity 5 až 10 dní staré hípokampální kultury nebo kultury HEK293 buněk 16 až 40 hodin po transfekci. Proudy vzniklé při snímání z celé buňky byly měřeny pomocí patch-clamp zesilovače (Axopatch ID; Axon Instruments, lne. Foster City, USA) po kompenzaci kapacity a sériového odporu (<10ΜΩ) na 80 až 90%). Agonistou indukované odpovědi byly filtrovány na 1 kHz (filtr 8-pole Bessel; Frequency Devices, Haverhill, USA), digitalizovány při 5 kHz a analyzovány softwarovým programem pClamp verze 9 (Axon Instruments). Borosilikátové mikropipety byly naplněny intracelulámím roztokem, který obsahoval 125 mM D-glúkonové kyseliny, 15 mM chloridu česného, 5 mM EGTA, 10 mM HEPES, 3 mM chloridu hořečnatého, 0,5 mM chloridu vápenatého a 2 mM hořečnaté soli ATP (pH upraveno na 7,2 roztokem hydroxidu česného). Extracelulámí roztok (ECS) obsahoval 160 mM chloridu sodného, 2,5 mM chloridu draselného, 10 mM HEPES, 10 mM glukózy, 0,2 mM EDTA a 0,7 mM chloridu vápenatého (pH upraveno na 7,3 roztokem hydroxidu sodného). Glycin byl přidán jak do testovacího, tak do kontrolního roztoku. K hipokampálním kulturám byl ještě navíc přidán bicuculin (10 μΜ) a tetrodotoxin (0,5 μΜ). Roztoky se steroidem byly připraveny z čerstvě připraveného zásobního roztoku (20 mM) steroidu rozpuštěného v dimethylsulfoxidu (DMSO). Ve všech extracelulárních roztocích byla použita stejná koncentrace DMSO. Kontrolní a testovací roztoky byly aplikovány mikroprocesorem kontrolovaným systémem promývání, s rychlostí výměny roztoku v okolí buňky přibližně 10 ms.

Proudové odpovědi vyvolané 100 μΜ NMDA (v případě hipokampálních neuronů) nebo 1 mM glutamátu (v případě rekombinantních NMDA receptorů) byly měřeny při udržovaném membránovém potenciálu -60 mV. V souladu s předchozími výsledky pregnanolonsulfát snížil amplitudu NMDA-indukované odpovědi. Při použití 100 μΜ pregnano Ion sul fátu byl průměrný inhibiční

- 14CZ 303037 B6 efekt 71,3 ± 5,0% (n = 5) odpovědí vyvolaných aktivací NMDA receptorů na hipokampálních neuronech a 67,2 ± 8,2 % (n = 5) na rekombinantníeh NR1/NR2B receptorech (Petrovic a spol., 2005). Syntetická analoga pregnanolon-sulfátu měla inhibiční efekt (obrázek 1) v koncentraci 50, 100 nebo 200 μΜ (tak aby míra inhibice byla v rozmezí 30 až 70% maximální inhibice). Relativí ní míra steroidem indukované inhibice byla použita pro výpočet IC₅₀. IC₅₀ byly vypočítány rovnicí RI = 1-(1/1 + ([steroid]/IC₅₀)^h), kde RI je relativní míra steroidem indukované inhibice a h je parametr Hillova koeficientu (1,2). Hodnoty IC₅o jsou uvedeny v následující tabulce.

Nově syntetizované analogy (z příkladů 1 až 20) mají stejný mechanismus působení na NMDA i o receptorech jako pregnanolon-sulfát, liší se však svou relativní afinitou (viz Tabulka 1).

Tabulka 1

testovaiMiJátkaálStóWrtBÍMí .(ařtkleoliřž;.	relativnímíro inhibice	IC50 frmol)	počet buněk;
Sloučenina z příkladu 3	83,6 ± 2,7	51	5
Sloučenina z příkladu 9	77,1 ± 5,2	73	5
Sloučenina z příkladu 20	36,3 ± 3,2	320	5
Sloučenina z příkladu 13	87,3 ± 8,9	40	4
Sloučenina z příkladu 17	81,6 ± 2,7	14	6
Sloučenina z příkladu 19	80,9 ±3,6	30	4
Sloučenina z příkladu 15	54,0 ± 10,8 %	175	5
Sloučenina z příkladu 14	61,5 ± 10,6 %	135	5

Výsledky tedy ukazují, že syntetizované analogy pregnanolon-sulfátu mají stejný mechanismus působení na NMDA receptorech jako pregnanolon-sulfát, liší se však svou relativní afinitou k NMDA receptorů. Vzhledem k etickému požadavku na minimalizaci počtu laboratorních zvířat použitých v pokusech jsme vybrali sloučeninu z příkladu 9 jako modelovou molekulu a studovali její vliv na chování zvířat a neuroprotektivní vlastnosti v ani mál nich modelech. Všechny pokusy byly prováděny v souladu se Zákonem na ochranu zvířat proti týrání.

- 15CZ 303037 B6

Příklad 22

Vliv sloučeniny z příkladu 9 na spontánní pohybovou aktivitu v testu otevřeného pole (openfield) a na senzor i motorický gat ing v testu prepulzní inhibice úle kove reakce

Při hodnocení spontánní lokomoční aktivity byla zvířata sledována 30 minut v testu otevřeného pole (open-fielďp který byl tvořen čtvercovou arénou s délkou hrany 1 m. Zvířata byla snímána systémem Ethovision Pro (Noldus) a vyhodnocována byla jejich celková ušlá dráha za toto sezení. Sloučenina z příkladu 9 byla aplikována subkutánně (rozpuštěna v cyklodextrinu) v dávkách 1 a 10 mg/kg, a to 30 min před behaviorálním sledováním. Kontrolním zvířatům byl aplikován fyziologický roztok.

Výsledky ukázaly, že sloučenina z příkladu 9 ani v jedné z dávek nezměnila spontánní pohybovou aktivitu, všechny skupiny zvířat vykazovaly podobnou ušlou vzdálenost (viz obr. 2); horní panel).

Testování prepulzní inhibice úlekové reakce jako měřítko možného deficitu v senzorimotorickém zpracování ukázalo, že ani jedna z dávek sloučeniny z příkladu 9 statisticky významně neovlivnila tento parametr ve srovnání s kontrolními zvířaty (viz obr. 2, dolní panel).

Příklad 23

Vliv samotné aplikace sloučeniny z příkladu 9 a dizocilpinu (nekompetitivní NMDA antagonista; standardní sloučenina používaná jako pozitivní kontrola, dále zde označovaná také jako Dízocilpin) na chování v úloze aktivního alotetického vyhýbání se místu (AAPA) jako měřítko prostorové orientace a kognitivních funkcí.

Vliv sloučeniny z příkladu 9 na kognitivní funkce a také lokomoci byl studován v úloze aktivního alotetického vyhýbání se místu (AAPA), která vyžaduje po zvířeti jednak schopnost prostorové navigace a také kognitivní koordinace (Wesierska et al., 2005) a zároveň umožňuje sledovat potenciální změny v lokomoční (pohybové) aktivitě. V úloze AAPA jsou zvířata trénována pohybovat se po rotující uniformní kruhové aréně, na které je vymezena zakázaná oblast, po jejímž navštívení zvíře obdrží mírnou elektrickou ranku do končetin. Tato zakázaná oblast je definována stabilně v souřadnicovém systému místnosti, ve které pokus probíhá (Stuchlík et al., 2008).

Tato úloha je vysoce závislá na hipokampální formaci u potkanů, kdy již pouhá jednostranná přechodná leze této struktury způsobí poškození orientace v AAPA (Cimadevilla et al., 2001). Zvíře se tak musí neustále aktivně pohybovat proti směru rotace arény, jinak by bylo touto rotací pasivně zaváženo do zakázané oblasti. Jedno experimentální sezení v této úloze trvá 20 min, a celkově jsme prováděli 4 sezení ve čtyřech po sobě následujících dnech.

Kontrolním zvířatům jsme intraperitoneálně aplikovali fyziologický roztok, experimentálním skupinám potom sloučeniny z příkladu 9, a to v dávkách 1 a 10 mg/kg (rozpuštěno v cyklodextrinu), podkožní aplikace. Roztok sloučeniny z příkladu 9 (1 nebo 10mg/2ml rozpuštěné v cyklodextrinu) byl aplikován subkutánně v dávce 2 ml/kg. Jako pozitivní kontrola bylo použito intraperitoneální podání sloučeniny Dizocilpin (dizocilpinu), nekompetitivního antagonisty NMDA receptorů, který v mnoha experimentech vykazuje neuroprotektivní aktivitu, avšak rovněž narušuje kognitivní a lokomoční parametry a de facto způsobuje stav do jisté míry analogický psychóze. Dizocilpin byl použit v dávkách 0,1 a 0,3 mg/kg. Je třeba rovněž uvést, že Dizocilpin se (kromě svého neuroprotektivního působení) využívá k modelování schizofrenii podobného chování u laboratorních hlodavců a opakovaně bylo prokázáno, že v závislosti na dávce vyvolává kognitivní deficit a hyperlokomoci.

- 16CZ 303037 B6

Výsledky jsou uvedeny v grafech na obrázku 3, kde jsou uváděny vždy průměry a střední chyby průměru (S.E.M.) za jednotlivá sezení. Statistické porovnání bylo pro přehlednost vyjádřeno vždy pro poslední sezení, kdy bylo dosaženo asymptotické úrovně výkonnosti u kontrolních zvířat.

Lokomoční (pohybová) aktivita byla v úloze AAPA hodnocena jako celková ušlá vzdálenost v aréně za 20minutové sezení. Zvířata, jimž byla aplikována sloučenina z příkladu 9, nevykazovala ani u jedné dávky této sloučeniny zvýšení ani snížení lokomoční aktivity oproti kontrolním potkanům, zatímco Dizocilpin dávkově závisle zvyšoval lokomoční aktivitu. Zatímco dávka io 0,1 g/kg Dizocilpinu nevedla ke zvýšení pohybu, dávka 0,2 mg/kg zvyšovala lokomoci výrazně a dávka 0,3 mg/kg způsobovala ještě výraznější hyperaktivitu.

Je třeba dodat, že hyperaktivita (hyperlokomoce) indukovaná aplikací NMDA antagonistů je v literatuře často považována za experimentální analogii pozitivních příznaků psychóz, neboť mj.

souvisí s nadměrnou funkcí dopaminového systému v mesolimbických oblastech. Hodnocení pohybové aktivity v úloze AAPA tedy ukázalo, že sloučenina z příkladu 9 tuto aktivitu v daném uspořádání experimentu nemění. Výsledky měření lokomoční aktivity jsou na obr. 3.

Obr. 3 ukazuje celkovou ušlou dráhu za každé sezení v úloze AAPA, a to po aplikaci Dizocilpinu no a sloučeniny z příkladu 9. Dvě vyšší dávky Dizocilpinu (0,2 a 0,3 mg/kg) způsobily hyperlokomoci, zatímco sloučenina z příkladu 9 nezpůsobila statisticky významnou změnu pohybové aktivity. * značí signifikantní rozdíl oproti kontrolám (P < 0,05), statistické rozdíly byly vyhodnocovány v posledním sezení, kdy je přítomná asymptotická úroveň u kontrol.

Příklad 24

Počet vstupů do zakázané oblasti

Dalším hodnoceným parametrem v úloze AAPA, tentokrát již parametrem prostorovým, je počet vstupů do zakázané oblasti. Tento parametr ukazuje, jak jsou zvířata schopna tuto úlohu řešit, je tedy měřítkem kognitivních funkcí zvířat. Výsledky experimentu ukázaly, že ani jedna z dávek sloučeniny z příkladu 9 nezpůsobila zhoršení v tomto parametru, zatímco Dizocilpin dávkově závisle tento parametr zhoršoval, tyto výsledky jsou znázorněny na obr. 4.

Obr. 4 ukazuje počet vstupů do zakázané oblasti jako měřítko kognitivních funkcí za každé sezení v úloze AAPA, a to po aplikaci Dizocilpinu a sloučeniny z příkladu 9. Všechny dávky Dizocilpinu způsobily zhoršení v tomto parametru, zatímco sloučenina z příkladu 9 nezpůsobila statisticky významnou změnu kognitivních funkcí. Symbol * značí signifikantní rozdíl oproti kontrolám (P < 0,05), statistické rozdíly byly vyhodnocovány v posledním sezení, kdy je přítomná asymptotická úroveň u kontrol.

Příklad 25

Maximální doba mezi dvěma vstupy

Dalším měřeným parametrem, který ukazuje na kognitivní schopnosti, byla maximální doba mezi dvěma vstupy, tzv. maximální čas vyhýbání. U tohoto parametru Dizocilpin ve všech třech dáv50 kách signifikantně zhoršoval výkonnost potkanů, avšak sloučenina z příkladu 9 tento účinek neměla. Její aplikace nevedla k signifikantnímu zhoršení kognitivních funkcí ve srovnání s kontrolními zvířaty. Tato část experimentuje graficky znázorněna na obr. 5.

Obr. 5 ukazuje maximální čas vyhýbání jako měřítko kognitivních funkcí za každé sezení v úloze

AAPA, a to po aplikaci Dizocilpinu a sloučeniny z příkladu 9. Všechny dávky Dizocilpinu způ- 17 CZ 303037 B6 sobily zhoršení v tomto parametru, zatímco sloučenina z příkladu 9 nezpůsobila statisticky významnou změnu kognitivních funkcí. Symbol * značí signifikantní rozdíl oproti kontrolám (P < 0,05), statistické rozdíly byly vyhodnocovány v posledním sezení, kdy je přítomná asymptotická úroveň u kontrol.

Z příkladů 22 až 25 plyne následující shrnutí: Výše uvedené poznatky lze tedy uzavřít tvrzením, že v uvedeném dávkovém rozmezí (I a 10 mg/kg) sloučenina z příkladu 9 nezpůsobuje statisticky významné zhoršení kognitivních funkcí, pokud je aplikována samotná. Tím se výrazně liší od neknmnetitivníhn antagonisty NMDA receptorů, Di žnci lpí nu, který způsobuje hynerlokomoci io a kognitivní deficit v úloze vyhýbání se místu. Tyto výsledky naznačují, že sloučenina z příkladu 9 ve výše uvedeném dávkovém rozmezí nenarušuje bazální synaptickou aktivitu v mozku a mohla by být tedy potenciálně využitelná při prokázání její možné neuroprotektivity (viz níže).

ts Příklad 26

Vliv sloučeniny z příkladu 9 na prostorovou kognici po oboustranné lézi hipokampu pomocí excitotoxické sloučeniny NMDA (/V-methyl—D-aspartátu)

Neuroprotektivní účinek 3a-substituovaných derivátů pregnanolonu jsme testovali na modelu oboustranné leze hipokampu mikroinjekcí NMDA, agonisty NMDA receptorů. Model intrahipokampální aplikace NMDA je dlouhodobě zavedený model narušení paměťových funkcí u laboratorních hlodavců. Tento model současně simuluje excesivní působení glutamátu na hipokampální buňky, jejichž poškození vede k zhoršení paměti. Vliv leze resp. protektivní vliv látek je sledován jako výkonnost zvířete v behaviorálních úlohách v časovém odstupu od exp. zákroku. V našem případě jsme testovali prostorovou orientaci a kognitivní koordinaci v testu aktivního alotetického vyhýbání se místu.

Všechny pokusy byly prováděny v souladu se Zákonem na ochranu zvířat ČR. V této fázi expe30 rimentu jsme sledovali účinnost v závislosti na dávce a v časovém odstupu od indukce excitotoxické léze. K experimentům bylo použito 150 dospělých samců (250 až 350 g) potkanů kmene Long-Evans. Potkani byli chováni v průhledných plastových boxech o rozměru 25 x 25 x 50 cm v klimatizovaném příručním zvěřinci se světelným režimem 12/12 hodin. Zvířata měla neomezený přístup k potravě a vodě.

Během operace byla zvířata fixována ve stereotaktickém aparátu a uvedena do hluboké inhalační anestézie i sofl uranem (3,5 %, poháněno vzduchem). Iniciační uspání bylo provedeno diethyletherem v iniciační komoře. Zvířatům byly mikrovrtačkou vyvrtány díry do lebky a následně stereotakticky bilaterálně aplikován mikroinjekcí 1 mikrolitr roztoku NMDA (0,09 mol roztok

NMDA ve fyziologickém roztoku, pufrováno d i hydrogen fosforečnanem vápenatým na pH = 7,2), do obou hipokampů. Koordináty aplikace (4 mm dorzálně od bregma, ± 2,5 mm bilaterálně, 4 mm do hloubky) byly odměřeny podle stereotaktického atlasu (Paxinos a Watson, 2005) a ověřeny podle h i sto logických kontrol. Po operaci byli potkani umístěni do měkkých pooperaěních boxů. Aplikace sloučeniny z příkladu 9 probíhala podle experimentálního schématu 30 minut před a po, 30 minut po, 3 hodiny po nebo 24 hodin po aplikaci NMDA v dávkách 0,01, 0,1 a 10 mg/kg živé váhy. V kontrolních skupinách a skupinách se samotnou lézí byl do hipokampu aplikován pouze fyziologický roztok anebo NMDA. Roztok sloučeniny z příkladu 9 (0,01, 0,1 nebo 10 mg/2 ml rozpuštěný v cyklodextrinu) byl aplikován subkutánně v dávce 2 ml/kg.

Před začátkem behaviorálního testování byla zvířata ponechána 7 dní v klidu. Poté byla testována 2 dny v úloze aktivního alotetického vyhýbání se místu (AAPA). Každý den zvíře podstoupilo dvě sezení. Potkan byl na začátku sezení umístěn do kruhové arény o průměru 82 cm, která se otáčí rychlostí 1 otáčka/min, s vymezenou zakázanou výsečí (60°), definovanou stabilně v souřadnicích místnosti (Stuchlík et al., 2008). Vstoupí 1-1 i potkan do zakázané oblasti arény, byl potrestán mírnou elektrickou rankou. Zvíře mělo na zádech připevněnu infračervenou diodu,

-18CZ 303037 B6 která je snímána televizní kamerou nad arénou, napojenou na počítač. Tato oblast není na aréně vyznačená a jediný způsobem, jak zvíře může určit její polohu, je vzhledem k okolním orientačním bodům v místnosti (Stuchlík et al., 2008). Pro správné řešení úlohy zvíře musí mít neporušené neuronální mechanismy prostorové paměti, orientované pozornosti a kognitivní koordinace (Wesierska et al., 2005) pro zdárné zvládnutí úlohy. Úloha je také vysoce závislá na hipokampální formaci u potkanů, kdy již pouhá jednostranná přechodná léze této struktury způsobí poškození orientace v AAPA (Cimadevilla et al., 2001). Z tohoto důvodu jsme tuto úlohu shledali velmi vhodnou pro detekci kognitivního deficitu po lézi hipokampu pomocí NMDA jejího možného zlepšení následkem podání sloučeniny z příkladu 9.

K analýze dat je využíván program TrackAnalysis od firmy Biosignal Group Corp. (USA). Tento program umožňuje analyzovat trajektorii zvířete. Počet vstupů do zakázané oblasti odráží sílu paměťové stopy a tedy kognitivní funkce, podobně jako maximální čas vyhýbání.

Aplikace samotného NMDA vedla k hipokampální lézi a tím k signifikantnímu zhoršení prostorového vyhýbání testovaného následně v úloze AAPA ve srovnání s kontrolními zvířaty. Potenciální zlepšující (a tedy neuroprotektivní) vliv sloučeniny z příkladu 9 v různých dávkách a různých časových odstupech od léze je shrnut v následujících odstavcích, V jednotlivých grafech jsou uváděny vždy průměry a střední chyby průměru (S.E.M.) v posledním sezení, kdy bylo dosaženo asymptotické úrovně výkonnosti u kontrolních zvířat.

Příklad 27

Vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,01 mg/kg na počet vstupů

Sloučenina z příkladu 9 v dávce 0,01 mg/kg zlepšila následnou výkonnost měřenou jako počet vstupů v úloze AAPA, pokud byla podána 30 minut po provedení NMDA léze. Zajímavé zde je, že pokud byla podána ve dvou dávkách (30 minut před a 30 minut po lézi), toto zlepšení nebylo signifikantní. S delším časovým odstupem tato dávka vliv na následné behaviorální testování neměla. Výsledky jsou uvedeny na obrázku 6.

Obr. 6 ukazuje vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,01 mg/kg na počet vstupů během následného testování v úloze AAPA. Dávka 0,01 mg/kg aplikovaná 30 minut po provedení léze zlepšila výkonnost potkanů ve srovnání se samotnou lézi pomocí NMDA.

Příklad 28

Vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,01 mg/kg na maximální dobu vyhýbání

Na další kognitivní parametr (maximální doba vyhýbání) měla sloučenina pozitivní účinek, pokud byla aplikována 30 minut po lézi a rovněž pokud byla injikována ve dvou dávkách, 30 minut před a 30 minut po provedení léze pomocí NMDA. Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 7, který uvádí vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,01 mg/kg na maximální čas vyhýbání během následného testování v úloze AAPA. Dávka 0,01 mg/kg aplikovaná 30 min po provedení léze a také 30 minut před a 30 minut po lézi zlepšila výkonnost potkanů ve srovnání se samotnou lézi pomocí NMDA.

- 19CZ 303037 B6

Příklad 29

Vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,1 mg/kg na počet vstupů

Na celkový počet vstupů do zakázané oblasti měla zlepšující (avšak nesignifikantní) vliv tato dávka pouze tehdy, pokud byla aplikována 30 minut po provedení léze, jak ukazuje obr. 8. Zvířata, jimž byla aplikována sloučenina z příkladu 9 v dávce 0,1 mg/kg, a to 30 minut po provedení léze, vykazovala podobnou výkonnost jako kontrolní zvířata, u nichž léze provedena nebyla, io avšak zřejmě díky vysokým rozptylům tato hodnota nenabyla statistické významnosti. Grafické znázornění výsledků je znázorněno na obr. 8, kde je uveden vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce

0,1 mg/kg na počet vstupů do zakázané oblasti během následného testování v úloze AAPA. Dávka 0,1 mg/kg aplikovaná 30 minut po provedení léze nesignifikantně zlepšila výkonnost potkanů ve srovnání se samotnou lézí pomocí NMDA.

Příklad 30

Vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,1 mg/kg na maximální čas vyhýbání

Podobné výsledky byly obdrženy také pro maximální čas vyhýbání, jak je znázorněno na obr. 9, kde je ukázán vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 0,1 mg/kg na maximální čas vyhýbání během následného testování v úloze AAPA. Dávka 0,01 mg/kg aplikovaná 30 minut po provedení léze nesignifikantně zlepšila výkonnost potkanů ve srovnání se samotnou lézí pomocí NMDA.

Příklad 31

Vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 10 mg/kg na počet vstupů

Sloučenina z příkladu 9 v dávce 10 mg/kg způsobila statisticky významné zlepšení oproti zvířatům se samotnou lézí pouze v případě, pokud byla aplikována ve dvou dávkách (30 minut před a 30 minut po provedení léze) a rovněž v samostatné dávce aplikované 3 hodiny po provedení léze. V ostatních intervalech nebylo zlepšení signifikantní nebo nebylo pozorováno, jak je zná55 zorněno na obr. 10, který ukazuje vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 10 mg/kg na celkový počet vstupů do zakázané oblasti během následného testování v úloze AAPA. Dávka 10 mg/kg aplikovaná 30 minut před a 30 minut po provedení léze a také 3 hodiny po lézi zlepšila výkonnost potkanů ve srovnání se samotnou lézí pomocí NMDA.

Příklad 32

Vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 10 mg/kg na maximální čas vyhýbání

U dalšího parametru kognitivních funkcí, a to maximálního času vyhýbání, bylo u této dávky pozorováno zlepšení ve stejných časových intervalech aplikace jako u počtu vstupů do zakázané oblasti, jak znázorňuje obr. 11, kde je uveden vliv sloučeniny z příkladu 9 v dávce 10 mg/kg na maximální čas vyhýbání ze sezení během následného testování v úloze AAPA. Dávka 10 mg/kg aplikovaná 30 minut před a 30 minut po provedení léze a také 3 hodiny po lézi zlepšila výkon50 nost potkanů ve srovnání se samotnou lézí pomocí NMDA.

Z předcházejících příkladů 26 až 32 vyplývá, že sloučenina z příkladu 9 v kombinaci s určitými odstupy od provedení hípokampální léze pomocí NMDA může zlepšit kognitivní výkonnost zvířat ve srovnání se zvířaty, kterým byla provedena pouze léze. To naznačuje potenciální neuropro-20CZ 303037 B6 tektivní působení sloučeniny z příkladu 9 na tento model prostorového učení po provedení hipokampální léze.

Příklad 33

Histochemická analýza po oboustranné NMDA lézí hipokampu

Pro histochemickou analýzu oboustranné NMDA léze hipokampu byla zvířata rozdělena do čtyř io skupin ve dvou sériích. První skupině bylo aplikováno i.c.v. NMDA a sloučenina z příkladu 9 v dávce I mg/kg i.p. Druhé skupině aplikován i.c.v. NMDA a cyklodextrin i.p. Třetí skupině byl aplikován i.c.v. fyziologický roztok a cyklodextrin ip. Čtvrté skupině aplikován i.c.v. fyziologický roztok a sloučenina z příkladu 9 i.p. v dávce l mg/kg i.p. 6 zvířat z každé skupiny bylo perfundováno první, druhý, třetí a čtvrtý den po experimentálním zákroku.

Během operace byla zvířata fixována ve stereotaktickém aparátu a uvedena do hluboké inhalační anestézie (3,5 %, poháněno vzduchem). Iniciační uspání bylo provedeno diethy(etherem v iniciační komoře. Zvířatům byly mikrovrtačkou vyvrtány díry do lebky a následně stereotakticky bilaterálně aplikován mikroinjekcí 1 mikrolitr roztoku NMDA (0,09 mol roztok NMDA ve fyzio20 logickém roztoku, puffováno dihydrogenfosforečnanem vápenatým na pH-- 7,2), do obou hipokampů. Koordináty aplikace (4 mm dorzálně od bregma, ± 2,5 mm bilaterálně, 4 mm do hloubky) byly odměřeny podle stereotaktického atlasu (Paxinos a Watson, 2005) a ověřeny podle histologických kontrol. Po operaci byli potkani umístěni do měkkých pooperačních boxů stejně jako v příkladu 26.

Aplikace sloučeniny z příkladu 9 probíhala podle experimentálního schématu 30 minut před a po aplikaci NMDA v jedné sérii a 30 minut po v druhé sérii pokusů.

První až čtvrtý den byla zvířata naperfundována. Mozky byly naloženy do paraformaldehydu a sacharosy. Potom zmraženy na -70 °C, nařezány na mikrotomu, nabarveny a analyzovány pod mikroskopem.

Po hipokampální lézi NMDA pri barvení Fluoro Jade B přítomno bilaterální poškození hipokampů v rozsahu gyrus dentatus, CA1-CA3, intenzivnější barvení v oblasti CA2 a gyrus dentatus, méně v subiculu, entorhinální kůře a pre a piriformním kortexu. V neokortexu frontálního a parietálního laloku postiženy cytoarch(tektonicky vrstvy 2. až 5., v menší míře i první a 6. vrstva. Nejzřetelněji se barvily pyramidové neurony a drobné intersticiální neurony 4. vrstvy. Dále přítomno postižení bazálních ganglií a thalamu v oblasti retikulám ího jádra, caudatoputamen. Zadní části hipokampu obarveny méně než hipokampální oblast suprakomisurální a ventrální.

Po aplikaci neurosteroidů zřetelné vymizení postižení hipokampu, zejména v oblasti gyrus dentatus a všech polí CAI-CA3, včetně subicula. Přidružené korové oblasti (entorhinální a piriformní kůra) si ponechávaly těžko kvant i fl kováte lné postižení 2. a 3. vrstvy archíkortexu v celém rozsahu až k hranici olfaktomích struktur. Ještě výraznější vymizení poškození v celé oblasti neokor45 texu (celé pole frontální a prefrontální kůry, parietální a okcipitální kůry, včetně funkčních korových oblastí - zrakové kůry, sluchové kůry a senzorimotorické kůry). Oslabení, ale ne přímo vymizení poškození v oblasti caudatoputamen a thalamických jader.

V obou případech kolokalizace na konfokálním mikroskopu s DAP1 ukázala specifické postižení neuronů bez neuroglie.

Tyto výsledky silně potvrzují neuroprotektivní působení sloučeniny z příkladu 9 na poškození hipokampu pomocí intrahipokampální aplikace NMDA,

-21 CZ 303037 B6

Průmyslová využitelnost

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou průmyslově vyrobitelné a použitelné pro léčení mnoha onemocnění CNS, jako jsou například:

1) ischemické poškození CNS

2) neurodegenerativní změny a poruchy

3) afektivní poruchy, deprese, PTSD a nemoci související se stresem

4) schizofrenie io 5) bolest

6) závislosti

7) roztroušená skleróza

8) epilepsie

9) gliomy

Seznam použité literatury

Cimadevilla JM, Wesierska M, Fenton A A, Bureš J, Inactivating one hippocampus impairs avoidance of a stable room-defined plače during díssociation of aréna cues from room cues by rotation of the aréna. Proč. Nati. Acad. Sci, USA 98 (2001) 3531 až 3536,

Morrow AL. Recent developments in the significance and therapeutic relevance of neuroactive steroids-Introduction to the speciál issue. Pharmacol. Ther. 2007; 116(1): 1 až 6.

Paxinos G, Watson CR, The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (5th ed.), Elsevier Academie Press, San Diego (2005),

Petrovic M, Sedlaček M, Horák M, Chodounska H, Vyklický L Jr. 20-oxo-5beta-pregnan3alpha-yl sulfáte is a use-dependent NMDA receptor inhibitor, J Neurosci. 2005; 25(37): 843 až

50.

Stuchlík A, PetrasekT, Valeš K, Dopamine D2 receptors and alpha 1-adrenoceptors synergistically modulate locomotion and behavior of rats in a plače avoidance task, Behav. Brain Res. 189 (2008) 139 až 144.

Villmann C, Becker CM. On the types and falls in neuroprotection; targeting the NMDA receptor. Neuroscientist. 2007; 13(6): 594 až 615.

Weaver CE, Land MB, Purdy RH, Ruchards KG, Gibbs TT, Farb DH, Geometry and charge 40 determine pharmac o logica! effects of steroids on Ά-methyl-D-aspartate receptor-induced Ca2 accumulation and cell death, J. Pharm. Exp. Ther. 293 (2000) 747 až 753.

Wesierska M, Dockery C, Fenton AA, Beyond memory, navigatíon, and inhibition; behavioral evidence for hippocampus-dependent cognitive coordination in the rat, J. Neurosci. 25 (2005)

2413 až 2419.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Deriváty pregnanolonu substituované v poloze 3alfa, mající obecný vzorec Ϊ v němž

R^l znamená skupinu obecného vzorce R³OOC-R²-C(R⁴)-R⁵- kde R² znamená alkylovou nebo alkenylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku s přímým nebo větveným uhlíkovým řetězcem, která může být substituována jedním nebo více atomy halogenu, aminovou skupinou, která může být buď volná, nebo chráněná chránící skupinou, zvolenou z /crc-butyloxykarbonylu a/nebo hetero15 cyklickou skupinou, kterou je {4—[1,1 lbis(methylensulfo)-3,3,9,9-tetramethyl 4,8-diaza-6oxa-3,6,8,9-tetrahydro-pentacen-13-yl]-benzen-l-karboxylová kyselin a}-3-karbonyl, R³ znamená buď atom vodíku, nebo chránící skupinu karboxylové skupiny, zvolenou z benzylu, R⁴ znamená atom kyslíku, NH skupinu nebo atom síry vázaný dvojnou vazbou nebo R⁴ znamená dva atomy vodíku, a R⁵ znamená atom kyslíku, atom dusíku nebo atom uhlíku, kromě toho, kdy R²

20 znamená skupinu (CH?)^ kde n = 0 až 3 a současně R³ znamená atom vodíku a R⁴ i R⁵ znamenají atom kyslíku.
2. Způsob výroby derivátů pregnanolonu obecného vzorce I podle nároku 1, v němž R¹ znamená skupinu obecného vzorce R³OOC-R²-COO-, kde R² znamená alkylovou nebo alkenylovou

25 skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku s přímým nebo větveným uhlíkovým řetězcem, která může být substituována jedním nebo více atomy halogenu, aminovou skupinou, která je chráněná chrániči skupinou, zvolenou z /erc-butyloxykarbonylu a benzoy loxy karbony lu a R³ znamená atom vodíku nebo chránící skupinu karboxylové skupiny zvolenou z benzylu či Zerc-butylu, vyznačující se tím, že příslušná dikyselina chráněná na jedné karboxylové skupině a popřípadě chrá30 něná na aminové skupině se rozpustí v rozpouštědle, zvoleném z benzenu či toluenu, zbytky vody se odstraní oddestilováním části tohoto rozpouštědla, reakční směs, ke které je zabráněn přívod vody, se ochladí na laboratorní teplotu, pod inertní atmosférou se pomalu přidá kondenzační činidlo a roztok 3alfa-hydroxy-5beta-pregnan~20-onu vzorce 11 od 0 do 50 °C, potom se druhý den směs nalije do nasyceného roztoku vodného NaHCO₃ nebo K.HCO3, a produkt se opakovaně extrahuje organickým rozpouštědlem, ve kterém je dobře roz40 pustný, spojené organické fáze se následně promývají vodou do odstranění přítomného hydrogenuhličitanu a vysrážená Ν,Ν’-dicyklohexylmočovina se odfiltruje, filtrát se vysuší síranem hořečnatým nebo síranem sodným a rozpouštědlo se odpaří oddestilováním ve vakuu, takto získaný produkt se popřípadě přečistí a získá se tak sloučenina obecného vzorce I, přičemž chránící sku-23CZ 303037 B6 pí na karboxylové skupiny se odstraní tak, že se získaná sloučenina rozpustí v alkoholu a k získanému roztoku se přidá hydrogenační katalyzátor, s výhodou Pd/CaCO₃; po hydrogenaci se katalyzátor odfiltruje a rozpouštědlo se odpaří.
5 3. Způsob výroby derivátů pregnanolonu obecného vzorce I podle nároku 2, vyznačující se tím, že výhodně se jako katalytické činidlo použije dimethylaminopyridin, reakční směs se míchá 10 až 48 hodin a výhodně přes noc při teplotě místnosti, produkt se extrahuje ethylacetátem a k přečištění produktu se použije chromatografie na sloupci silikagelu.

io 4. Způsob výroby derivátů pregnanolonu obecného vzorce I podle nároku 1, přičemž R¹ znamená skupinu obecného vzorce RWCR²-C()O-, kde R² znamená alkylovou nebo alkenylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku s přímým nebo větveným uhlíkovým řetězcem, která může být substituována jedním nebo více atomy halogenu či aminovou skupinou a R³ znamená atom vodíku, vyznačující se tím, že chránící skupina aminové skupiny substituentu R² slouče15 niny obecného vzorce I, získaná způsobem podle nároku 2 nebo 3, se odblokuje rozpuštěním této sloučeniny v organickém rozpouštědle, následně se přidá trifluoroctová kyselina, načež se tato směs nechá reagovat 0,1 až 48 hodin, při teplotě v rozmezí od 0 do 50 °C, poté se rozpouštědla odstraní odpařením, odparek se rozpustí v organickém rozpouštědle, přidá se pyridin a směs se odpaří dosucha.

5. Způsob výroby derivátů pregnanolonu podle nároku 4, vyznačující se tím, že výhodně se jako organické rozpouštědlo pro rozpuštění sloučeniny obecného vzorce l použije dichlormethan, po přidání trifluoroctové kyseliny se směs ponechá reagovat 16 hodin při teplotě místnosti a po odpaření rozpouštědel se odparek rozpustí v methanolu.
6. Způsob výroby derivátů pregnanolonu obecného vzorce I podle nároku 1, v němž R² znamená alkylovou skupinu s 1 až 18 atomy uhlíku s přímým nebo větveným uhlíkovým řetězcem, která je substituovaná aminovou skupinou s navázanou heterocy kličkou skupinou, jíž je {4[1,11 bis(methylensulfo)-3,3,9,9-tetramethy I—4,8-diaza-6—oxa--3,6,8,9-tetrahydro-pentacen-l 330 yl]-benzen-l-karboxylová kyselina}-3-karbonyl, jako je tomu v derivátu pregnanolonu následujícího vzorce III

35 vyznačující se t í m, že se aminová skupina na alkylovém řetězci R² molekuly obecného vzorce I podle nároku 1 uvede do reakce s aktivovanou karboxylovou skupinou, přičemž taková karboxylová skupina může být funkcionalizována aktivační skupinou, zvolenou z hydroxy benzotriazolové či substituované hydroxy benzotriazolové skupiny, skupiny odvozené od O-{7azabenzotriazol-l-vl)-.V;V,;V’,;V’-tetramethyluronium-hexařluorfbsfátu. Q (7-azabenzotriazoí40 l yl)-.V..V.A';A’-íetramethyluronium-tetrafluoroboritanu a s výhodou WWAT.TV-tetramethyl6L-(A-sukcinimidyl)uronium-tctrafiuoroboritanu ve formě sukeinimidylového esteru.

-24CZ 303037 B6
7. Použití derivátů pregnanolonu obecného vzorce 1 podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčení různých onemocnění centrální nervové soustavy, jako jsou například i schem ické poškození centrální nervové soustavy, neurodegenerativní změny a poruchy, afektivní poruchy, deprese, posttraumatická stresová porucha a nemoci související se stresem, schizofrenie, bolest, závislosti,

5 roztroušená skleróza, epilepsie, gliomy.
8. Použití derivátů pregnanolonu obecného vzorce I podle nároku 1 pro přípravu léčiva pro léčení neuropsychiatrických poruch souvisejících s dysbalancemi glutamátergního neuropřenašečového systému, ischemického poškození centrální nervové soustavy, neurodegenerativních io změn a poruch centrální nervové soustavy, afektivní poruchy, deprese, posttraumatické stresové poruchy a nemocí souvisejících se stresem, anxietu, schizofrenie a psychotických poruch, bolesti, závislosti, roztroušené sklerózy, epilepsie, gliomů.
9. Použití derivátů pregnanolonu obecného vzorce I podle nároku 1 pro výrobu veterinárního

15 a humánního farmaceutického přípravku pro léčení neuropsychiatrických poruch souvisejících s dysbalancemi glutamátergního neuropřenašečového systému, ischemického poškození centrální nervové soustavy, neurodegenerativních změn a poruch centrální nervové soustavy, afektivní poruchy, deprese, posttraumatické stresové poruchy a nemocí souvisejících se stresem, anxietu, schizofrenie a psychotických poruch, bolesti, závislosti, roztroušené sklerózy, epilepsie, gliomů.