CZ307229B6

CZ307229B6 - C-28 biotinylované triterpeny lupanového typu a jejich využití

Info

Publication number: CZ307229B6
Application number: CZ2016-408A
Authority: CZ
Inventors: Milan Urban; Miroslav Soural; arek Jan Ĺ
Original assignee: Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci
Priority date: 2015-08-10
Filing date: 2015-08-10
Publication date: 2018-04-11
Also published as: CZ2016408A3

Description

Oblast techniky

Vynález se týká C-28 biotinylovaných triterpenů lupanového typu a jejich využití při hledání molekulárních cílů. Jedná se o triterpeny lupanového typu navázané k biotinu přes variabilní raménko přes pozici č. 28 základního skeletu. Tyto konjugáty je možné využít pro stanovení molekulárního cíle, tedy proteinu v nádorové buňce, se kterým tyto aktivní triterpeny lupanového typu interagují, což má za následek její smrt. Využití se předpokládá zejména ve farmaceutickém průmyslu. V současné době je popsáno několik tisíc aktivních triterpenů lupanového typu přírodního nebo syntetického původu a další deriváty v literatuře neustále přibývají. Molekulární cíl je však znám pouze u několika z nich, což podstatně limituje jejich potenciální využití v humánní medicíně.

Dosavadní stav techniky

Triterpeny jsou přírodní sloučeniny, u kterých byla objevena řada biologických aktivit, z nichž nej významnější je selektivní protinádorová aktivita (Dzubak P., Hajduch M., Vydra D., Hustova Biedermann D., Markova L., Urban M., Šarek J. Nat. Prod. Rep. 2006, 23, 394 - 411). Jejich mechanizmus účinku je již studován řadu let a bylo objeveno několik typů proteinů, jejichž inhibice triterpeny vede k inhibici růstu rakovinných buněk, významná je např. inhibice proteasomu (K. Quian, S.-Y. Kim, H.-Y. Hung, L. Huang, C.-H. Chen. K..-H. Lee: Bioorg. Med Chem. Lett. 2011, 21, 5944). Je však zřejmé, že i malá změna ve struktuře triterpenů může mít podstatný vliv na mechanizmus účinku a tedy pro každý nový, cytotoxicky aktivní triterpen je vhodné najít jeho konkrétní molekulární cíle. Mezi triterpeny vynikají svými protinádorovými aktivitami triterpeny lupanového typu, kterých se týká tento vynález.

Jednou z metod hledání molekulárních cílů je dobře známá afinitní chromatografie (Rylova, G.; Ozdian, T.; Varanasi. L.; Šoural, M.; Hlavac. J.; Holub, D.: Dzubak, P.; Hajduch, M. Current Drug Targets 2015, 16, 60-76). Nejčastějším uspořádáním této metody je pevná fáze modifikovaná avidinem a aktivní molekula navázaná na biotin přes definované raménko. Tímto raménkem je myšlena organická molekula protáhlého tvaru, která spojuje molekulu biotinu se studovanou sloučeninou. Raménko může mít různý charakter, nejčastěji je však založeno na bázi ethylenoxy jednotek. Takto modifikovaná aktivní molekula se přidá k lyzátu nádorových buněk, přičemž vznikne slabá interakce protein—inhibitor (aktivní molekula). Poté se k tomuto roztoku přidá pevná fáze modifikovaná avidinem, vytvoří se velmi pevná vazba biotin-avidin. Pevná fáze se odfiltruje od zbytku lyzátu, promyje vhodnými pufry a následuje eluce pomocí soustavy jiných pufrů, kdy se postupně vymývají proteiny z kolony v závislosti na síle jejich interakce s aktivní molekulou. V tandemu s výkonným MALDI-TOF spektrometrem se určí struktura proteinů, které s aktivní molekulou interagují. Pak následuje validace cílů. Jedním ze způsobů, jak cíl validovat, je metoda navázání molekuly z různých poloh a zopakování afinitní chromatografie pro všechny takto navázané molekuly. Cíl by se měl objevit pouze tehdy, když je molekula navázána mimo farmakofor (uspořádání v molekule zodpovědné za její aktivitu). Pokud tedy navážeme molekulu přes farmakofor, měl by tento být zablokovaný a experiment s takovou molekulou sloužit jako negativní kontrola. Jedním z výhodných uspořádání této metody je její kombinace s evaluací pomocí kvantitativní proteomiky a SILAC, např. v lit. S. Sakamoto, M. Hatakeyama, T. Ito, H. Handa Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, 1990 nebo v S.-E. Ong, X. Li, M. Schenone, S. L. Schreiber. S. A. Carr, Methods Mol. Biol. 2012, 803, 129.

Je tedy zřejmé, že pro stanovení molekulárního cíle pomocí afinitní chromatografie je důležité spojit aktivní molekulu na vhodné části jejího skeletu s biotinem přes vhodné raménko. Za tímto účelem existuje řada metod. V literatuře je hojně popsána příprava a použití derivátů typu 1 (vzorec 1). Některé z těchto derivátů jsou i komerčně dostupné.

Hl. skelet bitoinu _{ke|etra|nénka}

-

\ o
V-s o s_______________________z	H N^yCOOH

n= 1-12

Vzorec l: Příklad biotinylačního derivátu s raménkem na bázi methylenových jednotek s koncovou karboxylovou skupinou

Znázorněný typ raménka, tj. pouze na bázi uhlíkatého skeletu -(CH₂)_n- však není považován pro účely afinitní chromatografie za zcela vhodný a nebude mu proto zde věnována další pozornost. Uvedeny budou pouze některé konkrétní příklady derivátů s raménkem na bázi ethylenoxy jednotek nebo deriváty s raménky podobné konstituce, která jsou považována z pohledu struktury za optimální. V literatuře je např. popsána příprava derivátu 2 dle vzorce 2 a jeho následné použití pro studium glykokonjugátů (McReynolds. Katherine D.; Hadd. Michael J.; GervayHague, Jacquelyn, Bioconjugate Chemistry 1999, 10(6), 1021-1031). Popsána je také syntéza derivátu 3 a jeho použití pro studium protein-fosfoinositid vazebných interakcí (Gong, Denghuang; Smith, Matthew D.; Manna, Debasis; Bostic, Heidi E.; Cho, Wonhwa; Best, Michael D, Bioconjugate Chemistry 2009, 20(2), 310-316).

COOH

2: n = 3

3: n = 4

Vzorec 2: Příklad biotinylačního činidla s raménkem na bázi ethylenoxy jednotek s koncovou karboxylovou skupinou

Derivát 4 s raménkem obsahujícím disulfidickou vazbu (vzorec 3) byl připraven pomocí biotinu, ethylendiaminu a merkaptoethanolu ve výtěžku 72 % a použit pro studium β-laktamáz (Marchand-Brynaert, Jacqueline; Bouchet, Michele; Touillaux, Roland; Beauve, Cecile; Fastrez, Jacques, Tetrahedron 1996, 52(15), 5591-606).

COOH

Vzorec 3: Příklad biotinylačního činidla s raménkem obsahujícím -S-S- vazbu a koncovou karboxylovou skupinou

V poslední době se pro syntézu konjugátů malých molekul s biotinem rozšířilo použití Huisgenovy 1,3-cykloadice, tzv. click chemie a pro tento účel byly syntetizovány deriváty biotinu substituované molekulou azidu (vzorec 4), např. 5. (Vundyala Neeraja. Sun Chiin, Sidime

-2CZ 307229 B6

Francoise, Shi Wei, L'Amoreaux Witliam, Raja Krishnaswami, Peetz, Ralf. M., Tetrahedron Letters 2008, 49(45), 6386-6389).

°·γ-ΝΗ _H ^HN^Mr^Nr°V^N3

5: n = 2 nebo 6

Vzorec 4: Příklad biotinylačního činidla s ethylenoxy raménkem a koncovou azidoskupinou

Dále je možné k syntéze biotinylovaných sloučenin pro afinitní chromatografii využít tzv. syntézy na pevné fázi, kde systém biotin-raménko je kovalentně uchycen na polymemí matrici. Syntéza na pevné fázi ve srovnání se syntézou v roztoku obecně poskytuje řadu výhod. Mezi největší výhody patří především jednoduché instrumentální vybavení a jednoduché experimentální provedení syntézy, dále snadná příprava malých množství látek (i při mnohastupňových syntézách) a zejména velmi jednoduchá izolace meziproduktu syntézy.

Příkladem takového přistupuje příprava polymemí matrice 5 s navázaným biotinem a raménkem zakončeným aminoskupinou (schéma 1, Cankarova Naděžda, Funk Petr, Hlavac Jan, and Šoural Miroslav, 2011, Tetrahedron Lett. 52, 5782 - 5788). Pryskyřice 5 následně reaguje s příslušnou aktivní molekulou, která pro tento účel musí obsahovat vhodnou funkční skupinu.

<»>

^H Fmoe

1. krok (0

2. krok (ví)

Potymemí matrice (kopatyvner styrenu a dMnyRMmanu)

Schéma 1. (i) 2-(2-aminoethoxy)ethanol, 10% AcOH/DMF, 20 °C, 16 h, potom NaBH(OAc)₃, 20 °C, 6 h; (ii) Fmoc-OSu, DCM, 20 °C, 16 h; (iii) biotin, HOBt, DIC, DIEA, DMF, 20 °C, 16 h, zopakováno 3x; (iv) 20% piperidin/DMF, 20 °C, 30 min.: (v) [2-[2-(Fmocamino)ethoxy]ethoxy]octová kyselina, HOBt, DIC, DCM/DMF (1:1), 20 °C. 16 h.

Právě výše uvedený způsob je využitelný pro jednoduchou a rutinní modifikaci triterpenů lupanového typu. Je však nutné vést v patrnosti, že triterpeny lupanového typu většinou neobsahují vhodnou funkční skupinu pro účel biotinylace. Za vhodnou (tedy dostatečně reaktivní) funkční skupinu se typicky považuje např. karboxylová skupina, aminoskupina nebo alkylhalogenidová skupina. Takové skupiny sice u triterpenů lupanového typu existují, nejsou však dostatečně reaktivní ze sterických důvodů. Pro vlastní biotinylaci triterpenů je proto nutné triterpeny lupanového typu premodifikovat. Vybrané příklady premodifikace ukazuje Schéma 2: výchozí triterpeny 6 a 7 jsou modifikovány inkorporací karboxylové skupiny za vzniku karboxylových kyselin 8 a 9. Tyto reakce jsou popsané v literatuře (Šarek, J., Hajduch, M., Svoboda, M., Nováková, K.., Spáčilová, P., Kubelka, T., Biedermann, D.: Method of preparation of a soluble formulation of water - insoluble pentacyclic and tetracyclic terpenoids, a soluble formulation of a pentacyclic or tetracyclic terpenoid and a pharmaceutical composition containing this soluble formulation, 2008 WO 2008/037226 A2 a Mukherjee. R., Jaggi, M., Siddiqui, M. J. A., Srivastava, S. K., Rajednran, P., Vardhan, A., Burman, A. C.: Bioorg. Med. Chem. Lett. 2004, 14, 4087-4091.)

-3 CZ 307229 B6

Schéma 2. (i) Benzyl bromoacetát, DMF, K₂CO₃, 20 °C, 14 h; (ii) cyklohexadien, Pd/C, THF, 24 h; (iv) Ph₃SiCl, imidazol, DMF, 24 h; (v) NBS, CC1₄, 2 h; (vi) TBAF, THF, 2 h.

Jediným biotinylovaným triterpenem nalezeným v literatuře je bardoxolone methyl (CDDO), ze kterého byly syntetizovány konjugáty s biotinem, například typu 10 a 11 (vzorec 5) (Honda Tadashi, Janošík Tomasz, Honda Yukiko, Han Jie, Liby Karen T., Williams Charlotte R.; Couch, Robin D., Anderson Amy C., Sporn Michael B., Gribble Gordon W. Journal of Medicinal Chemistry 2004, 47, 4923 - 4932). Tyto konjugáty mají dvě zásadní nevýhody: 1) obsahují příliš krátké raménko, což může u některých cílových proteinů vést k tomu, že ze sterických důvodů se při provedení afinitní chromatografie nezachytí; 2) toto raménko je pouze na bázi uhlíkatého skeletu (-(CH₂)_n-), který není považován pro účely afinitní chromatografie za zcela vhodný, protože má tendenci zaujímat nevhodné prostorové uspořádání. Zcela podstatný je především fakt, že Bardoxolone methyl není triterpen lupanového typu. Konjugáty triterpenů lupanového typu s biotinem přes raménko na bázi ethylenoxy jednotek, kterých se týká tento vynález, nejsou v literatuře vůbec popsány a z pohledu afinitní chromatografie jako metody pro studium molekulárních cílů těchto látek jsou molekuly obsažené v tomto patentovém spisu jedinečné.

Vzorec 5: Jediné biotinylované triterpeny popsané v literatuře

Podstata vynálezu

Podstata vynálezu spočívá v C-28 biotinylovaných triterpenech lupanového typu obecného vzorce I, Schéma 3. Lupanový skelet je v tomto případě modifikován přes atom C-28. Základní skelet (Schéma 3) znázorňuje tuto polohu na základním terpenickém skeletu lupanového typu. Obecný vzorec 1 (Schéma 3) znázorňuje strukturu C-28 biotinylovaných triterpenů lupanového typu.

Triterpen lupanového typu (základní skelet)

Biotinylované triterpeny lupanového typu (Obecný vzorec I)

Schéma 3: Obecná struktura cílových látek _ A _

Rámcový popis syntézy C-28 biotinylovaných triterpenů lupanového typu

Byla připravena biotinylovaná pryskyřice 5 a triterpenoidní prekurzory 6, 7 (Schéma 2).

Vzorec 6: Sloučenina biotin-L-NH₂ ukotvená na polystyrénové matrici (tzv. biotinylovaná pryskyřice 5).

Obecný postup pro acylace pryskyřice 5 terpenickými kyselinami

Triterpen lupanového typu 6, 7 (0,3 mmol) byly rozpuštěny v DMF (1,5 ml) a k roztoku byl následně přidán HOBt.2H₂O (45 mg, 0,3 mmol), DIC (45 pL, 0,3 mmol) a DCM (1,5 ml). 15 Roztok byl následně přidán k pryskyřici 5 (250 mg). Směs byla třepána přes noc, následně promyta 3 x DMF a 3 x DCM.

Odštěpení cílových produktů (C-28 biotinylovaných triterpenů lupanového typu) z pryskyřice

Pryskyřice po acylačním/alkylačním kroku byla třepána s 50% TFA v DCM (3 ml) po dobu 30 min za laboratorní teploty. Roztok byl odebrán a pryskyřice ještě 3 x promyta 50% TFA v DCM. Spojené promývací roztoky byly odpařeny proudem dusíku a surový produkt byl rozpuštěn ve 2 ml MeCN a chromatografován na HPLC s reverzní fází. Chromatograficky jednotné frakce byly odpařeny a lyofilizovány z vody, 2-methyl-2-propanolu nebo jejich směsi.

Těmito reakcemi je možné připravit kombinací jednotlivých ramének a jednotlivých triterpenů lupanového širokou škálu produktů.

C-28 biotinylované triterpeny lupanového typu uvedené v tomto patentovém spisu zahrnují 30 následující provedení:

a • Raménko je vždy lineární molekula tvořená uhlíkatým řetězcem s deseti až čtyřiceti atomy uhlíku s jednoduchými nebo jednou či více dvojnými nebo jednou či více trojnými vazbami a tento uhlíkatý řetězec může obsahovat jednu či více karbonylových skupin nebo jeden či více atomů uhlíků v tomto uhlíkatém řetězci může být substituováno atomem kyslíku, síry 40 nebo -NH- skupinou, • b je jednoduchá nebo dvojná vazba, c je jednoduchá nebo dvojná vazba, • Q je CH₂, nebo C=O, • B je CH₂, CHOH, CHNH₂, C=O, CH-(Hal), C-(Hal)₂; kde Hal je F, Cl, Br, I, • V případě, že b je jednoduchá vazba, pak A je CH₂, CHOH, CHNH₂, C=O, CH-Hal, C(Hal)₂, a kde Hal je F, Cl, Br, I, • V případě, že b je dvojná vazba, pak A je COH, CNH₂.

Příklady uskutečnění vynálezu

Podstata přípravy a použití derivátů podle vynálezu je blíže objasněna v následujících příkladech. Molekuly 24 až 40 byly připraveny dle rámcového popisu syntézy C-28 biotinylovaných triterpenů lupanového typu uvedeného v podstatě vynálezu a zde jsou uvedeny výtěžky těchto reakcí a data z hmotnostního spektrometru a NMR prokazující strukturu produktu.

Příklad 1

C-28 biotinylovaný triterpen lupanového typu 12

Výtěžek 11,0 mg (35%). HRMS (ESI-TOF) m/z vypočteno pro C₅₂H₈₂N4O₁₂S [M+H]⁺987,5723, nalezeno 987,5701.

Příklad 2

- 6 CZ 307229 B6

Výtěžek 51,0 mg (43 %). HRMS (ES1-TOF) m/z vypočteno pro C52H83BRN4O11S [M+H]⁺1051,4962, nalezeno 1051,4967.

Příklad 3

C-28 biotinylovaný triterpen lupanového typu 14

Výtěžek 30 mg (43 %). HRMS (ESI-TOF) m/z vypočteno pro CjjH^OhS [M+H]⁺ 973,5930, nalezeno 973,5939. 'H-NMR: 0,65 (s, 3H); 0,75 (s, 3H); 0,84 (s, 3H); 0,87 (s, 3H); 0,93 (s, 3H); 1,64 (s, 3H, 6 x CH3); 1,84 (m, IH); 1,95 (dd, IH, J, = 12,0 Hz, J2 = 8,0 Hz); 2,19 (m, 2H, OC(O)CH2-biotin); 2,30 (t, 2H, J = 7,5 Hz); 2,58 (d, IH, J = 12,0 Hz); 2,82 (dd, IH, J, = 12,0, J2 = 5,2, SCHH biotin); 2,88 (td, IH, J, = 11,5 Hz, J2 = 5,1 Hz, Η-19β); 2,96 (p, IH, J = 5,2, SCHbiotin); 3,09 (m, IH, SCHH biotin); 3,20 - 3,30 (m, 4H); 3,38 - 3,50 (m, 4H); 3,52 - 3,63 (m, 6H, 7 x CH2-linker); 3,88 (s, 2H, NHC(O)CH2O-linker); 4,11 (m, IH, ^,ercCH-biotin), 4,11 (m, 2H, 1 x CH2-linker); 4,24 (d, IH, J = 5,1 Hz, H-3a); 4,30 (dd, J, = 8,0 Hz, J₂ = 5,2 Hz, ^tercCHbiotin); 4,43 (d, IH, J = 4,3 Hz); 4,47 (d, IH, J = 4,3 Hz, 33-CH₂); 4,56 (bs, IH, H-29proEy, 4,68 (d, IH, J = 1,7 Hz, H-29proZf 6,35 (s, IH, NH-biotin); 6,41 (s, IH, NH-biotin); 7,64 (t, 1H, J = 5,7 Hz, NH-linker); 7,96 (t, 1H, J = 5,7 Hz, NH-linker).

Příklad 4

Výtěžek 15 mg (25 %). HRMS (ESI-TOF) m/z vypočteno pro C₅₂H8oN40_l2S [M+H]⁺ 985,5566, nalezeno 985,5576.

Příklad 5

Výtěžek 24,5 mg (34 %). HRMS (ES1-TOF) m/z vypočteno pro (^H^NjOnS [M+H]⁺ 986,5888, nalezeno 986,5879.

Příklad 6

Výtěžek 27,8 mg (41 %). HRMS (ES1-TOF) m/z vypočteno pro C52H82N4O11S [M+H]⁺971,5774, nalezeno 971,5753.

Příklad 7

Výtěžek 29,1 mg (54 %). HRMS (ESI-TOF) m/z vypočteno pro C52H8₅BrN₄OioS [M+H] 1037,5243, nalezeno 1037,5237.

Průmyslová využitelnost

C-28 biotinylované triterpeny lupanového typu jsou konjugáty cytotoxicky aktivních triterpenů lupanového typu (potenciálních protinádorových léčiv) s biotinem a jsou využitelné ve farmaceutickém průmyslu pro stanovení molekulárních cílů příslušných triterpenů pomocí afinitní chromatografie. S jejich využitím je možné identifikovat proteiny, se kterými tyto cytotoxicky aktivní triterpeny vytváří specifickou interakci, případně je inhibují, a tím ozřejmit 10 jejich mechanizmus účinku, což je pro potenciální nová léčiva zásadní informace.

Claims

1. C-28 biotinylované triterpeny lupanového typu, které jsou složené z biotinu, na který je přes raménko navázán triterpen lupanového typu, obecného vzorce:

kde raménko je lineární molekula tvořená uhlíkatým řetězcem s deseti až čtyřiceti atomy uhlíku s jednoduchými nebo jednou či více dvojnými nebo jednou či více trojnými vazbami a tento uhlíkatý řetězec může obsahovat jednu či více karbonylových skupin nebo jeden či více atomů 25 uhlíku v tomto uhlíkatém řetězci může být substituováno atomem kyslíku, síry nebo -NHskupinou a

30 · b je jednoduchá, nebo dvojná vazba; c je jednoduchá nebo dvojná vazba, • Q je CH₂, nebo C=O, • B je CH₂, CHOH, CHNH₂, C=O, CH-(Hal), C-(Hal)₂; kde Hal je F, Cl, Br, I, • v případě, že b je jednoduchá vazba, pak A je CH₂, CHOH, CHNH₂, C=O, CH-Hal, C(Hal)₂, a kde Hal je F, Cl, Br, I, • v případě, že b je dvojná vazba, pak A je COH, CNH₂.

2. Použití C-28 biotinylovaných triterpenů lupanového typu podle nároku 1 pro stanovení molekulárních cílů triterpenů lupanového typu.